JPS60262055A - 核酸のハイブリツド形成分析法およびそれに用いる試薬系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 光所少分！ この発明は、特定のポリヌクレオチド配列の検出に用い
る核酸ハイブリッド形成分析法および試薬系に関する。

核酸ハイブリッド形成分析法の原理は、目的とする特定
のボリヌクレオチし塩基配列を決定分離するための手段
として、組換えＤＮＡの分野の研究者達によ゛って開発
された。２本鎖体を変性させて得られるようなりＮＡや
ＲＮＡの如き単一鎖の核酸は、適当な条件下では、相補
的な１本鎖の核酸とハイブリッド形成または組換えを行
うことが分かった。このような相補的検出用プローブに
、何か容易に検出できる化学基で標識をつけることによ
って、単一鎖の形状をした試料核酸を含む試験媒体中の
目的とするポリヌクレオチドのいかなる配列の存在をも
検出することが可能となった。

組換えＤＮＡの分野以外に、この分析用ハイブリッド形
成技術は、就中、人間医学、獣医学、農業および食−科
学の分野における重要なポリヌクレオチドの検出に応用
することができる。特にこの技術□は、バクテリアやウ
ィルスなどの病原体の検出や同定、耐抗生物質性を目的
としたバクテリアのスクリーニング、鎌状赤血球貧血や
サラセミアのような遺伝障害の診断およびガン細胞の検
出に用いることができる。この技術並びにその現在およ
び将来の重要性に関するで般的論評は、バイオテクノロ
ジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　）　（１９８３年
１０月号）のｐ４７１〜４７８に記載されている。

従来例肢■ 下記あ情報は、本発明に関係あると出願人の考える情報
を開示する目的で示すものである。しかしながら、下記
の情報のいずれかが本発明に対し先行技術を構成するこ
とを必ずしも認めるものではなく、またそうであると考
えるべき、でもない。

従来の核酸ハイブリッド形成分析技術においては、一般
に、試料となる核酸を固体の支持体に固定化する。した
がってすなわち、試料となる核酸の目的とする特定の塩
基配列間ないし遺伝子間のハイブリッド形成は、非結合
の標識プローブを含有する残りの反応混合物から固体の
支持体を分離し、次いで該固体の支持体上の標識を検出
することにより測定される。

この従来技術によるハイブリッド形成分析法を実施する
ために試料となる核酸を固定化しなければならないが、
これには重要な二つの問題が存する。第一に固定化を達
成するために要する操作に、一般的に、時間がかかり、
そのため、臨床実験室でこの技術をルーチンで用いるの
に望ましくない工程が加わることになる。第二に不均一
な試料中の蛋白質その他の物質は、特に臨床試料の場合
に、核酸の固定化を妨害することがある。

核酸試料を固定化し、標識プローブを加える代わりに、
固定化されたプローブを使用し、核酸のサンプルをその
まま標識すること、更には、２つのプローブ（一方のプ
ローブは固定化され、他方のプローブは標識されている
）を必要とする二重−ハイブリッド形成技術を用いるこ
とも可能である〔メソッド・イン・エンザイモロジーＭ
ｅｔｈｏｄ３　ｉｌＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）６５　：　
４６　Ｂ　’（１９６８）及びジーン（Ｇｅｒｉｅ）　
２１　：　７７−’８６　’（１９８３）　）　、しか
し′第１の変法は、核酸試料をそのまま標識することに
通常の臨床技術者の能力をこえる高度の技術を必要とし
かつ標識の歩留りをモニターする簡単で高信頼性の方法
がないこととあいまって、最初に述べた方法よりも更に
望ましくない。標識の歩留りをモニターする便利な方法
がないことは、標識媒体に様々な量の標識反応に対する
阻害剤（インヒビター）が含まれている場合に、重大な
問題を惹起することがある。二重ハイブリッド形成技術
には、余分の試薬を必要とすること、培養工程およびハ
イブリッド形成反応の動力学が遅く効率が悪いことなど
あ欠点があるうえに、□試料配列順序との両プローブの
相補性が異な一場合、分析の正確さも同様に変動するこ
とが多い。

試料およびプロニブあポリヌクレオチド間のハイブリッ
ド形成生成物として生じたポリヌクレオチドニ重鎮構造
を直接検出し、これによって一方、または他方のポリヌ
クレオチドの化学標識を省こうという方法は、一般に成
功しなか′った。また単一鎖のり、ＮＡに優先して二重
鎖のＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドと選択的に結合するよ
うな抗体を作り出そうという試みは失與に終った〔バー
カーおよびへロラン（Ｐａｒｋｅｒ　ａｎｄ　、Ｈａｌ
ｌｏｒａｎ）　＋　”免疫学における核酸（Ｎｕｃｌｅ
、ｉｃ　Ａｃｊ、ｄｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）
プレスジアゼよびブラウン（Ｐｌｅｓｃｉａ　ａｎｄ　
Ｂｒａｕｎ　）スプリンガーーベルラーク（Ｓｐｒｉｎ
ｇｅｒ　−Ｖｅｒｌａｇ）編集、ニューヨーク（ＮＹ）
　（１９６９年）ｐ１８以下参照〕。一方、ＤＮＡ　−
ＲＮＡの混合ハイブリッドまたはＲＮＡ　−ＲＮＡハイ
ブリッドと結合し、単一鎖のポリヌクレオチドに対する
親些性が小さい抗体を作るのに成功した事例はいくつか
ある〔例えば、ルトキンおよびストーラー、ネイチャー
２６５　：　４７２！　（１９７７）　（Ｒｕｄｋｉｎ
ａｎｄ　５ｔｏｌｌａｒ。

Ｎａｔｕｒｅ　２６５　：　４７２　（１９７７）　）
参照〕。ルトキン（Ｒｕｄｋｉ、ｎ）およびストーラー
（Ｓｔｏｌｌａｒ　）は、顕微竺スライド上に全部の細
胞を固定させ、細胞核中のＤＮＡを取り出した。このも
のは、ＲＮＡプローブとハイブリッドを形成し、ハイブ
リッドはり、ＮＡ−ＲＮＡに対する螢光標識抗体を用い
て螢光顕微鏡によって検出された。しかしながら、これ
らの方法においては上述した標識プローブを用いるハイ
ブリッド形成技術の場合と同様に試料となる核酸の固定
化が必要であると記載されている。細胞ＤＮＡをそのま
まハイブリッド形成のために固定化することは、ＤＮＡ
が、ハイブリッド形成及び免疫化学検出工程中、微妙な
細胞残渣に固定されていなければならないので特に面白
味のない方法である。また、螢光顕微鏡による観察結果
では形成されるハイブリッドについての定量的なデータ
が得られない。・９ 従って、核酸試料を固定化する必要も、標識する必要も
なくか２二重のプローブを必要としない核酸のハイブリ
ッド形成分析法に対する大きな期待がある。更に、この
ような技術は、各種の標識特に非放射性同位元素型の標
識の使用を可能にするはずである。本発明の主な目的は
、これらの利点および他の利点を備えた核酸ハイブリッ
ド形成□分析方法及び試、集糸を提供することである。

発所勿員果 試料となる核酸の固定化または標識化を必要とせず、単
一のプローブ要素のみを必要とする核酸のハイブリッド
形成分析法が既に考案されている。

本発明は、単一鎖の核酸を含有する適当な試験媒体中の
特定なポリヌクレオチド配列を決定するための方法を提
供するものである。試験媒体は、分析すべき配列と相補
的なプローブ配列との間のハイブリッド形成に好適な条
件下、分析すべき配列と実質上相補的な少なくとも一本
の単一鎖の塩基配列からなる固定化されるかまたは固定
化可能なポリヌクレオチドプローブと合わされる。分析
すべき配列がＲＮＡまたはＤＮＡである場合には相補的
なプローブの配列は実質上ＲＮＡからなるように選択さ
れる。すなわち目的とする試料の配列がＲＮＡであろう
とＤＮＡであろうとこのようなプローブはＲＮＡである
ように選択することができる。また、目的とする試料の
配列がＲＮＡであ−る場合には相補的なプローブの配列
は実質上ＤＮＡかＲＮＡかのいずれかからなるように選
択することができる。従ってプローブおよび試料配列間
のハイブリッド形成によって生じるハイブリッドはＤＮ
Ａ−ＲＮＡまたはＲＮＡ・ＲＮＡ二重鎖となる。

そして生成するバイア”Ｊ　ソドは、プローブを試験媒
体と合わせて固定化すると同時または固定化後に、形成
されたＤＮＡ　−ＲＮＡ二重鎖またはＲＮＡ　−ＲＮＡ
二重鎖と結合しうる抗体試薬を加え、かかる二重鎖と結
合した抗体試薬を分析することにより測定される。本方
法の原理を実施するには、種々の手法および試薬の組合
わせを用いることができる。本発明の最も重要な特徴は
、試料となる核酸をプローブと接触する前に固定化また
は標識する必要がない点である。

プローブおよび試料となる核酸間のハイブリッド形成を
特異的かつ鋭敏に検出するためには抗体試薬が鍵となる
。勿論、全抗体またはこれら抗体の適当な断片および多
官能体を、以下に詳述するように、使用することができ
、本開示および特許請求の範囲において用いた抗体試薬
という用語は、特に断りがない場合、全抗体試薬並びに
それらの多官能体及び断片をも意味する。

抗体試薬のハイブリッド形成二重鎖に対する結１、合は
好都合な方法ならばいかなる方法によっても測定するこ
とができる。抗体試薬は、酵素学的に活性な原子団、螢
光、体、発色団、発光体、特異的な結合が可能な配位子
または放射性同位元素のような検出可能な化学的な原子
団で標識するのが好ましく、特に非放射性同位元素によ
る標識が好ましい。生成する固定化されたハイブリッド
二重鎖に結合される標識された抗体試薬は結合されなか
った抗体試薬かう容易に分離することができる。検出可
能な化学的な原子団ま−たは標識は、分離された何れの
両分においても測定されるが、通常は結合された抗体試
薬が測定される。

本発明は、試料となる核酸の固定化または標識化を省く
ことによって、非常に有利なハイブリッド形成分析技術
を提供する。、分析技術者は高度の分析技術を必要とし
ない。すなわち、固定化操作または標識化操作に要する
時間を省くことができる。、更に、試料が固定化操作を
妨害するという可能性が完全になくなる゛ｉ臨床的な使
用に供される試験キットは、例えば、固定化された結合
相手と結合させることによって既に固定されたプローブ
もしくは容易に固定化し得る形のプローブからなる。従
来技術における系では、試料中の外来性蛋白質およびそ
の他の物質の妨害によって、固定化される試料核酸がＲ
ＮＡであるかＤＮＡであるかが重大な問題となり得る。

従来技術の方法においては、固定化は、ニトロセルロー
スのような微細孔を有する膜への吸着または固体の支持
体の反応部位に対する共有結合によって達成される。微
細孔を有する膜への吸着に　゛よって固定化する場合に
は、試料からの蛋白質が膜の表面を覆い、核酸の吸着を
妨げる。更に多くの操作法は、吸着された核酸を支持体
に固定するためには、通常８０℃以上の高温度における
減圧下での加温操作を必要とする。試料に内在する粘液
その他の物質が存在する場合には、これらは支特休上で
乾燥されてフィルムを形成しうるが、このフィルムは、
ハイブリッド形成中に、標識されたプローブを吸着して
ノイズの信号を大きくし、感度を下げる原因となる。更
に、酵素またはその他の蛋白質が標識の検出に関与する
場合には、これがしばしば非特異的にフィルムに結合し
、ノイズが更に大きくなる原因となる。共有結合による
固定化を用いる場合には、１料からの蛋白質その他の物
質は、結合（カップリング）反応に与り、所望の核酸の
カップリングを中和するのに有効な反応性の原子団を有
するものと考えられる。

本発明は、好ましい実施態様において、既に固定化され
た形または固定化された結合相手に結合することにより
容易に固定化される形のプローブであるので、従来の固
定化操作技術に固有の欠陥が克服され、従って分析の検
出限界が下がることがない。更に本発明においては、試
料ＲＮＡまたはＤＮＡの固体の支持体に対する非特異的
な結合−が抗体試薬によって認識されないという利点が
ある。したがってノイズ信号が低下し、検出限界が改善
される。標識されたプローブと固定化されたプローブと
を用いる二重のハイブリッド形成に対しては、標識され
たヌクレオチドは、固体の支持体に非特異的に結合し得
るし、ノイズの原因ともなり得る。本発明の方法におい
ては、標識されたプローブを含まないのでこのような可
能性はない。

図面は、本発明を実施するための好ましい方法の概略を
表わす。核酸のハイブリッド形成を分析手段として用い
るのは、基本的にはＤＮＡの二重鎖構造を基礎としてい
る。二重鎖ＤＮＡのそれぞれの連鎖のプリンおよびピリ
ミジン塩基間の水素結合は可逆的に切断できる。このＤ
ＮＡの融解または変性によって生じる２本のＤＮＡの相
補的単−Ｉは融合・（リアニーリングまたはハイブリッ
ド形成ともいう）して二重鎖構造を再生する。当業者に
は周知のように、充分に相補性のある塩基配列からなる
ＤＮＡまたはＲＮＡの第１の単一鎖の核酸を適当な溶液
条件下、第２の単一鎖核酸と接触させると、場合により
、ＤＮＡ　−ＤＮＡ。

ＤＮＡ　−ＲＮＡまたはＲＮＡ　−ＲＮＡハイブリッ　
ｉドを形成する。

第１図に示す実施態様では、ハイブリッド形成に好適な
条件下、単一鎖の試料核酸（Ｓ）を固定化されたプロー
ブ（Ｐ）と接触させる。生成する固定化されかつハイブ
リッド形成された二重鎖を残る反応物から分離した後、
随時、ＤＮＡ・ＲＮＡまたはＲＮＡ　−ＲＮＡ二重鎖に
対して特異な抗体の標識した形（Ａｂ”）と接触させる
。結合せずかつ標識された抗体を洗浄した後、固体支持
体上に存在する標識を測定する。

第２図に示す実施態様では、単一鎖の試料核酸（Ｓ）を
、結合性のビオチン部分からなるように適当に化学修飾
したプローブ（Ｐ）の可溶形と接触させる。生じた可溶
性ハイブリッドに、ビオチンに対する結合相手であるア
ビジンの固定化された形を加え、固定化されたハイブリ
ッドを形成する。このようにして固定化された二重鎖を
、所望ならば、残る反応混合物から分離した後、標識さ
れた抗ハイブリッド抗体と接触させ、洗浄後、固体の支
持体上に存在する標識を前述のように測定する。

プローブ プローブは、検出さるべき配列と実質的に相補的な少な
くとも−の単一鎖塩基配列からなる。しかしながら、こ
のような塩基配列は単一の連続的なポリヌクレオチド断
片である必要はなく、非相補的な配列が介在する２つ以
上の個々の断片からなっていてもよい。これらのハイブ
リッドを形成しない配列は、線状であってもよく、また
、自己相補的でありかつヘアピンループを形成してもよ
い。更に、プローブの相補的領域は、その中に相補的配
列が、増殖のために、挿入されていたベクターのＤＮＡ
またはＲＮＡを含む配列のような、ハイブリッドを形成
しない配列によって３゛　−及び５゛−末端ではさみつ
けられていてもよい。何れにしても分析試薬として提供
されるプローブは、当該試料核酸と１個以上の点で検出
可能なハイブリッド形成を示す。臨界相同断片が単一鎖
の形で存在し、試料のＤＮＡまたはＲＮＡとハイブリッ
ドを形成するために利用で□き、しかもプローブととも
に用いるために選ばれた抗体試薬がプローブ中の二重鎖
領域と著しく交差反応しない（例えば抗体試薬がＤＮＡ
　−ＲＮＡハイブリッドに特異的であり、プローブがＲ
ＮＡ　−ＲＮＡ二重鎮領域からなるかまたはその逆。）
であるならば、線状または環状の単一鎖ポリヌクレオチ
ドは、多少とも相補的なポリヌクレオチド鎖が重複して
いてもプローブ要素として使用できる一０相補的なプロ
ーブ配列は士数個から１０，０００個程度の塩基範囲の
都合のよいまたは所望の長さの何れでもよ（、塩基が約
５０個以下のオリゴヌクレオチドを含む。

ＲＮＡまたはＤＮＡプローブは、種々の従来法により得
ることができる。例えば、ＲＮＡプローブの場合には、
ＲＮＡは、バクテリアもしくは細胞の転移ＲＮＡ＠から
の５８，１６８及び２３ｓリボゾームＲＮＡ類のような
細胞の天然生成物として単離することができる。メンセ
ンジャーがそれに一ついてコードする多量の蛋白質を専
ら生成する細胞からの特異なメツセンジャーＲＮＡを単
離することも実用的である。

ＲＮＡプローブを生体外で合成するには、非常に活性な
サルモネラ　チフィムリアム　バクテリオファージＳＰ
６複写プロモーター（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ
ｍｕｒｉｕｍ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　ＳＰ　６
　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｐｒｏｍｏｔｏｒ）　（
グリーンら（Ｇｒｅｅｎ　ｅｔａｌ）　（１９Ｂ３）セ
ル（Ｃｅｌｌ）　３２　：　６８１　）　を含むベクタ
ーを用いることができる。プロモーターに隣接する、エ
ンドヌクレアーゼによる多重切断部位を有するベクター
はプロメガ・バイオチク、マジスン、ライスコンシン（
Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ、　Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗ
ｌ）からも入手できる。ＤＮＡプローブをベクターにク
ローン化させ、次いでこのベクターをバクテリア宿主中
で増殖せしめる。クローン化されたＤＮＡプローブの多
重ＲＮＡ複写はバクテリオファージＳＰ６由来のＲＮＡ
ポリメラーゼに依存するＤＮＡを用いて生体外で合成す
ることができる。

ＤＮＡプローブは種々の源から調製することができる。

バクテリアのゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）は全て、典型的に
無菌状の試料中のバクテリアを検出するように設針され
たハイブリッド形成分析法のために固定化することがで
きる。この分析法によれば、リポゾームＲＮＡ　（ｒｉ
ｂｏｓｉｍａｌ’　ＲＮＡ）および転移ＲＮＡ等の豊富
なバクテリア性ＲＮへを検出することができる。また細
胞性ＲＮ　Ａ　（ｃｅｌｌｕｌａｒＲＮＡ）に対して相
補的なｉ異なりＮＡ配列は、公知のプラスミＶまたはウ
イ′ルス性のベクターにクローン化でき、ハイブリッド
形成プローブとして用いることができる。

ここでｒＲＮＡプローブ１ｍよびｒＤＮＡプローブ」と
いう表現を用いる場合、プローブ中に含まれる全てのヌ
クレオチドがリボヌクレオチドまたは２゛−デオキシリ
ボヌクレオチドであることを意味するものではない。本
ｉ明の目的に輌するＲＮＡまたはＤＮＡプローブの基本
的な特徴は、抗体をして、分析的に著しい程個々の単一
鎖と交差反応してハイブリッドのようなものを゛形成し
ない、ＲＮＡまたはＤＮＡプローブからなるＤＮＡ・Ｒ
ＮＡま゛たはＲＮＡ　−ＲＮＡハイブリッドに対して刺
激し得るような特性を有することである。したがって本
分析を実施するために必要な抗体結合特性が実質的に保
たれるならば、プローブ中に含まれるヌクレオチドの２
゛−位置を化学的に修飾することができる。同様に個々
の単一鎖に較べ、二重鎖のハイブリッド形成に対する抗
体の特異性が妨害されなければ、２゛−デオキシの化学
修飾に限らず、プローブは、一般に、リボースホスフェ
イト骨格に沿ってどのようにも化学修飾することができ
る。

ＲＮＡまたはＤＮＡプローブにこのような修飾がある場
合には、抗体試薬を惹起するために用いられる免疫原は
、検出さるべき試料がＲＮＡであるかＤＮＡであるかに
より、実質上対応する修飾を有する１つの鎖と実質上修
飾されていない第２の鎖とを含むものが好ましい。免疫
原の修飾された鎖は、ＲＮＡまたはＤＮＡプローブの修
飾された鎖と同一であるのが好ましい。免疫原の一例と
してハイブリッドポリ（２”−０−メチルアデニル酸）
・ポリ　（２’　−０−デオキシチミジル酸）かある。

その他、ポリ　（２°−０−エチリノシニソク酸）・ポ
リ　（リポシチジル酸）がある。更に修飾され　−たプ
ローブ中に含まれる修飾されたヌクレオチドの例を以下
に列挙する。２“−〇−メチルリボヌクレオチド、２”
−０−エチルリボヌクレオチド、２゛−アジドデオキシ
リボヌクレオチド、２′−クロルデオキシリボヌクレオ
チド、２’−０−アセチルリボヌクレオチドおよびリボ
ヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのホスボ
ロチオレートやメＬ／Ｌ、ホスホネートがある。修飾さ
れたヌクレオチドは、プローブが型（ｔｅｍｐｌａｔｅ
＞から酵素的に合成される間に導入された結果プローブ
中に出現することもある。例えば、アデノシン５°　−
０−（１−チオトリホスフェイト）（Ａ’ＴＰαＳ）お
よびｄＡＴＰαＳは、それぞれＤＮＡ依存ＲＮＡポリメ
ラーゼおよびＤＮＡポリメラーゼに対する基質となる。

更に化学的な修飾は、プローブの調製後に導入すること
もできる。例えば、ＲＮＡプローブは、水溶媒中緩和な
条件下で無水酢酸により２゛−〇−アセチル化すること
ができる〔スチュヮルドら、（Ｓｔｅｗａｒｄ、　Ｄ、
Ｌ；ｅｔ　ａｌ）、（１９７，２）バイオキム・バイオ
フィズ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

を 八ｃｔａ）　２６２　：　２２７）　。

ここで用いるＲＮＡ又はＤＮＡプローブの重要な性質は
、相補的なＲＮＡまたはＤＮＡ鎖と二重鎖を形成したプ
ローブに対して惹起された抗体がプローブの二重鎖形態
と単一鎖の核酸との間の結合性で識別されることである
。このような性質により、プローブのハイブリッドを形
成しない単一鎖の形態または非特異的に結合した試料の
核酸に対して著しくノイズとなる結合をすることな（、
分析混合物中のハイブリッドを形成したプローブを検出
することができる。上述のようにリボヌクレオチドまた
はデオキシリボヌクレオチド鎖に沿ったある種の修飾は
、単一鎖からの二重鎖の抗体識別能を失うことなく認め
うろことであるが、試料であるポリヌクレオチドがＲＮ
ＡまたはＤＮＡである場合には、全てリボヌクレオチド
からなるＲＮＡプローブを用いることが一般に好ましい
。

試料がＲＮＡである場合にはＤＮＡプローブを用いるの
が好ましい。

）３しニブ４柿１定准。

前述のように、てローブは、固定化されたまたは固定し
得る形で試料の核酸とく１イブリツドを形成する。プロ
ーブの固定し得φ形とは、ハイブリ、ラド彎成反応に続
き、プローブがうまい具合に固定化され得る形のもの牽
いう。プローブを究極的に固定化する手段は、本発明に
おいては、特に制限されないが、プローブと目的とする
配列との間で形成されるハイブリッドがプローブの性質
を介して固定化される限り、いかな食方法をも採用する
ことができる。従って試料核酸は竺接固定化されること
はない。

固定化された形でハイブリッド彎成反応に供される場合
には、プローブは、該プローブおよび、ハイブリッド形
成および／または抗ハイブリッド試薬との結合によって
プローブと結合する反応混合物の成分が残る混合物から
、遠心分離、濾過、クロマトグラフィーまたはデカンテ
ーション等によって単離または分離されうるかぎり、い
かなる形態をとってもよい。すなわち、固定化されたプ
ローブの種々の組成および形態は、当業者にとっては明
白でかつ利用７可能なものである。本質的には、反応混
合物に不溶なあらゆる形態のプローブを用いることがで
きる。例えば、プローブは、凝集すチか、さもなくば沈
澱させるか、不溶性の物質、ポリマー１．または支持体
に付着させるかあるいはアガロース（ａｇａｒｏｓｅ　
）またはポリアクリルアミド等のゲル中に捕獲せしめる
〔メソ・エンザイモル（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、
）　１２　Ｂ　：６３５　（１９６８）およびｔ″′−
エフエイ１ス（、Ｐ、Ｎ　Ａ　Ｓ　）　６７“８０７（
１９７０）参照〕。特に、プローブを共有結合または非
共有結合によっ正付着令せるか固定化するための固体の
支持体を用いるのが好ましく、非共有結合による場合に
は、適度に安定で、かつ、強力な付着力を与える吸着法
がある。固体の支持体は種々の形状および組成をとるこ
とができ、例えば、微粒子、ビーズ、多孔質で不浸透性
のストリップおよび膜、並びに試験管およびマイクロタ
イター・プレート（ｍｉｃｒｏｔｊｔｅｒ　ｐｌａｔｅ
）等の反応容器の内面が挙げられる。所望の反応相手を
、選択した固体の支持体に付着させる手段は当業者にと
っては日常的な仕事に属する。

プローブをニトロセルロースの股に吸着させる一方法と
して、プローブを沃化ナトリウムで飽和し、それを少量
この膜にスポットし絶遇する方法がある〔ブレノセルら
（Ｂｒｅｓｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ　）　（１９８３）ディ
ー・エヌ・ニー（ＤＮＡ）２　：　２４３）。沃化ナト
リウムは、プローブの変性を促進し、膜への吸着力を高
める。また、プローブは、通常１モル（Ｍ）程度の濃度
のグリオキサールで処理し、次いで膜に吸着させること
もできる。プローブは８０℃前後の温度で減圧下２〜４
時間、加温することにより固定化される〔トーマス・ピ
ー・ニス（Ｔｈｏｍａｓ、　Ｐ、Ｓ、）　、（１９８３
）メソッド・イン・エンサイモル（Ｍｅｔｈ、　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌ、　）　１００　ｒ２２５　）。

ＲＮＡまたはＤＮＡプローブは共有結合により固定化す
ることもできる。この場合広範な種類の支持体用材料お
よびカンプリング技術が用いられる。例えば、プローブ
は、カルボジイミドまたはカルボニルジイミダゾールに
より活性化されたホスフェイト（リン酸エステル基）基
を介してホスホセルロースに結合せしめることができる
〔バオトル・アカデ・サイ、ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔ’！。

＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳ＾）４８：４００−４０８
’。

シー・ティ・ワイおよびマー　チン・エム・ニー（Ｓｈ
ｉｈ、Ｔ、Ｙ、ａｎｄ　Ｍａｒｔｉｎ＋　Ｍ、八、）’
、　（１９７４）バイオケム（Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　Ｉ
　３　：３４１１−３４１８）。

またｍ−ジアゾベンゾイルオキシ−メチルセルロースの
ジアゾ基もポリヌクレオチドのグアニンおよびチミジン
残基と反応することができる〔ノイエス・ビー・イーお
よびスターク・ジー・アール（Ｎｏｙｅｓ、　Ｂ、Ｅ、
　ａｎｄ　５ｔａｒｋ、　Ｇ、Ｒ，）　＋　（１９７５
）セル（Ｃｅｌｌ）’５　：　３０１−３１０　；ライ
ザー・ジェイら（Ｒｅ’１ｓｅｒ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ）　
、（１９７８）バイオケム・バイオフィシ・リス・コミ
ユニ’　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、ＢｉｏｐｈｙＳ　。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｍ＋ｎｕｎ、）　８５　：１１０４−１
１１２）　ｏポリサッカライド支持体も水溶性のカルボ
ジイミドで活性化することによりポリヌクレオチドの末
端ホスフェイトと支持体の水酸基との間に形成されるホ
スホジエステル結合を介して結合させるのに用いること
ができるし〔リンチウッド・ディー（Ｒｉｃｈｓｌｏｏ
ｄ、Ｄ、、）　（１９７２）バイオチム・バイオフィシ
・アクタ（ＢｉｏｃｈｉＩｌｌ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃ
ｔａ）２６９：４７−５０；ギルハム・ビー・ティ（Ｇ
ｉｌｈａｍ、Ｐ、’Ｔ）　（１９６８）バイオケム（Ｂ
’ｉｏｃｈｅｍ、　）７７２８０９−２８１３）、また
ポリヌクレオチドの核部位をシアノーゲンブロマイド（
Ｃｙａｎｏｇｅｎｂｒｏｎ＋ｉｄｅ　）で活性化された
支持体と結合させてもよい〔アーント・ジジビシ・ディ
ー・ジェイら（＾ｒｎｄｔ−Ｊｏｖｉｎ　、　Ｄ、Ｊ、
、　ｅｔ　ａｌ　）　＋　（’１９７５）ニール・ジェ
イ・バイオケム（Ｅｕｒ、’Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）
５４：４１１−４１８；リンベルブ・ニーおよびエリク
ソン・ニス（Ｌｉｎｂｅｒｇ、　ｖ、、　ａｎｄ　Ｅｒ
１ｋｓｓｏｎ。

Ｓ、、）（１９７１）ニール・ジェイ・バイ芽ケム（Ｅ
ｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　１８　：　４７４
　４７９）。

更にプローブの３゛−ヒドロキシ末端を過沃素酸で酸化
し、アミンまたはヒドラジド基を有する支持体とシック
塩基形成により結合させてもよい〔ギルハム・ピー・テ
ィ（Ｇｉｌｈａｍ、　Ｐ、Ｔ、、　）　（１９７１）メ
ソッド・エンサイモル（Ｍｅｔｈｏｄ、　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌ、）　２１：ｉ９ｘ　−１９７；ハンスケ・エイチ・
ディーら’　（Ｈａｎｓ’＋ｋｅ、　Ｈ，Ｄ、、ｅｔ　
ａｌ、’）　（１９７９）メソッド・エンサイモル（Ｍ
ｅｔｈｏｄ’、　’Ｅｎ’ｚｙｍｏ１．）’　５９　：
　請求核性の部位を有する支持体は塩化シアヌル（シア
ヌル酸クロリド）と反応させ、次いで某すヌクレオチド
□と反応させてもよい〔ハンガー・エイチ・ディーら（
Ｈｕｎｇｅｒ＋　Ｈ，Ｄ、、ｅｔ　ａｌ＋　）（１９８
１）バイオチム・バイオフィシ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉ
’ｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｃｔａ　）’６５３　：　３
４’４−一般に、相補的な′単一鎖配列を試料核酸に対
しハイブリ、ラド形成すチために用いることができれば
、どのような方法すあってもプローブを固定化方法およ
び物質に限定され□るものではない。

直接固定化されたプローブを用いる方法に代わる特に魅
力ある別法、は、反応速度が更に速い溶液中でハイブリ
ッド形□成を進行させる固定化し得る形のプローブを用
“いる方法である゛。このような場合、通常、反応相手
と安定な共有結合または非共有結合を形成し得る反応部
位を有するプローブを用い、このような反応相手の固定
化された形にさらすことにより固定化することができる
。

プローブ中のこのような反応部位としては、アビジンま
たは反応相手となる抗体等の結合物質と特異な非共有結
合を形成し得るビオチンまたはハプテン部分等の結合部
位が好ましい。

本質的には、一対の物質はいずれも、相互に適当な親和
性があり安定な結合を形成する、すなわち以後の分析工
程、とりわけ分離および検出工程中に実質上破壊されず
反応部位と反応相手間に結合をつくる反応部位と反応相
手とのペアからなる。

形成される結合は、共有結合でも非共有結合的相互作用
でもよく、選択性または特異性の度合により特徴づけら
れる場合には、非共有結合的相互作用が特に好ましい。

このような好ましい結合が形成される場合には、プロー
ブ上の反応部位は結合部位といい、結合部位と非共有結
合、通常、特異的な結合を形成する反応相手は結合物質
という。

このような好ましい実施態様においては、結合部位は、
プローブ中の単一鎖のハイブリッド形成可能な部分また
は、単一鎖あるいは二重鎖のハイブリッド形成しない部
分に存在し、プローブの化学修飾の結果として存在して
もよい。ヌクレオチド配列中に存在する結合部位の例と
しては、プローブがプロモーター蛋白質（例えば、バタ
テリオファージプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼ）に
より結合可能なプロモーター配列（例えばｌａｃ　−プ
ロモーター、ｔｒｐ−プロモーター）からなるが、リプ
レッサー蛋白質（例えばｌａｃリプレッサー）により結
合可能なオペレーター配列（例えばｌａｃオペレーター
）からなるか、特異な抗体により結合可能な稀な抗原性
ヌクレオチドまたはその配列からなる場合である〔英国
特許明細書（ＢｒｉｔｉｓｈＰａｔ、　５ｐｅｃ、）　
２．１２５　、　９６４参照〕。プローブ中に含まれる
ポリヌクレオチドの化学的な修飾に。

よって導入された結合部位は特に有用であり、通常、特
異な結合対の一方のプローブ核酸に対して結合する。選
択されるべき有用な結合対としては、ビオチン／アビジ
ン（卵白アビジンおよびストレプトアビジンを含む）、
ハプテンおよび抗原／抗体、炭水化物／レクチン、酵素
／阻害剤等がある。

結合対が蛋白質系のものと非蛋白質系のものとからなる
場合は、蛋白質系のものはプローブのハイブリッド形成
の変性条件下では不安定となり得るので、通常、非蛋白
質系のものをプローブに゛結合するのが好ましい。好ま
しい系において、はプローブのビオチンまたはハプテン
に対する結合を含み、それぞれ固定化されたアビジンま
たは抗ハプテン抗体試薬を用いる。

プローブが、固定化し、１得る形で目的とする配列とハ
イブリッドを形成する場合、プローブの性質により、形
成される二重鎖を固定化する以後の工程および抗ハイブ
リッド抗体試薬の゛添加はいずれも所望の順序で進行さ
せることができる。固定化および抗−へイブリッド抗体
の添加は関連する試薬および物質の添加と同時にあるい
はいずれか一方を他方よりも先んじて添加することによ
り達成され、しかもいずれか一方を他方に先んじて添加
する場合、洗浄穿たば分離工程を介在させても省いても
よい。順序だてて添加する場合、もちろん形成されたハ
イブリッドが過飽和とならないように、添加される試薬
の濃度を考慮し、後から添加する物質が先に添加した物
質と相互作用しないよう、に注意する。

前述の特異な結合方法により固体の支持体に結合される
固定化されたプローブはまたは固定化し得るプローブは
好ましいけれども、固定化し得るプローブは比較的特異
性の低い方法により支持体に結合させることもできる。

この場合支持体は、ハイブリッド形成されたプローブに
結合するが、ハイブリッド形成されていない形には結合
しない。

次いでハイブリッドの量は抗体試薬を用いて測定される
。このタイプの支持体の例としては、ＤＮＡ　−ＲＮＡ
およびＲＮＡ　−ＲＮＡ二重鎖と結合するが単一鎖の種
とは結合しないヒドロキシアパタイトがある〔ブレンナ
ーおよびファルコウ（Ｂｒｅｎｎｅｒ　ａｎｄ　Ｆａｌ
ｋｏｗ）　＋アドブ・イン・ジェネット　（＾ｄｖ、ｉ
ｎ　Ｇｅｎｅｔ、）　、１６　：　８１　（１９７３）
　）　。

また化学的に活性なまたは活性化し得る原子団をプロー
ブに導入し、固定の支持体と反応させ、次いでハイブリ
ッドを形成することもできる。この系により共有結合で
固定化されたプローブが得られ、支持体に結合したハイ
ブリッドの量が抗体試薬を用いて測定される。

ハイブト・　゛　および　の 本発明の抗体試薬は、主として、プローブと相補的な試
料核酸との間に形成されるＤＮＡ・ＲＮＡまたはＲＮＡ
　−ＲＮＡハイブリッドと結合し単一鎖のポリヌクレオ
チドを著しく排除する能力に特徴がある。前述したよう
に抗体試薬は、全抗体、抗体断片、多官能性の抗体凝集
体または一般に、場合によってはＲＮＡ−ＲＮＡあるい
はＤＮＡ　−ＲＮＡに対する抗体からの１個以上の結合
部位からなるいかなる物質がらなっていてもよい。全抗
体の形態をとっている場合、抗体試薬は公知の免疫グロ
ブリンの群もしくは下位の群（サブクラス）、例えばＩ
ｇＧ、　ＩｇＭ等のいずれかに属する。ハイブリッド形
成したプローブに対する特異な結合親和性を保持するこ
のような抗体のいかなる断片も用いることができ、例え
ばＦａｂ、　Ｆ　（ａｂ’　）およびＰ（ａｂ’）２と
して従来公知であるＩｇＧの断片が用いられる。更に凝
集体、ポリマー、免疫グロブリンの誘導体および複合体
またはそれらの断片を適当な場合に用いることができる
。

抗体試薬に対する免疫グロブリン源は、従来の抗血清お
よびモノクロナール技術等のいがなる技術を用いても得
ることができる。抗血清は、適切な免疫原を用いて、マ
ウス、兎、モルモア）、山羊等の動物を感作させる十分
に確立された技術によって得ることができる。免疫グロ
ブリンもまた、適当な免疫原の利用を含み、モノクロナ
ール抗体といわれる物質を生じる体細胞のハイブリッド
形成技術によって得ることができる。

ＤＮＡ　−ＲＮＡハイブリッドに対して特異的な抗体を
刺激するための免疫原は、ホモ重合体またはへテロ重合
体のポリヌクレオチドニ重鎮から構成することができる
。可能なホモ重合体の二重鎖のなかでは、特にポリ　（
７Ａ）　・ポリ　（ｄＴ）がａｎｄ　５ｔｏｌｌａｒ　
）　（１９８２）モル・インミュノル（Ｍｏ１゜１＋＋
ｎ５ｕｎｏ１．）　１９　：　４１３７　、しかしなが
ら一般に、ヘテロ重合体の二重鎖を用いるのが好ましく
、φ×１７４ピリオンＤＮＡ　（φｘ＝ｌ　７４　Ｖｉ
ｒｉｏｎＤＮＡ）のＲＮＡポリメラーゼによる複写を含
む種々の方法によって調製することができる〔ナカザト
（Ｎａｋａｚａｔｏ）　（１９８０）バイオケム（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　）１９：２８３５）。選んだＲＮＡ　−
ＤＮＡ二重鎖は、メチル化した蛋白質に吸着させるか、
または仔牛血清アルブミン等の６従来゛の免疫源担体物
質等に結合させ、所望の宿主動物、に注入する〔スト−
ラー（Ｓｔｏｌｌａｒ　）　（１９８，０）メソ・エン
サイモル（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）　７０　：
　７０参照〕。

ＲＮＡ　−ＲＮＡ二重鎖に対する抗体は、とりわけレオ
ウィルス（ｒｅｏｖｉｒｕｓ）または蔗糖に感染するフ
ィーシイ病ウィルス（Ｆｉｊｉ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｖｉ
ｒｕｓ）、等のウィルスからの二重鎖Ｒ，ＮＡに対して
産生ずる。また、とりわけ、ポリ　（、ＴＩ）　・ポリ
　（γＣ）またはポリ（γＡ）　・ポリ＜’ｙＵ）等の
ホモ重合できる。　□ プローブに対する結合ｉ、いかなる好都合な技術によっ
ても検出することもできる。抗体試薬はそれ自体検出可
能な化学的な原子団によって標識されているのが有利で
あ＋。このよ？な化学的なｉ子団は、検出可能な物理的
または化学的性質を有すれば、いかなる物質毫あっても
よい。このような物質は、些疫分析法の領域においては
充分に開発されており、このよ□うな方法に用いられる
標識は、一般に、はとんど全て本発明に応用することが
できる。酵素（クラス・ケム（ＣＩｉｎ、Ｃｈｅ＊　）
　＋（１９７６）　２２　：　１２４３．ニー・ニス・
ライシュ・パソ）　（Ｕ、Ｓ、Ｒｅ１ｓｓｕｅ　Ｐａｔ
、）　Ｎｏ、３１，００６およびニー・ケイ・パット（
ＵＫ　Ｐａｔ、）　２．１０９，４０８参照〕、酵素基
質〔ニー・ニス・バント（ｌＪ、ｓ、Ｐａｔ、）　Ｎｏ
、４゜４９２、７５１参照〕、コファクター〔ニー・ニ
ス・バット（Ｕ、Ｓ、　Ｐａｔ、）　Ｎｏ、　４．２３
０，７９９およびＮｏ−’４＋２３８、５６５．参照〕
および酵素阻害剤〔ニー・エス・バット（ＩＪ、Ｓ、Ｐ
ａｔ、　）　Ｎｏ、４．１３４’、７９２参照〕等の酵
素学的に活性な原子団、螢光体〔クラニ・ケム（ＣＩｉ
ｎ、Ｃｈｅｍ、　）　（１９７９）　２５　：　３５３
参照　〕、発色団、化学発光体および生物発光体等の発
光体〔ニー・ニス・バット　（Ｕ、Ｓ、Ｐａｔ、　）　
Ｎｏ、４，３８０．　シ８゜参照〕、ビオチン等の特異
な結合が可能な配位子〔ユーロピアン・バット・セフ（
Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔ。

Ｓｅｃ、）　６３．　８７９）またはハプテン（ピー・
シー・ティ・パブリ・（ＰＣＴ　Ｐｕｂｌ、）　８３−
２２８６）、並びに３Ｈ，３５ｓ、　３２Ｐ、　１２５
工　および１４ｃ等の放射体同位元素が特に有用である
。このような標識および標識対は、それぞれ固有の物理
的性質（例えば、螢光体、発色団および放射性同位元素
）または反応性あるいは結合性（例えば、酵素、基質、
コファクターおよび阻害剤）に基づいて検出される。例
えば、コファクターで標識した抗体は、標識がコファク
ターおよび酵素に対する基質である酵素を添加すること
によって検出することかできる。ハプテンまたは配位子
（例えばビオチン）で標識し−た抗体は、検出可能な分
子（部分）を含んだ、ハプテンに対する抗体、または配
位子と結合する蛋白質（例えばアビジン）を添加するこ
とによって検出できる。このような検出可能な分子は、
測定可能な物理的性質（例えば螢光または光吸収）を有
する分子であるか、あるいは、酵素反応に関与する何ら
かの分子である（例えば、上記参照）。

例え畝基質に作用して測定可能な物理的性質を有する生
成物を与える酵素を用ｔ）ることができる。

このような酵素として、例えば、β−ガラクトシダーゼ
、アルカリ性ホスファターゼおよびペルオキシダーゼが
あるが、これらに限定されるものではない。その他の標
識化の方式は当業者にとってよく知られているものであ
る。

更に、抗体試薬は、それに固有の抗原性等の生来の性質
を基にして検出することもできる。標識された抗抗体（
ａｎｔｉ　−（ａｎｔｉｂｏｄｙ）　ａｎｔｉｂｏｄｙ
）は、二次抗体に対する標識が上述のような従来の標識
である場合に一次抗体に結合する。また、抗体は、抗体
検出法として知られているその他の技術と同様に、補足
的な固定化（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　ｆｉｘａｔｉｏｎ
　）できる。

好ましいことではあるが抗体試薬を標識する場合には、
標識部分と抗体試薬とは、共有結合を含むような直接的
な化学結合、あるいは、抗体と結合する小胞体（＋ｎ１
ｃｒｏｃａｐｓｕｊｅ）あるいはリポソームに標識が包
含共しめるよ１うな間接的な結合によって、相互に会合
せしめられるか結合される。標識化技術は当業煮には充
分知らむており、本発明においては、好都合な方法なら
いかなる方法をも用いることができる。

反皇皿金勝 分析される試験試料は、目的とするいかなる媒体であっ
てもよく、通常は、医学的、獣医学的、環境学的、栄養
学的あるいは工業的に重要な液体試料である。特に本発
明の方法によっては、ヒトおよび動物標本並びに体液を
分析烹ることができ、例えば尿、血液（血清または血Ｉ
Ｍ）、乳液、髄液、唾液、糞便、腫脹引物、喉スワブ、
性器スワブ、および滲出液、直腸スワブおよび鼻咽喉吸
引物などを分析することができる。患者その他の源から
得られた試験さるべき試験試料が主に、例えば、細胞中
に含まれる二重鎖核酸を含む場合には、試料を処理して
核酸を変性させ、必要に応じて、先ず核酸を細胞から放
出させる。核酸の変性は沸騰０、ＩＮ水酸化ナトリウム
）によって達成するのが好ましく、望ましくはこれらを
同時に使用して細胞を溶解させるのがよい。また、核酸
の放出は、例えば、機械的破壊（凍結／融解、摩耗、超
音波処理）、物理的／化学的破壊（Ｔｒｉ　ｔｏｎＪ　
Ｔｗｅｅｎ、ドデシル硫酸ナトリウムなどの洗剤、アル
カリ処理、浸透圧衝撃或いは熱）、或いは酵素的溶解（
リゾチーム、プｉティナー、ゼに１ペプシン）により得
ることができる。得られた試験媒体は核酸を一重鎖の形
態で含有し、これは次いで本発明のハイブリッド形成方
法により８分析することができる。

公知の如（、各種の共イブリッド形成条件を分析に使用
することができる。典型的には、ハイブリッド形成はや
や高温の条件、例えば、約３５〜７５℃、通常は６５℃
近辺において、適当なイオン強度を有する約ｐＨ６〜８
の緩衝液（例えば、１ｘＳＳＣ＝０．１５Ｍ塩化ナトリ
ウムおよび０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである場合
に２　Ｘ５ＳＣ、ｐＨ７，０）、仔牛血清アルブミン等
の蛋白質、ファイコル（Ｆｉｃｏｌｌ）　（ファルマシ
ア　ファイン　ケミカルズピスカタウェイ　ニューヨー
ク（ＰｈａｒｍａｃｉａＦｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ
＋　Ｐｔ５ｃａｔａｎａｙ、　ＮＹ　）によって販売さ
れているスクロースとエピクロルヒドリンとの共重合体
に対する商標）、ポリビニルピロリドンおよび仔牛の胸
腺あるいは鮭の精子等からの変性された異種ＤＮＡから
なる溶液中で進行する。

生起するハイブリッド形成に必要とする試料およびプロ
ーブの鏡開の相補性の度合は、条件の厳密性に依存する
。ハイブリッド形成の度合および特異性は、以下の主要
な条件によりて影響される。

１、核酸調製剤の純度 ２、プローブの塩基組成−すなわち、ＧＣ塩基対はＡ−
ＴまたはＡ＝Ｕ塩基対よりも熱安定性が１　大きい。従
って、Ｇ−Ｃ含量の高いハイブリッド形成は比較的高温
においても安定である。

３、均一な塩基配列の長さ−いかなる短い塩基の配列（
例えば６塩基以下）であっても、多数の核酸に存在する
可能性の度合が高い。従ってこのような短い塩基配列を
含むハイブリッド形成においては特異性はほとんどある
いは全くない。本発明の均一なプローブの配列は、少な
くとも１０塩基、通常は２０塩基以上であって、１００
塩基以上であるのが好ましい。実用的な見地からは、均
一なプローブ配列は３００〜１０００のヌクレオチドと
なることもしばしばである。

４、イオン強度−リアニーリングの速度はインキュベー
ション溶液のイオン強度の増大とともに増大する。ハイ
プリントの熱安定性も増大する。

５、インキュベーシヲン温度−所定の二重鎖に対する融
解温度（Ｔｍ　）よ、りも低い約２５〜３０℃の温度で
最適なリニアーリングが起こる。最適温度よりも著しく
低い温度における・インキュベーションにおいては、関
連する塩基配列のハイブリッド形成を起こしにくい。　
。

６、核酸濃度およびインキュベーション時間−通常、ハ
イブリッド形成を′推進するためには、バイブリソ゛ド
形成可能な試料核酸またはプローブ核酸の一方を゛過剰
に、通常は１００倍以上過刺に存在させる。

７、変性試薬−ホルムアルデヒドおよび尿素、のような
水素結合切断試薬が存在するとハイブリッド形成の厳密
性が増大する。

８、インキュベーシヲン時間−インキュベーション時間
が長ければ長い程、ハイブリッド形成は更に完璧になる
。

９、体積排除剤−例えば、デキストランおよび硫酸デキ
ストランのような体積排除剤が存在すると、これによっ
てハイブリッド形成要素の有効濃度が増大し、従□っｔ
ハイブリッド形成速度が増大する。

通常、ハイブリッド形成のために選ばれる温度条件は、
形成されたハイブリッドに対する抗体試薬の結合と標識
の応答の検出と相入れないものである。従って抗体試薬
の結合″工程および標識の検出工程は、ハイブリッド形
成工程の終了後に進行する。反応混合物は、通常、約り
℃〜約４０℃の範囲の温度とし、次いで結合および検・
出工程を行う。塩および／またはホルムアミドの濃度が
高くて抗体結合反応を著し、く阻害する時には、抗体試
薬を添加するに先立ってハイブリ・ノド形成混合物を゛
希釈するのが望ましい。

ＲＮ、Ａプローブを用いる特別な分析状況においては、
ホスホジエステル結合のアルカリ加水分解またはりポヌ
クレアーゼの存在によりプローブが部分的に減成を受け
ることもある。アルカリ加水分解の場合には、プローブ
がｐＨ約１０以上にならないように加水分解を制御する
ことができ、リボヌクレアーゼの場合には、ドデシル硫
酸ナトリウム、アラリントリカルボン酸、リボヌクレオ
チドバナジル錯体、ヘパリン、ジエチルピロカルボネー
トおよび補乳類源から単離される蛋白質系の阻害剤のよ
うな物質の存在により、リボヌクレアーゼをうまく阻害
することができる。

拭粂糸 本発明は、更に、試薬系即ち所望の分析方法を行うに必
要とされるあらゆる必須要素を含む試薬の組み合わせあ
るいは手段を提供するものである。

この試薬系は試薬の相溶性がある場合には組成物あるい
は混合物として商業的に包装された形態において、試験
装置としであるいはより通常には試験キット即ち１以上
の必要な試薬を保持するための容器、装置などの包装さ
れた組み合わせよりなり、通常分析法を実施するための
文書となった指示書も含めて提供される。本発明の試薬
系はここに記載した各種のハイブリッド形成仕様を実施
するためのあらゆる形態および組成をも含む。

いずれの場合にも、試薬系は、（１）ここで述べたよう
な固定化されたあるいは固定化し得るプローブおよび（
２）抗体試薬からなり、検出可能な化学的な原子団で標
識されているのが好ましい。

本系の・試験キットの形態には、ハイブリッド形成溶液
の成分および試験試料中の二重鎖核酸を単一鎖の形・態
に変換することのできる変性剤等の補助的化学品がある
。試料を処理してそれにより単一鎖の核酸を放出するた
めには、例えばアルカリのような化学的溶解・変性剤が
好ましい。

以下本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明
はこれらの実施例に限定されるものではない。

亥Ｊｉｌｔ引１ 固定化されたＲＮＡプローブを用いて細菌尿を検出する
ためのハイブリッド形成分析法Ａ、ＲＮＡプローブの開
裂 大腸菌（エソシェリヒア・コリ、Ｈｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉ）における蛋白質ＥＦ−Ｔｕをコードするｔ
ｕｆＡジーン（ｇｅｎｅ）の８００塩基対断片をバクテ
リオファージＭｌ　３−１０　（ＡＴＣＣ３９４０３−
１３１＞から誘導した。この断片をＭ１３ｍｐ９の旧ｎ
ｄｌｌＩ部位とＥｃｏ　ＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部
位との間にクローン化した〔ニューイングランド　バイ
オラプス　ベバリー　マサチューセソッ（ＮｅｓＥｎｇ
ｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ＋　Ｂｅｖｅｒｌｙ＋　ＭＡ
）　にのプラスミドをＥ、　Ｃｏｒｉ宿主内でＪＭ１０
３（Δ１ａｃ＋　ｐｒｏ）　。

ｓｕｐ　Ｅ、　ｔｈｉ、　ｓｔｒ＾、　５ｂｃＢ　１５
．　ｈｓｄ　Ｒ４，Ｆ’ｔｒａＤ３６＋ｐｒｏＡＢｌａ
ｃ　ＩｑＺＭ１５に成長させた。ｔｕｆ　Ａ断片をＭｌ
　３−１０から切採し、プロメガ・バイオチク・マジス
ン　ライスコンシン（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ、
。

Ｍａｄｉｓｏｎ＋旧）から入手できるＰＳｐ６４プラス
ミドベクターの旧ｎｄｌｌｌおよびＥｃｏ　Ｒ１部位に
クローン化した。

ｔｕｆ＾断片を含むｐＳＰ６４プラスミドを有する、−
晩培養したＥ、Ｃｏｒｉ　ＪＭ１０３　１５ｍｌを２１
のフラスコ内のｌＥの２ＸＹＴブロスに接種した。

培養は、３７℃で３時間行い、細胞を採取した。

これら細胞を溶解させ、ＤＮＡをフェノール／クロロホ
ルム抽出液で単離した。閉環したプラスミドＤＮＡを塩
化セシウム−臭化エチジウム勾配中遠心分離により精製
した〔マニアティス・ティー。

フリソシュ・イー・エフおよびサンプルツク・ジェイ　
（Ｍａｎｉａｔｉｓ、ｒ、ｌ　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ
、ａｎｄ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ。

Ｊ、）９モルキュラー・クローニング、コールドスプリ
ングハーバ−ラボラトリ−（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣＩｏ
ｎｉｎｇ＋　Ｇｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　
、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　＋　コールドスプリングハ
ーバ−ニューヨーク（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ
ｏｒ、ＮＹ　）　（１９Ｂ２）　）　。

精製したプラスミドを０．１Ｍ　、ＮａＣｌおよびｉｏ
＋ＭＥＤＴＡを含むｐＨ７，５のＴｒｉｓ−塩酸塩緩衝
液１゜ｍＭ中中ソファデックスジー５０　（Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘＧ　−５０）〔ファルマシア　ファイン　ケミカ
ルズ　ピスカ夕つエイ、ニューシャーシー（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ　ＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｐｉｓｃａ
ｔａｗａｙ、　ＮＪ）　）でクロマトグラフィーにより
分離した。Ｄ、ＮＡを含む溶出液を集め、冷エタノール
で沈澱させた。沈澱物を１０ｍＭのＮａＣ１，１０ｍ　
ＭのＭｇＣ１，および１ｍＭのジチオスライトールに溶
かし、１ＭｇのＤＮＡ当たり１単位のＥｃｏＲＩで１時
間消化（ｄｉｇｅｓｔ）させた。次いで、反応混合物°
をフェノール／クロロホルムで一回、クロロホルムで一
回抽出してＤＮＡを冷エタノールで沈澱させた。沈澱物
をｐＨ７，４のＴｒｉｓ　−塩酸塩緩衝液１０ｍＭに溶
解させると、ＤＮＡ５００μｇ／ｍｌが得られた。

以下の組成を有する反応混合物５ｏｏμｌが調製された
。ＥｃｏＲＩダイジェスト’５０＃　ｇ　；　ｐＨ７，
５のＴｒｉｓ−塩酸塩緩衝液４０　ｍＭ　；　ＭｇＣ１
ｚ　６　ｍＭ　；スペルミン２ｍＭ；ＡＴＰ、ＣＴＰお
よびＧＴＰＯ，５ｍＭＢジチオスライトール１０ｍ　Ｍ
　；　ＲＮａ５ｉｎ〔プロメガ　バイオチク（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）　）　５００単位およびバクテ
リオファージ５Ｐ６（プロメガバイオチク（Ｐｒｏｍｅ
ｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）　）からのＲＮＡポ＝ リフラーゼ５０単位。反応混合物を室温で１時間放置し
、次にＲＮＡポリメラーゼ５０単位を加えて、更に１時
間反応させた。

反応混合物中のＤＮＡをＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓ
ｅ　１０１１　ｇにより３７℃で１０分間で消化シタ。

反応混合物をフェノール／クロロホルムで抽出し、０．
１ＭのＮａＣ１を含むｐＨ７，４のＴｒｉｓ−塩酸塩緩
衝液１０ｍ　Ｍ中セファデックスジー５０　（Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘＧ’−５０）上でクロマトグラフィーにより分
離した。ＲＮＡを集め、冷エタノールで沈澱させた。

沈澱物を１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＨ５，０の酢酸ナト
リウム緩衝液５０ｍＭに熔解させた。

アキュレート　ケミカル　アンド　サイ′エンティフィ
ック　コーポレーション、ウェストバリーニューヨーク
（＾ｃｃｕｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　５ｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏｒｐ、、　Ｗｅｓｔｂｕｒｙ、　
ＮＹ）製の商標名ニーパージット　シー（Ｅｕｐｅｒｇ
ｉｔ　Ｃ）の下入手できる、反応性のエポキシド基を有
するアクリル系のビーズに上述したＲＮＡプローブを固
定化させた。２５０μｇのＲＮＡプローブを含むｐＨ４
，５の酢酸ナトリウム５０ｍ　Ｍ　３　ｍ　ｊ！をニー
パージット　シー（ＥｕｐｅｒｇｉｔＣ）　２００　ｍ
　ｇと室温で１０時間振盪した。緩衝液を除去し、生じ
た固定化量を測定するためにＲＮＡを分析した。

次いで、１．２ＭのＮａＣ１，０，５％（Ｗ／Ｖ　）の
ドデシル硫酸ナトリウム、１ｍｇ／ｍｌのポリビニルピ
ロリドンおよび５ｍｇ／ｍｌの仔牛血清アルブミンを含
むｐＨ６，５の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液１ｍｌ
と少し振盪することにより樹脂を洗浄した。このハイブ
リッド形成溶液を除去し、１ｍｌの新たなハイブリッド
形成溶液で置換し、懸濁液を６５℃で１時間インキュベ
ートして、非共有結合で結合したＲＮＡを除去した。溶
液を除去し、樹脂−ＲＮＡプローブ複合体をハイブリッ
ド形成溶液５０ｍＡ’に懸濁させた。

Ｂ、メチル化したチログロブリンの調製仔牛のチログロ
ブリン〔シグマ　ケミカル　カンパニー　セントルイス
　ミズリー（Ｓｉｇｍａ　ｃｈｅｍｉ−ｃａｌ　Ｃｏ、
、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ’　ＭＯ）　）　１００ｍｇを
無水メタノール１０ｍｌ！、およびＩＣＩ　２．５５　
Ｍメタノール溶液４００μβと合わせた。この混合物庖
ロータリーミキサーにより室温で５日間攪拌した。沈澱
物を遠心分離により集め、メタノールで二面、エタノー
ルで二面洗浄した。次いで減圧下で一晩乾燥した。約８
２ｍｇの乾燥粉末ケ得られた。

Ｃ，ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドに対する抗体の調製 中歪（Ｎａｋａｚｔｏ　）　（バイオケム（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、）　１９７２８３５　（１９８０’）　）により
記載されているようにφ×１７４ピリオンＤＮＡをＲＮ
Ａポリメラーゼで複写することによりＤＮＡ　−ＲＮＡ
ハイブリッドを調製した。１ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ
１，４の２０ｍＭ　７ｒｉｓ−塩酸塩緩衝液２５０μβ
中のハイブリッド１５　Ｑｍｇを水２５０μ！中のメチ
ル化された千ログロブリン１５０μｇと合わせた。沈澱
物が生じるが、これをＴｒｉｓ−緩衝液中に懸濁させた
。この混合物を等量のフロイント・アジュバントで乳化
した。この懸濁液０．５ｍ　ｌで複数匹のマウスをそれ
ぞれ免疫化し、生じるＲＮＡ　−ＤＮＡに対する血清抗
体力価が高くなったとき、ハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉ
ｄｏｍａ　）を調製し、ＲＮＡ　・ＤＮＡに対して特異
的なモノクロナール抗体をスフ−リングした〔スチュア
ートら（Ｓｔｕ’ａｒｔ　ｅｔ　ａｌ）（１９８１）プ
ロセ・ナトル・アカデ・サイ　ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　７８＋　
３７５１＋ガルフリおよびミルシュタイン（Ｇａｌｆｒ
ｅ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　）（１９８１）メソ　
イン　エンサイモル（Ｍｅｔｈ、　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ
、’＞　７３．１）。

クローニングされたハイブリドーマは、マウスの腹腔内
で増殖され、多量の抗体を産生じた。

０．１５ＭのＮａＣ！を含むｐＨ８，０めＴｒｉｓ−塩
酸塩緩衝液１０ｍＭと平衡なアフィゲル−ブルー（＾ｆ
ｆｉｇｅｌ−Ｂｌｕｅ）樹脂〔ハイオラソド　ラボラド
リース、リッチセント　パージニア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＶＡ）　）のカラムに腹水液を通
した。このクロマトグラフィーによりアルブミンが除去
され、抗体を含む溶離された蛋白質がＤＥＡＥ−セファ
ロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　）　（ファルマシア　フ
ァインケミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ）　）上で分離された。ｐＨ８，０の
Ｔｒｉｓ−塩酸塩緩衝液１０ｍＭから２００ｍＭのＮａ
Ｃｌを含むｐＨ８，’０のＴｒｉｓ　−塩酸塩緩衝液１
０ｍＭまでの直線勾配法によりクロマトグラフィーを行
った。溶離された蛋白質の主要なピークは、トランスフ
ェリンおよびアルブミンを含まないモノクロナール抗体
を含有していた。

Ｄ、β−ガラクトシダーゼ−抗体複合体の調製β−ガラ
クトシダーゼのスルフヒドリル残基は、ジチオスライト
ールを用いる還元により顕在せしめた。Ｏ，’０９Ｍ　
ＮａＣ１を含むｐｎ　’７．０（７）　０．１ＭのＮ−
２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ’−２−エタン
スルホネートの２　ｍ　ｅ中のβ−ガラクトシダーゼ（
３０，０００単位、グレード■、シグマ　ケミ、　（３
（ＬＯＯＯｕｎｉｔｓ、ｇｒａｄｅ■＋　Ｓｉｇｍａ　
Ｃｈｅｍｉｃａｌ”Ｃｏ、＋Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ＋　、
ＭＯ）　）をグチオスライトール３．５μ台と合わせ、
室温で４時間放置した。上述した緩衝液中セファロース
６ビーシー１　（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６ＢＣＩ）　（
ファルマシー　ファイン　ケミカルズ（ＰｈａｒｌＩｌ
ａｃｉｅ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍ’１ｃａｌｓ）　）の２
．−５　Ｘ　８０ｃｍの　。

カラムを用いたクロマトグラフィーによりジチオスライ
トールを除去した。蛋白質を含む留分を合わせてプール
した。酵素１モル当たりのスルフヒドリル基のモル数を
エルマン（Ｅｌｌｍａｎ）の方法により測定した〔エル
マン（Ｅｌｌｍａｎ）　（１９５９）アーク・バイオケ
ム・バイオフィＤ　（Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、）　８２．７０　〕。

〕スクシンイミジルー４−Ｎ−マレイミドメチル）シク
ロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）（ピア
ス　ケミカル　カンパニーロックフォード　イリノイ（
Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ。

Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬ）　）　５．３ｍｇを無水の
Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド２５０μｐに溶解し、こ
の一部分４０μ６をＯ，’１５ＭのＮａＣ１を含むｐＨ
７，０の０．ＩＭＨＥＰＥＳ緩衝液３ｍ６に加えた。こ
の反応混合物を室温で１５分間放置し１、エールマン（
Ｅｌｌｍａｎ）の方法により未反応のグルタチオンを測
定した。

ＤＮＡ　−ＲＮＡに対するモノクロナール抗体を４０９
フィクロモル（μｍｏｌ　）、のＳＭＣＣと合わせたと
ころ、最終体積５３３μｌのＩ−ＩＥ、ＰＥ５１０．１
５Ｍ　ＮａＣｌ緩衝液となったが、これを、３０℃で１
時間反応させた。バイオゲル　ピー２　（Ｂｉｏｇｅｌ
Ｐ−２）樹脂（バイオ−ラッド　ラポラトリーズリソチ
モンＦ　カリファルニア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏ　
−ｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ＋　ＣＡ）　
）のｌＸ２４ｃｍカラムで反応混合物をクロマトグラフ
ィーにより分離し、ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ　１０．１５Ｍ　
ＮａＣｌ緩衝液で溶離した。蛋白質を含む溶出液を集め
、蛋白質濃度をセドマ・７り（Ｓｅｄｍａｃｋ　）とグ
ロスバーブ（Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇ　）との方法〔アナリ
・バイオケム（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）７９、
！５４４　（，１９７７）　）により測定し、マレイミ
ド基の数を上述したようなグルタチオンを用いる滴定に
より測定した。

抗体−マレイミド付加体の２．８ｍｇをとり、ジチオス
ライ（−ル処理したβ−ガラクトシダーゼ１０ｍｇと合
わせ、室温で４時間反応させた。４℃のＨＥ　Ｐ　Ｅ　
Ｓ　１０．１５Ｍ　ＮａＣｌ中セファロース　６ビーシ
ー１　（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂ　ＣＩ　）の２．５
Ｘ　８０ｃｍのカラムを用いて４℃で反応混合物をクロ
マトグラフィーにより分離した。流速を４ｍｌ／時間と
し３ｍ１の留分を集めた。各留分につきβ−ガラクトシ
ダーゼ活性および抗体結合活性を分析した。再活性を有
する留分を集めた。

Ｅ、ハイブリッド形成分析法 尿路感染症の患者の尿の一部分１０ｍ１をｉｏ、ｏｏｏ
ｘｇで１０分間遠心分離し、上澄をデカンアークョシし
て廃棄した。２０ｍｇ／ｍｌの卵白リゾチーム〔シグマ
ケミカル　カンパニー　セントルイスミズリー　（Ｓｉ
ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、ＳＬ、Ｌｏｕｉｓ
、ＭＯ）、０．１ＭのＮａＣ１および５ｍＭのＥＤＴＡ
を含むｐＨ８，０の１０ｍＭのＴｒｉｓ−塩酸塩緩衝液
ｉ液５０．ｕ＃に沈渣を懸濁させた。室温で３０分間放
置して反応させ、ついでＩＭのＮａＯＨ１０μ℃を加え
、このアルカリ性混合物を室温で１０分間放置して原標
本中の全てのバクテリアに由来するＤＮＡを変性させた
。

前述した樹脂−ＲＮＡ複合体の緩衝懸濁液２５０μｌを
加えて反応混合物を中和した。このハイブリッド形成系
を緩やかに攪拌しながら約６５℃で１５時間インキュベ
ートした。

樹脂−ＲＮＡプローブ複合体を沈降させ、液体をデカン
テーションした。５ｍｇ／ｍｌの仔牛血清を含むｐＨ７
，４の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液０．５ｍ１に二
面懸濁させることにより樹脂を洗浄した。

１０ｍＭのＭｇＣ１；＋　、５ｍｇ／ｍｌの仔牛血清７
／ｌｚブミンおよび０．４μｇ／ｍｌのβ−ガラクトシ
ダーゼ−抗体（抗−ＤＮＡ　−ＲＮＡ）’ｔｒ含ムｐＨ
７，４（７）０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液３００μ
ｌと樹脂を混合した。混合物を室温で１時間緩やかに攪
拌し、０．１％のＴｗｅ、ｅｎ　２−０界面活性剤を含
むｐＨ７，４の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液５ｍｌ
で１分間ずつ二面樹脂を洗浄した。８００μＭの７−β
−ガラクトシル−３−〔６−アミノへキシルカルボキサ
ミドコクマリン〔ウォラーら（Ｗｏｒａｈ　ｅｔ　ａｌ
　）　（１９８１）クラニ・ケム（ＣＩｉｎ、Ｃｈｅｍ
、）　２７　：　６７３）を含むｐｌ　７．４のＯ，１
Ｍリン酸ナトリウム１．Ｏｍｌ中室温し で洗浄した樹脂を３０分分間中かに攪拌した。このイン
キュベーションの終わりに、４００ｎｍの励起光および
４５０ｎｍの発光を用いて溶液の螢光を記録した。

１ｍβ当たり１００，０００以上のバクテリアを含有す
る尿標本で顕色される螢光信号は１ｍβ当たり５．００
０以下のバクテリアを含有する尿標本よりも＋＋ 著しく大きかった。この方法は細菌尿の定量試験として
用いることができる。

実扁輿（ 固定化ＤＮＡプローブを用いるＥ、　Ｃｏｒｉ　２３ｓ
リボゾームＲＮＡに対するハイブリッド形成分析法 Ａ、２３ｓ　ＲＮＡに対するＤＮＡプローブＤＮＡプロ
ーブは、Ｅ、　Ｃｏｒｉ中の２３ｓＲＮＡをコードする
ｒｒｎ　ＤオペロンのＥｃｏＲＩ／　Ｂｇｌｌｌ断片で
あった〔ジンクスーロバートソンら（Ｊｉｎｋｓ　−Ｒ
ｏｂｅｒｔｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ　）　（１９Ｂ３）セル
（Ｃｅ１１．　）　３３　：８６５〕。本プローブは、
３゛　−ヒドロキシルカラの２３ｓ　ＲＮ　Ａ配列の約
２／３を含み、Ｍ１３ウィルスベクターでクローン化さ
れ、細胞リボゾームＲＮＡと相補性のある単一鎖ビリオ
ンＤＮＡを生成した。Ｍ１３ウィルスをＥ、　Ｃｏｒｉ
系統ＪＭ１０３（Ｅ　、　Ｃｏｒｉ　５ｔｒａｉｎ　Ｊ
　Ｍ　１０３）中で成長させ、ポリエ“チレングリコー
ルで沈澱させることにより培養溶媒から単離した。ピリ
オンＤＮＡをフェノール抽出によりウィルス粒子から精
製した〔マニアテイスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　ｅｔ　
ａｌ　）　、スプラ（ｓｕｐｒａ　）　）。

精製したＤＮＡをＮａＯＨ中０．３Ｍとし、３・７℃で
４時間インキュベートして夾雑するＲＮＡを減成しん。

混合物は、３０％酢酸を加えて中和し、ＤＮＡを冷エタ
ノールで沈澱させた。

Ｂ、ＤＮＡ−ＲＮＡに対する抗体 実施例１に記載したようにマウスをＤＮＡ・ＲＮ八へイ
ブリッドで免疫化し、牌細胞をＳＦ３　／　Ｏ−Ａｇ　
１４骨髄種細胞〔アメリカンタイプカルチャーコレクシ
ョン、ロックビル　メリーランド（Ａｍｅｒｉｃａｎ　
Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌ、　ＭＤ）から入手できる〕と融合さ
せた。

ＤＮＡ　−ＲＮＡに対して特異的な抗体を分泌するハイ
ブリドーマが上述したように単離された。最も好ましい
ハイブリドーマは、ＡＴＣＣＨＢ８７３０のような〔ア
メリカンタイプカルチャーコレクション、′ロックビル
　メリーランド（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔ
ｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌ、
　ＭＤ）に寄託されたハイブリドーマであった。

０１〜１０インチグレーターを備えたＬＤＣ／Ｍｉｌｔ
ｏｎ　Ｒｏｙ液体クロマトグラフを用いた高速液体クロ
マトグラフィ＝（Ｈ’ＰＬＣ）により腹水液から抗体を
精製した。腹水液をｐＨ６，８のリン酸カリウム０．Ｏ
ＩＭで透析し、遠心分離して微粒子物質を除去し、０．
２２μｍのニトロセルロースフィルターで濾過した。処
理した腹′水液の１〜２ｍｌをｐＨ６，８４のリン酸カ
リウム０．０１Ｍと平衡化した１０　Ｘ　２５０ｍｍの
陰イオン交換カラムに通した。ｐＨ６，８４の０．ＯＩ
Ｍリン酸カリウム〜ｐＨ６，４０の０．０８５Ｍリン酸
カリウム緩衝液を用い、流速１ｍｌ／ｍｉｎ　６０分間
の直線勾配法でクロマトグラフィーを行った。ＩｇＧを
含むピークを濃縮し、ＰＨ７，４のリン酸中１￥Ｎｋ塩
水で透析し、遠心分離することにより変性蛋白質を全７
！ｔ　去Ｌ　タｌ＆、Ｅ’−”１＝　１．４０ヲ用イア
２８０ｎｍの吸収を基にＩｇＧ濃度を測定した。

Ｃ，ＤＮＡプローブの固定化 セルロース粉末にｍ−ニトロフェニル基を導入し、次い
でＤＮＡを共有結合で固定化するためにジアゾニウム塩
に変換した。

１＝（（ｍ−二トロベンジルオキシ）メチル〕ピリジニ
ウム・クロリドはルドリソチ　ケミカル　カンパニー、
ミルウォーキー　ライスコンシン（＾１ｄｒｉｃｈ　Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、＋　Ｍｉｌｅｖａｕｋｅｅ、　
Ｍｌ　）　）を水７．７＋＋＋１中で酢酸ナトリウム１
２８ｗ＋ｇと混合した。シグマセルタイプ２ｏセルロー
ス（Ｓｉｇ＋＋＋ａｃｅｌ　１ｔｙｐｅ　２０５ｅｌｌ
ｕｌｏｓｅ　）　（シグマケミカルカンパニー（Ｓｉｇ
ｎ＋ａ　Ｃｈｅｓｉｃａｌ　Ｃｏ、）　）　２　ｇを添
加し、６０’ｃの水浴に浸したビーカー中で約１５分間
混合した。

セルロースをほぼ乾燥させ、更に１３５〜１４０℃のオ
ーブン中に４５分間いれた。この間、できる蒙り高温に
保持する程、ｍ−ニトロフェニル基がうまく包含せしめ
られた。温度が高すぎると〜　セルロースがカルモル化
した。

焼成工程後、セルロースを水に懸濁させ、粒子が１５μ
ｍの篩を通るまで水中のセルロースをこすって塊を砕い
た。セルロースを一回１２０ｍ１の水で三度、−回５０
＋ｗｌのエタノールで二度洗浄した。次いで一晩減圧下
で乾燥した。

２．０ｇのナトリウムジチオナイトを含む０．１ＭのＮ
ａ２Ｃｏ！　１０ｗｌ中６５℃で１時間インキュベート
することによりセルロースのニトロフェニル基ヲ還元し
た。次いでセルロースをガラス濾過器上水そ数回、３０
％酢酸で一回洗浄した。最終的にセルロースを水で更に
三面洗浄し、４０〜５０℃、減圧下で一晩乾燥した。

還元したセルロース２５０ｍｇを０℃で１．２ＭＨＣＬ
　５．Ｏ＋ｗｌに添加し、１００ｍｇ　／ｍｌのＮａＮ
Ｏ２１３μｍを添加した。この混合物を１．０時間放置
し、この間混合物につきＮａＮＯ２の存在を澱粉−ロー
ド試験紙で試験した。試験結果が弱いか陰性であれば、
ＮａＮＯ２２０，ｕ　ｌを添加シタ。

反応期間が終了した時点で、セルロースを冷ガラス濾過
器上まず冷水（０℃）３０〜５０．ｍｊ！で、次に１０
ｍＭの冷尿素１０〜１５１で、更に冷水で、そして最終
的にｐＨ４，０の０．２Ｍ冷酢酸ナトリウム約１ＯＬＩ
ｌｌで連続的に洗浄した。ＤＮＡプローブ６９μｇを含
有するｐＨ４，０の０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液０．
９２＋＋＋１を含むフラスコにセルロースを迅速に移し
た。

混合物を０〜４℃で１５時間振盪し、次いでガラス濾過
器上１　ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅ　（０，１８１１７１１７
）ＮａＣ１，１ｍＭ（７）ＥＤＴＡを含むｐＨ７，８の
リン酸ナトリウム緩衝液２０＋ｍＭ）、０．１％ドデシ
）Ｌｔ硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で洗浄した。ホルＡ７
　ミＦ　２．Ｏｎ＋１．２０ｘ　Ｓ、Ｓ　Ｐ　Ｅｌ、５
ｍｌ　、　１０ｍｇ／ｓ＋１の仔牛血清アルブミン、１
１０５ａ／ｍｌのＦｉｃｏｌｌ、１０ｍｇ／ｍｌのピロ
リドン０．３ｍｌ。

１０％（Ｗ／Ｖ　）　（ＤＳＤＳ　０．０３ｍ１　、４
．２５ｍｇ／ｍｌの鮭の精子０．１４０ｍ１をそれぞれ
含有するハイブリッド形成溶液中でセルロースを５５℃
で４時間インキュベートした。使用に先立ち、鮭の精子
のＤＮＡを０．３ＭのＮａＯＨ中３７℃で１７時間イン
キュベートし、３０％酢酸で中和し、冷エタノール（−
１５℃）で沈澱させることにより集めた。

５５℃でのインキュベーションに続き、０．１％のＳＤ
Ｓを含むｌＸ５ＳＰＥ約１０＋＋＋１ずつで二度セルロ
ースを洗浄した。゛セルロースをハイブリッド形成溶液
５．０＋＊ｌに再度懸濁させ、スラリー状の部分標本０
．２ｍｌをハイブリッド形成用の反応管に投じた。

Ｄ、２３ｓリボゾームＲＮＡの調製 リボゾームＲＮＡをＥ、　Ｃｏｒｉから調製し、スクロ
ース−密度勾配遠心分離により２３ｓ成分を単離した〔
タカナミ・エム（Ｔａｋａｎａｍｉ、Ｍ、　）　、（１
９６７）メソ・エンサイモル゛（Ｍｅｔｈ、　Ｅｆｉｚ
ｙｍｏｌ、）　、　１２Ａ　：４９１；マツコンキー・
イー・エイチ（ＭｃＣｏｎｋｅｙ＋Ｅ、Ｈ，）　（１９
６７、）メソ・エンサイモル（Ｍｅｔｈ。

Ｅｎｚｙｍｏｌ、）　、１２　Ａ　：　６２０　）。

Ｅ、２３ｓＲＮＡに対するハイブリッド形成分析法 固定化されたＤＮＡプローブを有するセルロースを含む
反応管からハイブリッド形成溶液を吸引した。次いで、
２３　ｓ　ＲＮＡ　１０ｎｇ　／＋＋＋１を含むハイブ
リッド形成溶液１００μｌを個々の反応管に添加し、こ
れらを指示された期間５５℃でインキュベートした。イ
ンキュベージジンが終了したら、ハイブリッド形成溶液
を除去し、０．１％のＳＤＳを含むｌ　ｘｓｓＰＥ　Ｏ
，５ｍｌでセルロースを洗浄し、０．１％のＳＤＳを含
む１　ｘｓｓＰＥ　Ｏ，５ｍｌ中５５℃で３０分間イン
キュベートし、０．１％のＳＤＳを含む１　ｘｓｓＰＥ
　Ｏ，５ｍｌで一回洗浄した。

形成されたＤＮＡ　−ＲＮＡの量を免疫分析（ｉｍ−ｍ
ｕｎｏａｓｓａｙ　）により測定した。０．１５ＭのＮ
ａＣ１，１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％（Ｖ／Ｖ　）　の
Ｔｗｅｅｎ　２０および５．０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含
むｐＨ７，４の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液５０μ
Ｅを個々の反応管のセルロースに加え、室温で３０分間
振盪した。

ついで、ＤＮＡ　−ＲＮＡに対する抗体１．０Ｍｇを含
む、この溶液１００ｐ＃を個々の反応管に加え、３０分
間振盪を続けた。吸引により液体を除去し、５ｍＭのＭ
ｇＣｌ２．０．５％のＴｗｅｅｎ　−２０及び５．０ｍ
ｇ／ｍ１の仔牛血清（Ｔｒｉｓ／ＭｇＣｌ２／Ｔｅｖｅ
ｅｎ　／ｊｓＡ　）を含むｐＨ８，０の０．１ＭＴｒｉ
ｓ−塩酸塩緩衝液各０．５’　ｍｌでセルロースを４回
洗浄した。次いで、アルカリ性ホスファターゼで標識し
た抗マウ、スＩｇＧ　（シグマ　ケミカル　カンパニー
（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ＋＋＋１ｃａｌＣｏ−、））１５
０μ＃を（Ｔｒｉｓ／ＭｇＣｌ２／Ｔｗｅｅｎ　／ＢＳ
Ａ　）中で２００倍に希釈して個々の反応管に加え、室
温で１．０時間振盪した。

０．５ＭのＮａＣｌを含むＴｒｉｓ／ＭｇＣｌ２／Ｔｗ
ｅｅｎ　／ＢＳＡ各０．５ｍｌで個々の分析からのセル
ロースを２度洗浄し、次いでこの緩衝液１４５〜２．０
ｍｌを用い、セルロースを清浄な試験管に移した。緩衝
液を除去し、セルロースに結合されたアルカリ性ホスフ
ァターゼ標識を測定した。

このために、１ｍＭのＭｇＣｈおよび１ｍｇ／ｍｌのｐ
−ニトロフェニルホスフェイトを含むｐＨ９，８の１．
０Ｍジェタノールアミン−ハイドロクロライド緩衝液２
００μｌを加え、２５℃で３０分間インキュベートした
。次いで、０．１ＭのＮａｓ　ＰＯ４１，５ｍｌを添加
することにより酵素触媒反応をクエンチし、４０５ｎｍ
の吸光度を記録した。

結果は以下のとおりであった。

吸光度はハイブリッド形成時間とともに増大し。

このことは形成されるＤＮＡ　−ＲＮＡハイブリ）。

ドの量が増大することを示す。

実隻週１ 固定化し得るＤＮＡプローブを用いる２３ｇリボゾーム
ＲＮＡに対するハイブリッド形成分析法付加したビオチ
ン残基を有する可溶性のＤＮＡプローブで試料ＲＮＡに
ハイブリッドを形成した。

次いで、固定化されたストレプトアビジンを有する固体
の支持体に、ハイブリッド形成したＤＮＡプローブとハ
イブリッド形成しないＤＮＡプローブとを結合させた。

ＤＮＡ　−ＲＮＡに対して酵素で標識した抗体を用いる
免疫分析法により、支持体上のＤＮＡ　−ＲＮＡの量を
測定した。

Ａ、ビオチニル化したプローブＤＮＡ ２３　ｓ　ＲＮＡに対して挿入相補性を有する実施例２
で上述したＭ−１３ウイ、ルスをＥ、　Ｃｏｒｉ系統Ｊ
Ｍ　１０３　（Ｅ、　Ｃｏｒｉ　５ｔｒａｉｎ　ＪＭ　
１０３）中で増殖せしめ、細菌細胞を採取してウィルス
性のＤＮＡの複製形を単離した。塩化セシウム−臭化エ
チジウム密度勾配遠心分離に杢りこの二重鎖ＤＮＡを精
製した〔マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ＋ｅｔａｌ
＋　）スプラ（ｓｕｐｒａ　）　）。

エンゾ　バイオケム　インコーホレイテッド。

−−ｓ−ヨーク（Ｈｎｚｏ　Ｂｉｏｃｈｅ＋ｓ、　Ｉｎ
ｃ、、　ＮＹ）により入手できるビオチニル化したｄＵ
ＴＰを用いニックトランスレーション（ｎｉｃｋ　ｔｒ
ａｎｓｌａｔｉｏｎ）により、ビオチン残基をこの二重
鎖ＤＮＡに導入した〔ランガー・ピー・アールら（Ｌａ
ｎｇｅｒ、　Ｐ、Ｒ，ｅｔａｌ）　（１’９８１）プロ
ス・ナッル・アヵデ・サイ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾
ｃａｄ、ｓｃｉ、　）　、　７８　：　６６３３　；リ
アリー・ジェイ・ジェイら（Ｌｅａｒｙ、　Ｊ、Ｊ、ｅ
ｔ　ａｌ）（１９８３）プロス・ナッル・アカデーサイ
（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ　）　、８０　：　４０
４５）。

実施例２に記載したようにアルカリ処理により夾雑する
ＲＮＡを減成した。使用する直前に、溶液を沸騰水浴に
４分間置くことによりビオチニル化したプローブを変性
した。

Ｂ、ストレプトアビジンの固定化 グルタルアルデヒドで活性化したアクリルアミド−アガ
ロース支持体であるアクト−ウルトロゲルＡｃＡ２２　
（＾ａｔ−１ｌｌｔｒｏｇｅｌ　ＲＡｃＡ　２２　）　
（エルケイビー　インスツルメント　インコーポレイテ
・７ド　ガイザープルグ　メリーランド（ＬＫ’Ｂ　Ｉ
ｎｓｔｒｕ−ｍｅｎｔｓ＋　Ｉｎｃ、＋　Ｇａｉｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ　）から入手できる〕上にストレプ
トアビジン〔カルバイオケムーベーリング・コーポレー
ション　ラ　ジョラ　カリフォルニア（Ｃａｌｂｉｏｃ
ｈｅｍ−Ｂｅｈｖｉｎｇ　Ｃｏｒｐ、。

Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）　）を固定化した。製造者の
指示に従い、固定化したところ、充填されたアクトーウ
ルト６ゲ７ｔｚＡｃ　Ａ２２　（＾ｃｔ−Ｕｌｔｒｏｇ
ｅｌ　Ａｃへ２２　＞　１０μｐ当たりほぼ６．５μｇ
のストレプトアビジンが得られた。

Ｃ，ハイブリッド形成分析 ゛細菌感染症の疑いのある尿の部分標本２ｎ＋１を３０
００Ｘｇで遠：Ｃ，・分離し、バクテリアを沈渣させ、
上澄をデカンテーションした。実施例２に記載した９０
μｌのハイブリッド形成溶液を菌糸塊（ｐｅｌｌｅｔ）
毎に加え、ビオチニル化したプローブ（０，５ｍＭのＥ
ＤＴＡを含むｐＨ７，０の２０ｍＭリン酸ナトリ′ウム
緩衝液中０．５μｇ／ｍｌの濃度で）を加えた。混合物
を攪拌して菌糸塊が存在すればこれを懸濁させ、これら
を５５℃で４．０時間インキュベートした。

次いで、仔牛血清５．０ｍｇと固定化されたストレプト
アビジンを有するウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ）５
０μｌとを含むｐＨ７，４の２０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液７００μｌを各混合物に加えてハイブリッド形成
溶液を希釈し、ビオチニル化したプローブを固定化した
。混合物を室温で２時間振盪し、支持体から液体を除い
た。

セルロース支持体に対して実施例２で記載したように、
免疫分析法によりウルトロゲル（’［１ｔｒｏｇｅｌ　
）支持体に会合したＤＮＡ　−ＲＮＡハイブリッドの量
を測定した。

−比較するために、マンコンキーおよび血液寒天培地（
ＭｃＣｏｎｋｅｙ　ａｎｄ’　ａｇａｒｐｌａｔｅｓ　
）を用い、１μｇのループ培養法”’（ｌｏｏｐ　ｃｕ
ｌｔｕｒｅ　ｍｅｔｈｏｄ　）により未処理の尿につＧ
）でバクテリアを試験した。

培地を３７℃で３６時ｉ培養し、コロニーを数えた。

培養法によるバクテリアの量の多い尿はハイブリッド形
成分析法により吸光度が大きかった。

以上、本発明の詳細な説明し例示した。明らかに、本発
明の趣旨及び範囲から離れることなく種々の変形及び変
法が荀能である。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図は、本発明を実施するための好まし
い方法の概略説明図である。 ＊ ＦＩＧ、１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、′単一鎖の核酸を含む試験媒体中の特定のポリヌク
   レオチドｉ己列を測定讐るための方法であって、（ａ）
   測定さるべき配列と相補的なプローブとのハイブリッド
   形成に好適な条件下で、決定さるべき配列と実質上相補
   めであり、　□ ′（ｉ）測定さるべき゛配列がＲＮＡまたはＤＮＡであ
   る場合に、実質上ＲＮＡからなり、または（ｉｉ　）測
   定さるべき鹸列が、ＲＮＡである場合に、実質上ＤＮＡ
   またはＲＮＡからなる、 少ｆＬ　くとも一本の単一鎖塩基配列を有する固定化ロ
   ーブと、試験媒体とを合わせる工程と、　“（ｂ）固定
   化し得る形で与えられた場合にプ占ニブを固定化し、測
   定さるべき配列と相−的なプローブ配列との間に形成さ
   れたＤＮＡ　−＊ＮＡまたはＲＮＡ・−ＲＮＡ二重鎖と
   結合可能な抗体試革を添加するこぶによりｉ盛されたハ
   イブリ・ノドを検出し、このような二重鎖雄結合された
   抗体試薬±測定する工程とからなる方法。 ２、前艷埠体試薬が検中可能な化学的な原子団で１ 標識されている特許請求の範囲第１項記載の方持。 ３、前記プローブを曹記竺験媒体と接触させる際に、前
   記プローブが一花仝れた形である特許請求の範囲町項記
   載の方法！ ４、前記プローブが、特異な結合部位を有し、しかもこ
   の結＊蔀位に対亥る峙合相手の固定化された形と接触さ
   せることにより固定化し得る特許請求の範囲第１項記載
   の方Φ、。、　。 ５、前記プローブを前記試験媒体と接触させる−に、晶
   、記プローブが可溶彫工あり１．シかも二重鎖核酸を吸
   着する吸着剤と接触させる。；、、Ｈにより前記測定さ
   るべき配列とハイブリッド形成させる際に・−のプ°−
   ブを固、定化し得る特許請求の範−第１項記載の方法。 ６、前記試験媒体が、存在する核酸を放出しかつ変性す
   る条件下におかれた生物学的試料からなる特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ７、単一鎖の核酸を含む試験媒体中の特定のポリヌクレ
   オチド配列を測定するための核酸ハイブリッド形成方法
   であって、 （ａ）測定さるべき配列と相補的なプローブ配列とのハ
   イブリッド形成に好適な条件下で、測定さるべき配列と
   実質上相補的であり、 （ｉ）測定さるべき配列がＲＮＡまたはＤＮＡである場
   合に、実質上ＲＮＡからなり、または（ｉｉ　）測定さ
   るべき配列がＲＮＡである場合に、実質上ＤＮＡまたは
   ＲＮＡからなる、 少なくとも一本の単−鎮塩基配列を有し、固定化された
   形であるか、または、結合相手の固定化された形との接
   触によりプローブを甲定化しうる特異な結合部位、を有
   するポリヌクレオチドプローブと試験媒体とを合わせる
   工程と、 （ｂ）プローブが前記固定化し得る形である場合、　に
   、生成した反応混合物を固定化された相手と接触させる
   工程と、 （Ｃ）測定さるべき配列と相補的なプローブ配列との間
   に形成きれたＤＮＡ　−ＲＮＡまたはＲＮＡ・臀〒Ａ二
   重鎮に対して結合性を有する抗体を添加し、かかる二重
   鎖と結合した抗体試薬を測定することにより、生成する
   固定化されハイブリッドを形成したプローブを検出する
   工程と、からなる方法。 ８、工程（ｃ）に先立ち、前記試験媒体から生成する固
   定化されハイブリッドを形成した核酸を前記反応混合物
   の残部から分離する特許請求の範囲第７項記載の方法。 ９、前記抗体試薬が検出可能な化学的な原子団で標識さ
   れている特許請求の範囲第７項記載の方法。 １０、前記検出可能な化学的な原子団が、酵素学的に活
   性な原子団、螢光体、発色団、発光体、特異な結合性を
   有する配位子または放射性同位元素である特許請求の範
   囲第９項記載の方法。 １１、前記検出可能な原子団が酵素である特許請求の範
   囲第９項記載の方法。 １２・前記０重鎖２結合ｂｈ＠織抗体試薬４結合　）し
   りかった抗体試薬から分離し、分離した画分の一方につ
   き検出可能な化学的な原子団を測定する特許請求の範囲
   第９項記載の方法。 １３、前記プローブが固体の卑持体に固定されるごとに
   より固定化された特許請求の範囲竿７項記１４１．前記
   プローブが固定化し得る形であり、かつ、その結合部位
   が特異的に一合可能な配位子部分である特許請求の範囲
   第７項記載の方法。 １５、前記配位子がビオチンまたはハプテンであり、か
   つ、それに対する前ｉ結合相手が、それぞれ、アビジン
   または抗−ハブテン抗体試薬である特許請求の範囲第１
   ４項記載の方法。 １６、前記測定さる二゛き特定省ポリヌクレオチド配列
   がＲＮＡまたはＤＮＡであり、かつ、前記プローブが実
   質上ＲＮＡから雇るｉ許請求の範囲第７項記載の方法６ １７、前記測定さるべき特定のポリヌクレオチド配列が
   ＲＮＡまたはＤＮＡであり、かつ、前記プローブが実質
   上ＤＮＡからなる特許請求の範囲第７項記載の方法。 １８、核酸のハイブリッド形成により試験媒、体中の特
   定のポリヌクレオチド配列を検出するための試薬系であ
   って、 （１）測定さるべき配列と相補的であり、（ｉ）測定さ
   墨べき配ｊに（ＲＮＡまたはＤＮＡである場合に、壺質
   上ＲＮＡからなり、または（ｉｉ　）測！さるべき配列
   が１．ＲＮＡである場合に、実質上ＤＮＡまたはＲＮＡ
   からなる、 少なくとも一本の単一鎖塩基配列を有する固定化された
   ポリヌクレオチドプローブと、 （２）渕寓さるべき配列と相補的なプローブ配列との間
   に形成されるＤＮＡ　−ＲＮＡまたはＲＮＡ・ＲＮＡ二
   重鎖に対して結合性を有する抗体試薬と、 からなる試薬系。 １９、前記抗体試薬が検出可能な化学的な原子団により
   標識されている特許請求の範囲第１８項記載の試薬系。 ２０、前記検出可能な化学的な原子団が、酵素学的に活
   性な原子団、螢光体、発色団、発光体、特異的に結合し
   得る配位子または放射性同位元素である特許請求の範囲
   第１９項記載の試薬系。 ２１、前記検出可能な化学的な原子団１が酵素である特
   許請求の範囲第１９項記載の試薬系。 ２２、前記プローブが固体の支持体に固定されることに
   より固定化されている特許請求の範囲第１８項記載の試
   薬系。 ２３、核酸のハイプリント形成により試験媒体中の特定
   のポリヌクレオチド配列を検出するための試薬系であっ
   て、 （，１）特定な結合部分と、 測定さるべき配列と相補的であり、 （ｉ）測定さるべき配列がＲＮＡまたはＤＮＡである場
   合に、実質上ＲＮＡからなり、または１（１１）測定さ
   れるべき配列が、ＲＮＡである、場合に、実質上ＤＮＡ
   またはＲＮＡからなる、少なくとも一本の単−鎮塩基配
   列と、 を有するポリヌクレオチドプローブと１、　（２）プロ
   ーブ上の前記結合部位に対する結合相手の固定化された
   形と、 （３）測定さるべき配列と相補的なプローブ配列との間
   に形成されるＤＮＡ　−ＲＮＡまたはＲＮＡ・ＲＮＡ二
   重鎖に対して結合性を有する抗体試薬と、 からなる試薬系。 ２４、前記プローブ配列結合部位が特異的に結合可能な
   配位子部分である特許請求の範囲第２３項記載の試薬系
   。 ２５、前記配位子がビオチンまたはハプテンであり、か
   つ、それに対する前記結合相手が、それぞれ、アビジン
   または抗−ハブテン抗体試薬である特許請求の範囲第２
   ４項記載の試薬系。 ２６、前記抗体試薬が検出可能な化学的な原子団で標識
   されている特許請求の範囲第２３項記載の試薬系。 ２７、前記検出可能な化学的な原子団が酵素学的に活性
   な原子団、螢光体、発色団、発光体、特異的に結合可能
   な配位子または放射性同位元素である特許請求の範囲第
   ２６項記載の試薬系。 ２８、前記検出可能な化学的な原子団が酵素である特許
   請求の範囲第２６項記載の試薬系。