NO844849L - Hybridiseringsanalyse ved anvendelse av merkede par av hybridbindende reagenser - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører nukleinsyre hybridiser-ingsanalysemetoder og reagenssystemer for detektering av spesifike polynukleotide sekvenser. Prinsippet for nukleinsyre hybridiseringsanalyser ble utviklet ved arbeider innen feltet rekombinant DNA forskning for å bestemme og isolere spesielle polynukleotide basesekvenser av interesse. Det ble funnet at enkeltkjedede nukleinsyrer, f.eks. DNA og RNA, slik som de oppnås ved denaturering av de dobbeltkjedede former, hybridiserer eller rekombinerer under egnede betingelser ved komplementære enkeltkjedede nukleinsyrer.

Ved å merke slike komplementære probenukleinsyrer med en

lett detekterbar gruppe, kan man detektere nærværet av en hvilken som helst polynukleotidsekvens av interesse i et forsøksmedium som inneholder prøve nukleinsyrer på enkeltkjedet form.

I tillegg til feltet rekombinant DNA, kan den analytiske hybridiseringsteknikken anvendes til detektering av viktige polynukleotider blant annet innen feltene human- og veteri-nærmedisin, jordbruk, og næringsmiddelvitenskap. Spesielt kan teknikken anvendes til detektering og identifisering av etiologiske agenter som f.eks. bakterier og virus, til å undersøke bakterier med hensyn til antiobiotisk resistens, til å lette diagnosen av genetiske forstyrrelser som f.eks. sigdcelleanemi og talassemia, og til detektering av kreft-celler. En generell oversikt over teknikken og dens nåværende og fremtidige betydning, finnet i Biotechnology (august 1983), side 471-478.

Den følgende informasjonen tilveiebringes for å gjøre kjent informasjon som antas å være relevant med hensyn til foreliggende oppfinnelse. Den følgende informasjon utgjør ikke tidligere kjent teknikk som skal vurderes mot foreliggende oppfinnelse.

Teknikkens stand når det gjelder nukleinsyre hybridiserings-analyseteknikk, innbefatter generelt en separering av hybridisert og uhybridisert merket probe. Dette nødvendige separasjonstrinnet lettes ved at enten prøve nukleinsyrene eller nukleinsyreproben immobiliseres på en fast bærer. Vanligvis detekteres hybridiseringen mellom spesielle basesekvenser eller gener av interesse i prøvenukleinsyrer og en merket form av probe nukleinsyren ved separering av den faste bæreren fra den gjenværende reaksjonsblanding som inneholder uhybridisert probe, etterfulgt av detektering av merket på den faste bæreren.

Det gjøres stadig forsøk på å forenkle den analytiske fremgangsmåten for utføring av nukleinsyre hybridiseringsanalyser. Den primære hensikt ved disse anstrengelsene er å redusere kompleksiteten ved fremgangsmåten i en slik grad av den enkelt og rutinemessig kan utføres i kliniske laboratorier. Nødvendigheten av et separasjonstrinn er i stor grad til hindre for disse bestrebelsene. Separasjonstrinnet krever betydelig ekspertise dersom det skal utføres på en analytisk reproduserbar måte, og det er en prosess som ikke lett kan automatiseres eller anvendes på store forsøksvolumer.

Videre møter man to betydelige vanskeligheter ved konvensjonelle fremgangsmåter som innbefatter immobilisering av prøve nukleinsyrer. For det første er de fremgangsmåtene som kreves for å oppnå immobilisering generelt tidkrevende og utgjør et ekstra trinn hvilket er uønsket for rutinemessig bruk av teknikken i kliniske laboratorier. For det andre kan proteiner eller andre materialer i den hetero-gene prøven, spesielt i tilfelle med kliniske prøver, påvirke immobiliseringsprosessen.

Som alternativer til immobilisering av prøve nukleinsyrer

og tilsats av merket probe, kan man immobilisere en probe og merke prøve nukleinsyrene in situ, eller man kan benytte en dual hybridiseringsteknikk som krever to prober, hvorav den ene immobiliseres og det andre merkes. Det første alternativet er imidlertid enda mindre ønskelig fordi in

situ merking av prøve nukleinsyrer krever større tekniske ferdigheter enn man kan forvente hos klinisk laboratorie-personell, og det finnes ingen enkle, pålitelige fremgangsmåter for å styre merkeutbyttet, dette kan være et betydelig problem dersom merkemediet inneholder variable mengder av inhibitorer for merkingsreaksjonen. Den duale hybridiseringsteknikken har den ulempen at den krever en ekstra reagens og et inkuberingstrinn, og kinetikken for hybridiseringsreaksjonen kan være treg og ineffektiv. Nøyaktigheten av analysen kan også være variabel dersom komplementariteten av de to probene med prøvesekvensen er variabel.

Noen av problemene som er diskutert ovenfor, løses ved

å anvende en immobilisert RNA probe og detekterer resulterende immobiliserte DNA"RNA eller RNA'RNA hybridier med et merket spesifikt anti-hybrid antistoff (se US patentsøk-nad nr. 616.132, inngitt 1. juni 1984). Denne teknikken krever fremdeles et separasjonstrinn og har derfor de ulem-per som er diskutert ovenfor, og er felles for alle hybridiseringsteknikker som krever se separasjonstrinn.

US-PS 3.996.345; 4.233.402; og 4.275.149 beskriver analyser til deteksjon av antigener ved immunoanalyseteknikker som innbefatter enzympar og energioverføringsvekselvirkninger.

Europeisk patentsøknad nr. 70.685 foreslår en hybridiserings-analyseteknikk som eliminerer behovet for å fysisk separere hybridisert fra uhybridisert probe. Det foreslås å anvende et par av prober som hybridiserer til tilstøtende områder av en polynukleotidsekvens av interesse, og å merke en probe med en kjemiluminescent katalysator som f.eks. enzymet peroksydase og den andre med et absorberende molekyl for den kjemiluminescente emmisjonen. Katalysator- og absorbent merkene må være plassert nær de tilgrensende terminalender av de respektive probene på en slik måte at det ved hybridisering observeres slokking av den kjemiluminescente emmisjonen ved energioverføring til det absorberende molekylet.

For å utføre en slik analyse må man være istand til kontrol- lerbart å syntetisere to kritisne probereagenser slik at de respektive merkene bringes i en slukkende orientering med hensyn til probe nukleinsyren uten å påvirke de respektive merkede probesegmenters tendens til virkelig å undergå hybridisering.

Man har nå kommet frem til en nukleinsyre hybridiseringsanalyse som er basert på benyttelsen av nabopar av vekselvirkende merker som gir et detekterbart signal som er målbart forskjellig for den hybridiserte proben sammenlignet med uhybridisert probe. På denne måten foreligger det ikke noe behov for å separere hybridisert og uhybridisert probe, dette letter i stor grad gjennomføringen og automatiseringen av analysen. I tillegg er analysesignalet ikke-radioiso-topt av natur og oppfyller dermed et annet kriterium for en hensiktsmessig analyse, anvendelsen av deteksjonssystemer som ikke innbefatter radioaktivitet.

Ifølge foreliggende oppfinnelse detekteres spesifike polynukleotide sekvenser i en prøve ved at det dannes et hybrid mellom sekvensen som skal detekteres og en nukleinsyreprobe som har en komplementær sekvens på en slik måte at det resulterende hybrid har bindingsposisjoner for to forskjellige spesifike bindingsreagenser. Den ene av disse bindings- reagensene innbefatter et første merke og den andre et andre merke, hvor vekselvirkningen mellom de to merkene tilveiebringer en detekterbar respons som er målbart forskjellig, enten i positiv eller negativ forstand, når de to merkede reagensene bindes til samme hybrid sammenlignet med det tilfellet at de ikke bindes på denne måten.

Når de bindes de det samme hybridet, bringes de to merkene

i nabovekselvirkningsavstand til hverandre, derved øker vekselvirkningene mellom de to merkene som gir signal i stor grad sammenlignet med de relativt mindre hyppige vekselvirkningene som finner sted i bulk oppløsningen.mellom frie diffunderbare, merkede reagenser.

En foretrukket vekselvirkning mellom de to merkene er en trinnvis vekselvirkning hvor det første merket deltar i en første kjemisk reaksjon, slik at det dannes et diffunderbart produkt som er en deltager i en andre kjemisk reaksjon med det andare merke, slik at det dannes et detekterbart produkt. Det er spesielt foretrukket at det første og det andre merket er katalysatorer, f.eks. enzymer, for henholdsvis den første og den andre kjemiske reaksjonen. Dersom f.eks. det første merket er glukose oksydase og

det andre er peroksydase, vil hydrogenperoksydet som dannes ved virkningen av glukoseoksydase på glukose, diffundere til peroksydasemerket og detekteres som et optisk signal i nærvær av en egnet indikatorfargesammensetning. Et annet foretrukket merkepar er et par som innbefatter energiover-føringsvekselvirkning som f.eks. mellom et fluorescerende eller luminiscerende stoff, og en slukker for fotoemmisjonen fra det første merket.

Med hensyn til naturen av de spesifike bindende agenser

som benyttes, må i prinsippet minst en av de to bindes en en posisjon som er unik for hybrider dannet i analysen sammenlignet med uhybridiserte nukleinsyrer fordi signal genereringen må være avhengig av dannelsen av slikt hybrid. Derfor vil den spesifike bindende reagensen fortrinnsvis være et antistoff som er selektivt for hybridet sammenlignet med enkeltkjedede nukleinsyrer som er tilstede i analyse-blandingen. Et stort antall forskjellige andre bindende reagenser kan benyttes som beskrevet nedenfor.

Foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved et antall betydelige fordeler. I tillegg til hovedfordelen som er eliminering av separasjonstrinnet, kreves det ikke noen immobilisering av hverken prøve eller probe nukleinsyrer som gir opphav til ikke-spesifik binding og reproduserbar-hetsproblemer ved vanlig anvendte hybridiseringsteknikker. En annen fordel er at analysen kan utføres uten vasketrinn.Analysereagensene kan tilsettes trinnvis til hybridiserings-mediet, uten behov for å vaske uoppløselige bærermaterialer.

Et annet vesentlig trekk ved foreliggende oppfinnelse er

at deteksjonssystemet som anvendes er spesielt effektivt fordi dobbeltkjedede duplekser kan inneholde mange bindings-posisjonser for den første og den andre merkede reagensen. Dette resulterer i at store mengder av det første og det andre merke festes i vekselvirkende konfigurasjon per enhet hybridisert probe. Når man vurderer antistoffer til RNA"-DNA eller RNA'RNA hybrider, kan et merket antistoff bindes til tilnærmet hvert 10. basepar av hybridet. Dersom proben f.eks. er 500 baser lang, kan 40-50 antistoff bindes. Ligander som passer til merkede bindende proteiner, kan innføres i prober i mengder på 1 ligand pr. 5-20 baser. Nærværet av multiple bindingsposisjoner på hybrider kan

med fordel benyttes når små mengder hybrid må detekteres.

Fig. 1-3 er skjematiske illustrasjoner av foretrukne fremgangsmåter for utførelse av foreliggende oppfinnelse.

Disse fremgangsmåtene beskrives i detalj nedenfor.

Anvendelsen av nukleinsyrehybridisering som et analyttisk verktøy er fundamentalt plassert på den dobbeltkjedede, duplekse strukturen av DNA. Hydrogenbindingene mellom purin- og pyimidin-basene i de respektive kjedene i dobbeltkjedet DNA, kan brytes reversibelt. De to komplementære enkeltkjedene av DNA som resulterer ved denne "smeltingen" eller "denatureringen" av DNA, vil assosieres (ofte kalt rekombinering eller hybridisering) slik at dupleksstruk-turen igjen dannes. Som kjent vil kontakt mellom en første enkeltkjedet nukleinsyre, enten DNA eller RNA, som innbefatter en basesekvens som er tilstrekkelig komplementær med (dvs. "homolog med") en andre enkeltkjedet nukleinsyre under egnede betingelser, resultere i dannelse av DNA'DNA-, RNA"DNA-, eller RNA'RNA-hybrider, avhengig av utgangsmateri-alene.

Proben vil innbefatte minst en enkeltkjedet basesekvens

som i det vesentlige er komplementær med, eller homolog

med sekvensen som skal detekteres. En slik basesekvens behøver imidlertid ikke å være et enkelt kontinuerlig poly-nukleotidsegment, men kan bestå av to eller flere individuelle segmenter som er avbrutt av ikke-homologe sekvenser. Disse ikke-homologe sekvensene kan være lineære, eller

de kan være selvkomplementære og danne hårnålssløyfer.

I tillegg kan det homologe området av proben være flankert på 3'- og 5<1->terminalene av ikke-homologe sekvenser, som f.eks. de som innbefatter DNA eller RNA av en vektor hvori den homologe sekvensen er innkutt for propagering. I ethvert tilfelle vil proben, når den er tilstede som analytisk reagens, vise detekterbar hybridisering ved et eller flere punkter med prøvenukleinsyrene av interesse. Lineære eller sirkulære enkeltkjedede polynukleotider kan benyttes som probeelement, hvor større eller mindre deler er dupleks-dannet med en komplementær polynukleotidkjede eller kjeder, forutsatt at det kritiske homologe segmentet eller segment-ene er i enkeltkjedet form og tilgjengelig for hybridisering med prøve DNA eller RNA. Det foretrekkes generelt å anvende prober som i det vesentlige er på enkeltkjedet form. Pre-parering av en egnet probe for en spesiell analyse er et spørsmål om rutinemessige ferdigheter.

Ifølge prinsippet ved foreliggende oppfinnelse, resulterer hybridiseringen, som er avhengig av nærværet av den polynukleotide sekvensen av interesse, og binding av de merkede reagenser til hybridet, i at de to merkene bringes tilstrekkelig nærhverandre, slik at signalet som dannes blir vekselvirkning mellom dem, er målbart forskjellig fra det signalet som dannes ved møter under enkel diffusjon i bulk-analyse-mediet. Forskjellige vekselvirkningsfenomener kan anvendes ved foreliggende oppfinnelse. Vekselvirkningen kan være kjemisk, fysisk, eller elektrisk, eller kombina-sjoner av disse kreftene. Omgivelsene for merket som dannes ved hybridisering og binding av de merkede reagenser til de dannede hybrider, heretter referert til som omgivelser forbundet hybrid, må i minst et kritisk henseende være distinkt forskjellig fra bulk-mediet. Siden hybridiseringen bestemmer andelen av merker som dannes i lokaliserte hybrid-omgivelser sammenlignet med bulkfasen, vil den resulterende signalresponsen være avhengig av nærværet av sekvensen som skal bestemmes i analysemediet.

En foretrukket vekselvirkning mellom de to merkene innbefatter to kjemiske reaksjoner hvor et merke deltar i den første reaksjonen og danner et diffunderbart mellomprodukt som deltar i den andre reaksjonen med det andre merket,

og gir et detekterbart produkt. Mikroomgivelsene for det bundne hybridet vil følgelig inneholde en høyere lokalisert konsentrasjon av mellomproduktet, slik at hastigheten for den signalproduserende andre merkereaksjonen økes, enn bulkoppløsningen. De to merkede kan henholdsvis delta i reaksjonen som reaktanter eller, spesielt foretrukket,

som katalysatorer. En eventuell katalyse kan enten være ensymatisk eller ikke-enzymatisk.

Et stort antall forskjellige enzymer og katalysatorer kan anvendes ved foreliggende oppfinnelse. Nyttige enzymer for den første reaksjonen innbefatter oksydoreduktaser, spesielt slike som inneholder nukleotider som f.eks. nikotin-amid a de ni'n dinukleotid (NAD) eller dets reduserte form (NADH), eller adenosin trifosfat (ATP) som kofaktorer eller slike som produserer hydrogenperoksyd eller andre små diffunderbare produkter. Noen eksempler er alkoholdehydrogenase, glycerol dehydrogenase, laktat dehydrogenase, malat dehydrogenase, glukose-6-fosfat-dehydrogenase, glukoseoksydase og uricase. Andre klasser av enzymer som f.eks. hydrolase, transferase, lyaser, og isomeraser kan også anvendes.

Det er spesielt foretrukket at det andre merke også er

et enzym hvor produktet av den første enzymreaksjonen er et substrat eller en kofaktor for det andre enzymet, slik at man oppnår rask enzymreaksjon i omgivelsene for det bundne hybridet. Dersom f.eks. det første enzymet er en oksydorduktase, som danner hydrogenperoksyd som produkt,

kan det andre enzymet være peroksydase. En detaljert opp-listing og beskrivelse av nyttige enzymer finnes i US-PS 4.233.02 og 4.275.149. Andre nyttige systemer innbefatter et enzym som det første merke som katalyserer en reaksjon som danner en prostetisk gruppe for et apoenzym eller pro-enzym. Ikke-enzymatiske katalysatorer kan også tjene som merker som nevnt tidligere. Som et eksempel kan det refereres til US-PS 4.160.645.

En annen foretrukket vekselvirkning mellom merkene er energi-overføringsvekselvirkning. Det første merke er et foto-emmiterende stoff som f.eks. et fluorescerende- eller luminiscerende stoff, det førstnevnte vil emmitere ved bestråling og det andre vil emmitere ved kjemisk reaksjon. Fotoemmisjonen kan absorberes av det andre merke, slik at emmisjonen enten flokkes eller tilveiebringer en annen emmisjon som f.eks. dersom det absorberende merke selv er fluorescerende. Par av forbindelser som er nyttige for dette formål, beskrives i detalj i US-PS 4.275.149 og 4.318.981. Noen foretrukne fluorescerende/slukkende par er naftalen/antracen, a-naftylamin/dansy1, tryptofan/dansyl, dansyl/fluorescein, ffluorescein/rodamin, tryptofan/fluorescein, N-/p-(2-benzoksazolyl)fenyl/maleimid (BPM)/tiokrom, MPB/8-anilino-1-naftalensulfonat (ANS), tiokrom/N-(4-dimetylamino-3,5-dinitrofenyl)maleimid (DDPM), og ANS/DDPM. Noen foretrukne luminiscerende/slukkende par er luminol med fluorescein, eosin eller rodamin S.

Dersom det ønskes, kan forskjellige modifikasjoner av de merkede reagensene anvendes innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse. Ved en variasjon kan en av de merkede reagensene innbefatte en fast fase, hvortil det bindende stoffet er bundet og separat også merket. Den faste fasen kan være veggene av reaksjonsbehol-deren eller et dispergert faststoff som f.eks. polyakryl-amid- eller agaroseperler. Man kan også modifisere det bindende stoffet med en bindbar ligand som f.eks. en hapten eller biotin, og innføre merke ved tilsats av et merket anti-hapten antistoff eller merket avidin før eller etter hybridiseringsreaksjonen. Det fremgår følgelig at merket kan forbindes med det bindende stoffet direkte eller in-direkte ved hjelp av mellomliggende komponenter.

Et kritisk trekk ved foreliggende oppfinnelse er dannelsen av et hybrid mellom proben og den polynukleotide sekvensen av interesse som innbefatter bindingsposisjoner for de to spesifike bindende reagensene. Et prinsipp for analysen er 2.t hybridiseringen av proben med den ønskede sekvensen medfører at de respektive bindingsposisjonene for de to bindende reagensene bringes til en slik avstand fra hverandre at vekslevirkning mellom merkene kan finne sted. Det kan benyttes en hvilken som helst utførelse av systemet som gir en bindingsposisjon for minst en av de to merkede reagensene som er unikt for hybridet. Derved sikres at den ønskede lokalisering av merkeparet bare vil finne sted ved dannelsen av hybridet.

Bindingen av merkereagense til hybridet vil normalt innbefatte en meget spesifik ikke-kovalent binding, som er karak-teristisk for en rekke biologisk r avledede stoff, spesielt bindende proteiner som f.eks. immunoglobuliner. En rekke bindende stoff kan benyttes for å tilveiebringe minst en bindende reagens som har unik bindingsaffinitet for hybridet og ubetydelig bindingsaffinitet for enkeltkjedede nukleinsyrer som f.eks. uhybridisert probe og uhybridiserte prøve- . nukleinsyrer.

Spesielt foretrukne bindende stoff er antistoffreagenser

som har anti-hybrid bindingsaktivitet og kan være hele antistoffer eller fragmenter derav, eller aggregater eller konjugater derav, av konvensjonell polyklonal eller mono-klonal type. Foretrukne antistoffreagenser vil være de som er selektive for binding til (i) DNA'RNA eller RNA"RNA hybrider, eller (ii) interkaleringskomplekser. Man vet nå at antistoffer kan stimuleres slik at de er selektive

for DNA"RNA eller RNA'RNA hybrider fremfor enkeltkjedede nukleinsyrer, på det nåværende tidspunkt betraktes det imidlertid som umulig å generere slik selektivitet i tilfellet DNA * DNA hybrider. I den grad selektive DNA * DNA antistoffer utvikles i fremtiden, vil de klart kunne anvendes ved foreliggende oppfinnelse. Antistoffer til DNA"RNA eller RNA'RNA hybrider, kan benyttes der hvor proben er RNA og prøvenukleinsyrene er DNA eller RNA, eller der

hvor probene er DNA og prøven RNA.

Det bør videre bemerkes at når det refereres til en RNA probe, benyttet med en anti-DNA<*>RNA eller anti-RNA<*>RNA reagens, menes det her at ikke alle nukleotidene som innbefattes i proben må være ribonukleotider, dvs. bære en 2'-hydroksylgruppe. Det fundamentale trekk ved en RNA probe benyttet her, er at den er tilstrekkelig ikke-DNA

i karakter til å muliggjøre stimulering av antistoffer til DNA * RNA eller RNA"RNA hybrider som innbefater en RNA probe som ikke kryssreagerer i analytisk signifikant grad med de individuelle enkeltkjedene som utgjør slike hybrider. Derfor kan en eller flere av 2<1->posisjonene på nukleotidene som innbefattes i proben, være på deoksyform, forutsatt at antistoff-bindingsegenskapene som er nødvendige for at foreliggende analyse skal kunne utføres, opprettholdes i betydelig grad. På tilsvarende måte kan en RNA probe i tillegg til, eller alternativt til, slik begrenset 2'-deoksymodifikasjon, innbefatte nukleotider som har andre 2<1->modifikasjoner, eller generelt en hvilken som helst av modifikasjon langs ribosefosfat ryggraden, forutsatt at det ikke i betydelig grad påvirker spesifisiteten av antistoffet overfor det dobbeltkjedede hybridiseringsproduk-tet fremfor dets individuelle enkeltkjeder.

Der hvor slike modifikasjoner finnes i en RNA-probe, vil det immunogene som benyttes for å opprette antistoffreagensen fortrinnsvis innbefatte en kjede som i det vesentlige har tilsvarende modifikasjoner og den andre kjeden vil hovedsakelig bestå av umodifisert RNA eller DNA, avhengig av om prøve-RNA eller -DNA skal detekteres. Fortrinnsvis bør den modifiserte kjeden i immunogene bære identisk med den modifiserte kjeden i RNA probe. Et eksempel på et immunogen er hybridet poly(2'-0-metyladenylsyre)"poly (2<1->deoksytymidylsyre). Et annet eksempel er poly(2'-0-etylinosinsyre)"poly(ribocytidylsyre). Følgende forbindelser er ytterligere eksempler på modifiserte polynukleotider som kan være innbefattet i en RNA probe: 2'-O-metylribo-nukleotid, 2'-O-etylribonukleotid, 2<1->acidodeoksy ribonukleotid, 2'-klorodeoksyribonukleotid, 2'-0-acetyl ribonukleotid, og metylfosfonatene eller fosforotiolatene av ribonukleotider eller deoksy ribonukleotider. Modifiserte nukleotider kan være tilstede i RNA prober som et resultat av innføring under enzymsyntese av proben fra en sjablong. F.eks. er adenosin 5'-0-(1-tiotrifosfat) (ATpaS) og dATPaS substrater for henholdsvis DNA avhengige RNA polymeraser og DNA polymeraser. Alternativt kan den kjemiske modifika-sjonen innføres etter at proben er fremstilt. F.eks. kan en RNA probe 2<1->0-acetyleres med eddiksyreanhydrid under milde betingelser i et vandig oppløsningsmiddel.

Immunogener for stimulering av antistoffer spesifike for RNA'DNA hybrider kan innbefatte homopolymere eller heteropolymere polynukleotide duplekser. Blant de mulige homopolymere dupleksene er poly(rA)'poly(dT) spesielt foretrukket. /Kitagawa og Stollar (1982) Mol. Immunol. 19:413/. Generelt foretrekkes imidlertid heteropolymere duplekser og disse kan fremstilles på en rekke forskjellige måter, innbefattet transkripsjon av <t>X174 virion DNA med RNA polymerase /Nakasato (1980) Biochem 19:2835/. De valgte RNA' DNA dupleksene adsorberes på et metylert protein, eller bindes på annen måte til et konvensjonelt immunogent bærer-materiale, som f.eks. bovinserumalbumin, og injiseres i det ønskede vertsdyr /se også Stollar (1980) Meth.Enzymol. 70:70/.Antistoffer til RNA'RNA duplekser kan opprettes mot dobbeltkjedede RNA fra viruser som f.eks. reovirus eller Fiji sykdomsvirus som infiserer bl.a. sukkerrør. Også homopolymere duplekser som f.eks. bl.a. poly(ri)"poly (rC) eller poly(rA)"poly(rU), kan benyttes for immunisering som ovenfor. Ytterligere informasjon angående antistoffer til RNA"DNA eller RNA"RNA hybrider, er tilveiebragt i US patentsøknad nr. 616.132, inngitt 1. juni 1984.

Antistoffer til interkaleringskomplekser kan fremstilles mot et immunogen som vanligvis vil innbefatte et ionisk kompleks mellom et kationisk protein eller proteinderivat (f.eks. metylert bovinsyrealbumin), og det anioniske interkalator nukleinsyrekomplekset. Ideelt bør interkalatoren være kovalent koblet til den dobbeltkjedede nukleinsyren. Interkalator-nukleinsyrekonjugatet kan alternativt være kovalent koblet til et bærerprotein. Nukleinsyredelen av immunogenet kan innbefatte de spesifike parede sekvensene som finnes i analysehybrider eller kan innbefatte en hvilken som helst annen ønsket sekvens siden spesifisiteten av antistoffer generelt ikke vil avhenge av den spesielle basesekvensen som innbefattes. Ytterligere informasjon vedrørende antistoffer til interkaleringskomplekser er tilveiebragt i US patentsøknad nr. 560.429, inngitt 12. desember 19 83.

Som angitt ovenfor, kan antistoffreagensen bestå av hele antistoffer, fragmenter av antistoffer, polyfunksjonelle antistoffaggregater, eller generelt et hvilket som helst stoff som innbefatter en eller flere spesifike bindings-posis joner fra et antistoff. Når den foreligger i form av hele antistoff, kan de tilhøre en hvilken som helst av klassene eller underklassene av kjente immunoglobuliner, f.eks. IgG, IgM osv. Et hvilket som helst fragment av et hvilket som helst slik antistoff som beholder den spesifike bindingsaffiniteten for den hybridiserte proben kan også anvendes, f.eks. fragmentene av IgG konvensjonelt kjent som Fab, F(ab') og F(ab 1)2• 1 tillegg kan aggregater, polymerer, derivater og konjugater av immunoglobuliner eller fragmenter derav, benyttes der hvor det er hensikts-

messig.

Immunoglobulinkilden for antistoffreagensen kan oppnås

på en hvilken som helst tilgjengelig måte som ved konvensjonelle antiserum- og monoklonale teknikker. Antiserum kan oppnås ved velkjente teknikker som innbefatter immunisering av et dyr, som f.eks en mus, kanin, marsvin eller geit, med et egnet immunogen. Immunoglobulinene kan også oppnås ved somatiske cellehybridiseringsteknikker, disse resulterer i det som vanligvis betegnes som monoklonale antistoffer, dette innebærer også anvendelse av et egnet immunogen.

I de tilfeller hvor en antistoffreagens selektiv for interkaleringskomplekser anvendes som en av de bindende reagenser, kan en rekke interkalatorforbindelser benyttes. Generelt kan man si at interkalatorforbindelsen fortrinnsvis er et molekylav lavmolekylvekt, som er plant, vanligvis aroma-tisk men noen ganger polycyklisk, og istand til å danne binding med dobbeltkjedede nukleinsyrer, f.eks. DNA"DNA, DNA"RNA, eller RNA"RNA duplekser, vanligvis ved innskudd mellom basepar. Den primære bindingsmekanismen er vanligvis ikke-kovalent, hvor kovalent binding kan finne sted som et andre trinn der hvor interkalatoren har reaktive eller aktiverbare kjemiske grupper som vil danne kovalente bindin-ger med nabokjemiske grupper på en av eller begge de inter-kalerte duplekskjedene. Resultatet av interkaleringen er at nabo basepar spres til en avstand som er ca. dobbelt så stor som den normale separasjonsavstanden, dette ser ut til en økning av molekyllengdenfor duplekset. Videre må det finne sted en oppvinning av dobbeltspiralen på ca. 12-36° for at interkalatoren kan finne plass. Generelle oversikter og ytterligere informasjon finnes i Lerman, J. Mol. Biol. 3:18 (1961); Bloomfield et al., "PhysicalChemistry of Necleic Acids", kap. 7, side 429-476;Harper

og Rowe, NY (1974); Waring, Nature 219:1320 (1968); Hartmann et al., Angew. Chem., Engl. Ed. 7:693 (1968);Lippard,Accts. Chem. Res. 11:211(1978); Wilson, Intercalaltion

Chemistry )1982), 455; og Berman et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 10:87 (1981); samt den tidligere nevnte US patent-søknad nr. 560.429. Eksempler på interkalatorer er akridin-fargestoffer, f.eks. akridinorange, fenantridiner, f.eks. etidium, fenaziner, furocoumariner, fenotiaziner, og kino-liner.

Interkaleringskompleksene dannes i analysemediet under hybridiseringen ved bruk av en probe som er modifisert i dens komplementære, enkeltkjedede området slik at den har interkalatoren kjemisk bundet dertil på en slik måte at interkaleringskompleksene dannes under hybridiseringen.

En hvilken som helst velegnet fremgangsmåte kan benyttes

for å oppnå slik binding. En spesielt nyttig fremgangsmåte innbefatter acidointerkalatoren. Når de utsettes for ultra-fiolett lys av høy bølgelengde eller synlig lys, genereres de reaktive nitrenene lett. Nitrenene av arylazider fore-trekker innskuddsreaksjoner fremfor omdanningsprodukter /se White et al., Methods in Enzymol. 46: 644 (1977]_/. Eksempler på azidointerkalatorer er 3-azidoakridin, 9-azidoakridin, etidium monoazider, etidiumdiazod, etidium dimer-azid /Mitchell et al., JACS 104:4265 (19 8-2 )_/, 4-azido-7-klorokinolin, og 2-azidofluoren. Andre nyttige fotoreager-bare interkalatorer er furocoumarinene som danner /2+2/ cykloaddisjonsprodukter med pyrimidinresiduer. Alkylerings-midler kan også benyttes, som f.eks. bis-kloroetylaminer og epoksyder eller aziridiner, f.eks. aflatoksiner, poly-cykliske hydrokarbonepoksyder, mitomycin, og norphillin A. Den interkalator-modifiserte dupleksen denatureres

så slik at den gir den modifiserte enkeltkjedede proben.

Som nevnt må minst en av de bindbare reagensene være av

den typen som er diskutert ovenfor, det er imidlertid større valgmuligheter for den andre bindende reagensen siden denne ikke trenger å diskrimiere mellom hybridet og andre nukleinsyrer, innbefattet proben og prøvematerialene, for å oppnå den ønskede effekten. Følgelig kan den andre bindende

reagensen være den samme som eller et annet bindende materiale enn benyttet i den nevnte reagensen, bortsett fra at når den er den samme, består den endelige forskjellen i at analysereagensen merkes med det andre merket. Når man anvender en antistoffreagens som er selektiv forbinding av interkaleringskomplekser som begge de bindende reagaenser ønsker man normalt å anvende en probe som er modifisert slik at den har interkalatoren kjemisk bundet til proben,

i motsetning til tilsats som en oppløselig forbindelse.

Alternativt kan den andre bindende reagensen være et hvilket som helst materiale som bindes til proben. Dvs. at den kan være en antistoffreagens som bindes ikke-spesifikt til nukleinsyrer som f.eks. anti-DNA"DNA. Ved en annen utførelse anvendes en probe som innbefatter en spesifikt bindende ligand-del hvor den ikke-spesifikt bindende reagensen er en bindende partner for en slik ligand-del. I et slikt tilfelle kan ligand-del/bindende partner-paret velges fra kjente materialer som f.eks. haptener/antistoffer, antigener/antistoffer, lecitiner/polysakkarider, hormoner/ reseptorproteiner o.l. I denne forbindelse kan det refereres til britisk patent 2.019,408, europeisk patent søknad 63.879 og 97.373 og PCT publisert søknad 83-1459 og 83-2286 .

Selv om det generelt foretrekkes at de kritiske mikroomgivelsene for det bundne hybrider skapes i en del av eller hele det hybridiserte komplementære området av prøve/probe-dupleksen, kan prinsippielt slike mikroomgivelser også finnes på grensen mellom et slikt komplementært område og det flankerende området. Dette kan skje ved anvendelse av bindende reagenser som beskrevet ovenfor. I tillegg kan man benytte et bindende stoff for en bindingsposisjon på.dobbeltkjedede flankeringsområder av proben som den ikke-spesifike bindende reagensen. Eksempler på slike bindingsposisjon/bindende partner-par er promotorsekvenser (f.eks. lac-promotor, trp-promotor, og promotorer forbundet med bakteriofager)/polymerase; lac operator/lac repressor protein; og antiiske nukleotider og sekvenser (f.eks. Z-

DNA og sjeldne nukleotider som f.eks 5-halodeoksyuridiner)/ antistoffer dertil.

Med referanse til tegningene og de eksemplene som følger, kan et par spesifike utførelser av foreliggende analyse metode beskrives. Ved fremgangsmåten vist i fig. 1 anvendes en umodifisert polynukleotid probe som enten er RNA eller DNA når prøvesekvensen av interesse er RNA, når prøvesekven-sen er DNA er proben RNA. Bindingsreagensene er de samme eller forskjellige antistoffreagenser (Ab) som er selektive for RNA"DNA eller RNA'RNA hybrider avhengig av hvilke som foreligger. En antistoffreagens er merket med glukoseoksydase (GOD) og den andre mer peroksydase (POD). I nærvær av glukose og en fargeindikator for hydrogenperoksyd vil hastigheten for fargeutviklingen avhenge av omfanget av hybridiseringen som finner sted. I det bundne hybridet bringes glukoseoksydase og peroksydase til et område a fra hverandre, dette resulterer i en øket hastighet for fargeutvikling på grunn av rask diffusjon av hydrogenperoksyd til peroksydase. I bulkmediet må hydrogenperoksyd gjennomsnittlig diffundere avstanden b for å forårsake en fargeutvikling som gir opphav til en betydelig forandret hastighet. Even-tuelt kan katalase inkluderes i bulkoppløsningen i konsen-trasjoner tilstrekkelige til effektivt å ødelegge alt hydrogenperoksyd som diffunderer bort fra mikroomgivelsen for det bundne hybridet, slik at bakgrunnsfargedannelsen reduseres .

Anvendelsen av en ligand-modifisert probe er vist i fig.

2, hvor biotin (Bio) er den valgte ligand. I dette tilfellet er den GOD-merkede bindingsreagensen igjen et antistoff til.RNA'DNA eller RNA'RNA, avhengig av hvilken som foreligger, og den andre bindingsreagensen er POD-merket avidin (Av). Registreringen av fargeutviklingen vil foregå som beskrevet ved fremgangsmåte A.

Ved fremgangsmåten vist i fig. 3 er proben dobbeltmodifisert, med både biotin som i fremgangsmåte B og en kjemisk bundet interkalator (I). Et antistoff til interkaleringskomplekser som innbefatter I er merket med et fluorescerende stoff

(F) og avidin er merket med en slukker (Q). Fluorescens-

og slukker-merkene bringes i energioverføringsavstand a

i det bundne hybridet, slik at ved bestråling med lys av en første bølgelengde (hv^), vil den emmiterte energi (h^) absorberes av slukkeren og ikke detekteres. På den annen side vil fluorescens-merket antistoff i bulkoppløsningen befinne seg i en gjennomsnittlig avstand b fra slukkeren, hvilket ikke er nær nok for effektiv energioverføring,

og fluorescens emmisjonen observeres. Mengden av hlys som detekteres er omvendt proporsjonal med omfanget av hybridiseringen som finner sted.

Prøven som skal analyseres kan være et hvilket som helst medium av interesse, og vil vanligvis være en flytende prøve av medisinsk-, veterinærmedisinsk-, miljømessig-, ernæringsmessig-, eller industriell betydning. Humane og animale prøver og legemsvæsker kan spesielt analyseres ved foreliggende fremgangsmåte, innbefattet urin blod (serum eller plasma), fostervann, melk, cerebrospinalvæske, spytt, avføring, lungeaspirater, halsavstrykninger, genitalavstryk-ninger og eksudater, rektalavstrykninger, og nasopharnygale aspirater. I tilfeller hvor prøven som tas fra pasienten eller andre kilder for undersøkelse, inneholder hovedsakelig dobbeltkjedede nukleinsyrer, slik de f.eks. inneholdes i celler, behandles prøven for å denaturere nukleinsyrene,

og om nødvendig først å frigjøre nukleinsyrer fra celler.Denaturering av nukleinsyrer utføres fortrinnsvis ved oppvar-ming i kokende vann, eller ved alkalibehandling (f.eks.

0,1 N natriumhydroksyd) som om ønsket samtidig kan benyttes for å lyse cellene. Frigjøring av nukleinsyrer kan også oppnås ved f.eks. mekanisk nedbrytning (frysing/opptining, abrasjon, ved "hjelp av lydbølger), fysisk/kjemisk nedbrytning (rensemidler som f.eks. "Triton", "Tween", natriumdode-

cylsulfat, alkalibehandling, ostmotisk sjokk, eller varme), eller enzymatisk lysing (lysozym, proteinase K, pepsin).

Det resulterende forsøksmedium vil inneholde nukleinsyrer på enkeltkjedet form som såkan analyseres ifølge foreliggende hybridiseringsfremgangsmåte. I de tilfeller hvor RNA'DNA skal detekteres med merkede antistoffreagenser, kan m RNA

og rRNA i prøven forhindres fra deltagelse i bindingsreak-sjonen ved konvensjonelle fremgangsmåter som f.eks. behandling under alkaliske betingelser, f.eks. de samme betingelser som benyttes for å denaturere nukleinsyrene i prøven.

Som kjent kan forskjellige hydridiseringsbetingelser benyttes ved analysen. Typisk vil hybridiseringen foregå ved noe forhøyede temperaturer, f.eks. mellom 35 og 75°C, vanligvis rundt 65°C, i en oppløsning som innbefatter buffer ved pH mellom ca. 6 og 8, og med egnet ionestyrke (f.eks. 5XSSX hvor 1XSSC = 0,15 M natriumklorid og 0,015M natrium-citrat, pH 7,0). I tilfeller hvor det er ønskelig å benytte lavere hybridiseringstemperaturer, kan hydrogenbindende reagenser som f.eks. dimetylsulfoksyd og formamid innbefattes. Graden av komplementaritet mellom prøven og probe-kjedene som kreves for at hybridiseringen skal finne sted, avhenger av stringensen ved betingelsene. Faktorer som bestemmer stringensen er velkjente.

Normalt vil de temperaturbetingelsene som velges for hybridisering være inkompatible med bindingen av anti-hybrid reagensen til dannede hybrider og deteksjon av merkerespon-sen. Følgelig vil anti-hybrid-bindingstrinnet og merke-deteksjonstrinnet finne sted etter at hybridiseringstrinnet er fullført. Reaksjonsblandingen bringes normalt til en temperatur i området fra ca. 3°C til ca. 40°C, og bindings-og deteksjonstrinnene utføres så. Fortynning av hybridiser-ingsblandingen før tilsats av antistoffreagensen er ønskelig når salt- og/eller formamid-konsentrasjonene er høye nok til i betydelig grad å påvirke antistoff bindingsreak-sj onen.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer i tillegg et reagenssystem, dvs. en reagenskombinasjon eller innretninger,

som innbefatter alle de essensielle elementer som kreves for å gjennomføre en ønsket analysefremgangsmåte. Reagenssystemet befinner seg på kommersielt pakket form, som en sammensetning eller tilsetning der hvor kompatibiliteten av reagensene tillater det, i en forsøkskonfigurasjon,

eller vanligvis som en forsøkspakke, dvs. en pakket kombina-sjon av en eller flere beholdere, innretninger e.l. som inneholder de nødvendige reagenser, og vanligvis innbefattet skriftlige instruksjoner angående utførelsen av analysene. Reagenssystemene ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter alle konfigurasjoner og sammensetninger for utføring av forskjelige hybridiseringsmetoder beskrevet her.

I alle tilfeller vil reagenssystemet innbefatte (1) en nukleinsyreprobe som beskrevet, og (2) første og andre merkede bindende reagenser. En forsøkspakkeform av systemet kan i tillegg innbefatte hjepekjemikalier som f.eks. kompo-nentene av hybridiseringsoppløsningen og denatureringsmidler som er istand til å overføre dobbeltkjedede nukleinsyrer i en prøve til enkeltkjedet form. Fortrinnsvis innbefattes et kjemisk lysings- og denatureringsmiddel, f.eks. alkali, for behandling av prøver slik at enkeltkjedede nukleinsyrer frigj øres.

Foreliggende oppfinnelse skal nå illustreres, men ikke begrenses, ved følgende eksempler.

Eksempel 1.

Hybridiseringsanalyse for bekateriell RNA kontrollert med merkede antistoffer til RNA"DNA hybrid.

A. Monoklonalt antistoff til RNA'DNA hybrid opprettes

etter fremgangsmåten beskrevet av Stewart et al., (1981)

PNAS 78, 3751. Antistoffet isoleres fra bukhinnevæske

ved affinintetskromatografi på protein A "Sepharose".

Ca. 1 ml bukhinnevæske pr. ml protein A "Sepharose" tilføres kolonnen og deretter vaskes kolonnen med 50 millimolar (mM) bicin buffer, pH 8,0, 0,15 molar (M) NaCl inntil absorbansen for effluenten ved 280 nanometer (mn) er mindre enn 0,05. Det bundne antistoffet elueres med 0,1 M glycin-buffer, pH 3,0, og antistoff detekteres ved å måle absorbansen ved 280 nm. Samlingen av antistoff innstilles på

pH 5,0 eller høyere ved tilsats av IM bicin buffer, pH

8,5. Samlingen dialyseres i 0,IM borat buffer, pH 9,0.

Antistoffet merkes lett med 5-(4,6-diklorotriazin-2-yl)-aminofluorescein (DTAF) (Molecular Probes, Inc., Junction City, Oregon) ved fremgangsmåten ifølge Blakeslee og Baines

(1976) J. Immunol. Meth. 13, 305. En oppløsning som inneholder 1,44 mikromol ((imol) DTAF i 361 mikroliter {[ il)

av boratbuffer, tilsettes til 2,4 ml 0,014 mM antistoff og får reagere i 1 time ved 25°C. Reaksjonsblandingen kromatograferes på en 1 x 25 cm "Biogel P-6DG" kolonne med 0,IM natriumfosfat buffer, pH 7,0, 0,IM NaCl som eluent. Absorbansene ved 280 nm av . 1 ml fraksjoner kontrolleres

og de som innbefatter den første toppen samles. Det molare DTAF/proteinforholdet bestemmes ved fremgangsmåten ifølge The og Feltkamp (1970) Immunology 18, 865.

Frie tiol-grupper innføres i antistoffet ved reaksjon med N-ravsyreimidyl 3-(2-pyridylditio)propionat og etterfølgende mild reduksjon med ditiotreitol /Carlson et al., (1978) Biochem. J. 173, 723/.

B. Et glukoseoksydase antistoff konjugat fremstilles på følgende måte. Maleimid-grupper innføres i glukoseoksydase (tilgjengelig fra Miles Scientific, Naperville, IL) ved reaksjon med N-hydroksyravsyreimidester av N-(4-karboksy-cykloheksylmetyl)-maleimid (SMCC) som beskrevet av /Yoshi-toake, et al., (1979)0 Eur. J. Biochem. 101, 395 (1979]_/.

Denne glukoseoksydasen kombineres øyeblikkelig med det

dobbelte av den molare mengde av det tiol-derivatiserte

antistoffet beskrevet ovenfor. Reaksjonsbetingelsene og rensefremgangsmåtene ifølge Yoshitake et al. følges. Enzyminnholdet i det rensede konjugatet bestemmes ved måling

av enzymaktiviteten og antistoffinnholdet bestemmes ved måling av DTAF innholdet som beskrevet av The og Feltkamp, supra.

C. Pepperrot peroksydase reageres med SMCC og kobles

til det tiol-derivatiserte antistoffet ved fremgangsmåten ifølge Ishikawa et al., (1983) J. Immunoassay 4:209. D. Et 565 basepar fragament fra en gene for det 16. ribosomale RNA fra E.coli er klonet mellom Hind III posisjonene på en pBR322 vektor /Brosius (1978) Proe. Nat'. Acad. Sei. 75:4801/. Fragmentet deles ved nedbrytning med Hind III restriksjons endonuklease.

E. En urinprøve som inneholder mer enn 10^ bakterier

pr. ml, fortynnes til det tredobbelte volum til en anriket kulturbuljong og inkuberes ved 35°C inntil cellepopulasjonen nåo r ca. 10 9 organismer pr. ml. Deler av kulturen overføres til en serie rør, slik at hvert rør inneholder 10"<*>til 10 9 bakterier. Rørene sentrifugeres ved 10 000 x g i 10 minutter og overvæskene fjernes. Cellene lyses i 20 |_il pr. rør av 10 milligram eggehvitelysozym (Sigma CHemical Co., St. Louis, MO) i 10 mM tris-hydrokloridbuffer, pH

8,0, 0,IM NaCl og 5 mM etylendiamintetraeddiksyre. 15

minutter senere tilsettes 80 |il av en oppløsning sammensatt av 60% formamid og 40% 0,16 M natriumfosfatbuffer, pH 6,5,

1,44 M NaCl, og 0,1% (vekt/volum) natriumdoedcylsulfat).

DNA proben beskrevet i avsnitt D ovenfor, i 0,2 M natriumfosfatbuffer, pH 6,5, denatureres i et kokende vannbad i 5 minutter og avkjøles på is. 20 mikroliters prøver (80 ng DNA) tilsettes til hvert rør og inkuberes ved 55°C

i 18 timer. Deretter tilsettes 500 (il av peroksydasemerket antistoff og glukoseoksydase-merket antistoff til hvert

rør som får så ved romtemperatur i 2 timer. Konsentrasjonen av disse enzymkonjugatene optimaliseres i innledende forsøk, slik at man oppnår optimale signal-til-bakgrunns-forhold.

Følgende substratreagens fremstilles og benyttes innen

3 timer: 0,IM natriumfosfat, pH 6,5, 0,1% bovinserumalbumin, 20 mM 3,5-dikloro-2-hydroksybenzensulfonat, 0,IM glukose, 0,01 enhet katalase/ml og 0,2 mM 4-aminoantipyrin. 1 ml av substratreagens tilsettes til hvert rør og inkuberes ved 37°C i 30 minutter. Absorbansene ved 510 nm registreres. Når antallet bakterier pr. rør øker, vil mengden av ribosomalt RNA"DNA hybrid øke, og som er resultat, vil absorbansen avta.

Eksempel II.

Hybridiseringsanalyse for deteksjon av bakterielt ribosomalt RNA ved bruk av biotinylert DNA probe.

A. Biotin-ll-dUTP og streptavidin-pepperrot peroksydase-konjugat er tilgjengelig fra Enzo Biochem., Inc., New York,

NY.

B. 565 basepar proben for ribosomal RNA merkes med biotin-11-dUTP ved fremgangsmåten etter Langer et al., (1981)

Proe. Nati., Acad. Sei., 78:6633.

C.Bakterier bearbeides som beskrevet i eksempel I, del

E ovenfor. Lysatene kombineres med 80 ul av en oppløsning bestående av 60% formamid og 40% 0,16M natriumfosfatbuffer,

pH 6,5, 1,44M NaCl og 0,1% (vekt/volum) natriumdodecylsulfat. Den biotinylerte DNA proben denatureres i et kokende vannbad i 5 minutter og avkjøles så på is. Proben er i 0,2M natriumfosfatbuffer, pH 6,5, og 20 ul porsjoner som inneholder80ng probe tilsettes til hvert ekstrakt og inkuberes ved65°C i 18 timer. Deretter tilsettes 500 ul av peroksydase-

merket streptavidin og glukoseoksydasemerket antistoff mot RNA"DNA hybrid til hvert rør som får stå ved romtemperatur i 2 timer. Konsentrasjonene av disse enzymkonjugatene optimaliseres i innledende forsøk, slik at man oppnås maksi-male signal-til-bakgrunn forhold.

Enzymreaksjonene initieres ved tilsats av 1 ml av substratreagensen beskrevet i eksempel I, seksjon D. Disse reak-sjonene får forløpe ved 37°C i 30 minutter og deretter registreres absorbansene ved 510 nm. Absorbansene vil øke når antallet bakterier tilsatt pr. rør øker.

Eksempel III.

Hybridiseringsanalyse for bakteriell ribosomal RNA ved anvendelse av en probe interkalert med etidiumbromid.

A. Kalvetymus DNA (Sigma Chemical Co.) behandles med

pronase for å nedbryte proteinforurensninger og oppløses deretter i etanol. DNA oppløses i 20 mM Tris-hydrokloridbuffer, pH 8,0, 0,2 M NaCl.

Et fotoreaktivt derivat av etidiumbromid, 8-azidoetidium, fremstilles ved fremgangsmåten ifølge Graves et al., (1977) Biochim. Biophys. Acta, 479:98. Det fremstilles en oppløs-ning som inneholder ca. 1 mM basepar av DNA og 0,5 mM 8-azidoetidium. Denne oppløsningen omrøres i et reaksjons-

kar av glass som befinner seg i et vannbad som holdes ved 20-30°C, og fotolyseres 10-20 cm fra en 150 watts lyskaster i 60 minutter. Etter fotolysen fjernes ikke-kovalent bundet etidiumderivat ved ekstraksjoner med n-butanol mettet med vann. Mengden av etidium koblet til DNA estimeres ved bruk

3—1—1

av ekstinsjonskoeffesienter på E4 .ny un<=>4x10 M cm for fotolysert etidiumazid, relasjonen mellom A260°^A490

for fotolysert etidium bundet til DNA /& 2eo = /A4<gg><=>(<A>49g x 3,4)-0,01l7/og & 260~l'32xlO^M ^ cm 1 for konsentrasjonen av DNA basepar for en gitt DNA som merkes.

B. Fremstilling av metylert tyroglobulin.

100 mg av bovintyroglobulin (Sigma) kombineres med 10 ml vannfri metanol og 400 (il av 2,55 M HC1 i metanol. Denne blandingen omrøres på en rotasjonsblander ved romtemperatur 1 5 dager. Bunnfallet samles ved sentrifugering og vaskes

2 ganger med metanol og 2 ganger med etanol. Deretter tørkes det under vakuum over natten. Det oppnås ca. 82

mg tørt pulver.

C. Det fremstilles et immunogen ved å kombinere DNA-etidiumkomplekset med metylert tyroglobulin som angitt av Stoller (1980) Methods in Enzymology 70:70.

20-50 mikrogram av immunogenet i Freunds hjelpestoff injiseres pr. mus og forsterkningsinjeksjoner gis ukentlig med begynnelse 2 uker etter den innledende immuniseringen. Antistofftitere måles ved hjelp av en ELISA prosedyre og hybridomas fremstilles og undersøkes med hensyn til anti-

stoff ved standard prosedyrer /Galfre og Milstein, (1981)

Meth. Enzymol. 73:1; Poirier, et al., )1982) PRoc. Nati.

Acad. Sei., 79:6443/. Utvelgelsesprosedyrer ble utformet

for antistoffer som binder DNA-etidiumkomplekset med asso-siasjonskbnstanter på 10"^ eller større, men som ikke bindes til enkelt- eller dobbeltkjedet DNA eller etidiumresiduet alene.

Antistoff isoleres fra bukhinnevæske som beksrevet i eksempel

I, del A, for antistoff til RNA"DNA hybrid. Dette antistoffet merkes også lett med DTAF og kobles til glukoseoksydase.

D. 565 basepar fragmentet fra pKK115 plasmidet klones

inn i Hind III posisjonen på M13 mp9 /Messing og Vieria,

(1982) Gene 19, 269; kommersielt tilgjengelig fra New Eng-

land Biolabs, Beverly, MA/. Fragmentet innskytes i to orienteringer og en kloning med virion DNA sekvensen komplementært til ribosomal RNA velges for videre arbeid.

Den modifiserte M13 mp9 progageres i E.coli JM103 /Alac, pro)thi, strA, supE, endA, sbcB15, hsdR4, F'traD36, proAB, laclq, ZAM15/ tilgjengelig fra bethesda Research Laborato-ries, Gaitherburg, MD. Fagen isoleres fra kulturbuljongen ved utfelling med polyetylenglukol og virion DNA renses ved fenol/kloroform ekstraksjon /Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor/.

En oligonukleotid primer (CACAATTCCACACAAC; tilgjengelig

fra New England Biolabs) er komplementær til M13 mp9 vektoren på 5'-0H siden av den innskutte ribosomale RNA proben.

Denne primeren benyttes til å initiere replikeringen av

M13 sekvensen ved hjelp av E.coli DNA polymerase (Klenow fragment) i nærvær av begrensede mengder av deoksynukleo-tid trifosfater. Replikeringen begrenses til et slik omfang at den innskutte ribosomale RNA proben forblir enkeltkjedet og tilgjengelig for hybridisering /Hu og Messing (1982)

Gene 17:271/.

Denne modifiserte M 13 proben blandes med 8-azidoetidium, fotolyseres og renses som beskrevet i del A ovenfor.

E. Bakterier fremstilles og lyses som beskrevet i eksempel I, del A. Lysatene blandes med 80 ul av formamid hybridi-seringsoppløsningen beskrevet i eksempel I, del E. 20 mikroliter av etidium-probe komplekset (100 ng DNA) (del

D) tilsettes til ekstraktene og inkuber.es ved 65°C i 18 timer, og deretter tilsettes 500 ul av peroksydasemerket antistoff til RNA"DNA og glukoseoksydasemerket antistoff

til etidium-DNA kompleks til hvert rør. Blandingene får stå ved romtemperatur i 2 timer.

Ved avslutningen av denne inkuberingen, tilsettes 1,0 ml

av substratreagensen, eksempel I, del E, og inkuberes ved 37°C i 30 minutter. Deretter registreres absorbansen ved 510 nm. Når antallet bakterier pr. rør økes, vil absorbansen avta.

Eksempel IV.

Hybridiseringsanalyser for cytomegalovirus kontollert med et fluorescerende-lukkende par.

A. Et 1500 basepar fragment av cytomegalovirus genomet klones inn i M13 mp 8 vektoren. En komplementær kopi av det innskutte fragmentet syntetiseres in vitro med DNA polymerase i nærvær av et biotinylert nukleotid trifosfat slika at det tilveiebringes en biotinylert probe. Proben modifiseres videre ved kovalent inkorporering av etidium-residuer som interkaleringskomplekser.

Et EcoRI nedbrytningselement av cytomegalovirus DNA fremstilles og fragmentene klones inn i plasmidet pACYC184 /Ta,asjorp et al., (1982) J. Virology 42:547/. Plasmidene propageres i E.coli stamme HB101 Ree A og EcoRI e fragmentet beskrevet av Tamashiro benyttes for fremstilling av proben. Fragmentet fjernes fra plasmidet ved nedbrytning med EcoRI restriksjonsenzym og klones inn i EcoRI posisjonen på Ml3mp8 vektoren (New England Biolabs) som propageres i E.coli K12JM101 verten. Viruset isoleres fra kulturvæsken ved utfelling med polyetylenglykol og DNA renses ved fenol/ kloroformekstraksjon.

DNA rekombineres med en 17 baseprimer med sekvensen GTAAAACGACGGCCAGT (New England Biolabs) som er komplementær med et område av Ml3mp8 sekvensen nær 3'-OH enden av EcoRI

e innskuddet. DNA i 20 mM tris-hydrokloridbuffer, pH 8,0, som inneholder 10 mM MgC^ kombineres med et molart over-skudd av primeren og inkuberes med 55°C i 45 minutter. /Bankier og Barrell (1983) Techniques in Nucleic Acid Bio-chemistry, Elsevier, Ireland/. Reaksjonsblandingen gjøres 15 mM med hensyn på dATP, dCTP, dGTP og Bio-ll-dUTP (tilgjengelig fra Enzo Biochem) og endelig tilsettes Klenow fragmentet av DNA polymerase I. Denne reaksjonen inkuberes ved 25°C i et tidsrom som bestemmes ved innledende forsøk.

I disse forsøkene tas prøver fra reaksjonsblandingen ved forskjellige tider, og elektroforeres i alkalisk agarosegel /Maniatis et al., supra/. Målet er å finne reaksjonsbe-tingelser som gir biotinmerkede prober som strekker seg gjennom EcoRI e innskuddet. Denne fremgangsmåten vil tilveiebringe biotinmerket DNA med noe varierende lengde; imidlertid er utvidelse av det merkede DNA ut over EcoRI

e innskuddet inn i M13 aksepterbart for foreliggende formål.

Det neste trinnet er den kovalente koblingen av etidium-residuer til det biotinmerkede DNA som interkaleringskomplekser. Dette oppnås ved fotolyse av DNA med 8-azidoetidium fremstilt ved fremgangsmåten ifølge Graves et al., supra. Biotinmerket DNA ekstraheres med fenol/kloroform og utfelles med etanol. Det oppløses i 20 mM tris-hydrokloridbuffer,

pH 8,0, 0,2 M NaCl, slik at det gir ca. 50 ug DNA/ml og gjøres 0,5 mM med hensyn på 8-azidoetidium. Blandingen fotolyseres i 1 time 10-20 cm. fra en 150 watts lyskaster. Blandingen omrøres under dette tidsrommet i et reaksjonskar av glass som er plassert i et vannbad av glass. Badet opprettholder en reaksjonstemperatur på 20-30°C.

Deretter fjernes det ikke-kovalent bundne 8-azidoetidium

og fotolysebiproduktene ved hjelp av suksessive ekstraksjoner med n-butanol mettet med vann. DNA utfelles med etanol og oppløses i tris-bufferen. Det kovalent bundne etidium måles spektrofotometrisk som beskrevet i eksempel III,

del A.

8-azidoetidium bindes kovalent til DNA nesten utelukkende i det dobbeltkjedede området hvor interkaleringskomplekser kan dannes. Måler er å kovalent koble et etidiumresidu pr. 10-50 basepar. Siden den fotolytiske reaksjonen for-løper nesten fullstendig i løpet av 1 time, kan inkorporer-ingen reduseres ved å redusere reaksjonstiden eller ved å redusere konsentrasjonen av 8-azidoetidium. Inkorporerin-gen kan økes ved å gjenta fotolysen med frisk 8-azidoetidium.

Det endelige trinnet er separering av den biotinmerkede/ etidium modifiserte proben fra M13mp8 sjablongen. Den merkede proben er vesentlig mindre enn Ml3mp8 sjablongen og kan isoleres ved alkalisk agarosegel elektroforese, /Maniatis et al., supra/. Delen som inneholder proben skjæres fra stykket av agarosegel og utvinnes ved elektro-eluering som beskrevet av Maniatis.

B. Fluoresceinmerket antistoff til etidium-DNA inter-kaleringskompleks.

Monoklonalt antistoff til etidium-DNA kompleks beskrevet

i eksempel III, del B ovenfor, dialyseres i 0,IM natrium-borat buffer, pH 9,0, og 0,5 ml som inneholder 5 mg antistoff, kombineres med 0,5 ml av 10 mM 5 (4,6-diklorotriazin-2-yl)-aminofluorescein (Molecular Probes, In., Junction City, OR) i boratbufferen. Blandingen får stå i 7 timer

ved romtemperatur og kromatograferes så på en 1x26 cm kolonne av "Biogel P6DG" harpiks i 0,1 M tris-hydrokloridbuffer,

pH 8,0. Absorbansene ved 280 nm av 1,0 ml fraksjoner måles, og fraksjonene fra den første eluerte toppen samles. Fluorescein/protein-forholdet måles spektrofotometrisk

ved fremgangsmåten ifølge The og Feltkamp (1970) Immunology 18:865. C. Fremstilling av streptavidin merket med 4,5-dimetoksy-6-kårboksyfluorescein.

N-hydroksyravsyreimidesteren av 4', 5'-dimetoksy-6-karboksyfluorescein syntetiseres ved fremgangsmåtene ifølge Khanna og Ullman (1980) Anal. Biochem. 108:156. (Denne syntesen gir i praksis en blanding av 5 og 6-karboksyfluorescein isomerene). Streptavidin isolert fra Streptomyces avidini /Hoffman et al., (1980) Proe. Nati. Acad. Sei. 77:4666/ merkes med N-hydroksyravsyreimidesteren av 4',5<1->dimetoksy-6-karboksyfluorescein ved fremgangsmåten beskrevet avKhanna og Ullman for merking av immunoglobuliner.

D. Hybridiseringsanalyse for cytomegalovirus i urin.

Ved denne fremgangsmåten benyttes sentrifugering til å isolere viruset fra urinen og den virale DNA hybridiseres i oppløsning med den biotinmerkede/etidiummodifiserte proben. Deretter får det merkede avidin og antistoffet til etidium-DNA interkaleringskomplekset danne binding til hybridene

som er dannet og fluorescens benyttes for å estimere mengden av hybrid som er tilstede.

Celleformede og partikkelformede materialer fjernes fra urinen ved sentrifugering i en "Sorvall GLC-3" sentrifuge ved 3000 rpm i 5 minutter. Overvæsken plasseres i et poly-allomert ultrasentrifugerør og kjøres ved 25 000 rpm i en "Beckman Ti50" rotor i 75 minutter. Pelletsen oppløses i 0,1 M NaOH og inkuberes ved 37°C i 30 minutter.

150 mikroliter 0,2 M natriumfosfatbuffer, pH 6,0, som inneholder 1,8 M NaCl, 0,1% natriumdodecylsulfat (vekt/volum)

og 1 mM EDTA tilsettes. Deretter tilsettes 20 ul av den biotinmerkede/etidium-modifiserte proben (50 mg) og hybridi-seringsblandingen inkuberes ved 65°C i 10 timer. Etter hybridiseringsreaksjonen tilsettes 650 ul av 0,1 M tris-hydroklorid-buffer, pH 8,2, som inneholder det merkede avidin og antistoff til etidium-DNA interkaleringskomplekset. Konsentrasjonen av de merkede proteiner i denne reagensen optimaliseres i innledende forsøk for å maksimere forholdet mellom fluorescens-lukkingen og bakgrunnen. Proteinbind-ingsreaksjonene får foregå ved romtemperatur i 1 time.

Deretter registreres fluorescensen for reaksjonsblandingen ved å benytte 495 nm lys for eksitering og 519 nm for emmisjon. En referanseanalyse kjøres parallelt med en urin-prøve som vites å være fri for cytomegalovirus, og fluorescenssignalet som oppnås ved denne referanseanalysen vil være høyere enn signalene som oppnås for prøver som inneholder viruset, følgelig vil fluorescenssignalet avta når viruskonsentrasjonen øker.

Claims (15)

1. Fremgangsmåte for detektering av en spesiell polynukleotidsekvens i en prøve som innbefatter enkeltkjedede nukleinsyrer, hvor fremgangsmåten innbefatter at prøven bringes i kontakt med en nukleinsyreprobe som inneholder minst en enkeltkjedet basesekvens som i det vesentlige er komplementær med sekvensen som skal detekteres, og be-stemmelse av de resulterende hybridene, karakterisert ved at hybridene dannes slik at de har bindingsposisjoner for to spesifike bindende reagenser, ethvert hybrid som dannes bringes i kontakt med de to spesifikt bindende reagensene, hvorav den ene innbefatter et første merke og den andre innbefatter et andre merke, vekselvirkningen mellom første og andre merke gir en detekterbar respons som er målt forskjellig når de to merkede reagensene begge er bundet til det samme hybridet sammenlignet med det tilfellet at de ikke er bundet på denne måten, og den detekterbare responsen måles som en funksjon av nærværet av sekvensen som skal detekters i prøven.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det første merket deltar i en første kjemisk reaksjon som danner et diffunderbart produkt som er en deltager i en andre kjemisk reaksjon med et andre merket, slik at det dannes et produkt som tilveiebringer den detekterbare responsen, det første og det andre merket er fortrinnsvis katalysatorer som henholdsvis den første og den andre kjemiske reaksjonen.

3. Fremgangsmtåe ifølge krav 1, karakterisert ved det første og andre merket deltar i en energioverførings vekselvirkning.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at en av de spesifikt bindende reagensene er en antistoff-reagens.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at antistoffreagensen er en reagens som er selektiv for binding til DNA"RNA hybrider hvor enten proben eller sekvensen som skal detekteres er DNA og den andre er RNA, eller en som er selektiv forbinding til RNA" RNA hybrider dersom både prøven og sekvensen som skal detekteres er RNA.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at antistoffreagensen er en som er selektiv forbinding til interkaleringskomplekser, hvor duplekset som dannes i analysen innbefatter en nukleinsyre-interkalator bundet dertil i form av interkaleringskomplekser, fortrinnsvis er interkalatoren kjemisk bundet til proben i dens enkeltkjedede komplementære område, hvorved det ved hybridisering med sekvensen som skal detekteres, dannes interkaleringskomplekser i det resulterende hybridet.

7. Fremgangsmåte ifølge enten krav 5 eller 6, karakterisert ved at (i) den andre spesifikt bindende reagensen innbefatter den samme antistoffreagensen, (ii) nukleinsyreproben innbefatter en spesifikt bindende ligand-del, og den andre spesifikt bindende reagensen er en bindende partner for en slik ligand-del, eller (iii) nukleinsyreproben innbefatter en dobbeltkjedet del som har en bindingsposisjon for et protein og den andre spesifikt bindende reagensen er et slikt protein.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at prøven innbefatter en biologisk prøve som har vært utsatt for betingelser som frigjør og denataurerer nukleinsyrer som er tilstede i prøven.

9. Reagenssystem for detektering av en spesiell polynukleotidsekvens i en prøve som innbefatter en nukleinsyre probe som inneholder minst en enkeltkjedet basesekvens som i det vesentlige er komplementær med sekvensen som skal detekteres, karakterisert ved at den i tillegg innbefatter første og andre spesifikt bindende reagenser istand til å danne binding til hybridene som dannes mellom sekvensen som skal detekteres i prøven og proben, slike bindende reagenser innbefatter henholdsvis første og andre merker, som vekselvirker med hverandre og tilveiebringer en detekterbar respons som er målbart forskjellig når de to merkede reagensene begge er bundet til samme hybridet, sammenlignet med det tilfellet at de ikke er bundet på denne måten.

10. Reagenssystem ifølge krav 9, karakterisert ved at det første merke deltar i en første kjemisk reaksjon som produserer et diffunderbart produkt som er en deltager i en andre kjemisk reaksjon med det andre merke, slik at det dannes et produkt som tilveiebringer den detekterbare responsen, det første og det andre merke er fortrinnsvis katalysatorer for henholdsvis den første og den andre kjemiske reaksjonen.

11. Reagenssystem ifølge krav 9, karakterisert ved at det første og andre merke deltar i en energioverførings vekselvirkning.

12. Reagenssystem ifølge krav 9, karakterisert ved at en av de spesifikt bindende reagensene er en antistoffreagens.

13. Reagenssystem ifølge krav 12, karakterisert ved at antistoffreagensen er en som er selektiv forbinding til DNA"RNA hybrider der hvor enten proben eller sekvensen som skal detekteres er DNA og den andre er RNA, eller en som er selektiv forbinding til RNA'RNA hybrider der hvor både proben og sekvensen som skal detekteres er RNA.

14. Reagenssystem ifølge krav 12, karakterisert ved at antistoffreagensen er en som er selektiv forbinding til interkaleringskomplekser, hvor dupleksene som dannes i analysen innbefatter en nukleinsyre interkalator bundet dertil, i form av interkaleringskomplekser, fortrinnsvis er interkalatoren kjemisk bundet til proben i dens enkeltkjedede komplementære området, hvorved det ved hybridisering med sekvensen som skal detekteres, dannes interkaleringskomplekser i det resulterende hybridet.

15. Reagenssystem ifølge krav 13 eller 14, karakterisert ved at (i) den andre spesifikt bindende reagensen innbefatter den samme antistoffreagensen, (ii) nukleinsyreproben innbefatter en spesifikt bindende ligand-del, og den andre spesifikt bindende reagensen er en bindende partner for en slik ligand-del, eller (iii) nukleinsyreproben innbefatter en dobbeltkjedet del som har en bindingsposisjon for et protein, og den andre spesifikt bindende reagensen er et slikt protein.