NO844848L - Hybridiseringsanalyse med immobilisering av hybrider ved anti-hybrid binding - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører nukleinsyre hybridiserings-analysemetoder og reagenssystemer for detektering av spesifike polynukleotidesekvenser. Prinsippet for nukleinsyre-hybridiseringsanalyser ble utviklet ved arbeider innen feltet rekombinant DNA som et hjelpemiddel for å bestemme og iso-lere spesielle polynukleotide basesekvenser av interesse.

Det ble funnet at enkeltkjedede nukleinsyrer, f.eks. DNA

og RNA, slik som de oppnås ved denaturering av dobbeltkjedede former, hybridiserer eller rekombinerer under egnede betingelser med komplementære enkeltkjedede nukleinsyrer.

Ved å merke slike komplementære probe nukleinsyrer med en lett detekterbar kjemisk gruppe, gjørs det mulig å detektere nærværet av en hvilken som helst polynukleotidsekvens av interesse i et forsøksmedium som inneholder prøve-nukleinsyrer i enkeltkjedet form.

I tillegg til feltet rekombinant DNA forskning, kan den ana-lyttiske hybridiseringsteknikken anvendes til detektering av polynukleotider av betydning, bl.a. innen feltene human-og veterinærmedisin, jordbruk og næringsmiddelvitenskap. Spesielt kan teknikken anvendes til å detektere og identifi-sere etiologiske agenter som f.eks. bakterier og virus, til å lette diagnosen av genetiske forstyrrelser, som f.eks. sigdcelle-anemi og thalassemia, og til å detektere kreft-celler. En generell forsikt over teknikken og dens nåværende og fremtidige betydning, finnes i Biotechnology (August 1983), side 471-478.

Følgende informasjon tilveiebringes for å gjøre kjent informasjon som antas å ha mulig relevans med hensyn til foreliggende oppfinnelse. Det bør bemerkes at følgende informasjon ikke er ment å utgjøre tidligere teknikk overfor foreliggende oppfinnelse.

Teknikkens stand år det gjelder nukleinsyre hybridiserings-analyseteknikker, innbefatter generelt immobilisering av prøve-nucleinsyren på en fast bærer. Hybridiserin mellom spesielle basesekvenser eller gener av interesse i prøve-nukleinsyrene og en merket form av probe nukleinsyren, bestemmes ved å separere den faste bæreren fra resten av reaksjonsblandingen som inneholder den ubundede, merkede proben, etterfulgt av detektering av merket på den faste bæreren.

Nødvendigheten av å immobilisere prøve-nukleinsyrene for

å utføre hybridiseringsanalysen ifølge teknikkens stand,

gir to betydelige problemer. For det første er fremgangsmåtene som kreves for å oppnå immobilisering generelt tid-krevende, og utgjør et ekstra trinn som er uønsket ved rutinemessig anvendelse av teknikken i et klinisk laboratorium.

For det andre kan proteiner og andre materialer i den hetero-gene prøven, spesielt i tilfelle med kliniske prøver, påvirke immobiliseringen av nukleinsyrene.

Som alternativer til immobilisering av prøve-nukleinsyrer

og tilsats av merket probe, kan man benytte en immobilisert probe og merke prøve-nukleinsyrene in situ, eller man kan benytte en dual hybridiseringsteknikk som krever to prober, hvorav den ene immobiliseres og den andre merkes /Methods in Enzymology 65:468(1968) og Gene 21:77-86(19 83/. Det første alternativet er imidlertid enda mindre ønskelig siden in situ merking av prøvenukleinsyrer krever en høy grad av tekniske ferdigheter som ikke rutinemessig kan forventes hos klinisk teknisk personell og der finnes ingen enkle, pålitelige fremgangsmåter for å styre merkeutbyttet, hvilket kan være et betydelig problem hvis merkemediet inneholder variable mengder av inhibitorer for merkereaksjonen. Den duale hybridiseringsteknikken har den ulempen at den krever en ekstra reagens og et inkubasjonstrinn, og kinetikken for hybridiseringsreaksjonen kan være langsom og ineffektiv.Nøyaktigheten av analysen kan også være variabel dersom kom-plementariteten av de to probene med prøvesekvensen er variabel.

Anvendelsen av immobiliserte RNA prober og deteksjon av resulterende immobiliserte DNA ' RNA eller RNA'RNA hybrider ved hjelp av merkede antistoffer som er selektive for de respektive hybrider, beskrives i US patentsøknad 616,132, inngitt 1. juni 1984. Dette eliminerer nødvendigheten av å immobilisere eller merke prøvenukleinsyrene, imidlertid er probe-kjeden innbefattet i hybridiseringen immobilisert, hvilket kan nedsette hastigheten hvorved proben og sekvensen av interesse kan rekombinere i betydelig grad.

Teknikker for direkte detektering av polynukleotide duplekser dannet som produkter ved hybridisering mellom prøven og probe nukleotidene, hvorved man unngår kjemisk merking og immobilisering av prøve eller probe-nukleotider, har generelt ikke virket tilfredsstillende. Forsøk på å generere antistoffer som selektivt vil binde dobbeltkjedede DNA'DNA hybrider fremfor enkelt-kjedet DNA, har ikke vær vellykket. /Parker og Halloran, "Nucleic Acids in Immunology", red. Plescia og Braun, Springer-Verlag, NY (1969), side 18 et seqV

Man har til en viss grad lykkes med å generere antistoffer som vil binde RNA'DNA-blandede hybrider eller RNA'RNA-hybrider og som har lav affinitet for de enkeltkjedede polynukleotidene /se f.eks. Rudkin og Stollar, Nature 265 : 472 ( 1977 )_/. Metod-ene som er beskrevet krever imidlertid, på samme måte som hybridiseringsteknikkene beskrevet ovenfor hvor det anvendes merkede prober, immobilisering av prøve-nukleinsyrene.

Rudkin og Stollar fikserte hele celler på mikroskopplater

og eksponerte DNA i kjernen. Det ble hybridisert med en RNA-probe og hybridet ble detektert ved fluorescensmikroskopi med fluorescein-merket antistoff til RNA1 DNA.

Tidlige fremgangsmåter for detektering av spesifike DNA-sekvenser var oppløsningsutførelser hvor hybridiseringen innbefattet oppløselige former av både prøve-DNA og en radioaktivt-merket RNA-probe.Hybridet som ble dannet i oppløs-ningen ble isolert ved tetthetsgradient-sentrifugering /Hall og Spiegelmann (1961) Proe.Nati.Acad. Sei. 47:137/. Sen- trifugeringen var for langsom og upraktisk for analyse av et stort antall prøver. Denne oppløsningshybridiserings-fremgangsmåter ble gjort mer anvendelig ved den oppdagelse at nitrocellulosefiltere i sterk grad adsorberer enkeltkjedet DNA sammen med eventuelt hybridisert RNA /Nygaard og Hall (19 64) J. Mol. Biol. 9:125/. Den merkede RNA-proben bindes meget svakt til filterne og fremgangsmåten ble forbedret ved å eksponere filterne for ribonuklease som hydrolyserer den enkeltkjedede proben men ikke RNA<1>DNA hybridet. Fremgangsmåten er begrenset til hybridisering av DNA-prøver med RNA-prober, og nedbrytningen med ribonuklease må kontrolleres nøye; derfor ble hybridiseringsfremgangsmåter i fast. fase viktigere.

Følgelig foreligger det et stort behov for en nukleinsyre-hybridiseringsanalyse som ikke krever immobilisering av hverken probe el]er prøve-nukleinsyrer og som overvinner de be-grensninger som er forbundet med de kjente oppløsnings-hybridiseringsteknikkene. Videre bør en slik teknikk tillate bruk av et antall forskjellige merker, spesielt av ikke-radioisotop type. En nukleinsyre hybridiserings-analysemetode og reagenssystem som har disse og andre fordeler,

er hovedhensikten ved foreliggende oppfinnelse.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en nukleinsyre hybridiseringsanalyse hvor hybridet som dannes mellom den spesielle polynukleotide sekvensen som skal detekteres og en nukleinsyre-probe immobiliseres ved binding til en immobilisert eller immobiliserbar form av en antistoff-reagens som er selektiv forbinding til slike hybrider. Ifølge de foretrukne utførelser, muliggjør dette separasjon av hybridisert og uhybridisert probe dersom er merket probe anvendes, eller separasjons av hybrid-bundet fra fri merket annen antistoff-reagens dersom en merket form av anti-hybridreagens benyttes. Ved foreliggende fremgangsmåte unngås således behovet for immobilisering av enten prøve eller probenukleinsyrer full-stendig, og hybridiseringen kan foregå i oppløsning hvor

hybridiseringshastigheten er rask og mere effektiv.

Generelt innbefatter fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse at en forsøksprøve som inneholder enkeltkjedede nukleinsyrer bringes i kontakt med proben som har en enkelt-kjedet basesekvens som i det vesentlige er komplementær med sekvensen som skal detekteres. Dette hybridiseringstrinnet vil foregå under betingelser som er fordelaktige for hybridisering mellom proben og sekvensen som skal detekteres. De resulterende hybridene kan så detekteres ved tilsats av anti-stof f -reagensen som er selektiv for binding av duplekser som dannes ved hybridisering mellom den komplementære probe-sekvensen og sekvensen som skal detekteres. På dette trinnet av analysen, vil antistoffreagensen normalt være i en immobilisert tilstand, f.eks. kjemisk- eller fysisk bundet til en fast bærer. Alternativt kan anti-hybrider bringes i kontakt med de dannede hybrider i en oppløselig form, og deretter gjøres immobil, f.eks. ved kontakt med en immobilisert form av et antistoff, dyrket mot anti-hybridet eller ved å anvende et ligand-modifisert anti-hybrid og tilsette en immobilisert form av en bindende del for liganden.

De resulterende duplekser som bindes til den immobiliserte antistoff-reagensen kan bestemmes på forskjellige måter. Normalt vil man benytte en merket probe eller en merket form av en annen anti-hybrid reagens. I det første tilfellet, separeres den hybridiserte, merkede proben som blir forbundet med den immobiliserte fasen fra den uhybridiserte proben som blir igjen i oppløsningen, og man måler enten merke forbundet med den immobiliserte fasen eller merke i den gjenvær-ende uhybridiserte proben. Der hvor det anvendes et merket anti-hybrid, separeres det som blir forbundet med den immobiliserte fasen ved binding til dannede hybrider fra det som fremdeles finnes i oppløsningen og en måles enten merke som er blitt forbundet med den immobiliserte fasen, eller merke som gjenstår med ubundet merket anti-hybrid. En rekke forskjellige merker kan benyttes, innbefattet radioaktive merker, og fortrinnsvis ikke-radioisotope merker, som f.eks. enzymer, fluorescerende stoff, ligander o.l.

Foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved en rekke betydelige fordeler.

For det første kan hybridiseringen av prøvenukleinsyrer med en probe utføres i oppløsning hvor reaksjonshastighetene er høyest. Hybridiseringshastighetene i fast fase begrenses typisk ved diffusjon av den merkede proben til prøve-nukleinsyrer immobilisert på den faste overflaten. Denne begrensnin-gen finnes ikke ved hybridisering i oppløsning.

For det andre, er ikke-spesifik binding av en merket probe til den faste fasen som benyttes for å immobilisere prøve-nukleinsyren et problem ved fremgangsmåter i fast fase. Typisk blir prøve-nukleinsyrene adsorbert på en fast fase; derfor må den faste fasen være et stoff som binder nukleinsyrer med høy affinitet, men denne egenskapen blir et problem i det etterfølgende hybridiseringstrinnet hvor ikke-spesifik adsorbsjon av den merkede proben bør være minst mulig. I foreliggende oppfinnelse kan den faste fasen for anti-hybrid immobilisering velges for materialer som ikke adsorberer nukleinsyrer. Videre krever de fleste hybridiseringsmetoder immobilisering av prøvenukleinsyrer ved adsorbsjon til en fast overflate, eller ved kovalent kobling til et fast stoff. Proteiner og andre materialer i prøven påvirker immobiliseringen; derfor må prøven renses ved fremgangsmåter som f.eks. fenolekstraksjon.Foreliggende oppløsnings-hybridiserings-metode immobiliserer hybridene med antistoffer som har høy affinitet og spesifisitet for hybridet, og som ikke er utsatt for påvirkning ved proteiner, karbohydrater og lipider i prøven.

Videre, i tilfeller hvor prøve-nukleinsyrer er immobilisert ved adsorbsjon eller kovalent kobling, finnes det ikke noen hensiktsmessig fremgangsmåte for å sikre at nukleinsyrene immobiliseres i høyt og reproduserbart utbytte. Videre gjør adsorbsjonsprosessen deler av den polynukleotide sekvense utilgjengelig for hybridisering. F.eks. er mindre enn halv-parten av DNA adsorbert på en nitrocellulosemembran tilgjengelig for hybridisering. Dette betyr at deteksjonsgrens-ene for analysen ikke er optimale, og utbyttet av hybrider kan være variabelt. Hybridisering i oppløsning som mulig-gjøres ved foreliggende oppfinnelse, tillater prøvenuklein-syrene å danne hybrider med maksimal effektivitet.

Flg. 1 og 2 er skjematiske illustrasjoner av foretrukne fremgangsmåter for utførelse av foreliggende oppfinnelse. Disse fremgangsmåtene beskrives i detalj nedenfor.

Anvendelsen av nukleinsyre-hybridisering som et analyttisk verktøy er fundamentalt basert på den dobbeltkjedede dupleksstrukturen av DNA. Hydrogenbindingene mellom purin- og pyri-midin-basene av de respektive kjedene i dobbeltkjedet DNA, kan brytes reversibelt. De to komplementære enkeltkjedene av DNA som resulterer ved denne "smeltingen", eller "denatu-reringen", vil reassosieres (ofte referert til som rekombi-nering eller hybridisering), slik at dupleksstrukturen igjen dannes. Det er nå velkjent at kontakt mellom en første enkeltkjedet nukleinsyre, enten DNA eller RNA, som innbefatter en basesekvens som er tilstrekkelig komplementær med (dvs. "homolog med") en annen enkeltkjedet nukleinsyre under egnede betingelser, vil gi dannelse av DNA1 DNA, RNA'DNA eller RNA'RNA hybrider, avhengig av utgangsstoffene.

Proben vil innbefatte minst en enkeltkjedet basesekvens som

i det vesentlige er komplementær med eller homolog med sekvensen som skal detekteres. En slik basesekvens behøver imidlertid ikke å være et enkelt, kontinuerlig polynukleotid-segment, men kan bestå av to eller flere individuelle segmenter avbrutt av ikke-homologe sekvenser. Disse ikke-homologe sekvsnene kan være lineære, eller de kan være selv-komplementære og danne hårnålssløyfer.

I tillegg kan det homologe området av proben være flankert

på 3'- og 5<1->terminalene av ikke homologe sekvenser, som f.eks. de som innbefatter DNA eller RNA av en vektor hvori den homologe sekvensen er innført for propagering. I ethvert tilfelle, vil proben som en analyttisk reagens vise detekterbar hybridisering ved et eller flere punkter med prøve-nukleinsyrer av interesse. Lineære eller sirkulære enkelte kjedede polynukleotider kan benyttes som probeelementet,

med hoveddeler eller mindre deler dupleksdannet med en komple-komplementær polynukleotidkjede eller kjeder, forutsatt at det kritiske homologe segmentet eller segmentene er i enkeltkjedet form, og tilgjengelige for hybridisering med prøve-DNA eller RNA. Det foretrekkes generelt å anvende prober som i det vesentlige foreligger i enkeltkjedet form. Fremstillingen av en egnet probe for en spesiell analyse,

er et spørsmål om rutinemessige ferdigheter innen teknikken.

Et kritisk trekk ved foreliggende oppfinnelse er muligheten til å immobilisere selektive hybrider som dannes ved fordelaktige kinetiske vekselvirkninger mellom proben og sekvensen som skal detekteres i oppløsningen. I motsetning til tidligere kjente fremgangsmåter, tilveiebringer foreliggende oppfinnelse slik immobilisering binding av dannede hybrider til en antistoffreagens som tilsettes til reaksjonsmediet i en immobilisert tilstand, eller som kan gjøres immobilt i et etterfølgende trinn ved konvensjonelle fremgangsmåter.

Slik betegnelse benyttes her, refererer antistoff-reagens

til et immunologisk avledet bindende stoff som har antihybrid bindende aktivitet og som kan være hele antistoffer eller deler derav, eller aggregater eller konjugater derav, av konvensjonell polyklonal eller monoklonal type. Foretrukne antistoffreagenser er de som selektivt binder dobbeltkjedede nukleinsyrer fremfor enkeltkjedede nukleinsyrer, dvs. de som selektivt bindes (i) DNA'RNA eller RNA'RNA hybrider eller (ii) interkaleringskomplekser.

Det er nå kjent at antistoffer kan stimuleres slik at de

er selektive for DNA'RNA eller RNA'RNA hybrider fremfor enkeltkjedede nukleinsyrer, det er imidlertid på det nåværende tidspunkt betraktet som ugjennomførlig å generere slik selektivitet i tilfellet av DNA'DNA hybrider. I den utstrek-ning selektivite DNA'DNA hybrider utvikles i fremtiden, vil de klart være anvendelige i foreliggende oppfinnelse. Antistoffer til DNA'RNA eller RNA'RNA hybrider kan benyttes der hvor probene er RNA og prøvenukleinsyrene er DNA eller RNA eller der hvor proben er DNA og prøven RNA.

Videre bør det bemerkes at når det refereres til en RNA-prøve som benyttes med en anti-DNA'RNA eller anti-RNA'RNA reagens, menes det her at ikke alle polynukleotidene som innbefattes i proben er ribonukleotider, dvs. inneholder en 2'-hydrok-sylgruppe. Det fundamentale trekket ved en RNA probe ifølge oppfinnelsen, er at den er tilstrekkelig ikke-DNA i karakter til å muliggjøre stimulering av antistoffer til DNA'RNA, eller RNA'RNA hybrider som innbefatter en RNA-probe som ikke kryssreagerer i en analyttisk betydelig grad, med de individuelle enkeltkjedene som utgjøre slike hybrider. Derfor kan en eller flere av 2<1->merket posisjonene av polynukleotidene som innbefattes i proben, være på deoksy-form. Forutsatt at bindingskarakteren for antistoffet som er nødvendig for utførelse av foreliggende analyse, opprettholdes i betydelig grad. På samme måte kan en RNA-probe i tillegg til eller alternativt til slik begrenset 2<1->deoksymodifika-sjon, innbefatte nukleotider som har andre 2'-modifikasjoner, eller generelt en hvilken som helst annen modifikasjon langs ribosefosfatryggraden, forutsatt at det ikke er betydelig interferens med spesifisiteten av antistoffet for det dobbeltkjedede hybridiseringsproduktet sammenlignet med de individuelle enkeltkjedene.

Der hvor slike modifikasjoner eksisterer i en RNA-probe,

bør immunogene som benyttes for å dyrke antistoffreagensen fortrinnsvis innbefatte en kjede som har i det vesentlige

tilsvarende modifikasjoner og den andre kjeden bør være umo-difisert RNA eller DNA, avhengig av om prøve-RNA eller DNA skal detekteres. Fortrinnsvis bør den modifiserte kjeden i immunogene være identisk med den modifiserte kjeden i en RNA-probe. Et eksempel på et immunogen er det hybride poly-(2'-O-metyladenylsyre)<1>poly(2'-deoksytymidylsyre). Et annet eksempel er poly(2<1->0-etyliosinsyre)'poly(ribocytidylsyre).

Følgende er ytterligere eksempler på modifiserte polynukleotider som kan innbefattes i en RNA-probe: 2'-O-metylribo-nukleotid, 2-0-etylribonukleotid, 2<1->acidodeoksyribonykleotid, 2<1->klorodeoksyribonukleotid, 2'-O-acetylribonukleotid, og metylfosfonatene eller fosfortiolatene av ribonukleotider eller deoksyribonukleotider. Modifiserte nukleotider kan finnes i RNA-prober som et resultat av innføring under enzym-zyntese av proben fra en sjablong. F.eks. er adenosin 5'-0-'('l—tiotrifosfat) (ATPaS) og dATPaS substrater for henholdsvis DNA-avhengige RNA polymeraser og DNA-polymeraser. Alternativt kan den kjemiske modifikasjonen innføres etter at proben er fremstilt. F.eks. kan en RNA-probe 2<1->0-acetyle-res med eddiksyreanhydrid under milde betingelser i et vandig oppløsningsmiddel.

Immunogener for stimulering av antistoffer spesifike for RNA'DNA hybrider, kan innbefatte homopolymere eller heteropolymere polynukleotide duplekser. Blant mulige homopolymere duplekser foretrekkes spesielt poly(rA)<1>poly(dT) (Kitagawa og Stoller (1982) Mol. Immunol. 19:413). Generelt foretrekkes imidlertid heteropolymere duplekser og disse kan fremstilles på en rekke forskjellige måter, innbefattet transkripsjon av 4>X174 virion DNA med RNA polymerase (Nakazato (1980) Biochem. 19:2835). De valgte RNA'DNA-dupleksene adsorberes

på et metylert protein, eller bindes på annen måte til et konvensjonelt immunogent sperremateriale, som f.eks. bovin serumalbumin, og injiseres i det ønskede vertsdyr (se også Stollar (1980) Meth. Enzymol. 70 : 70). Antistoffer til RNA1 RNA duplekser kan dyrkes mot dobbeltkjedet RNA fra virus som f.eks. reovirus eller Fiji sykdomsvirus som infiserer sukker-

rør, bl.a. Også homopolymere duplekser som f.eks. poly(ri)' poly(rC) eller poly(rA)'poly(rU), blant andre, kan benyttes for immunisering som angitt ovenfor. Ytterligere informasjon vedrørende antistoffer til RNA'DNA og RNA1 RNA hybrider, er tilveiebragt i US patentsøknad 616.132, inngitt 1. juni 1984.

Antistoffer til interkolleringskomplekser kan fremstilles mot et immunogen som vanligvis innbefatter et ionisk kompleks mellom et kationisk protein eller proteinderivat (f.eks. metylert bovinserumalbumin) og det anioniske interkollator-nukleinsyrekomplekset. Ideelt er interkollatoren kovalent koblet til den dobbeltkjedede nukleinsyren. Alternativt kan interkollator-nukleinsyrekonjugatet være kovalent koblet til et bærerprotein. Nukleinsyredelen av immunogenet kan innbefatte de spesifikt parede sekvensene som finnes i ana-lysehybridet, eller kan innbefatte andre ønskede sekvenser siden spesifisiteten av antistoffet generelt ikke vil avhenge av den spesielle basesekvensen som er involvert. Ytterligere informasjon vedrørende antistoffer til interkalleringskomplekser er tilveiebragt i US patentsøknad 560.429, inngitt 12 desember 1983.

Som angitt ovenfor, kan antistoffreagensen bestå av hele antistoffer, antistoff-fragmenter, polyfunksjonelle anti-stof f aggreagater , eller generelt av et hvilket som helst stoff som innbefatter en eller flere spesifike bindingsposisjoner for et antistoff. Når det foreligger i form av hele antistoff, kan de tilhøre en hvilken som helst av klassene eller underklassene av kjente immungolbuliner, f.eks. IgG, IgM, osv. Et hvilket som helst fragment av et hvilket som helst slikt antistoff, som beholder spesifik bindingsaffini-tet for den hybridiserte proben kan også anvendes, f.eks. fragmentene av IgG, konvensjonelt kjent som Fab, F(ab'),

og F(ab')2. I tillegg kan aggregater, polymere, derivater og konjugater av immunogolbuliner eller fragmenter av disse, benyttes der hvor det er hensiktsmessig.

Immunoglobulinkilden for antistoff-reagensen kan oppnås på en hvilken som helst tilgjengelig måte som f.eks. ved konvensjonelle antiserum og monoklonale teknikker. Antiserum kan oppnås ved velkjente teknikker som innbefatter immunisering av et dyr, som f.eks. en mus, kanin, marsvin eller geit,

med et egnet immunogen. Immunoglobulinene kan også oppnås ved somatiske cellehybridiserings-teknikker, og resulterer i det som vanligvis betegnes som monoklonale antistoffer,

og som også innbefatter anvendelse av et egnet immunogen.

I de tilfeller hvor det anvendes en antistoff-reagens som

er selektiv for interkolleringskomplekser, som anti-hybrid, kan en rekke forskjellige interkollatorforbindelser være innbefattet. Generelt kan man si at interkollatorforbindel-sen fortrinnsvis er et molekyl med lav molekylvekt, plant, vanligvis aromatisk men noen ganger polycyklisk, som er istand til binding med dobbeltkjedede nukleinsyrer, f.eks. DNA'DNA, DNA'RNA, eller RNA'RNA duplekser, vanligvis ved innføring mellom basepar. Den primære bindingsmekanismen er vanligvis ikke-kovalent, mens kovalent binding finner sted som et andre trinn der hvor interkollatoren har reaktive eller aktivbare kjemiske grupper som kan danne kovalente bindinger med nabo-kjemiske grupper på en eller begge av de interkollerte duplekskjedene. Resultatet av interkolleringen er at nabo-basepar spres til ca. det dobbelte av den normale separa-sjonsavstanden, dette fører til en økning av molekyllengden for dupleksen. Videre må det skje en oppvikling av dobbelt-spiralen på ca. 12-36° for å gi plass til interkollatoren. Generelle oversikter og ytterligere opplysninger kan finnes

i Lerman, J. Mol. Biol. 3:18(1961); Bloomfield et al., "Physical Chemistry of NucleicAcids", kap. 7, side 429-479,Harper og Rowe, NY(1974); Waring, Nature 219:1320(1968); Hartmann et al., Angew. Chem.,Engl. Ed. 7:693 (1968);Lippard, Accts. Chem. Res. 11:211 (1978); Wilson, Intercala-tion Chemistry (1982), 445; ogBerman et al., Ann. Rev.Bio-phys.Bioeng. 20:87(1981); såvel som fra den tidligere nevnte US patentsøknad nr. 560.429. Eksempler på interkollatorer

er akridinfargestoffer, f.eks. akridinorange, fenantridiner, f.eks. etidium, fenaziner, furocoumariner, fenotiaziner,

og kinoliner.

Interkolleringskompleksene dannes i analysemediet under hybridiseringen ved bruk av en probe som er modifisert i det komplementære, enkeltkjedede området, slik at en har interkollatoren kjemisk bundet til dette på en slik måte at det ved hybridisering dannes interkolleringskomplekser.

En hvilken som helst velegnet metode kan benyttes for å oppnå slik binding. Vanligvis dannes bindingen ved å bevirke interkollering med en reaktiv, fortrinnsvis fotoreaktiv, interkollator etterfulgt av bindingsreaksjonen. En spesielt nyttig fremgangsmåte innbefatter acidointerkollatorene.

Ved eksponering for ultrafiolett eller synlig lys, dannes

de reaktive nitrenene likt. Nitrenene av akrylacider fore-trekker innføringsreaksjoner fremfor dannelse av omvandlings-produkter /se White et al., Methods in Enzymol. 46 : 644 ( 1977 )_/. Representative acidointerkollatorer er 3-azidoacridin, 9-azidoacridin, etidiummonoazid, etidiumdiazid, etidiumdimer-azid /Mitchell et a., JACS 104:4265 (1982 J), 4-azido-7-klor-kinolin, og 2-azidofluoren. Andre nyttige fotoreagerbare interkollatorer er furocoumarinene som danner /2+2/ cyklo-addisjonsprodukter med pyrimidinresiduene. Alkylerings-midler kan også benyttes som f.eks. biskloroetylaminer og epoksyder eller aziridiner, f.eks. aflatoksiner,

polycykliske hydrokarbonepoksyder, mitomycin, og norphyllin A. Den interkollator-modifiserte dupleksen denatureres så slik at den gir den modifiserte enkeltkjedede proben.

Mens foretrukne anti-hybrider for bruk i foreliggende oppfinnelse, som angitt ovenfor, vil diskriminere ved binding mellom dobbeltkjedede og enkeltkjedede nukleinsyrer, er det ikke kritisk å ha slik selektivitet i alle utførelser. Der hvor slik selektivitet ikke er kritisk, blir et antall ekstra fremgangsmåter for å oppnå anti-hybrid tilgjengelige.

Disse innbefatter anti-DNA'DNA antistoffer som er hovedsake lig ikke-spesifike overfor DNA både i enkelt- og dobbeltkjedet form, antistoffer dyrket mot kjemisk modifiserte nukleinsyrer som f.eks. cis-diamindikloroplatina-DNA addisjonsprodukter, antistoffer til Os04~oksydert DNA som f.eks. anti-tymin glykol, antistoffer til antibiotika-DNA komplekser som f.eks. anti-distamycin A-DNA kompleks eller anti-netropsin-DNA kompleks og antistoffer til modifiserte baser som f.eks. anti-5-bromouracil og anti-6-metyladenosin. Betydningen av dobbeltkjedet selektivitet er tilstede under utførelsen av analysen innbefatter merking av enkeltkjedet nukleinsyre, og derfor krever diskriminering mellom hybridisert og uhybridisert merket nukleinsyre. En slik situasjon er tilstede når enten en probe eller enkeltkjedede prøve-nukleinsyrer er merkede. Når på den annen side en merket form av en annen anti-hybrid reagens anvendes, er det bare nødvendig at en av det endelig immobiliserte anti-hybrid og det merkede anti-hybrid har selektivitet for dobbeltkjedede nukleinsyrer fremfor enkeltkjedede nukleinsyrer.

Selv om foreliggende fremgangsmåte spesielt er beskrevet

med anvendelse av immobilisering av hybrider ved binding til antistoffreagenser, bør det bemerkes at tilnærmet hvilket som helst stoff som har evnen til selektivt å binde nuklein-syrehybrider som dannes under analysen, på samme måte kan benyttes. Dette gjelder både de analyseutførelser som krever selektivitet for dobbeltkjedede nukleinsyrer såvel som hvor dobbeltkjedet versus enkeltkjedet selektivitet ikke er kritisk som diskutert ovenfor. Ekvivalenter for antistoffreagensen ifølge foreliggende oppfinnelse, som kan benyttes uten å avvike fra foreliggende oppfinnelsesmessige konsept, vil normalt vise en meget spesifik ikke-kovalent binding, som f.eks. i ligand-reseptor og immunoglobulinbinding. Materialer som er tilgjengelige nå eller i fremtiden og som har slike karakteristiske bindingsegenskaper, betraktes som ekvi-valente med den foreliggende antistoffreagensen.

Antistoffreagensen bringes i kontakt med de dannede hybrider, enten i en immobilisert form eller en immobiliserbar form, dvs. at den deretter kan gjøres immobil ved konvensjonelle fremgangsmåter. Det foretrekkes generelt å anvende immobiliserte former av anti-hybridet. Et stort antall fremgangsmåter er kjente for immobilisering av proteiner for faste bærere, og de fleste av fremgangsmåtene kan anvendes på antistoffer /se Methods in Anzymology, vol. 44 (1976]_/. Antistoffer immobiliseres vanligvis enten ved kovalent kobling eller ved ikke-kovalent adsorbsjon. Ikke-kovalente fremgangsmåter som ofte anvendes, er ikke-spesifik adsorbsjon på polystyren-perler eller mikropartikler, og på polyvinylkloridoverflater. Mange kovalente fremgangsmåter benyttes og noen innbefatter cyanogenbromid aktiverte agaroser og dekstraner; glutaraldehyd aktiverte nyloner og polyakrylamider; og epoksyder på akryl- eller andre bærere. Antistoffer av IgG-klassen kan også immobiliseres ved binding til immobiliserte former av protein A. Der hvor protein A benyttes for denne immobilisering og merket anti-hybrid skal brukes i analysen, må man omhyggelig unngå at det merkede anti-hybridet også bindes ved det immobiliserte protein A, som f.eks. ved metning av bindingsposisjonene på protein A eller ved benyttelse av et merket anti-hybrid som ikke innbefatter protein A reseptor posisjonen, f.eks. ved å benytte Fab eller Fab' eller et anti-hybrid fra en annen immunogøibulinklasse enn IgG.

Hovedhensikten med immobiliseringen er å muliggjøre fysisk mannipulering og isolering eller separering av hybrider som er dannet i analysen, for å bestemme mengden av disse ved hjelp av responsen eller signalet som produseres av merket. Det vil si at immobiliseringen kan finne sted etter bindingen av anti-hybrid til hybrider som er dannet i analysen.

En rekke fremgangsmåter for å oppnå dette, er nærliggende.

Man kan anvende immobiliserte anti-(anti-hybrid)-antistoffer, ved å sørge for at dersom merkede anti-hybrider skal benyttes i analysen, må de immobiliserte antistoffene ikke ha betydelig affinitet for den merkede reagensen. Dette kan oppnås ved å anvende antigenetisk adskillbare immunoglobuliner som de to anti-hybrid-reagensene, f.eks. ved å benytte anti-hybrider fra forskjellige immunoglobulinklasser.Immobilisert protein A kan også anvendes med de samme forsiktighetsregler som beskrevet ovenfor, angående bruken av protein A og merket anti-hybrid. Spesielt nyttig er utførelser som innbefatter kjemisk modifisering av anti-hybridet ved konjugering til en del av et spesifikt bindende par, og anvendelse av en immobilisert form av den andre delen av paret. Nyttige bindende par som de kan velges fra, innbefatter biotin/avidin, haptener og antigener/antistoffer, karbohydrater/lectiner, enzymer/inhibitorer, o.l. Det er foretrukket å modifisere anti-hybridet med biotin eller en hapten, og anvende henholdsvis : en immobilisert for av avidin- eller anti-hapten antistoff.

De hybridene av interesse som til sist blir assosiert med

den immobiliserte antistoffreagensen, kan bestemmes på en rekke forskjellige måter. Det foretrekkes generelt å anvende en merket probe eller en merket form av en annen antistoff-reagens som er istand til binding til det dannede hybridet. Den sistnevnte fremgangsmåten er spesielt foretrukket fordi hverken proben eller prøvenukleinsyrene må modifiseres kjemisk, f.eks. ved merking, for å utføre analysen. Man kan enkel bringe hybridene i kontakt med den immobiliserte eller immobiliserbare første antistoff-reagensen, og med den merkede andre antistoffreagensen, og bestemme merket som assosieres med den immobiliserte fasen, eller alternativt måle merket som er igjen som ubundet merket annen antistoffreagens.

Det er mulig å anvende samme stoffer som første og andre antistoffreagens. F.eks. kan man benytte anti-DNA'RNA der hvor det dannes DNA1 RNA hybrider, og en fraksjon av slike anti-hybrider kan immobiliseres og en annen fraksjon merkes.Hybridene vil ha multiple epitoper for anti-DNA'RNA, som muliggjør binding av både merket og immobilisert anti-hybrid. Alternativt kan forskjellige anti-hybrider benyttes, der hvor f.eks. monoklonale antistoffer benyttes, kan man anvende forskjellige hybridomas for forskjellige bindings-spesifisiteter og/eller affiniteter.

Merkede prober kan benyttes i foreliggende oppfinnelse på flere måter. I et tilfelle, benyttes en enkelt merket probe og de resulterende merkede hybrider separeres fra den frie merkede proben for detektering ved binding til immobilisert eller immobiliserbart anti-hybrid. Alternativt kan man benytte en dual hybridiseringsfremgangsmåte som innbefatter to probesegmenter som er komplementære til ensidig eksklusive segmenter av sekvensen som skal detekteres. Et av probeseg-mentene vil være merket og det andre vil danne pitoper for anti-hybrid ved hybridisering med sekvensen som skal detekteres .

En rekke andre merke-fremgangsmåter vil være innlysende. F.eks. kan man, selv om det er betydelig mindre ønskelig, innføre merke ved å merke enkeltkjedede prøvenukleinsyrer

in situ, man oppnår derved merkede hybrider ved hybridisering med den umerkede proben. Videre kan, som diskutert nedenfor, komponenten som skal merkes, direkte bindes, f.eks. ved kovalente bindinger, til stoffer som tilveiebringer det endelige detekterbare signalet, eller ved indirekte binding som f.eks. ved konkorporering av det endelige detekterbare stoffet i en mikrokapsel eller liposom, som i sin tur forbindes med komponenten som skal merkes. Videre kan man merke med en spesifik bindbar ligand, f.eks. en hapten eller biotin, og bringe det endelige detekterbare stoffet ved et hvilket som helst ønsket tidspunkt, inn i analysen, ved tilsats av en bindende partner for liganden, f.eks. et antistoff eller avidin, hvortil det detekterbare spcies forbindes. Når man anvender immobiliserte og merkede anti-hybrider, kan de tilsettes til reaksjonsblandingen samtidig; imidlertid kan virkningen optimaliseres, avhengig av det spesielle sys-tem, ved å tilsette en av komponentene et bestemt tidsrom før den andre.

Merker av forskjellige typer kan anvendes til å merke prober, annen anti-hybrid, osv., som beskrevet ovenfor. Merket vil være et stoff som har en detekterbar fysisk, kjemisk, eller elektrisk egenskap. Slike materialer er velutviklede innen feltet immunoanalyser og generelt kan et hvilket som helst merke som er nyttige ved slike fremgangsmåter, anvendes i foreliggende oppfinnelse. Spesielt nyttige er enzymatisk aktive grupper, som f.eks. enzymer (se Clin. Chem (1976) 22:1232, US Reissue Pat. 31.006, og UK pat. 2.019.408), enzymsubstrater (se britisk pat. 1.548.741), koenzymer (se US pat. nr. 4.230.797 og 4.238.565), og enzyminhibitorer (se US patent 4.134.792); flourescerende stoff (se Clin. Chem. (1979) 25:353); kromoforerende stoff; luminescerende stoff som f.eks. kjemiluminiscerende og bioluminiscerende stoff (se Clin. Chem. (1979) 25:512, og ibid, 1531); spesifikt bindbare ligander som f.eks. biotin, (se Eur. Pat. 63.879) eller et hapten (se PCT Publ. 83-2286); og radioisotoper som f.eks.<3>H,<35>S,<32>P,<125>I og 14C. Slike merker detekteres på basis av deres fysiske egenskaper (f.eks. fluore-scens, kromoforese og radioisotoper), eller deres reaktive og bindende egenskaper (f.eks. enzymer, substrater, koenzymer og inhibitorer). F.eks. kan et kofaktor-merket species detekteres ved tilsats av enzymet (eller enzymer hvor et ringslutningssystem benyttes) som merket er en kofaktor for, og et substrat eller substrater for enzymet. En hapten eller ligand (f.eks. biotin) merket species, kan detekteres ved tilsats av et antistoff til haptenen eller et protein (f.eks. avidin), som binder liganden, merket med et detekterbart molekyl. Slike detekterbare molekyler kan være molekyler med en målbar fysisk egenskap (f.eks. fluorescerende eller absorberende molekyler), eller en deltager i en enzymreaksjon (se liten ovenfor). F.eks. kan man benytte et enzym som virker på et substrat, slik at det genereres et produkt med en målbar fysisk egenskap. Eksempler på sistnevnte innbefatter, men er ikke begrenset til, B -galaktosidase, alkalisk fosfatase og peroksydase.

Der hvor en andre antistoffreagens benyttes for å måle dupleksen som assosieres med den immobiliserte første antaistoffreagensen, kan et slikt andre antistoff detekteres på basis av en iboende egenskap, som f.eks. dets antigenisi-tet. Et merket anti-(antistoff) antistoff vil bindes til den andre antistoffreagensen hvor merket for det andre antistoffet er et hvilket som helst konvensjonelt merke som ovenfor. Videre kan antistoffet detekteres ved komplement-fiksering, eller ved bruk av det merkede protein A, såvel som ved andre teknikker kjent for detektering av antistoffer. Der hvor merket protein A benyttes, vil den immobiliserte antistoffreagensen være i en form som mangler protein A bindingsposisjonen (f.eks. kan man anvende immobilisert Fab elelr Fab').

Fremgangsmåter for fremstilling av merkede komponenter benyt-tet i de foretrukne utførelser av foreliggende oppfinnelse, er lett tilgjengelige fra tidligere kjent teknikk. Mest foretrukket er de analyseutførelsene som innbefatter merkede prober eller merket andre anti-hybrid. Merkene som er beskrevet ovenfor kan benyttes ved disse utførelsene. Ved merking av prober anvender man syntetiske fremgangsmåter som er effektive for modifisering av nukleinsyrer uten at det i stor grad interfererer med den merkede probens evne til å delta i hybridiseringen, og man velger merke som er tilstrekkelig stabile ved de betingelsene som benyttes for hybridiseringen til å muliggjøre etterfølgende detektering.

Som et eksempel kan følgende fremgangsmåte benyttes til merking av prober. Radioaktivt merkede nukleotider kan innkorporeres i DNA prober ved fremgangsmåter som f.eks. nick-translatering, terminal merking med terminal deoksynukleotidy1 transferase, og in vivo merking. Radioaktivt merkede nukleotider kan innkorporeres i RNA prober under in vitro syntese med DNA-avhengige RNA polymerase, fra bakteriofag SP6 ved bruk av "Riboprobe TM " DNA sjablongsystem. Fremgangsmåoten etter Langer et al., /Tl981) Proe.Nati. Acad. Sei., 78:6633/ Iran horn;l-)-p<; t- i 1 å knhlp hi n-t-in t- i 1 H<=>+- nrimjprp aminpt f\\ t 5-(3-amino)allyluridin og deoksyuridintrifosfater. Disse biotinylerte nukleotidene kan inkorporeres i dobbeltkjedet DNA ved nick-translatering, eller tilsettes til 3'-0H terminalene med terminal deoksynukleotidyl transferase. Biotin kan også festes til 3<1->0H terminalene av RNA ved polyamin-/Broker, T.R., (1978)Nucl. Acids Res. 4:363/ og cytokrom C-broer /Sodja, A. og Davidson, N. (1978) Nucl. Acids Res. 5:385/. Direkte kobling av proteinmerker til prober kan utføres ved fremgangsmåten ifølge Renz /Tl983) EMBO Journal,

12 5

2:817/ som koblet I-histoner til denaturert DNA med glutaraldehyd. Enzymer som f.eks. peroksydase og alkalisk fosfatase kan bindes til DNA prober ved hjelp av tilsvarende kjemi /Renz og Kurz (1984) Nucl. Acids Res. 12.3435/. Andre kjemiske fremgangsmåter for ende-merking av DNA prober innbefatter den som er beskrevet av Eshaghpour et al., /(1979) Nucl. Acids Res. 7:1485/. Et eller flere 4-tiouridinrester kan innføres på 3'-0H endene av DNA og tiolene reageres med forskjellige elektrofile reagenser med lav molekylvekt. Dene kjemien kan benyttes for å forbinde forskjellige haptener til DNA-prober. Merking med hapten N-acetoksy-N-2-acetyla-aminofluoren, er beskrevet av Tchen et al., /Tl984) Proe. Nati. Acad. Sei. 81:3566/. DNA og RNA prober kan reageres med N-acetoksy-N-2-acetylaminofluoren og gir et addisjonspro-dukt som har N-2-acetylaminofluoren residuer forbundet med 8-karbonet av guanin. Det kovalent modifiserte DNA kan detekteres med antistoff opprettet mot N-acetoksy-N-2-acetyl-amino-fluoren-residu. Fremgangsmåten etter Hu og Messing /Tl982)^Gene, 17:271/ kan benyttes for tilsats av merker til prober som er klonet inn i enkeltkjedede M13 vektorer. En universal primer, komplementær til området 5' av kloneposisjonen, ini-tierer DNA syntese komplementært til M13 kjeden nedenfor probesekvensen. Siden DNA polymerasen vil inkorporere radioaktive nukleotide trifosfater og biotin 5-(3-aminoallyl) deoksyuridintrifosfat i den nye kjeden, kan disse merkene forbindes til vektoren borte fra probesekvensen. Den dobbeltkjedede delen kan også modifiseres ved reaksjon med 8-^azidoetidium.

Fremstillingen av merkede antistoffer er grundig beskrevet

125

i litteraturen. Inkorporering av I-merke kan utføres ved fremgangsmåten ifølge Balton og Hunter (1973) Biochem.

J. 133:529. Ishikawa et al. (1983) J. Immunoassay 4:209

har angitt flere forskjellige fremgangsmåter for kobling av forskjellige enzymer til antistoffer. Yoshitake et al.,

(1979) Eur. J. Biochem. 101:395 har beskrevet en fremgangsmåte for bruk av maleimider til å koble glukoseoksydase til antistoff. Alkalisk fosfatase kan kobles til antistoff med glutaraldehyd /Voller et al., (1976) Bull. World Health Organ., 53:55/. Antistoffer kan merkes med fluorescein ved fremgangsmåten beskrevet av Blakeslee og Baines (1976) J. Immunol. Meth., 31:305. Kjemiluminiscente merker kan innføres ved fremgangsmåten ifølge Schroeder et al., (1981) Clin. Chem. 27:1378.

Med referanse til tegningene og eksemplene som følger, kan

nå få spesifike utførelser av foreliggende analyse beskrives.

Fremgangsmåten vist i fig. 1 innbefatter bruk av en umerket polynukleotid probe som er enten RNA eller DNA når prøvese-kvensen av interesse er RNA elelr er RNA når prøvesekvensen er DNA. To populasjoner av anti-hybrid antistoffer (Ab) anvendes, disse kan innbefatte det samme eller forskjellige polyklonale eller monoklonale immunoglobuliner som er selektive for RNA'RNA eller RNA1 DNA hybrider, avhengig av utgangs-materialene. Den første anti-hybride reagensen er tilstede i en immobilisert form, og en andre er merket med et flourescerende stoff. Ved dannelse av hybrider mellom sekvensen av interesse og proben, dannes det bindingsposisjoner for anti-hybrid reagensene. De resulterende, immobiliserte og merkede hybrider separeres fra ubundet, merket anti-hybrid og fluorescensmengen som dannes av det immobiliserte species, måles og korreleres med nærværet eller mengden av sekvensen av interesse i prøven.

I fremgangsmåten vist i fig. 2, er proben dobbelt modifisert, både med et biotinmerke (bio) og en kjemisk bundet interkollator (I). Et antistoff (Ab) til interkolleringskompleksene tjener som den kritiske anti-hybrid reagensen og er tilstede i en immobilisert form. Biotin-merket detekteres ved bruk av avidin (Av) merket med et detekterbart enzym. Ved avslut-ningen av hybridiseringstrinnet, separeres de resulterende immobiliserte og merkede hybrider fra ubundet, merket avidin og enzymaktiviteten av det immobile species måles og relateres til nærværert av sekvensen av interesse.

Prøvene som analyseres kan være et hvilket som helst medium av interesse, og vil vanligvis være en flytende prøve av medisinsk, veterinærmedisinsk, miljømessig, ernæringsmessig, eller industriell betydning. Humane og animale prøver og legemsvæsker kan spesielt analyseres ved foreliggende fremgangsmåte, innbefattet urin, blod (serum eller plasma), melk, cerebrospinalvæske, spytt, avføring, lungeaspirater, hals-avstrykninger, genitale avstrykninger og exudater, rektal-avstrykninger og nasofarnygale aspirater. Der hvor prøvene som tas fra pasienten eller andre kilder for undersøkelse inneholder hovedsakelig dobbeltkjedede nukleinsyrer,

slik de f.eks. inneholdes i celller, behandles prøvene slik at nukleinsyrene denatureres, og om nødvendig slik at nukleinsyrene først frigjøres fra cellene. Denaturering av nukleinsyrer oppnås fortrinnsvis ved opparming i kokende vann, eller alkalibehandling (f.eks. 0,1 N natriumhydroksyd), som, om ønsket, samtidig kan benyttes for å lyse cellene. Frigjøring av nukleinsyrer kan også f.eks. oppnås ved meka-nisk nedbrytning (frysing/opptining, abrasjon, ved hjelp av lydbølger), fysisk/kjemisk nedbrytning (rensemidler som f.eks. "Triton", "Tween", natriumdodecylsulfat, alkalibehandling, osmotisk sjokk, eller varme), eller enzymatisk lysing (lysozym, proteinase K, pepsin). Det resulterende forsøksmedium vil inneholde nukleinsyrer i enkeltkjedet form som så kan analyseres ifølge foreliggende hybridiseringsfremgangsmåte. I tilfeller hvor RNA1 DNA hybrider skal detekteres med merkede antistoffreagenser, kan mRNA og rRNA i prøven fjernes fra deltagelse i hybridiseringsreaksjonen ved kon-

vensjonelle fremgangsmåter som f.eks. behandling under alka-liske betingelser, f.eks. de samme betingelser som ble benyt-tet for å denaturere nukleinsyrene i prøven.

Som kjent innen teknikken, kan forskjellige hybridiserings-betingelser benyttes ved analysen. Typisk vil hybridiseringen foregå ved svakt forhøyede temperaturer, f.eks. mellom ca. 35 og 75°C, vanligvis rundt 65°C, i en oppløsning som innbefatter buffer ved pH mellom ca. 6 og 8, og med egnet ionestyrke (f.eks. 5XSSC hvor 1XSSC = 0,15 M natriumklorid og 0,015 M natriumcitrat, pH 7,0) og eventuelt protein, som f.eks. bovinserumalbumin, og en denaturert fremmed DNA, f.eks. fra kalvetymus eller laksespermer. I tilfelle hvor lavere hybridiseringstemperaturer ønskes, kan hybrogenbindingsrea-genser som f.eks. dimetylsulfoksyd og formamid innbefattes. Graden av komplementaritet mellom prøven og probekjedene

som kreves for at hybridiseringen skal finne sted, avhenger av stringensen ved betingelsene. Faktorer som bestemmer stringensen er vel kjente i teknikken.

Normalt vil de temperaturbetingelsene som velges for hybridiseringen være inkompatible med bindingen av antihybrid-reagensen til dannede hybrider og detektering av merke-responsen. Følgelig vil anti-hybrid bindingstrinnet og merke deteksjonstrinnet foregå etter avslutning av hybridiseringstrinnet. Reaksjonsblandingen vil vanligvis bringes til en temperatur i området fra ca. 3°C til ca. 40°C, og bindings-og deteksjonstrinnene utføres så. Fortynning av hybridiser-ingsblandingen før tilsats av antihybrider er ønskelig når salt- og/eller formamid-konsentrasjonene er høye nok til i betydelig grad å påvirke antistoff bindingsreaksjonen.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer i tillegg et reagenssystem, dvs. en reagens-kombinasjon eller innretninger som innbefatter alle de essensielle elementene som kreves for å gjennomføre en ønsket analysemetode. Reagenssystemet er tilstede i en kommersielt pakket form, som en sammensetning eller tilsetning der hvor kompatibiliteten av reagensene vil tillate det, i en forsøksinnretningskonfigurasjon, eller vanligvis som er forsøkspakke, dvs. en pakket kombinasjon av en eller flere beholdere, innretninger, e.l., som inneholder de nødvendige reagenser, vanligvis innbefattet skriftlig instruksjon for gjennomføring av analysene. Reagenssystemer ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter alle konfigura-sjoner og sammensetninger for utførelse av forskjellige hybri-diseringsanalyser som er beskrevet.

I alle tilfeller vil reagenssystemet innbefatte (1) en nukleinsyreprobe som beskrevet, og (2) anti-hybrid reagensen. En forsøkspakke av systemet kan i tillegg innbefatte hjelpe-kjemikalier som f.eks. komponentene av hybridiseringsoppløs-ningen og denatureringsagentene som er istand til å overføre dobbeltkjedede nukleinsyrer i en prøve til enkeltkjedet form. Fortrinnsvis er det innbefattet et kjemisk lysings- og de-natureringsmiddel, f.eks. alkali, for behandling av prøven slik at enkeltkjedet nukleinsyre frigjøres fra denne.

Foreliggende oppfinnelse skal nå illustreres, men ikke begrenses, ved hjelp av følgende eksempler.

Eksempel 1.

Hybridiseringsanalyse ved bruk av immobiliserte og merkede anti-hybrider.

A. Fremstilling av en RNA probe for cytomegalovirus.

Et DNA fragment fra genomet av cytomegalovirus klones inn

i en vektor som inneholder promotorer for DNA avhengig RNA-polymerase fra bakteriofag SP6 som infiserer Salmonella typhimurium LT2 celler. Den klonede sekvensen transkriberes ved hjelp av polymerase, slik at det dannes en RNA probe.

Cytomegalovirus DNA nedbrytes medEcoRI restriksjonsendo- nuklease og fragmentene klones inn i plasmidet pACYC 184 /Tamashiro et al., (1982) J. Virology 42:547-557/.Plas-midene progageres iE.coli stamme HB101 og EcoRI e fragmentet definert av Tamashiro, benyttes for fremstilling av proben. Det rensede plasmidet nedbrytes med EcoRI restriksjons endonuklease og innskuddet isoleres ved hjelp av agarosegel elektroforese /Maniatis et al., (1982) "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory/. Cytomegalovirus EcoRI e fragmentet klones inn i EcoRI posisjonen på pSP65 vektoren som er tilgjengelig fra Promega Biotec, Madison, WI.

pSP65 vektoren med EcoRI e innskuddet propageres i E.coli JM103 celler ved 37°C. Cellene lyses og den cellulare DNA isoleres ved hjelp av fenol/kloroform ekstraksjoner. Plasmidet separeres fra den kromosomale DNA ved hjelp av sentrifugering i en cesiumklorid-etidiumbromid-gradient /Maniatis et al., supra/.

Cesiumkloridet og etidiumbromidet separeres fra plasmidet

ved gelfiltrering på "Sephadex G-50" i 10 mM Tris-hydroklorid-buffer, pH 7,5, som inneholder 50 mM NaCl og 1 mM EDTA. Effluenten som inneholder DNA samles og DNA feilet ut med kald etanol. Bunnfallet oppløses i 10 mM Tris-hydroklord-buffer, pH 7,5, som inneholder 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2og 1 mM ditiotreitol og nedbrytes i 1 time ved 37°C med 1 enhet Hind III restriksjons endonuklease pr. mikrogram DNA. Blandingen ekstraheres en gang med fenol/kloroform og DNA utfelles med kald etanol. Utfellingen oppløses i 10 mM Tris-hydro-klodirbuffer, pH 7,4, slik at man får 0,5 mgDNA/ml.

Denne pSP65 vektoren med EcoRI e innskuddet transkriberes medSP6 DNA avhengig RNA polymerase, ved start ved promotoren og slutt ved den posisjonen som skjæres ved Hind III resetrik-sjonsendonuklease. Det meste av DNA i det transkriberte området er EcoRI e innskuddet.

Transkripsjonsreaksjonsblandingen ( 550 (il) har følgende sammensetning: 50 |ag av Hind III nedbrutt DNA; 40 mMTris-hydrokloridbuf f er, pH 7,5; 6 mM MgC^; 2 mM spermin; 0,5

mM ATP, CTP, UTP og GTP; 10 mM ditiotreitol; 500 enheter RNasin (Promega Biotec) og 50 enheter av SP6 RNA polymerase (Promega Biotec). Reaksjonen f.år forløpe i 1 time ved romtemperatur og deretter tilsettes ytterligere 50 enheter av RNA polymerase, og får reagere i 1 time.

DNA i blandingen ødelegges ved nedbrytning i 10 minutter

ved 37°C med 10 |ig av RNase-fri DNase. Reaksjonsblandingen ekstraheres med fenol/kloroform, og kromatograferes på "Sephadex G-50" i 10 mM Tris-hydrokloridbuffer, pH 7,4, 0,1 M NaCl. RNA samles og utfelles med kald etanol. Utfellingen oppløses i 50 mM natriumacetatbuffer, pH 6,0, som inneholder 1 mM

EDTA.

B. Fremstilling av monokolonalt antistoff til RNA1 DNA.

1. Fremstilling av RNA1 DNA hybrid - Hybridet fremstilles ved transkripsjon av 4>X174 virion DNA med DNA-avhengig RNA polymerase fra E.coli. Fremgangsmåten er beskrevet av Nakazato (1980) Biochem. 19:2835. 2. Fremstilling av metylert tyroglobulin - Bovint tyroglobulin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 100 mg blandes med 10 mg vannfri metanol og 400 |jL av 2,5 M HC1 i metanol. Blandingen får reagere i 5 dager på en rotasjonsblander ved romtemperatur. Utfellingen samles ved sentrifugering og vaskes to ganger med metanol og to ganger med etanol. Deretter tørkes den under vakuum over natten. 3. Immunisering av mus - 150 mikrogram av RNA1 DNA hybrid i 250 (iL av 20 mM Tr is-hydroklor idbuf f er, pH 7,4, 1 mM EDTAblandes med 150 (jg metylert tyroglobulin i 250 [ ih vann.

Det dannes et bunnfall og 2,5 ml avTris-bufferen tilsettes. Hele blandingen emulgeres med et like stort volum av Freunds hjelpestoff. BALB/c mus immuniseres med 0,5 ml av suspen sjonen. Forsterkningsimmuniseringer gis 3 uker senere og deretter med 1 ukes intervaller. Blod tas med 2 ukers intervaller med begynnelse 1 uke etter den første forsterknings-immunisering.

Antistoff titere i serumene måles ved hjelp av en enzymmerket immunosorbent analysemetode. "Immulon II" mikrotiterbrønner dekkes med RNA'DNA ved å plassere 50 uL av en 5 |ig/ml oppløs-ning i hver brønn. RNA'DNA er i 0,015 M natriumcitratbuffer, Ph 6,8, som inneholder 0,15 M NaCl. Når oppløsningene har stått ved romtemperatur i 2 timer, vaskes brønnene med 0,02

M natriumfosfatbuffer, pH 7,4, som inneholder 5 mg bovinsyre albumin/mL og 0,5% "Tween 20" vaskemiddel (vol/vol). Egnede oppløsninger av antiserum tilsettes til brønnene slik at antistoffene bindes til immobilisert RNA'DNA. Deretter kan de bundne antistoffene detekteres med enzymmerket anti-mus IgG ved velkjente fremgangsmåter. Miltceller fra en mus

med en høy serum titer overfor RNA'DNA men lav titer overfor •enkeltkjedet DNA forbindes med myeloma celler slik at det dannes hybridomas /Stuart et al., (1981) Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 78:3751; Galfre og Milstein (1981) Meth. in Enzymol. 73:1/.

Klonede hybridomas gros intraperitonealt i mus slik at det dannes adekvate mengder av antistoff for videre arbeide. Albumin fjernes fra ascitites-væsken ved kromatografi på "Affigel-Blue" harpiks, bragt til likevekt med 10 mM Tris-hydrokloridbuffer, pH 8,0, 0,15 M NaCl. Kolonneeffluenten som inneholder antistoffet kromatograferes på "DEAE-Sepharose" ved bruk av en lineær gradient av 10 mM Tris-hydroklorid-buffer, pH 8,0, til denne bufferen som inneholder 0,2 M NaCl.Hovedtoppen for eluert protein inneholder det monoklonale antistoffet fritt for transferrin og albumin. C.Immobilisering av monoklonalt antistoff til RNA'DNA.

Monoklonalt antistoff til RNA'DNA immobiliseres på magnetiser- bare mikropartikler. "Act-Magnogel AcA44". Partiklene er porøse polyakrylamid-agarose perler som inneholder 7% jernok-syd og denne harpiksen er aktivert med glutaraldehyd. Kobling av antistoffet til "Act-Mangnogel AcA44" utføres ifølge fabrikkantens instruksjoner.

D. Fluorescein-merket antistoff til RNA1 DNA.

Renset antistoff til RNA1 DNA dialyseres i 0,1 M natriumbo-rat-buffer, pH 9,0, og 0,5 ml som inneholder 5 mg antistoff blandes med 0,5 ml 5-(4,6-diklortriazin-2-yl)-aminofluores-cein (Molecular Probes, Inc., Junction City, OR) i boratbufferen. Blandingen får reagere i 1 time ved 25°C

og kromatograferes så på en 1 x 25 cm "Biogel P-6DG" -kolonne med 0,1 M Tris-hydrokloridbuffer, pH 8,0, som eluent. Absorbanser ved 280 nm av 1,0 ml fraksjoner bestemmes og

de som innbefatter den første toppen samles. Fluorescein/ protein-forholdet bestemmes ved fremgangsmåten ifølge The og Feltkamp (1970) Immunology 18:865.

E. Hybridiseringsanalyse for cytomegalovirus i urin.

Denne analysen innbefatter separering av cytomegalovirus

fra urin ved sentrifugering og hybridisering av viral DNA

med RNA-proben i oppløsning. Mengden av hybrid som dannes bestemmes immunokjemisk med det immibiliserte antistoffet til RNA'DNA, og de flouresceinmerkede antistoffet.

Celler og cellulare bruddstykker fjernes fra urinen ved sentrifugering i en "SoevallGLC-3" sentrifuge ved 3000 rpm i 5 minutter. 10 ml av overvannet plasseres i et polyallomert ultrasentrifugerør og kjøres ved 25.000 rmp i en "BeckmanTi50" rotor i 75 minutter. Overvannet fjernes og pelletten oppløses i 0,05 ml av 0,1 M NaOH og inkuberes ved 37°C i 30 minutter.

150 mikroliter av følgende oppløsning tilsettes:

0,1 M natriumfosfat-buffer, pH 6,0; 1,8 M NaCl; 0,1% natriumdodecylsulfat (vekt/vol) og 1 mM EDTA. Deretter tilsettes 20 ul av RNA-proben (20 ng) og blandingen inkuberes ved 65°C

i 10 timer. Reaksjonen avkjøles til romtemperatur og 650

ul av 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 7,4, som inneholder 2

mM MgCl2og 5,0 mg bovinserumalbumin/ml tilsettes. Deretter tilsettes 50 ul av immobilisert antistoff og blandingen ristes i 30 minutter på en slik måte at det faste antistoffet holdes i suspensjonen. 50 mikroliter fluorescein merket antistoff tilsettes og ristingen fortsettes i 1 time. Konsentrasjonene av det immobiliserte antistoffet og de fluorescein-merkede antistoffreagensene optimaliseres i innledende forsøk for å tilveiebringe antistoff-konsentrasjoner som gir et stort overskudd sammenlignet med de mengder som kreves for å binde alt RNA'DNA hybridet som er tilstede i analysen.

Ved slutten av reaksjonsperioden trekkes den fase bæreren

til en vegg av reaksjonsrøret ved hjelp av en magnet og væsken fjernes ved avsugning. Den faste fasen vaskes to ganger hver gang med 1 ml av 0,1>M natriumfosfat-buffer, pH 7,4,

som inneholder 2,0 nm MgCl2og 0,1% "Tween 20" (vol/vol).

Det fluorescein-merkede antistoffet som er bundet til den faste fasen dissosieres ved tilsats av 1,0 ml 0,1 M NaOH. Suspensjonen ristes i 5 minutter og den faste fasen trekkes til bunnen av røret ved hjelp av en magnet. Fluorescensen av oppløsningen måles med 495 nm lys for eksitering og 520

nm for emmisjon.

En kontrollanalyse kjøres parallelt med en urinprøve som

man vet er fri for cytomegalovirus. Flourescens-signalene som genereres med de fiinfiserte urinprøvene, vil være høyere enn signalene for kontrollprøvene.

Eksempel II.

Hybridiseringsanalyse ved bruk av immobilisert anti-hybrid

og merket probe.

A. Fremstilling av en merket probe for cytomegalovirus DNA.

EcoRI e fragmentet fra cytometalovirus beskrevet i eksempel

I ovenfor klones inn i M13mp8 vektoren som er tilgjengelig fra New England Biolabs, Beverly, MA. De rekombinante virus propageres i E.coli K12JM101 verten. Viruset separeres fra kulturvæsken ved utfelling med polyetylenglykol, og det enkeltkjedede virion DNA isoleres ved hjelp av fenol/kloroform ekstraksj on.

En 17 base oligodeoksynukleotid primer med sekvensen GTAAACGACGGCCAGT er komplementær til et segment av M13mp8

nær 3<1->OH-enden av EcoRI e innskuddet. Denne primeren vil initiere DNA-syntese ve Klenow fragmentet av DNA polymerase I fra E.coli og replikeringen rettes gjennom EcoRI e innskuddet. Den nye DNA-proben merkes med biotin ved at "Bio-11-dUTP" tilsettes i reaksjonsblandingen istedet for den van-lige dTTP /Leary et al., (1983) Proe. Nati. Acad. Sei. 80: 4045/.

Den rensede M13mp8 DNA med EcoRI e innskuddet blandes med

et moplart overskudd av 17 baseprimeren (New England Biolabs) i 20 mM Tris-HCl buffer, pH 8,0, som inneholder 10 mM MgCl2(endelige konsentrasjoner) /Bankier og Barrell, Techniques in Nucleic Acid Biochemistry,Elsevier, Ireland/. Blandingen inkuberes ved 55°C i 45 minutter slik at primeren rekombine-res til Ml3mp8 DNA. Reaksjonsblandingen gjøres 15 mM med hensyn på dATP, dGTP, dCTP og "Bio-ll-dUTP", og til sist tilsettes Klenow-fragmentet av DNA polymerase I. Denne reaksjonen inkuberes ved 25°C i et tidsrom som bestemmes for hver kombinasjon av reagenser. Reaksjonstiden optimaliseres slik at man oppnår ny syntetiserte DNA fragmenter som er

noe større enn EcoRI e innskuddet. For å bestemme den optimale tiden tas prøver reaksjonsblandingen ved forskjellige tider, og elektroforeres i denaturerende alkalisk agarosegel. /Maniatis et al., supre/. Denne fremgangsmåten vil gi giotin merket DNA med noen variasjoner i lengde; forleng-else av den merkede DNA ut over EcoRI e innskuddet inn i M13 sekvensen er imidlertid akseptabelt for det foreliggende formål.

DNA renses ved fenol/kloroform-ekstraksjon og utfelles med etanol. Det oppløses i 20 mM Tris-hybrokloridbuffer, pH 8,0, og etidium-residuet innføres som kovalente interkaleringskomplekser. For dette formål fremstilles 8-azidoetidium og renses som beskrevet av Graves et al., (1977) Biochim. Biophys. Acta 479:98. (Foreliggende studier viser at denne fremgangsmåten gir en blanding av 3- og 8-azidoetidium isomere).

En oppløsning av det biotin-merkede DNA kompleksbundet med M13 sjablongen (ca. 50 ug DNA/ml) gjøres 0,5 mM med hensyn til 8-azidoetidium og fotolyseres i 1 time ved en avstand på 10 til 20 cm fra en 150 watts utendørs lyskaster. DNA-oppløsningen omrøres under fotolysen i et glass reaktør-rør som befinner seg i et glass-vannbad. Glasset adsorberer ultrafiolett stråling og vannbadet benyttes for å holde reak-sjonstemperaturen mellom 20 og 30°C.

Ved slutten av fotolysen fjernes de ikke-kovalent bundne etidium fotolyseproduktene ved 10 suksessive ekstraksjoner med vann mettet med n-butanol. Deretter utfelles DNA med etanol og oppløses i Tris-bufferen. Mengden av kovalent bundet DNA estimeres ved hjelp av optiske absorbsjonsmålinger

or~>3—1—1

og ekstinksjonskoeffesientene på E. qn = 4 x 10 M cm for fotolysert etidiumazid, relasjonen mellom A2goog A490for fotolysert etidium bundet til DNA /& 266 =''^A490 X 2,3 ^ ~ 0,011/ og E25Q^ 1,3 x 10 M cm for DNA-baseparkon-sentrasjonen.

Etidiumet vil være kovalent bundet til DNA tilnærmet uteluk-kende i det dobbeltkjedede området hvor interkaleringskomplekser kan dannes. Målet er å introdusere et etdiumresidum pr. 10 til 50 basepar. Fotolysereaksjonen går tilnærmet til fullbyrdelse i løpet av 1 times reaksjonstid og inkorporeringen av etidium kan nedsettes ved å redusere fotolyse-tiden eller ved å redusere etidiumkonsentrasjonen. Inkorporeringen kan økes ved å gjenta fotolysen med nytt 8-azidoetidium.

Det endelige trinn er separeringen av den biotinmerkede og interkollator-modifiserte proben fra Ml3mp8 sjablong DNA. Separasjonen utføres ved hjelp av elektroforese i alkalisk agarosegel /Maniatis et al., supra/. DNA båndene detekteres i gelen ved fluorescensfarging med etidiumbromid. Det biotin-merkede DNA er mindre enn M13mp8 sjablong-kjeden og migrerer derfor fortere. Gel som inneholder det biotinmerkede DNA, fjernes og DNA gjenvinnes ved elektroeluering som beskrevet av Maniatis.

B. Fremstilling av monoklonalt antistoff til etidium-interkollert DNA.

1. Fremstilling av kovalent etidium-DNA komplekser.

Ca. 250 g laksesperma DNA (Sigma Chemical Co., Ct. Louis,

MO) oppløses i 40 ml av 50 mM NaCL og kappes ved fem passasjer gjennom en nål (23 gauge). Det kappede DNA plasseres i en 250 ml flaske og fortynnes med ytterligere 160 ml buffer.

145 mikroliter (145ul) av S-^nuklease, 200.000 enheter pr.

ml (Pharmacia P-L Biochemicals, Piscataway, NJ), tilsettes og blandingen inkuteres ved 27°C i 50 minutter.

Deretter ekstraheres reaksjonsblandingen to ganger med fenol: kloroform, en gang med kloroform og DNA utfelles to ganger med etanol /Maniatis et al., supra/. Den endelige utfellingen oppløses i 70 ml av 20 mM Tris-hydrokloridbuffer, pH 8,0. Dette DNA reageres med 8-azidoetidium under følgende betingelser. Reaksjonsblandingen fremstilles med 33 ml av 2,7 mg DNA/ml, 13,5 ml av 4,95 mM 8-azidoetidium, 13,5 ml av 0,2

M Tris-hydrokloridbuffer, pH 8,0, 0,2 M NaCl, og 76 ml vann. Blandingen plasseres i et 250 ml begerglass med en vannmantel som holdes ved 22°C. Blandingen omrøres og belyses i 60 minutter ved hjelp av en 150 watts lyskaster ved en avstand på 10 cm. Denne fotolysen gjentas med en identisk reaksjon sb landing .

De fotolyserte reaksjonsblandingene samles og ekstraheres

10 ganger, hver gang med et like stort volum av n-butanol mettet med 20 mM Tris-hydrokloridbuffer, pH 8,0, 0,2 M NaCl. Den ekstraherte DNA oppløsningen kombineres med 23 ml av

4,95 mM 8-azidoetidium og 77 ml av 20 mM Tris-hydroklorid-buf fer, pH 8,0, 0,2 M NaCl. Denne oppløsningen fotolyseres i 60 minutter som beskrevet ovenfor. Reaksjonsproduktene ekstraheres 10 ganger med buffer-mettet butanol som beskrevet ovenfor, og DNA utfelles med etanol. Utfellingen oppløses i 10 mM Tris-hydroklorid-buffer, pH 8,0, 1 mM EDTA og absor-bansene ved 260 og 490 nm registreres. 2. Fremstilling av kovalent etidium-DNA metylert tyroglobulin kompleks.

Metylert tyroglobulin (5 mg) fremstilt som beskrevet i eksempel I, del B-2 ovenfor, oppløses i 1,0 ml vann og 5,6 ml av en 2,2 mg/ml kovalent etidium DNA oppløsning tilsettes.

En utfelling dannes straks og suspensjonen fortynnes til

62,5 ml med 0,15 M NaCl. Denne suspensjonen emulgeres med et like stort volum av Freunds hjelpestoff og hver BALB/c mus immuniseres subkutant med 0,5 ml av blandingen. Forsterkningsimmuniseringer gis med 2 ukers mellomrom med den samme blandingen. Blodprøver tas en uke etter hver immunisering med start etter den tredje forsterkningsimmuniseringen.

Antistoff titere analyseres ved standard enzym-merke immuno- adsorbant fremgangsmåter. Kovalent interkollert DNA, dobbeltkjedet DNA og enkeltkjedet DNA belegges på mikro-titerbrønner som beskrevet i eksempel I, del B-3 ovenfor. Fortynnet antiserum inkuberes i de belagte brønnene og antistoff bundet til de immobiliserte antigenene detekteres som beskrevet ovenfor. Antiserum sorteres slik at det benyttes serum som har lave titere for enkelt og dobbeltkjedet DNA, men høye titere for kovalent interkallert DNA.

I et ekstra forsøk måles antistoff titere til ikke-kovalent etidium-DNA interkolleringskompleks. For dette formålet belegges dobbeltkjedet DNA på brønnene, og 100 um etidiumbromid innbefattes i det fortynnede antiserum, og alle etterfølgende binde- og vaske-oppløsninger, men det innbefattes ikke i substratoppløsningen som benyttes for måling av enzymaktiviteten.

Antiserum gir typisk høyere titere for kovalent interkallert DNA enn for de ikke-kovalente kompleksene. Denne forskjellen skyldes nærværet av antistoffer til etidium-residuet som blir kovalent bundet med lavt utbytte til fosfat-ribosestrukturen av dobbeltkjedet DNA. Derfor velges dyr med høye titere for ikke-kovalent interkallert DNA for fremstilling av hybridomas.

Miltceller fra utvalgte mus smeltes sammen med myelomaceller slik at det dannes hybridomas /Stuart et al., supra; Gilfre og Milstein, supra/. Hybridomacellene klones i selektive medier og de som produserer antistoffer til ikke-kovalent interkallert DNA, velges for antistoffproduksjon intraperitonealt i mus.

Antistoffet isoleres fra ascites-væsken som beskrevet i eksempel I, del B-3 ovenfor. C. Fremstilling av B-galaktosidase-Straptavidin-konjugat.

Sulfidryl-residuer på3-galaktosidase eksponeres ved reduk-sjon av med titiotreitol.6-galaktosidase (30.000 enheter, kvalitet VIII, Sigma Chemical Co.) i 2 ml 0,1 M N-2-hydroksy-etyl-piperazin-N<1->2-etansulfonat-buffer (HEPES), pH 7,0,

0,09 M NaCl, blandes med 3,5 umol av ditiotreitol og får stå ved romtemperatur i 4 timer. Ditritreitolen fjernes ved kromatografering på en 2,8 x 8 cm kolonne av "Sepharose 6B Cl" i bufferen beskrevet ovenfor. Fraksjoner som inneholder proteiner samles i en beholder. Antall mol av sulfhydrylgruppper pr. mol av enzym måles ved fremgangsmåten angitt av Ellman (1959) Arch. Biochem. Biophys. 82:70.

Ravsyreimidyl-4-(N-maleimidometyl)cykloheksan-l-karboksylat (SMCC) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL), 5,3 mg, oppløses i 250 ul av vannfriN,N-dimetylformamid og en 40ul del blandes med 3 ml 0,1 M HEPES-buffer, pH 7,0, 0,15 M NaCl. En 25

ul del av den vandige oppløsningen tilsettes til 825 ul av HEPES/NaCl buffer, og 100 ul av 1 mM glutation (redusert form). Når denne reaksjonsblandingen har stått ved romtemperatur i 15 minutter, bestemmes det ureagerte glutation ved Ellman's fremgangsmåte. Resultatene benyttes til å beregne SMCC-konsentrasj onen.

Streptavidin fra Bethseda Research Laboratories, Gaithers-burg, MD, utveksles i 0,1 M HEPES buffer, pH 7,0, 0,15 M

NaCl ved gel eksklusjonskromatografi i "Biogel P-6DG".

Etter utvekslingen blandes 1,75 ml av 3,7 mg/ml streptavidin med 17,6 ul av 61 mM SMCC og får reagere i 1 time ved 30°C.Reaksjonsblandingen kromatograferes på en 1 x 25 cm kolonne av "Biogel P6DG" i HEPES bufferen. Fraksjonene som tilsvarer den første effluent-toppen med absorbans ved 280 nm samles og analyseres for maleimid-innhold ved tilbaketitrering av glutation som beskrevet ovenfor.

Siden maleimidet er utsatt for hydrolyse, initieres kobling til B-galaktosidase så snart som mulig. Aktivert streptavidin, 3,9 mg, i 3,3 ml av HEPES bufferen tilsettes til 32

mg av redusert B-galaktosidase, slik at det gir reaksjons-volum på 9,3 ml. Etter 4 timer ved 25°C, slukkes reaksjonen ved tilsats av 800 ul av 1 mM glutation og inkuberes i ytterligere 30 minutter ved 25°C. Deretter kromatograferes reaksjonsblandingen på en 1,5 x 110 cm kolonne av "Biogel A-I,5

m" og utvikles med 0,1 M HEPES buffer, pH 7,0, 0,15 M NaCl.

2 ml fraksjoner samles og absorbansen ved 280 nm registreres. Den første toppen samles for videre studier. D. Immobilisering av antistoff til etidium interkollert DNA.

Det monoklonale antistoffet til etidium interkollert DNA immobiliseres på "Act-Magnogel AcA44" som beskrevet i eksempel 1, del C ovenfor.

E. Hybridiseringsanalyse for cytomegalovirus i urin.

Bearbeidelse av urinprøver og hybridiseringsreaksjoner ut-føres som beskrevet i eksempel I, del E ovenfor, bortsett fra at biotinmerket DNA-probe (delA) benyttes istedet for RNA-proben. Etter hybridiseringsreaksjonen tilsettes 650

ul av 0,1 M natriumfosfat-buffer, pH 7,4, som inneholder 2 mM MgCl,,, 5,0 mg bovinserumalbumin/ml og det immobiliserte antistoffet til etidium interkollert DNA (del D ovenfor). Blandingen ristes i 30 minutter på en slik måte at det faste antistoffet holdes i suspensjon. Deretter tilsettes 50 ul av B-galaktosidase merket streptavidin og ristingen fortsettes i 1 time.

Når inkuberingen er avsluttet, trekkes den faste fasen til den ene veggen av reaksjonsrøret med en magnet og væsken fjernes ved avsugning. Den faste fasen vaskes to ganger, hver gang med 1 ml 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 7,4, som inneholder 2,0 mM MgCl2og 0,1%"Tween 20" (vol/vol). Enzymaktiviteten assosiert med den faste fasen måles ved tilsats av 1,0 ml av 0,1 M natriumfosfatbuffer, pH 7,4, som inneholder 800 um 7-B-galaktosyl-3-/6-aminoheksylkarboks-amid/ coumarin /Worah et al., (1981) Clin. Chem. 27:673/. Ved slutten av denne inkuberingen trekkes de fastes partiklene til bunnen av kyvetten med en magnet, og flourescensen av oppløsningen registreres ved bruk av 400 nanometer (nm) excitering og 450 nm emirisjon.

En kontrollanalyse kjøres parallelt med en urinprøve som man vet er fri for cytomegalovirus. Fluorescenssignalene som genereres i de infiserte urinprøvene, vil være høyere enn signalene fra kontrollprøvene.

Claims (14)

1. Fremgangsmåte for detektering av en spesiell poly-nukleotidsekvense i en prøve som innbefatter enkeltkjedede nukleinsyrer, som innbefatter at prøven bringes i kontakt med en nukleinsyreprobe som innbefatter minst er. enkeltkjedet basesekvens som i det vesentlige er komplementær med sekvensen som skal detekteres, under betingelser som er gunstige for hybridisering mellom prober: cg sekvensen som skal detekteres, og bestemmelse av det resulterende duplekset, karakterisert ved dupleksene som dannes ved hybridiseringen mellom den komplementære probe-sekvensen og sekvensen som skal detekteres, bringes i kontakt med en antistoff-reagens som er selektiv forbinding til slike duplekser, hvor antistoff-reagensen er immobilisert eller deretter gjøres immobil, og dupleksene som bindes til den immobiliserte antistoff-reagensen bestemmes.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoff-reagensen er selektiv forbinding til (i) DNA'RNA hybrider hvor enten proben eller sekvensen som skal detekteres er DNA og andre er RNA, (ii) RNA'RNA hybrider hvor både proben og sekvensen som skal detekteres er RNA, eller (iii) interkalleringskomplekser hvor dupleksene som dannes i analysen innbefatter en nukleinsyre interkallator bundet dertil i form av interkalleringskomplekser .

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at dupleksene som bindes til den immobiliserte antistoff-reagensen bestemmes ved tilsats av en merket form av en andre antistoff-reagens som er istand til binding med dupleksen, hvor første og andre antistoff-reagens fortrinnsvis er samme stoff, og merket som assosieres med den immobiliserte reagensen måles.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, k a r a k - terisert ved at proben er merket og dupleksene som bindes til den immobiliserte antistoff-reagensen bestemmes ved å måle merket som er blitt forbundet med den immobiliserte reagensen.

5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at antistoff-reagensen tilsettes en oppløselig form og bindes til en spesifik bindbar ligand, og ved at de resulterende duplekser i tillegg bringes i kontakt med immobilisert form av en bindende partner for denne ligand.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at liganden er biotin eller en hapten, og den bindende partner er henholdsvis avidin eller et anti-hapten antistoff.

7. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at merket er en enzymatisk aktiv gruppe, en fluorescerende gruppe, en kromoforerende gruppe, en luminiscerende gruppe, en spesifikt bindbar ligand, eller et radioisotop.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at prøven er en biologisk prøve som har vært utsatt for betingelser som frigjør og denaturer-er nukleinsyrer som er tilstede i prøven.

9. Reagenssystem for detektering av en spesiell polynukleotid sekvens i en prøve, som innebefatter nukleinsyreprobe som inneholder minst en enkelt kjedet basesekvens som i det vesentlige er komplementær med sekvensen som skal detekteres, karakterisert ved at den i tillegg innbefatter en antistoff-reagens som er selektiv forbinding til duplekser dannet vedh ybr idisering mellom den komplementære probe-sekvensen og sekvensen som skal detekteres, hvor antistoff-reagensen enten er immobilisert eller bindes til en spesifik bindbar ligand, og dersom den nevnte binding ikke er immobilisert, en immobilisert form av en bindende partner for den nevnte ligand.

10. Reagenssystem ifølge krav 9, karakterisert ved at antistoff-reagensen er selektiv forbinding til (i) DNA'RNA hybrider hvor enten proben eller sekvensen som skal detekteres er DNA og den andre er RNA, (ii) RNA'RNA hybrider hvor både proben og sekvensen som skal detekteres er RNA, eller (iii) inerkolleringskomplekser hvor dupleksene som er dannet i analysen innbefatter en nukleinsyre interkollator bundet dertil i form av interkolleringskomplekser.

11. Reagenssystem ifølge krav 9 som i tillegg innbefatter en merket form av en andre antistoff-reagens som selektiv forbinding til de nevnte duplekser, karakterisert ved at første og andre anti-stof f -reagens fortrinnsvis er samme stoff.

12. Reagenssystem ifølge krav 9, karakterisert ved at proben innbefatter et merke.

13. Reagenssystem ifølge enten krav 11 eller 12, karakterisert ved at merket er en enzymatisk aktiv gruppe, en fluorescerende gruppe, en kromoforerende gruppe, en luminiscerende gruppe, en spesifikt bindbar ligand, eller et radioisotop.

14. Reagenssystem ifølge krav 9, karakterisert ved at liganden er biotin eller enh apten, og den nevnte bindende partner er henholdsvis avidin eller et anti-hapten antistoff.