NO844849L - HYBRIDIZATION ANALYSIS USING LABELED COUPLES OF HYBRID BINDING REAGENTS - Google Patents
HYBRIDIZATION ANALYSIS USING LABELED COUPLES OF HYBRID BINDING REAGENTSInfo
- Publication number
- NO844849L NO844849L NO844849A NO844849A NO844849L NO 844849 L NO844849 L NO 844849L NO 844849 A NO844849 A NO 844849A NO 844849 A NO844849 A NO 844849A NO 844849 L NO844849 L NO 844849L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- reagent
- rna
- binding
- probe
- dna
- Prior art date
Links
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 94
- 238000009739 binding Methods 0.000 title claims description 69
- 230000027455 binding Effects 0.000 title claims description 67
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 title claims description 46
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 109
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 57
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 43
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 43
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 43
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 32
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 claims description 22
- 230000002687 intercalation Effects 0.000 claims description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 19
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 18
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 18
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 16
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 16
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 16
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 claims description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 14
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 11
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 claims description 9
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 claims description 9
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 9
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 8
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 65
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 55
- 239000002585 base Substances 0.000 description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 15
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 14
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 14
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 14
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 14
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 14
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 14
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 14
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 11
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 10
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 10
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 10
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 10
- IMFJTOBLMOJLDM-UHFFFAOYSA-O 8-azido-5-ethyl-6-phenylphenanthridin-5-ium-3-amine Chemical compound C12=CC(N=[N+]=[N-])=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 IMFJTOBLMOJLDM-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 8
- -1 DNA and RNA Chemical class 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 7
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 7
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 7
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 6
- HWQQCFPHXPNXHC-UHFFFAOYSA-N 6-[(4,6-dichloro-1,3,5-triazin-2-yl)amino]-3',6'-dihydroxyspiro[2-benzofuran-3,9'-xanthene]-1-one Chemical compound C=1C(O)=CC=C2C=1OC1=CC(O)=CC=C1C2(C1=CC=2)OC(=O)C1=CC=2NC1=NC(Cl)=NC(Cl)=N1 HWQQCFPHXPNXHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 5
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 239000008364 bulk solution Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 4
- 238000006303 photolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000015843 photosynthesis, light reaction Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 4
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 4
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- GTQXMAIXVFLYKF-UHFFFAOYSA-N thiochrome Chemical compound CC1=NC=C2CN3C(C)=C(CCO)SC3=NC2=N1 GTQXMAIXVFLYKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 3
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 3
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 3
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 3
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 3
- RUFPHBVGCFYCNW-UHFFFAOYSA-N 1-naphthylamine Chemical compound C1=CC=C2C(N)=CC=CC2=C1 RUFPHBVGCFYCNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LJROKJGQSPMTKB-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-hydroxyphenyl)-pyridin-2-ylmethyl]phenol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C(C=1N=CC=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 LJROKJGQSPMTKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 4-aminoantipyrine Chemical compound CN1C(C)=C(N)C(=O)N1C1=CC=CC=C1 RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102100033620 Calponin-1 Human genes 0.000 description 2
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 2
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000945318 Homo sapiens Calponin-1 Proteins 0.000 description 2
- 101000652736 Homo sapiens Transgelin Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N Naphthalene Chemical compound C1=CC=CC2=CC=CC=C21 UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 2
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- MWPLVEDNUUSJAV-UHFFFAOYSA-N anthracene Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3C=C21 MWPLVEDNUUSJAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003172 anti-dna Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 239000012911 assay medium Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 125000001295 dansyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=C2C([H])=C([H])C([H])=C(C2=C1[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- QPYAUURPGVXHFK-UHFFFAOYSA-N 1-[4-(dimethylamino)-3,5-dinitrophenyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(N(C)C)=C([N+]([O-])=O)C=C1N1C(=O)C=CC1=O QPYAUURPGVXHFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NHXWOZNNPSXUKN-UHFFFAOYSA-N 2-azido-9h-fluorene Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C3CC2=C1 NHXWOZNNPSXUKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCPHSBOTFHCNQC-UHFFFAOYSA-N 3',6'-dihydroxy-4',5'-dimethoxy-1-oxospiro[2-benzofuran-3,9'-xanthene]-5-carboxylic acid Chemical compound O1C(=O)C2=CC=C(C(O)=O)C=C2C21C1=CC=C(O)C(OC)=C1OC1=C2C=CC(O)=C1OC DCPHSBOTFHCNQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LWKJNIMGNUTZOO-UHFFFAOYSA-M 3,5-dichloro-2-hydroxybenzenesulfonate Chemical compound OC1=C(Cl)C=C(Cl)C=C1S([O-])(=O)=O LWKJNIMGNUTZOO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- MDQUSQOIBBZWLQ-UHFFFAOYSA-N 3-azidoacridine Chemical compound C1=CC=CC2=NC3=CC(N=[N+]=[N-])=CC=C3C=C21 MDQUSQOIBBZWLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQILVUYCDHSGEU-UHFFFAOYSA-N 4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexane-1-carboxylic acid Chemical compound C1CC(C(=O)O)CCC1CN1C(=O)C=CC1=O LQILVUYCDHSGEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YFHYLFGKDYAHBW-UHFFFAOYSA-N 4-azido-7-chloroquinoline Chemical compound [N-]=[N+]=NC1=CC=NC2=CC(Cl)=CC=C21 YFHYLFGKDYAHBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 5,5-dimethyl-2,4-dioxo-1,3-oxazolidine-3-carboxamide Chemical compound CC1(C)OC(=O)N(C(N)=O)C1=O QCVGEOXPDFCNHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 5-carboxyfluorescein Chemical class C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C21OC(=O)C1=CC(C(=O)O)=CC=C21 NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical class C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 1
- FWEOQOXTVHGIFQ-UHFFFAOYSA-M 8-anilinonaphthalene-1-sulfonate Chemical compound C=12C(S(=O)(=O)[O-])=CC=CC2=CC=CC=1NC1=CC=CC=C1 FWEOQOXTVHGIFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GHUXAYLZEGLXDA-UHFFFAOYSA-N 8-azido-5-ethyl-6-phenylphenanthridin-5-ium-3-amine;bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N=[N+]=[N-])=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 GHUXAYLZEGLXDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFOMVRGJRFLFCJ-UHFFFAOYSA-N 9-azidoacridine Chemical compound C1=CC=C2C(N=[N+]=[N-])=C(C=CC=C3)C3=NC2=C1 BFOMVRGJRFLFCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930195730 Aflatoxin Natural products 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010006591 Apoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 108020004513 Bacterial RNA Proteins 0.000 description 1
- 101000800130 Bos taurus Thyroglobulin Proteins 0.000 description 1
- 229910001369 Brass Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 241001302129 Fiji disease virus Species 0.000 description 1
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000002794 Glucosephosphate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000644555 Guppy reovirus Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004195 Isomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930192392 Mitomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000186983 Streptomyces avidinii Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010043395 Thalassaemia sickle cell Diseases 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108010092464 Urate Oxidase Proteins 0.000 description 1
- 241001265414 Vieraea Species 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- AZRNEVJSOSKAOC-VPHBQDTQSA-N [[(2r,3s,5r)-5-[5-[(e)-3-[6-[5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]hexanoylamino]prop-1-enyl]-2,4-dioxopyrimidin-1-yl]-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C(\C=C\CNC(=O)CCCCCNC(=O)CCCC[C@H]2[C@H]3NC(=O)N[C@H]3CS2)=C1 AZRNEVJSOSKAOC-VPHBQDTQSA-N 0.000 description 1
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000999 acridine dye Substances 0.000 description 1
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000005409 aflatoxin Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- PPQRONHOSHZGFQ-LMVFSUKVSA-N aldehydo-D-ribose 5-phosphate Chemical group OP(=O)(O)OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PPQRONHOSHZGFQ-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 239000002168 alkylating agent Substances 0.000 description 1
- 229940100198 alkylating agent Drugs 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000012805 animal sample Substances 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 description 1
- 150000001541 aziridines Chemical class 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008275 binding mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- TXFLGZOGNOOEFZ-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl)amine Chemical class ClCCNCCCl TXFLGZOGNOOEFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010951 brass Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000012459 cleaning agent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 239000012084 conversion product Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006352 cycloaddition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- MWEQTWJABOLLOS-UHFFFAOYSA-L disodium;[[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-oxidophosphoryl] hydrogen phosphate;trihydrate Chemical compound O.O.O.[Na+].[Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP([O-])(=O)OP(O)([O-])=O)C(O)C1O MWEQTWJABOLLOS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 235000014103 egg white Nutrition 0.000 description 1
- 210000000969 egg white Anatomy 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 101150012763 endA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002118 epoxides Chemical class 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000007274 generation of a signal involved in cell-cell signaling Effects 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 108010046301 glucose peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000006713 insertion reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 125000005439 maleimidyl group Chemical group C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 108091005592 methylated proteins Proteins 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical class CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical class FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 150000005053 phenanthridines Chemical class 0.000 description 1
- 125000001791 phenazinyl group Chemical class C1(=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3N=C12)* 0.000 description 1
- 125000001484 phenothiazinyl group Chemical class C1(=CC=CC=2SC3=CC=CC=C3NC12)* 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 125000003367 polycyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører nukleinsyre hybridiser-ingsanalysemetoder og reagenssystemer for detektering av spesifike polynukleotide sekvenser. Prinsippet for nukleinsyre hybridiseringsanalyser ble utviklet ved arbeider innen feltet rekombinant DNA forskning for å bestemme og isolere spesielle polynukleotide basesekvenser av interesse. Det ble funnet at enkeltkjedede nukleinsyrer, f.eks. DNA og RNA, slik som de oppnås ved denaturering av de dobbeltkjedede former, hybridiserer eller rekombinerer under egnede betingelser ved komplementære enkeltkjedede nukleinsyrer. The present invention relates to nucleic acid hybridization analysis methods and reagent systems for detecting specific polynucleotide sequences. The principle of nucleic acid hybridization assays was developed by work in the field of recombinant DNA research to determine and isolate particular polynucleotide base sequences of interest. It was found that single-stranded nucleic acids, e.g. DNA and RNA, as obtained by denaturing the double-stranded forms, hybridize or recombine under suitable conditions with complementary single-stranded nucleic acids.
Ved å merke slike komplementære probenukleinsyrer med enBy labeling such complementary probe nucleic acids with a
lett detekterbar gruppe, kan man detektere nærværet av en hvilken som helst polynukleotidsekvens av interesse i et forsøksmedium som inneholder prøve nukleinsyrer på enkeltkjedet form. easily detectable group, one can detect the presence of any polynucleotide sequence of interest in an experimental medium containing sample nucleic acids in single-stranded form.
I tillegg til feltet rekombinant DNA, kan den analytiske hybridiseringsteknikken anvendes til detektering av viktige polynukleotider blant annet innen feltene human- og veteri-nærmedisin, jordbruk, og næringsmiddelvitenskap. Spesielt kan teknikken anvendes til detektering og identifisering av etiologiske agenter som f.eks. bakterier og virus, til å undersøke bakterier med hensyn til antiobiotisk resistens, til å lette diagnosen av genetiske forstyrrelser som f.eks. sigdcelleanemi og talassemia, og til detektering av kreft-celler. En generell oversikt over teknikken og dens nåværende og fremtidige betydning, finnet i Biotechnology (august 1983), side 471-478. In addition to the field of recombinant DNA, the analytical hybridization technique can be used for the detection of important polynucleotides, among other things, in the fields of human and veterinary medicine, agriculture and food science. In particular, the technique can be used for the detection and identification of etiological agents such as e.g. bacteria and viruses, to examine bacteria with regard to antibiotic resistance, to facilitate the diagnosis of genetic disorders such as sickle cell anemia and thalassemia, and for the detection of cancer cells. A general overview of the technique and its present and future importance, found in Biotechnology (August 1983), pages 471-478.
Den følgende informasjonen tilveiebringes for å gjøre kjent informasjon som antas å være relevant med hensyn til foreliggende oppfinnelse. Den følgende informasjon utgjør ikke tidligere kjent teknikk som skal vurderes mot foreliggende oppfinnelse. The following information is provided to make known information believed to be relevant to the present invention. The following information does not constitute prior art to be assessed against the present invention.
Teknikkens stand når det gjelder nukleinsyre hybridiserings-analyseteknikk, innbefatter generelt en separering av hybridisert og uhybridisert merket probe. Dette nødvendige separasjonstrinnet lettes ved at enten prøve nukleinsyrene eller nukleinsyreproben immobiliseres på en fast bærer. Vanligvis detekteres hybridiseringen mellom spesielle basesekvenser eller gener av interesse i prøvenukleinsyrer og en merket form av probe nukleinsyren ved separering av den faste bæreren fra den gjenværende reaksjonsblanding som inneholder uhybridisert probe, etterfulgt av detektering av merket på den faste bæreren. The state of the art in nucleic acid hybridization analysis techniques generally includes a separation of hybridized and unhybridized labeled probe. This necessary separation step is facilitated by either the sample nucleic acids or the nucleic acid probe being immobilized on a solid support. Typically, the hybridization between particular base sequences or genes of interest in sample nucleic acids and a labeled form of the probe nucleic acid is detected by separation of the solid support from the remaining reaction mixture containing unhybridized probe, followed by detection of the label on the solid support.
Det gjøres stadig forsøk på å forenkle den analytiske fremgangsmåten for utføring av nukleinsyre hybridiseringsanalyser. Den primære hensikt ved disse anstrengelsene er å redusere kompleksiteten ved fremgangsmåten i en slik grad av den enkelt og rutinemessig kan utføres i kliniske laboratorier. Nødvendigheten av et separasjonstrinn er i stor grad til hindre for disse bestrebelsene. Separasjonstrinnet krever betydelig ekspertise dersom det skal utføres på en analytisk reproduserbar måte, og det er en prosess som ikke lett kan automatiseres eller anvendes på store forsøksvolumer. Attempts are constantly being made to simplify the analytical procedure for performing nucleic acid hybridization analyses. The primary purpose of these efforts is to reduce the complexity of the procedure to such an extent that it can be easily and routinely performed in clinical laboratories. The necessity of a separation step is largely an obstacle to these endeavours. The separation step requires considerable expertise if it is to be performed in an analytically reproducible manner, and it is a process that cannot be easily automated or applied to large trial volumes.
Videre møter man to betydelige vanskeligheter ved konvensjonelle fremgangsmåter som innbefatter immobilisering av prøve nukleinsyrer. For det første er de fremgangsmåtene som kreves for å oppnå immobilisering generelt tidkrevende og utgjør et ekstra trinn hvilket er uønsket for rutinemessig bruk av teknikken i kliniske laboratorier. For det andre kan proteiner eller andre materialer i den hetero-gene prøven, spesielt i tilfelle med kliniske prøver, påvirke immobiliseringsprosessen. Furthermore, two significant difficulties are encountered with conventional methods that include immobilization of sample nucleic acids. First, the procedures required to achieve immobilization are generally time-consuming and constitute an additional step which is undesirable for routine use of the technique in clinical laboratories. Second, proteins or other materials in the heterogeneous sample, especially in the case of clinical samples, can affect the immobilization process.
Som alternativer til immobilisering av prøve nukleinsyrerAs alternatives to the immobilization of sample nucleic acids
og tilsats av merket probe, kan man immobilisere en probe og merke prøve nukleinsyrene in situ, eller man kan benytte en dual hybridiseringsteknikk som krever to prober, hvorav den ene immobiliseres og det andre merkes. Det første alternativet er imidlertid enda mindre ønskelig fordi in and addition of the labeled probe, one can immobilize a probe and label the nucleic acids in situ, or one can use a dual hybridization technique that requires two probes, one of which is immobilized and the other labeled. However, the first option is even less desirable because in
situ merking av prøve nukleinsyrer krever større tekniske ferdigheter enn man kan forvente hos klinisk laboratorie-personell, og det finnes ingen enkle, pålitelige fremgangsmåter for å styre merkeutbyttet, dette kan være et betydelig problem dersom merkemediet inneholder variable mengder av inhibitorer for merkingsreaksjonen. Den duale hybridiseringsteknikken har den ulempen at den krever en ekstra reagens og et inkuberingstrinn, og kinetikken for hybridiseringsreaksjonen kan være treg og ineffektiv. Nøyaktigheten av analysen kan også være variabel dersom komplementariteten av de to probene med prøvesekvensen er variabel. in situ labeling of sample nucleic acids requires greater technical skills than can be expected from clinical laboratory personnel, and there are no simple, reliable methods to control the labeling yield, this can be a significant problem if the labeling medium contains variable amounts of inhibitors for the labeling reaction. The dual hybridization technique has the disadvantage that it requires an additional reagent and an incubation step, and the kinetics of the hybridization reaction can be slow and inefficient. The accuracy of the analysis can also be variable if the complementarity of the two probes with the sample sequence is variable.
Noen av problemene som er diskutert ovenfor, løses vedSome of the problems discussed above are solved by
å anvende en immobilisert RNA probe og detekterer resulterende immobiliserte DNA"RNA eller RNA'RNA hybridier med et merket spesifikt anti-hybrid antistoff (se US patentsøk-nad nr. 616.132, inngitt 1. juni 1984). Denne teknikken krever fremdeles et separasjonstrinn og har derfor de ulem-per som er diskutert ovenfor, og er felles for alle hybridiseringsteknikker som krever se separasjonstrinn. using an immobilized RNA probe and detecting the resulting immobilized DNA'RNA or RNA'RNA hybrids with a labeled specific anti-hybrid antibody (see US Patent Application No. 616,132, filed June 1, 1984). This technique still requires a separation step and therefore has the disadvantages discussed above, and is common to all hybridization techniques that require a separation step.
US-PS 3.996.345; 4.233.402; og 4.275.149 beskriver analyser til deteksjon av antigener ved immunoanalyseteknikker som innbefatter enzympar og energioverføringsvekselvirkninger. US-PS 3,996,345; 4,233,402; and 4,275,149 describe assays for the detection of antigens by immunoassay techniques involving enzyme pairs and energy transfer interactions.
Europeisk patentsøknad nr. 70.685 foreslår en hybridiserings-analyseteknikk som eliminerer behovet for å fysisk separere hybridisert fra uhybridisert probe. Det foreslås å anvende et par av prober som hybridiserer til tilstøtende områder av en polynukleotidsekvens av interesse, og å merke en probe med en kjemiluminescent katalysator som f.eks. enzymet peroksydase og den andre med et absorberende molekyl for den kjemiluminescente emmisjonen. Katalysator- og absorbent merkene må være plassert nær de tilgrensende terminalender av de respektive probene på en slik måte at det ved hybridisering observeres slokking av den kjemiluminescente emmisjonen ved energioverføring til det absorberende molekylet. European Patent Application No. 70,685 proposes a hybridization assay technique that eliminates the need to physically separate hybridized from unhybridized probe. It is proposed to use a pair of probes that hybridize to adjacent regions of a polynucleotide sequence of interest, and to label a probe with a chemiluminescent catalyst such as e.g. the enzyme peroxidase and the other with an absorbing molecule for the chemiluminescent emission. The catalyst and absorbent labels must be placed close to the adjacent terminal ends of the respective probes in such a way that, upon hybridization, quenching of the chemiluminescent emission by energy transfer to the absorbing molecule is observed.
For å utføre en slik analyse må man være istand til kontrol- lerbart å syntetisere to kritisne probereagenser slik at de respektive merkene bringes i en slukkende orientering med hensyn til probe nukleinsyren uten å påvirke de respektive merkede probesegmenters tendens til virkelig å undergå hybridisering. To perform such an analysis, one must be able to controllably synthesize two critical probe reagents so that the respective labels are brought into a quenching orientation with respect to the probe nucleic acid without affecting the tendency of the respective labeled probe segments to actually undergo hybridization.
Man har nå kommet frem til en nukleinsyre hybridiseringsanalyse som er basert på benyttelsen av nabopar av vekselvirkende merker som gir et detekterbart signal som er målbart forskjellig for den hybridiserte proben sammenlignet med uhybridisert probe. På denne måten foreligger det ikke noe behov for å separere hybridisert og uhybridisert probe, dette letter i stor grad gjennomføringen og automatiseringen av analysen. I tillegg er analysesignalet ikke-radioiso-topt av natur og oppfyller dermed et annet kriterium for en hensiktsmessig analyse, anvendelsen av deteksjonssystemer som ikke innbefatter radioaktivitet. One has now arrived at a nucleic acid hybridization assay which is based on the use of neighboring pairs of interacting labels which give a detectable signal that is measurably different for the hybridized probe compared to the unhybridized probe. In this way, there is no need to separate hybridized and unhybridized probe, this greatly facilitates the execution and automation of the analysis. In addition, the analysis signal is non-radioisotope in nature and thus fulfills another criterion for an appropriate analysis, the use of detection systems that do not include radioactivity.
Ifølge foreliggende oppfinnelse detekteres spesifike polynukleotide sekvenser i en prøve ved at det dannes et hybrid mellom sekvensen som skal detekteres og en nukleinsyreprobe som har en komplementær sekvens på en slik måte at det resulterende hybrid har bindingsposisjoner for to forskjellige spesifike bindingsreagenser. Den ene av disse bindings- reagensene innbefatter et første merke og den andre et andre merke, hvor vekselvirkningen mellom de to merkene tilveiebringer en detekterbar respons som er målbart forskjellig, enten i positiv eller negativ forstand, når de to merkede reagensene bindes til samme hybrid sammenlignet med det tilfellet at de ikke bindes på denne måten. According to the present invention, specific polynucleotide sequences are detected in a sample by forming a hybrid between the sequence to be detected and a nucleic acid probe that has a complementary sequence in such a way that the resulting hybrid has binding positions for two different specific binding reagents. One of these binding reagents includes a first label and the other a second label, where the interaction between the two labels provides a detectable response that is measurably different, either in a positive or negative sense, when the two labeled reagents bind to the same hybrid compared provided that they are not bound in this way.
Når de bindes de det samme hybridet, bringes de to merkeneWhen they tie the same hybrid, the two marks are brought
i nabovekselvirkningsavstand til hverandre, derved øker vekselvirkningene mellom de to merkene som gir signal i stor grad sammenlignet med de relativt mindre hyppige vekselvirkningene som finner sted i bulk oppløsningen.mellom frie diffunderbare, merkede reagenser. in neighboring interaction distance to each other, thereby increasing the interactions between the two labels that give a signal to a large extent compared to the relatively less frequent interactions that take place in the bulk solution between free diffusible, labeled reagents.
En foretrukket vekselvirkning mellom de to merkene er en trinnvis vekselvirkning hvor det første merket deltar i en første kjemisk reaksjon, slik at det dannes et diffunderbart produkt som er en deltager i en andre kjemisk reaksjon med det andare merke, slik at det dannes et detekterbart produkt. Det er spesielt foretrukket at det første og det andre merket er katalysatorer, f.eks. enzymer, for henholdsvis den første og den andre kjemiske reaksjonen. Dersom f.eks. det første merket er glukose oksydase og A preferred interaction between the two labels is a stepwise interaction where the first label participates in a first chemical reaction, so that a diffusible product is formed which is a participant in a second chemical reaction with the other label, so that a detectable product is formed . It is particularly preferred that the first and second brands are catalysts, e.g. enzymes, for the first and the second chemical reaction respectively. If e.g. the first brand is glucose oxidase and
det andre er peroksydase, vil hydrogenperoksydet som dannes ved virkningen av glukoseoksydase på glukose, diffundere til peroksydasemerket og detekteres som et optisk signal i nærvær av en egnet indikatorfargesammensetning. Et annet foretrukket merkepar er et par som innbefatter energiover-føringsvekselvirkning som f.eks. mellom et fluorescerende eller luminiscerende stoff, og en slukker for fotoemmisjonen fra det første merket. the other being peroxidase, the hydrogen peroxide formed by the action of glucose oxidase on glucose will diffuse to the peroxidase label and be detected as an optical signal in the presence of a suitable indicator dye composition. Another preferred label pair is a pair involving energy transfer interaction such as between a fluorescent or luminescent substance, and a quencher of the photoemission from the first mark.
Med hensyn til naturen av de spesifike bindende agenserWith regard to the nature of the specific binding agents
som benyttes, må i prinsippet minst en av de to bindes en en posisjon som er unik for hybrider dannet i analysen sammenlignet med uhybridiserte nukleinsyrer fordi signal genereringen må være avhengig av dannelsen av slikt hybrid. Derfor vil den spesifike bindende reagensen fortrinnsvis være et antistoff som er selektivt for hybridet sammenlignet med enkeltkjedede nukleinsyrer som er tilstede i analyse-blandingen. Et stort antall forskjellige andre bindende reagenser kan benyttes som beskrevet nedenfor. which is used, in principle at least one of the two must be bound to a position that is unique for hybrids formed in the analysis compared to unhybridized nucleic acids because the signal generation must be dependent on the formation of such a hybrid. Therefore, the specific binding reagent will preferably be an antibody that is selective for the hybrid compared to single-stranded nucleic acids present in the assay mixture. A wide variety of other binding reagents can be used as described below.
Foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet ved et antall betydelige fordeler. I tillegg til hovedfordelen som er eliminering av separasjonstrinnet, kreves det ikke noen immobilisering av hverken prøve eller probe nukleinsyrer som gir opphav til ikke-spesifik binding og reproduserbar-hetsproblemer ved vanlig anvendte hybridiseringsteknikker. En annen fordel er at analysen kan utføres uten vasketrinn.Analysereagensene kan tilsettes trinnvis til hybridiserings-mediet, uten behov for å vaske uoppløselige bærermaterialer. The present invention is characterized by a number of significant advantages. In addition to the main advantage which is the elimination of the separation step, no immobilization of either sample or probe nucleic acids is required, which gives rise to non-specific binding and reproducibility problems with commonly used hybridization techniques. Another advantage is that the analysis can be carried out without a washing step. The analysis reagents can be added step by step to the hybridization medium, without the need to wash insoluble carrier materials.
Et annet vesentlig trekk ved foreliggende oppfinnelse erAnother essential feature of the present invention is
at deteksjonssystemet som anvendes er spesielt effektivt fordi dobbeltkjedede duplekser kan inneholde mange bindings-posisjonser for den første og den andre merkede reagensen. Dette resulterer i at store mengder av det første og det andre merke festes i vekselvirkende konfigurasjon per enhet hybridisert probe. Når man vurderer antistoffer til RNA"-DNA eller RNA'RNA hybrider, kan et merket antistoff bindes til tilnærmet hvert 10. basepar av hybridet. Dersom proben f.eks. er 500 baser lang, kan 40-50 antistoff bindes. Ligander som passer til merkede bindende proteiner, kan innføres i prober i mengder på 1 ligand pr. 5-20 baser. Nærværet av multiple bindingsposisjoner på hybrider kan that the detection system used is particularly effective because double-stranded duplexes can contain many binding positions for the first and the second labeled reagent. This results in large amounts of the first and second label being attached in an interacting configuration per unit hybridized probe. When considering antibodies to RNA"-DNA or RNA'RNA hybrids, a labeled antibody can bind to approximately every 10 base pairs of the hybrid. If the probe is, for example, 500 bases long, 40-50 antibodies can bind. Suitable ligands to labeled binding proteins, can be introduced into probes in amounts of 1 ligand per 5-20 bases.The presence of multiple binding positions on hybrids can
med fordel benyttes når små mengder hybrid må detekteres. advantageously used when small amounts of hybrid must be detected.
Fig. 1-3 er skjematiske illustrasjoner av foretrukne fremgangsmåter for utførelse av foreliggende oppfinnelse. Fig. 1-3 are schematic illustrations of preferred methods for carrying out the present invention.
Disse fremgangsmåtene beskrives i detalj nedenfor. These procedures are described in detail below.
Anvendelsen av nukleinsyrehybridisering som et analyttisk verktøy er fundamentalt plassert på den dobbeltkjedede, duplekse strukturen av DNA. Hydrogenbindingene mellom purin- og pyimidin-basene i de respektive kjedene i dobbeltkjedet DNA, kan brytes reversibelt. De to komplementære enkeltkjedene av DNA som resulterer ved denne "smeltingen" eller "denatureringen" av DNA, vil assosieres (ofte kalt rekombinering eller hybridisering) slik at dupleksstruk-turen igjen dannes. Som kjent vil kontakt mellom en første enkeltkjedet nukleinsyre, enten DNA eller RNA, som innbefatter en basesekvens som er tilstrekkelig komplementær med (dvs. "homolog med") en andre enkeltkjedet nukleinsyre under egnede betingelser, resultere i dannelse av DNA'DNA-, RNA"DNA-, eller RNA'RNA-hybrider, avhengig av utgangsmateri-alene. The application of nucleic acid hybridization as an analytical tool is fundamentally situated on the double-stranded, duplex structure of DNA. The hydrogen bonds between the purine and pyimidine bases in the respective chains in double-stranded DNA can be reversibly broken. The two complementary single chains of DNA resulting from this "melting" or "denaturation" of DNA will associate (often called recombination or hybridization) so that the duplex structure is again formed. As is known, contact of a first single-stranded nucleic acid, either DNA or RNA, which includes a base sequence sufficiently complementary to (ie "homologous to") a second single-stranded nucleic acid under appropriate conditions will result in the formation of DNA'DNA-, RNA "DNA or RNA'RNA hybrids, depending on the starting materials.
Proben vil innbefatte minst en enkeltkjedet basesekvensThe probe will include at least one single-stranded base sequence
som i det vesentlige er komplementær med, eller homologwhich is essentially complementary to, or homologous to
med sekvensen som skal detekteres. En slik basesekvens behøver imidlertid ikke å være et enkelt kontinuerlig poly-nukleotidsegment, men kan bestå av to eller flere individuelle segmenter som er avbrutt av ikke-homologe sekvenser. Disse ikke-homologe sekvensene kan være lineære, eller with the sequence to be detected. However, such a base sequence need not be a single continuous polynucleotide segment, but may consist of two or more individual segments which are interrupted by non-homologous sequences. These non-homologous sequences can be linear, or
de kan være selvkomplementære og danne hårnålssløyfer.they can be self-complementary and form hairpin loops.
I tillegg kan det homologe området av proben være flankert på 3'- og 5<1->terminalene av ikke-homologe sekvenser, som f.eks. de som innbefatter DNA eller RNA av en vektor hvori den homologe sekvensen er innkutt for propagering. I ethvert tilfelle vil proben, når den er tilstede som analytisk reagens, vise detekterbar hybridisering ved et eller flere punkter med prøvenukleinsyrene av interesse. Lineære eller sirkulære enkeltkjedede polynukleotider kan benyttes som probeelement, hvor større eller mindre deler er dupleks-dannet med en komplementær polynukleotidkjede eller kjeder, forutsatt at det kritiske homologe segmentet eller segment-ene er i enkeltkjedet form og tilgjengelig for hybridisering med prøve DNA eller RNA. Det foretrekkes generelt å anvende prober som i det vesentlige er på enkeltkjedet form. Pre-parering av en egnet probe for en spesiell analyse er et spørsmål om rutinemessige ferdigheter. In addition, the homologous region of the probe may be flanked at the 3'- and 5<1->termini by non-homologous sequences, such as e.g. those which include the DNA or RNA of a vector into which the homologous sequence has been cut for propagation. In any case, the probe, when present as an analytical reagent, will show detectable hybridization at one or more points with the sample nucleic acids of interest. Linear or circular single-stranded polynucleotides can be used as a probe element, where larger or smaller parts are duplexed with a complementary polynucleotide chain or chains, provided that the critical homologous segment or segments are in single-chain form and available for hybridization with sample DNA or RNA. It is generally preferred to use probes that are essentially in single chain form. Preparation of a suitable probe for a particular assay is a matter of routine skill.
Ifølge prinsippet ved foreliggende oppfinnelse, resulterer hybridiseringen, som er avhengig av nærværet av den polynukleotide sekvensen av interesse, og binding av de merkede reagenser til hybridet, i at de to merkene bringes tilstrekkelig nærhverandre, slik at signalet som dannes blir vekselvirkning mellom dem, er målbart forskjellig fra det signalet som dannes ved møter under enkel diffusjon i bulk-analyse-mediet. Forskjellige vekselvirkningsfenomener kan anvendes ved foreliggende oppfinnelse. Vekselvirkningen kan være kjemisk, fysisk, eller elektrisk, eller kombina-sjoner av disse kreftene. Omgivelsene for merket som dannes ved hybridisering og binding av de merkede reagenser til de dannede hybrider, heretter referert til som omgivelser forbundet hybrid, må i minst et kritisk henseende være distinkt forskjellig fra bulk-mediet. Siden hybridiseringen bestemmer andelen av merker som dannes i lokaliserte hybrid-omgivelser sammenlignet med bulkfasen, vil den resulterende signalresponsen være avhengig av nærværet av sekvensen som skal bestemmes i analysemediet. According to the principle of the present invention, the hybridization, which is dependent on the presence of the polynucleotide sequence of interest, and binding of the labeled reagents to the hybrid, results in the two labels being brought sufficiently close to each other so that the signal generated is interaction between them, measurably different from the signal formed by encounters during simple diffusion in the bulk analysis medium. Various interaction phenomena can be used in the present invention. The interaction can be chemical, physical, or electrical, or combinations of these forces. The environment for the label formed by hybridization and binding of the labeled reagents to the hybrids formed, hereinafter referred to as environment associated hybrid, must in at least one critical respect be distinctly different from the bulk medium. Since the hybridization determines the proportion of labels formed in localized hybrid environments compared to the bulk phase, the resulting signal response will depend on the presence of the sequence to be determined in the assay medium.
En foretrukket vekselvirkning mellom de to merkene innbefatter to kjemiske reaksjoner hvor et merke deltar i den første reaksjonen og danner et diffunderbart mellomprodukt som deltar i den andre reaksjonen med det andre merket, A preferred interaction between the two labels involves two chemical reactions where one label participates in the first reaction and forms a diffusible intermediate that participates in the second reaction with the second label,
og gir et detekterbart produkt. Mikroomgivelsene for det bundne hybridet vil følgelig inneholde en høyere lokalisert konsentrasjon av mellomproduktet, slik at hastigheten for den signalproduserende andre merkereaksjonen økes, enn bulkoppløsningen. De to merkede kan henholdsvis delta i reaksjonen som reaktanter eller, spesielt foretrukket, and gives a detectable product. The microenvironment for the bound hybrid will consequently contain a higher localized concentration of the intermediate, so that the rate of the signal-producing second label reaction is increased, than the bulk solution. The two labels can respectively participate in the reaction as reactants or, particularly preferred,
som katalysatorer. En eventuell katalyse kan enten være ensymatisk eller ikke-enzymatisk. as catalysts. Any catalysis can be either enzymatic or non-enzymatic.
Et stort antall forskjellige enzymer og katalysatorer kan anvendes ved foreliggende oppfinnelse. Nyttige enzymer for den første reaksjonen innbefatter oksydoreduktaser, spesielt slike som inneholder nukleotider som f.eks. nikotin-amid a de ni'n dinukleotid (NAD) eller dets reduserte form (NADH), eller adenosin trifosfat (ATP) som kofaktorer eller slike som produserer hydrogenperoksyd eller andre små diffunderbare produkter. Noen eksempler er alkoholdehydrogenase, glycerol dehydrogenase, laktat dehydrogenase, malat dehydrogenase, glukose-6-fosfat-dehydrogenase, glukoseoksydase og uricase. Andre klasser av enzymer som f.eks. hydrolase, transferase, lyaser, og isomeraser kan også anvendes. A large number of different enzymes and catalysts can be used in the present invention. Useful enzymes for the first reaction include oxidoreductases, especially those containing nucleotides such as nicotinamide a de ni'n dinucleotide (NAD) or its reduced form (NADH), or adenosine triphosphate (ATP) as cofactors or those that produce hydrogen peroxide or other small diffusible products. Some examples are alcohol dehydrogenase, glycerol dehydrogenase, lactate dehydrogenase, malate dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, glucose oxidase and uricase. Other classes of enzymes such as hydrolase, transferase, lyases, and isomerases can also be used.
Det er spesielt foretrukket at det andre merke også erIt is particularly preferred that the other brand is also
et enzym hvor produktet av den første enzymreaksjonen er et substrat eller en kofaktor for det andre enzymet, slik at man oppnår rask enzymreaksjon i omgivelsene for det bundne hybridet. Dersom f.eks. det første enzymet er en oksydorduktase, som danner hydrogenperoksyd som produkt, an enzyme where the product of the first enzyme reaction is a substrate or a cofactor for the second enzyme, so that rapid enzyme reaction is achieved in the environment of the bound hybrid. If e.g. the first enzyme is an oxidoreductase, which forms hydrogen peroxide as a product,
kan det andre enzymet være peroksydase. En detaljert opp-listing og beskrivelse av nyttige enzymer finnes i US-PS 4.233.02 og 4.275.149. Andre nyttige systemer innbefatter et enzym som det første merke som katalyserer en reaksjon som danner en prostetisk gruppe for et apoenzym eller pro-enzym. Ikke-enzymatiske katalysatorer kan også tjene som merker som nevnt tidligere. Som et eksempel kan det refereres til US-PS 4.160.645. the second enzyme may be peroxidase. A detailed listing and description of useful enzymes can be found in US-PS 4,233,02 and 4,275,149. Other useful systems include an enzyme as the first label that catalyzes a reaction that forms a prosthetic group for an apoenzyme or proenzyme. Non-enzymatic catalysts can also serve as labels as mentioned earlier. As an example, reference can be made to US-PS 4,160,645.
En annen foretrukket vekselvirkning mellom merkene er energi-overføringsvekselvirkning. Det første merke er et foto-emmiterende stoff som f.eks. et fluorescerende- eller luminiscerende stoff, det førstnevnte vil emmitere ved bestråling og det andre vil emmitere ved kjemisk reaksjon. Fotoemmisjonen kan absorberes av det andre merke, slik at emmisjonen enten flokkes eller tilveiebringer en annen emmisjon som f.eks. dersom det absorberende merke selv er fluorescerende. Par av forbindelser som er nyttige for dette formål, beskrives i detalj i US-PS 4.275.149 og 4.318.981. Noen foretrukne fluorescerende/slukkende par er naftalen/antracen, a-naftylamin/dansy1, tryptofan/dansyl, dansyl/fluorescein, ffluorescein/rodamin, tryptofan/fluorescein, N-/p-(2-benzoksazolyl)fenyl/maleimid (BPM)/tiokrom, MPB/8-anilino-1-naftalensulfonat (ANS), tiokrom/N-(4-dimetylamino-3,5-dinitrofenyl)maleimid (DDPM), og ANS/DDPM. Noen foretrukne luminiscerende/slukkende par er luminol med fluorescein, eosin eller rodamin S. Another preferred interaction between the tags is energy transfer interaction. The first mark is a photo-emitting substance such as a fluorescent or luminescent substance, the former will emit upon irradiation and the latter will emit upon chemical reaction. The photoemission can be absorbed by the other label, so that the emission is either clustered or provides another emission such as e.g. if the absorbent label itself is fluorescent. Pairs of compounds useful for this purpose are described in detail in US-PS 4,275,149 and 4,318,981. Some preferred fluorescent/quenching pairs are naphthalene/anthracene, α-naphthylamine/dansy1, tryptophan/dansyl, dansyl/fluorescein, ffluorescein/rhodamine, tryptophan/fluorescein, N-/p-(2-benzoxazolyl)phenyl/maleimide (BPM)/ thiochrome, MPB/8-anilino-1-naphthalenesulfonate (ANS), thiochrome/N-(4-dimethylamino-3,5-dinitrophenyl)maleimide (DDPM), and ANS/DDPM. Some preferred luminescent/quenching pairs are luminol with fluorescein, eosin or rhodamine S.
Dersom det ønskes, kan forskjellige modifikasjoner av de merkede reagensene anvendes innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse. Ved en variasjon kan en av de merkede reagensene innbefatte en fast fase, hvortil det bindende stoffet er bundet og separat også merket. Den faste fasen kan være veggene av reaksjonsbehol-deren eller et dispergert faststoff som f.eks. polyakryl-amid- eller agaroseperler. Man kan også modifisere det bindende stoffet med en bindbar ligand som f.eks. en hapten eller biotin, og innføre merke ved tilsats av et merket anti-hapten antistoff eller merket avidin før eller etter hybridiseringsreaksjonen. Det fremgår følgelig at merket kan forbindes med det bindende stoffet direkte eller in-direkte ved hjelp av mellomliggende komponenter. If desired, various modifications of the labeled reagents can be used within the scope of the present invention. In a variation, one of the labeled reagents may include a solid phase to which the binding substance is bound and separately also labeled. The solid phase can be the walls of the reaction container or a dispersed solid such as e.g. polyacrylamide or agarose beads. One can also modify the binding substance with a bindable ligand, such as a hapten or biotin, and introduce label by adding a labeled anti-hapten antibody or labeled avidin before or after the hybridization reaction. It therefore appears that the mark can be connected to the binding substance directly or indirectly by means of intermediate components.
Et kritisk trekk ved foreliggende oppfinnelse er dannelsen av et hybrid mellom proben og den polynukleotide sekvensen av interesse som innbefatter bindingsposisjoner for de to spesifike bindende reagensene. Et prinsipp for analysen er 2.t hybridiseringen av proben med den ønskede sekvensen medfører at de respektive bindingsposisjonene for de to bindende reagensene bringes til en slik avstand fra hverandre at vekslevirkning mellom merkene kan finne sted. Det kan benyttes en hvilken som helst utførelse av systemet som gir en bindingsposisjon for minst en av de to merkede reagensene som er unikt for hybridet. Derved sikres at den ønskede lokalisering av merkeparet bare vil finne sted ved dannelsen av hybridet. A critical feature of the present invention is the formation of a hybrid between the probe and the polynucleotide sequence of interest that includes binding sites for the two specific binding reagents. A principle for the analysis is 2.t the hybridization of the probe with the desired sequence means that the respective binding positions for the two binding reagents are brought to such a distance from each other that interaction between the labels can take place. Any design of the system that provides a binding position for at least one of the two labeled reagents that is unique to the hybrid can be used. This ensures that the desired localization of the tag pair will only take place during the formation of the hybrid.
Bindingen av merkereagense til hybridet vil normalt innbefatte en meget spesifik ikke-kovalent binding, som er karak-teristisk for en rekke biologisk r avledede stoff, spesielt bindende proteiner som f.eks. immunoglobuliner. En rekke bindende stoff kan benyttes for å tilveiebringe minst en bindende reagens som har unik bindingsaffinitet for hybridet og ubetydelig bindingsaffinitet for enkeltkjedede nukleinsyrer som f.eks. uhybridisert probe og uhybridiserte prøve- . nukleinsyrer. The binding of labeling reagent to the hybrid will normally include a very specific non-covalent bond, which is characteristic of a number of biologically derived substances, especially binding proteins such as e.g. immunoglobulins. A variety of binding agents can be used to provide at least one binding reagent that has unique binding affinity for the hybrid and negligible binding affinity for single-stranded nucleic acids such as e.g. unhybridized probe and unhybridized sample- . nucleic acids.
Spesielt foretrukne bindende stoff er antistoffreagenserParticularly preferred binding agents are antibody reagents
som har anti-hybrid bindingsaktivitet og kan være hele antistoffer eller fragmenter derav, eller aggregater eller konjugater derav, av konvensjonell polyklonal eller mono-klonal type. Foretrukne antistoffreagenser vil være de som er selektive for binding til (i) DNA'RNA eller RNA"RNA hybrider, eller (ii) interkaleringskomplekser. Man vet nå at antistoffer kan stimuleres slik at de er selektive which have anti-hybrid binding activity and may be whole antibodies or fragments thereof, or aggregates or conjugates thereof, of conventional polyclonal or monoclonal type. Preferred antibody reagents will be those which are selective for binding to (i) DNA'RNA or RNA'RNA hybrids, or (ii) intercalation complexes. It is now known that antibodies can be stimulated so that they are selective
for DNA"RNA eller RNA'RNA hybrider fremfor enkeltkjedede nukleinsyrer, på det nåværende tidspunkt betraktes det imidlertid som umulig å generere slik selektivitet i tilfellet DNA * DNA hybrider. I den grad selektive DNA * DNA antistoffer utvikles i fremtiden, vil de klart kunne anvendes ved foreliggende oppfinnelse. Antistoffer til DNA"RNA eller RNA'RNA hybrider, kan benyttes der hvor proben er RNA og prøvenukleinsyrene er DNA eller RNA, eller der for DNA"RNA or RNA'RNA hybrids rather than single-stranded nucleic acids, at the present time, however, it is considered impossible to generate such selectivity in the case of DNA * DNA hybrids. To the extent that selective DNA * DNA antibodies are developed in the future, they will clearly be applicable of the present invention. Antibodies to DNA"RNA or RNA'RNA hybrids can be used where the probe is RNA and the test nucleic acids are DNA or RNA, or where
hvor probene er DNA og prøven RNA.where the probes are DNA and the sample RNA.
Det bør videre bemerkes at når det refereres til en RNA probe, benyttet med en anti-DNA<*>RNA eller anti-RNA<*>RNA reagens, menes det her at ikke alle nukleotidene som innbefattes i proben må være ribonukleotider, dvs. bære en 2'-hydroksylgruppe. Det fundamentale trekk ved en RNA probe benyttet her, er at den er tilstrekkelig ikke-DNA It should also be noted that when referring to an RNA probe, used with an anti-DNA<*>RNA or anti-RNA<*>RNA reagent, it is meant here that not all the nucleotides included in the probe must be ribonucleotides, i.e. bear a 2'-hydroxyl group. The fundamental feature of an RNA probe used here is that it is sufficiently non-DNA
i karakter til å muliggjøre stimulering av antistoffer til DNA * RNA eller RNA"RNA hybrider som innbefater en RNA probe som ikke kryssreagerer i analytisk signifikant grad med de individuelle enkeltkjedene som utgjør slike hybrider. Derfor kan en eller flere av 2<1->posisjonene på nukleotidene som innbefattes i proben, være på deoksyform, forutsatt at antistoff-bindingsegenskapene som er nødvendige for at foreliggende analyse skal kunne utføres, opprettholdes i betydelig grad. På tilsvarende måte kan en RNA probe i tillegg til, eller alternativt til, slik begrenset 2'-deoksymodifikasjon, innbefatte nukleotider som har andre 2<1->modifikasjoner, eller generelt en hvilken som helst av modifikasjon langs ribosefosfat ryggraden, forutsatt at det ikke i betydelig grad påvirker spesifisiteten av antistoffet overfor det dobbeltkjedede hybridiseringsproduk-tet fremfor dets individuelle enkeltkjeder. in nature to enable the stimulation of antibodies to DNA * RNA or RNA"RNA hybrids that include an RNA probe that does not cross-react to an analytically significant degree with the individual single chains that make up such hybrids. Therefore, one or more of the 2<1->positions may on the nucleotides included in the probe, be in the deoxy form, provided that the antibody-binding properties necessary for the present assay to be carried out are maintained to a significant extent. Similarly, an RNA probe may, in addition to, or alternatively to, such limited 2 '-deoxy modification, including nucleotides having other 2<1> modifications, or generally any modification along the ribose phosphate backbone, provided that it does not significantly affect the specificity of the antibody to the double-stranded hybridization product over its individual single chains.
Der hvor slike modifikasjoner finnes i en RNA-probe, vil det immunogene som benyttes for å opprette antistoffreagensen fortrinnsvis innbefatte en kjede som i det vesentlige har tilsvarende modifikasjoner og den andre kjeden vil hovedsakelig bestå av umodifisert RNA eller DNA, avhengig av om prøve-RNA eller -DNA skal detekteres. Fortrinnsvis bør den modifiserte kjeden i immunogene bære identisk med den modifiserte kjeden i RNA probe. Et eksempel på et immunogen er hybridet poly(2'-0-metyladenylsyre)"poly (2<1->deoksytymidylsyre). Et annet eksempel er poly(2'-0-etylinosinsyre)"poly(ribocytidylsyre). Følgende forbindelser er ytterligere eksempler på modifiserte polynukleotider som kan være innbefattet i en RNA probe: 2'-O-metylribo-nukleotid, 2'-O-etylribonukleotid, 2<1->acidodeoksy ribonukleotid, 2'-klorodeoksyribonukleotid, 2'-0-acetyl ribonukleotid, og metylfosfonatene eller fosforotiolatene av ribonukleotider eller deoksy ribonukleotider. Modifiserte nukleotider kan være tilstede i RNA prober som et resultat av innføring under enzymsyntese av proben fra en sjablong. F.eks. er adenosin 5'-0-(1-tiotrifosfat) (ATpaS) og dATPaS substrater for henholdsvis DNA avhengige RNA polymeraser og DNA polymeraser. Alternativt kan den kjemiske modifika-sjonen innføres etter at proben er fremstilt. F.eks. kan en RNA probe 2<1->0-acetyleres med eddiksyreanhydrid under milde betingelser i et vandig oppløsningsmiddel. Where such modifications are present in an RNA probe, the immunogen used to create the antibody reagent will preferably include one chain that has essentially corresponding modifications and the other chain will consist mainly of unmodified RNA or DNA, depending on whether the sample RNA or -DNA is to be detected. Preferably, the modified chain in the immunogen should bear identical to the modified chain in the RNA probe. An example of an immunogen is the hybrid poly(2'-0-methyladenylic acid)"poly (2<1->deoxythymidylic acid). Another example is poly(2'-0-ethylinosinic acid)"poly(ribocytidylic acid). The following compounds are further examples of modified polynucleotides that can be included in an RNA probe: 2'-O-methylribonucleotide, 2'-O-ethylribonucleotide, 2<1->acidodeoxy ribonucleotide, 2'-chlorodeoxyribonucleotide, 2'-0 -acetyl ribonucleotide, and the methylphosphonates or phosphorothiolates of ribonucleotides or deoxy ribonucleotides. Modified nucleotides may be present in RNA probes as a result of introduction during enzymatic synthesis of the probe from a template. E.g. are adenosine 5'-0-(1-thiotriphosphate) (ATpaS) and dATPaS substrates for DNA-dependent RNA polymerases and DNA polymerases, respectively. Alternatively, the chemical modification can be introduced after the probe has been produced. E.g. an RNA probe can be 2<1->0-acetylated with acetic anhydride under mild conditions in an aqueous solvent.
Immunogener for stimulering av antistoffer spesifike for RNA'DNA hybrider kan innbefatte homopolymere eller heteropolymere polynukleotide duplekser. Blant de mulige homopolymere dupleksene er poly(rA)'poly(dT) spesielt foretrukket. /Kitagawa og Stollar (1982) Mol. Immunol. 19:413/. Generelt foretrekkes imidlertid heteropolymere duplekser og disse kan fremstilles på en rekke forskjellige måter, innbefattet transkripsjon av <t>X174 virion DNA med RNA polymerase /Nakasato (1980) Biochem 19:2835/. De valgte RNA' DNA dupleksene adsorberes på et metylert protein, eller bindes på annen måte til et konvensjonelt immunogent bærer-materiale, som f.eks. bovinserumalbumin, og injiseres i det ønskede vertsdyr /se også Stollar (1980) Meth.Enzymol. 70:70/.Antistoffer til RNA'RNA duplekser kan opprettes mot dobbeltkjedede RNA fra viruser som f.eks. reovirus eller Fiji sykdomsvirus som infiserer bl.a. sukkerrør. Også homopolymere duplekser som f.eks. bl.a. poly(ri)"poly (rC) eller poly(rA)"poly(rU), kan benyttes for immunisering som ovenfor. Ytterligere informasjon angående antistoffer til RNA"DNA eller RNA"RNA hybrider, er tilveiebragt i US patentsøknad nr. 616.132, inngitt 1. juni 1984. Immunogens for stimulation of antibodies specific for RNA-DNA hybrids may include homopolymeric or heteropolymeric polynucleotide duplexes. Among the possible homopolymeric duplexes, poly(rA)'poly(dT) is particularly preferred. /Kitagawa and Stollar (1982) Mol. Immunol. 19:413/. In general, however, heteropolymeric duplexes are preferred and these can be prepared in a number of different ways, including transcription of <t>X174 virion DNA with RNA polymerase /Nakasato (1980) Biochem 19:2835/. The selected RNA' DNA duplexes are adsorbed on a methylated protein, or otherwise bound to a conventional immunogenic carrier material, such as e.g. bovine serum albumin, and injected into the desired host animal /see also Stollar (1980) Meth.Enzymol. 70:70/. Antibodies to RNA'RNA duplexes can be created against double-stranded RNA from viruses such as e.g. reovirus or Fiji disease virus which infects e.g. sugar cane. Also homopolymeric duplexes such as e.g. blue. poly(ri)"poly (rC) or poly(rA)"poly(rU), can be used for immunization as above. Additional information regarding antibodies to RNA"DNA or RNA"RNA hybrids is provided in US Patent Application No. 616,132, filed June 1, 1984.
Antistoffer til interkaleringskomplekser kan fremstilles mot et immunogen som vanligvis vil innbefatte et ionisk kompleks mellom et kationisk protein eller proteinderivat (f.eks. metylert bovinsyrealbumin), og det anioniske interkalator nukleinsyrekomplekset. Ideelt bør interkalatoren være kovalent koblet til den dobbeltkjedede nukleinsyren. Interkalator-nukleinsyrekonjugatet kan alternativt være kovalent koblet til et bærerprotein. Nukleinsyredelen av immunogenet kan innbefatte de spesifike parede sekvensene som finnes i analysehybrider eller kan innbefatte en hvilken som helst annen ønsket sekvens siden spesifisiteten av antistoffer generelt ikke vil avhenge av den spesielle basesekvensen som innbefattes. Ytterligere informasjon vedrørende antistoffer til interkaleringskomplekser er tilveiebragt i US patentsøknad nr. 560.429, inngitt 12. desember 19 83. Antibodies to intercalating complexes can be raised against an immunogen which will usually comprise an ionic complex between a cationic protein or protein derivative (eg methylated bovine albumin) and the anionic intercalating nucleic acid complex. Ideally, the intercalator should be covalently linked to the double-stranded nucleic acid. Alternatively, the intercalator nucleic acid conjugate may be covalently linked to a carrier protein. The nucleic acid portion of the immunogen may include the specific paired sequences found in assay hybrids or may include any other desired sequence since the specificity of antibodies will generally not depend on the particular base sequence included. Additional information regarding antibodies to intercalation complexes is provided in US Patent Application No. 560,429, filed December 12, 1983.
Som angitt ovenfor, kan antistoffreagensen bestå av hele antistoffer, fragmenter av antistoffer, polyfunksjonelle antistoffaggregater, eller generelt et hvilket som helst stoff som innbefatter en eller flere spesifike bindings-posis joner fra et antistoff. Når den foreligger i form av hele antistoff, kan de tilhøre en hvilken som helst av klassene eller underklassene av kjente immunoglobuliner, f.eks. IgG, IgM osv. Et hvilket som helst fragment av et hvilket som helst slik antistoff som beholder den spesifike bindingsaffiniteten for den hybridiserte proben kan også anvendes, f.eks. fragmentene av IgG konvensjonelt kjent som Fab, F(ab') og F(ab 1)2• 1 tillegg kan aggregater, polymerer, derivater og konjugater av immunoglobuliner eller fragmenter derav, benyttes der hvor det er hensikts- As indicated above, the antibody reagent may consist of whole antibodies, fragments of antibodies, polyfunctional antibody aggregates, or generally any substance that includes one or more specific binding positions from an antibody. When in whole antibody form, they may belong to any of the classes or subclasses of known immunoglobulins, e.g. IgG, IgM etc. Any fragment of any such antibody that retains the specific binding affinity for the hybridized probe may also be used, e.g. the fragments of IgG conventionally known as Fab, F(ab') and F(ab 1)2• 1 in addition, aggregates, polymers, derivatives and conjugates of immunoglobulins or fragments thereof, can be used where appropriate
messig.appropriately.
Immunoglobulinkilden for antistoffreagensen kan oppnåsThe immunoglobulin source for the antibody reagent can be obtained
på en hvilken som helst tilgjengelig måte som ved konvensjonelle antiserum- og monoklonale teknikker. Antiserum kan oppnås ved velkjente teknikker som innbefatter immunisering av et dyr, som f.eks en mus, kanin, marsvin eller geit, med et egnet immunogen. Immunoglobulinene kan også oppnås ved somatiske cellehybridiseringsteknikker, disse resulterer i det som vanligvis betegnes som monoklonale antistoffer, dette innebærer også anvendelse av et egnet immunogen. by any means available such as by conventional antiserum and monoclonal techniques. Antiserum can be obtained by well known techniques which include immunization of an animal, such as a mouse, rabbit, guinea pig or goat, with a suitable immunogen. The immunoglobulins can also be obtained by somatic cell hybridization techniques, these result in what are usually referred to as monoclonal antibodies, this also involves the use of a suitable immunogen.
I de tilfeller hvor en antistoffreagens selektiv for interkaleringskomplekser anvendes som en av de bindende reagenser, kan en rekke interkalatorforbindelser benyttes. Generelt kan man si at interkalatorforbindelsen fortrinnsvis er et molekylav lavmolekylvekt, som er plant, vanligvis aroma-tisk men noen ganger polycyklisk, og istand til å danne binding med dobbeltkjedede nukleinsyrer, f.eks. DNA"DNA, DNA"RNA, eller RNA"RNA duplekser, vanligvis ved innskudd mellom basepar. Den primære bindingsmekanismen er vanligvis ikke-kovalent, hvor kovalent binding kan finne sted som et andre trinn der hvor interkalatoren har reaktive eller aktiverbare kjemiske grupper som vil danne kovalente bindin-ger med nabokjemiske grupper på en av eller begge de inter-kalerte duplekskjedene. Resultatet av interkaleringen er at nabo basepar spres til en avstand som er ca. dobbelt så stor som den normale separasjonsavstanden, dette ser ut til en økning av molekyllengdenfor duplekset. Videre må det finne sted en oppvinning av dobbeltspiralen på ca. 12-36° for at interkalatoren kan finne plass. Generelle oversikter og ytterligere informasjon finnes i Lerman, J. Mol. Biol. 3:18 (1961); Bloomfield et al., "PhysicalChemistry of Necleic Acids", kap. 7, side 429-476;Harper In those cases where an antibody reagent selective for intercalation complexes is used as one of the binding reagents, a number of intercalator compounds can be used. In general, it can be said that the intercalator compound is preferably a molecule of low molecular weight, which is planar, usually aromatic but sometimes polycyclic, and capable of forming bonds with double-stranded nucleic acids, e.g. DNA"DNA, DNA"RNA, or RNA"RNA duplexes, usually by insertion between base pairs. The primary binding mechanism is usually non-covalent, where covalent binding may occur as a second step where the intercalator has reactive or activatable chemical groups that will form covalent bonds with neighboring chemical groups on one or both of the intercalated duplex chains. The result of the intercalation is that neighboring base pairs are spread to a distance that is approximately twice the normal separation distance, this appears to be an increase in the molecular length for the duplex. Furthermore, a winding of the double helix of about 12-36° must take place for the intercalator to find its place. General overviews and further information can be found in Lerman, J. Mol. Biol. 3:18 (1961); Bloomfield et al ., "PhysicalChemistry of Necleic Acids", ch. 7, pp. 429-476;Harper
og Rowe, NY (1974); Waring, Nature 219:1320 (1968); Hartmann et al., Angew. Chem., Engl. Ed. 7:693 (1968);Lippard,Accts. Chem. Res. 11:211(1978); Wilson, Intercalaltion and Rowe, NY (1974); Waring, Nature 219:1320 (1968); Hartmann et al., Angew. Chem., Engl. Oath. 7:693 (1968); Lippard, Accts. Chem. Res. 11:211(1978); Wilson, Intercalaltion
Chemistry )1982), 455; og Berman et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 10:87 (1981); samt den tidligere nevnte US patent-søknad nr. 560.429. Eksempler på interkalatorer er akridin-fargestoffer, f.eks. akridinorange, fenantridiner, f.eks. etidium, fenaziner, furocoumariner, fenotiaziner, og kino-liner. Chemistry (1982), 455; and Berman et al., Ann. Fox. Biophys. Bio meadow. 10:87 (1981); as well as the previously mentioned US patent application no. 560,429. Examples of intercalators are acridine dyes, e.g. acridine orange, phenanthridines, e.g. ethidium, phenazines, furocoumarins, phenothiazines, and kino-lines.
Interkaleringskompleksene dannes i analysemediet under hybridiseringen ved bruk av en probe som er modifisert i dens komplementære, enkeltkjedede området slik at den har interkalatoren kjemisk bundet dertil på en slik måte at interkaleringskompleksene dannes under hybridiseringen. The intercalation complexes are formed in the assay medium during the hybridization using a probe that is modified in its complementary, single-stranded region so that it has the intercalator chemically bound to it in such a way that the intercalation complexes are formed during the hybridization.
En hvilken som helst velegnet fremgangsmåte kan benyttesAny suitable method may be used
for å oppnå slik binding. En spesielt nyttig fremgangsmåte innbefatter acidointerkalatoren. Når de utsettes for ultra-fiolett lys av høy bølgelengde eller synlig lys, genereres de reaktive nitrenene lett. Nitrenene av arylazider fore-trekker innskuddsreaksjoner fremfor omdanningsprodukter /se White et al., Methods in Enzymol. 46: 644 (1977]_/. Eksempler på azidointerkalatorer er 3-azidoakridin, 9-azidoakridin, etidium monoazider, etidiumdiazod, etidium dimer-azid /Mitchell et al., JACS 104:4265 (19 8-2 )_/, 4-azido-7-klorokinolin, og 2-azidofluoren. Andre nyttige fotoreager-bare interkalatorer er furocoumarinene som danner /2+2/ cykloaddisjonsprodukter med pyrimidinresiduer. Alkylerings-midler kan også benyttes, som f.eks. bis-kloroetylaminer og epoksyder eller aziridiner, f.eks. aflatoksiner, poly-cykliske hydrokarbonepoksyder, mitomycin, og norphillin A. Den interkalator-modifiserte dupleksen denatureres to achieve such binding. A particularly useful method involves the acid intercalator. When exposed to high-wavelength ultra-violet light or visible light, the reactive nitrenes are readily generated. The nitrenes of aryl azides prefer insertion reactions to conversion products / see White et al., Methods in Enzymol. 46: 644 (1977]_/. Examples of azido intercalators are 3-azidoacridine, 9-azidoacridine, ethidium monoazides, ethidium diazod, ethidium dimer-azide /Mitchell et al., JACS 104:4265 (19 8-2 )_/, 4 -azido-7-chloroquinoline, and 2-azidofluorene. Other useful photoreactive intercalators are the furocoumarins which form /2+2/ cycloaddition products with pyrimidine residues. Alkylating agents can also be used, such as bis-chloroethylamines and epoxides or aziridines , e.g., aflatoxins, polycyclic hydrocarbon epoxides, mitomycin, and norphillin A. The intercalator-modified duplex is denatured
så slik at den gir den modifiserte enkeltkjedede proben.so that it gives the modified single-stranded probe.
Som nevnt må minst en av de bindbare reagensene være avAs mentioned, at least one of the bindable reagents must be off
den typen som er diskutert ovenfor, det er imidlertid større valgmuligheter for den andre bindende reagensen siden denne ikke trenger å diskrimiere mellom hybridet og andre nukleinsyrer, innbefattet proben og prøvematerialene, for å oppnå den ønskede effekten. Følgelig kan den andre bindende the type discussed above, however, there is greater choice for the second binding reagent since it does not need to discriminate between the hybrid and other nucleic acids, including the probe and sample materials, to achieve the desired effect. Consequently, the other can be binding
reagensen være den samme som eller et annet bindende materiale enn benyttet i den nevnte reagensen, bortsett fra at når den er den samme, består den endelige forskjellen i at analysereagensen merkes med det andre merket. Når man anvender en antistoffreagens som er selektiv forbinding av interkaleringskomplekser som begge de bindende reagaenser ønsker man normalt å anvende en probe som er modifisert slik at den har interkalatoren kjemisk bundet til proben, the reagent be the same as or a different binding material than that used in said reagent, except that when it is the same, the final difference consists in the assay reagent being labeled with the other label. When using an antibody reagent that is selective binding of intercalation complexes as both binding reagents, one normally wants to use a probe that has been modified so that it has the intercalator chemically bound to the probe,
i motsetning til tilsats som en oppløselig forbindelse. as opposed to additive as a soluble compound.
Alternativt kan den andre bindende reagensen være et hvilket som helst materiale som bindes til proben. Dvs. at den kan være en antistoffreagens som bindes ikke-spesifikt til nukleinsyrer som f.eks. anti-DNA"DNA. Ved en annen utførelse anvendes en probe som innbefatter en spesifikt bindende ligand-del hvor den ikke-spesifikt bindende reagensen er en bindende partner for en slik ligand-del. I et slikt tilfelle kan ligand-del/bindende partner-paret velges fra kjente materialer som f.eks. haptener/antistoffer, antigener/antistoffer, lecitiner/polysakkarider, hormoner/ reseptorproteiner o.l. I denne forbindelse kan det refereres til britisk patent 2.019,408, europeisk patent søknad 63.879 og 97.373 og PCT publisert søknad 83-1459 og 83-2286 . Alternatively, the second binding reagent can be any material that binds to the probe. That is that it can be an antibody reagent that binds non-specifically to nucleic acids such as e.g. anti-DNA"DNA. In another embodiment, a probe is used which includes a specifically binding ligand part where the non-specific binding reagent is a binding partner for such a ligand part. In such a case, the ligand part/binding partner can -the pair is selected from known materials such as haptens/antibodies, antigens/antibodies, lecithins/polysaccharides, hormones/receptor proteins, etc. In this connection, reference can be made to British patent 2,019,408, European patent application 63,879 and 97,373 and PCT published application 83-1459 and 83-2286.
Selv om det generelt foretrekkes at de kritiske mikroomgivelsene for det bundne hybrider skapes i en del av eller hele det hybridiserte komplementære området av prøve/probe-dupleksen, kan prinsippielt slike mikroomgivelser også finnes på grensen mellom et slikt komplementært område og det flankerende området. Dette kan skje ved anvendelse av bindende reagenser som beskrevet ovenfor. I tillegg kan man benytte et bindende stoff for en bindingsposisjon på.dobbeltkjedede flankeringsområder av proben som den ikke-spesifike bindende reagensen. Eksempler på slike bindingsposisjon/bindende partner-par er promotorsekvenser (f.eks. lac-promotor, trp-promotor, og promotorer forbundet med bakteriofager)/polymerase; lac operator/lac repressor protein; og antiiske nukleotider og sekvenser (f.eks. Z- Although it is generally preferred that the critical microenvironments for the bound hybrids are created in part or all of the hybridized complementary region of the probe/probe duplex, in principle such microenvironments can also be found at the boundary between such a complementary region and the flanking region. This can be done by using binding reagents as described above. In addition, one can use a binding substance for a binding position on double chain flanking regions of the probe as the non-specific binding reagent. Examples of such binding site/binding partner pairs are promoter sequences (eg, lac promoter, trp promoter, and promoters associated with bacteriophages)/polymerase; lac operator/lac repressor protein; and antigenic nucleotides and sequences (eg, Z-
DNA og sjeldne nukleotider som f.eks 5-halodeoksyuridiner)/ antistoffer dertil. DNA and rare nucleotides such as 5-halodeoxyuridines)/ antibodies thereto.
Med referanse til tegningene og de eksemplene som følger, kan et par spesifike utførelser av foreliggende analyse metode beskrives. Ved fremgangsmåten vist i fig. 1 anvendes en umodifisert polynukleotid probe som enten er RNA eller DNA når prøvesekvensen av interesse er RNA, når prøvesekven-sen er DNA er proben RNA. Bindingsreagensene er de samme eller forskjellige antistoffreagenser (Ab) som er selektive for RNA"DNA eller RNA'RNA hybrider avhengig av hvilke som foreligger. En antistoffreagens er merket med glukoseoksydase (GOD) og den andre mer peroksydase (POD). I nærvær av glukose og en fargeindikator for hydrogenperoksyd vil hastigheten for fargeutviklingen avhenge av omfanget av hybridiseringen som finner sted. I det bundne hybridet bringes glukoseoksydase og peroksydase til et område a fra hverandre, dette resulterer i en øket hastighet for fargeutvikling på grunn av rask diffusjon av hydrogenperoksyd til peroksydase. I bulkmediet må hydrogenperoksyd gjennomsnittlig diffundere avstanden b for å forårsake en fargeutvikling som gir opphav til en betydelig forandret hastighet. Even-tuelt kan katalase inkluderes i bulkoppløsningen i konsen-trasjoner tilstrekkelige til effektivt å ødelegge alt hydrogenperoksyd som diffunderer bort fra mikroomgivelsen for det bundne hybridet, slik at bakgrunnsfargedannelsen reduseres . With reference to the drawings and the examples that follow, a couple of specific embodiments of the present analysis method can be described. In the method shown in fig. 1, an unmodified polynucleotide probe is used which is either RNA or DNA when the sample sequence of interest is RNA, when the sample sequence is DNA the probe is RNA. The binding reagents are the same or different antibody reagents (Ab) that are selective for RNA'DNA or RNA'RNA hybrids depending on which are present. One antibody reagent is labeled with glucose oxidase (GOD) and the other more peroxidase (POD). In the presence of glucose and a hydrogen peroxide color indicator, the rate of color development will depend on the extent of hybridization that takes place. In the bound hybrid, glucose oxidase and peroxidase are brought to a distance a from each other, this results in an increased rate of color development due to rapid diffusion of hydrogen peroxide to peroxidase . In the bulk medium, hydrogen peroxide must diffuse the average distance b to cause a color development that gives rise to a significantly altered rate. Optionally, catalase may be included in the bulk solution in concentrations sufficient to effectively destroy any hydrogen peroxide that diffuses away from the microenvironment for the bound the hybrid, so that the background color e formation is reduced.
Anvendelsen av en ligand-modifisert probe er vist i fig.The use of a ligand-modified probe is shown in fig.
2, hvor biotin (Bio) er den valgte ligand. I dette tilfellet er den GOD-merkede bindingsreagensen igjen et antistoff til.RNA'DNA eller RNA'RNA, avhengig av hvilken som foreligger, og den andre bindingsreagensen er POD-merket avidin (Av). Registreringen av fargeutviklingen vil foregå som beskrevet ved fremgangsmåte A. 2, where biotin (Bio) is the selected ligand. In this case, the GOD-labeled binding reagent is again an antibody to RNA'DNA or RNA'RNA, whichever is present, and the other binding reagent is POD-labeled avidin (Av). The registration of the color development will take place as described in procedure A.
Ved fremgangsmåten vist i fig. 3 er proben dobbeltmodifisert, med både biotin som i fremgangsmåte B og en kjemisk bundet interkalator (I). Et antistoff til interkaleringskomplekser som innbefatter I er merket med et fluorescerende stoff In the method shown in fig. 3, the probe is doubly modified, with both biotin as in method B and a chemically bound intercalator (I). An antibody to intercalation complexes involving I is labeled with a fluorescent substance
(F) og avidin er merket med en slukker (Q). Fluorescens-(F) and avidin is labeled with a quencher (Q). Fluorescence
og slukker-merkene bringes i energioverføringsavstand aand the extinguisher marks are brought into energy transfer distance a
i det bundne hybridet, slik at ved bestråling med lys av en første bølgelengde (hv^), vil den emmiterte energi (h^) absorberes av slukkeren og ikke detekteres. På den annen side vil fluorescens-merket antistoff i bulkoppløsningen befinne seg i en gjennomsnittlig avstand b fra slukkeren, hvilket ikke er nær nok for effektiv energioverføring, in the bound hybrid, so that upon irradiation with light of a first wavelength (hv^), the emitted energy (h^) will be absorbed by the quencher and not detected. On the other hand, fluorescently labeled antibody in the bulk solution will be at an average distance b from the quencher, which is not close enough for efficient energy transfer,
og fluorescens emmisjonen observeres. Mengden av hlys som detekteres er omvendt proporsjonal med omfanget av hybridiseringen som finner sted. and the fluorescence emission is observed. The amount of light detected is inversely proportional to the extent of hybridization that takes place.
Prøven som skal analyseres kan være et hvilket som helst medium av interesse, og vil vanligvis være en flytende prøve av medisinsk-, veterinærmedisinsk-, miljømessig-, ernæringsmessig-, eller industriell betydning. Humane og animale prøver og legemsvæsker kan spesielt analyseres ved foreliggende fremgangsmåte, innbefattet urin blod (serum eller plasma), fostervann, melk, cerebrospinalvæske, spytt, avføring, lungeaspirater, halsavstrykninger, genitalavstryk-ninger og eksudater, rektalavstrykninger, og nasopharnygale aspirater. I tilfeller hvor prøven som tas fra pasienten eller andre kilder for undersøkelse, inneholder hovedsakelig dobbeltkjedede nukleinsyrer, slik de f.eks. inneholdes i celler, behandles prøven for å denaturere nukleinsyrene, The sample to be analyzed can be any medium of interest, and will usually be a liquid sample of medical, veterinary, environmental, nutritional, or industrial importance. Human and animal samples and body fluids can in particular be analyzed by the present method, including urine blood (serum or plasma), amniotic fluid, milk, cerebrospinal fluid, saliva, feces, lung aspirates, throat swabs, genital swabs and exudates, rectal swabs, and nasopharyngeal aspirates. In cases where the sample taken from the patient or other sources for examination mainly contains double-stranded nucleic acids, as they e.g. contained in cells, the sample is processed to denature the nucleic acids,
og om nødvendig først å frigjøre nukleinsyrer fra celler.Denaturering av nukleinsyrer utføres fortrinnsvis ved oppvar-ming i kokende vann, eller ved alkalibehandling (f.eks. and, if necessary, first to release nucleic acids from cells. Denaturation of nucleic acids is preferably carried out by heating in boiling water, or by alkali treatment (e.g.
0,1 N natriumhydroksyd) som om ønsket samtidig kan benyttes for å lyse cellene. Frigjøring av nukleinsyrer kan også oppnås ved f.eks. mekanisk nedbrytning (frysing/opptining, abrasjon, ved "hjelp av lydbølger), fysisk/kjemisk nedbrytning (rensemidler som f.eks. "Triton", "Tween", natriumdode- 0.1 N sodium hydroxide) which, if desired, can also be used to light the cells. Release of nucleic acids can also be achieved by e.g. mechanical degradation (freezing/thawing, abrasion, with the help of sound waves), physical/chemical degradation (cleaning agents such as "Triton", "Tween", sodium dode-
cylsulfat, alkalibehandling, ostmotisk sjokk, eller varme), eller enzymatisk lysing (lysozym, proteinase K, pepsin). cyl sulfate, alkali treatment, osmotic shock, or heat), or enzymatic lysis (lysozyme, proteinase K, pepsin).
Det resulterende forsøksmedium vil inneholde nukleinsyrer på enkeltkjedet form som såkan analyseres ifølge foreliggende hybridiseringsfremgangsmåte. I de tilfeller hvor RNA'DNA skal detekteres med merkede antistoffreagenser, kan m RNA The resulting test medium will contain nucleic acids in single-chain form, which can then be analyzed according to the present hybridization method. In cases where RNA'DNA is to be detected with labeled antibody reagents, m RNA can
og rRNA i prøven forhindres fra deltagelse i bindingsreak-sjonen ved konvensjonelle fremgangsmåter som f.eks. behandling under alkaliske betingelser, f.eks. de samme betingelser som benyttes for å denaturere nukleinsyrene i prøven. and rRNA in the sample is prevented from participating in the binding reaction by conventional methods such as e.g. treatment under alkaline conditions, e.g. the same conditions used to denature the nucleic acids in the sample.
Som kjent kan forskjellige hydridiseringsbetingelser benyttes ved analysen. Typisk vil hybridiseringen foregå ved noe forhøyede temperaturer, f.eks. mellom 35 og 75°C, vanligvis rundt 65°C, i en oppløsning som innbefatter buffer ved pH mellom ca. 6 og 8, og med egnet ionestyrke (f.eks. 5XSSX hvor 1XSSC = 0,15 M natriumklorid og 0,015M natrium-citrat, pH 7,0). I tilfeller hvor det er ønskelig å benytte lavere hybridiseringstemperaturer, kan hydrogenbindende reagenser som f.eks. dimetylsulfoksyd og formamid innbefattes. Graden av komplementaritet mellom prøven og probe-kjedene som kreves for at hybridiseringen skal finne sted, avhenger av stringensen ved betingelsene. Faktorer som bestemmer stringensen er velkjente. As is known, different hydridation conditions can be used in the analysis. Typically, the hybridization will take place at somewhat elevated temperatures, e.g. between 35 and 75°C, usually around 65°C, in a solution including buffer at pH between approx. 6 and 8, and with suitable ionic strength (e.g. 5XSSX where 1XSSC = 0.15 M sodium chloride and 0.015 M sodium citrate, pH 7.0). In cases where it is desirable to use lower hybridization temperatures, hydrogen-binding reagents such as e.g. dimethylsulfoxide and formamide are included. The degree of complementarity between the sample and probe strands required for hybridization to occur depends on the stringency of the conditions. Factors that determine stringency are well known.
Normalt vil de temperaturbetingelsene som velges for hybridisering være inkompatible med bindingen av anti-hybrid reagensen til dannede hybrider og deteksjon av merkerespon-sen. Følgelig vil anti-hybrid-bindingstrinnet og merke-deteksjonstrinnet finne sted etter at hybridiseringstrinnet er fullført. Reaksjonsblandingen bringes normalt til en temperatur i området fra ca. 3°C til ca. 40°C, og bindings-og deteksjonstrinnene utføres så. Fortynning av hybridiser-ingsblandingen før tilsats av antistoffreagensen er ønskelig når salt- og/eller formamid-konsentrasjonene er høye nok til i betydelig grad å påvirke antistoff bindingsreak-sj onen. Normally, the temperature conditions chosen for hybridization will be incompatible with the binding of the anti-hybrid reagent to the hybrids formed and detection of the label response. Accordingly, the anti-hybrid binding step and the label detection step will take place after the hybridization step is completed. The reaction mixture is normally brought to a temperature in the range from approx. 3°C to approx. 40°C, and the binding and detection steps are then performed. Dilution of the hybridization mixture before adding the antibody reagent is desirable when the salt and/or formamide concentrations are high enough to significantly affect the antibody binding reaction.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer i tillegg et reagenssystem, dvs. en reagenskombinasjon eller innretninger, The present invention additionally provides a reagent system, i.e. a reagent combination or devices,
som innbefatter alle de essensielle elementer som kreves for å gjennomføre en ønsket analysefremgangsmåte. Reagenssystemet befinner seg på kommersielt pakket form, som en sammensetning eller tilsetning der hvor kompatibiliteten av reagensene tillater det, i en forsøkskonfigurasjon, which includes all the essential elements required to carry out a desired analysis procedure. The reagent system is in commercially packaged form, as a composition or additive where the compatibility of the reagents permits, in an experimental configuration,
eller vanligvis som en forsøkspakke, dvs. en pakket kombina-sjon av en eller flere beholdere, innretninger e.l. som inneholder de nødvendige reagenser, og vanligvis innbefattet skriftlige instruksjoner angående utførelsen av analysene. Reagenssystemene ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter alle konfigurasjoner og sammensetninger for utføring av forskjelige hybridiseringsmetoder beskrevet her. or usually as a trial package, i.e. a packaged combination of one or more containers, devices etc. containing the necessary reagents, and usually including written instructions regarding the performance of the analyses. The reagent systems according to the present invention include all configurations and compositions for carrying out the various hybridization methods described here.
I alle tilfeller vil reagenssystemet innbefatte (1) en nukleinsyreprobe som beskrevet, og (2) første og andre merkede bindende reagenser. En forsøkspakkeform av systemet kan i tillegg innbefatte hjepekjemikalier som f.eks. kompo-nentene av hybridiseringsoppløsningen og denatureringsmidler som er istand til å overføre dobbeltkjedede nukleinsyrer i en prøve til enkeltkjedet form. Fortrinnsvis innbefattes et kjemisk lysings- og denatureringsmiddel, f.eks. alkali, for behandling av prøver slik at enkeltkjedede nukleinsyrer frigj øres. In all cases, the reagent system will include (1) a nucleic acid probe as described, and (2) first and second labeled binding reagents. A test package form of the system can also include auxiliary chemicals such as e.g. the components of the hybridization solution and denaturants capable of converting double-stranded nucleic acids in a sample to single-stranded form. Preferably, a chemical lightening and denaturing agent is included, e.g. alkali, for treating samples so that single-stranded nucleic acids are released.
Foreliggende oppfinnelse skal nå illustreres, men ikke begrenses, ved følgende eksempler. The present invention shall now be illustrated, but not limited, by the following examples.
Eksempel 1.Example 1.
Hybridiseringsanalyse for bekateriell RNA kontrollert med merkede antistoffer til RNA"DNA hybrid. Hybridization assay for bacterial RNA controlled with labeled antibodies to RNA"DNA hybrid.
A. Monoklonalt antistoff til RNA'DNA hybrid opprettesA. Monoclonal antibody to RNA'DNA hybrid is created
etter fremgangsmåten beskrevet av Stewart et al., (1981)following the procedure described by Stewart et al., (1981)
PNAS 78, 3751. Antistoffet isoleres fra bukhinnevæskePNAS 78, 3751. The antibody is isolated from peritoneal fluid
ved affinintetskromatografi på protein A "Sepharose".by affinity chromatography on protein A "Sepharose".
Ca. 1 ml bukhinnevæske pr. ml protein A "Sepharose" tilføres kolonnen og deretter vaskes kolonnen med 50 millimolar (mM) bicin buffer, pH 8,0, 0,15 molar (M) NaCl inntil absorbansen for effluenten ved 280 nanometer (mn) er mindre enn 0,05. Det bundne antistoffet elueres med 0,1 M glycin-buffer, pH 3,0, og antistoff detekteres ved å måle absorbansen ved 280 nm. Samlingen av antistoff innstilles på About. 1 ml peritoneal fluid per ml protein A "Sepharose" is added to the column and then the column is washed with 50 millimolar (mM) bicine buffer, pH 8.0, 0.15 molar (M) NaCl until the absorbance of the effluent at 280 nanometers (mn) is less than 0.05 . The bound antibody is eluted with 0.1 M glycine buffer, pH 3.0, and antibody is detected by measuring the absorbance at 280 nm. The collection of antibody is set to
pH 5,0 eller høyere ved tilsats av IM bicin buffer, pHpH 5.0 or higher with the addition of IM bicine buffer, pH
8,5. Samlingen dialyseres i 0,IM borat buffer, pH 9,0. 8.5. The collection is dialysed in 0.1M borate buffer, pH 9.0.
Antistoffet merkes lett med 5-(4,6-diklorotriazin-2-yl)-aminofluorescein (DTAF) (Molecular Probes, Inc., Junction City, Oregon) ved fremgangsmåten ifølge Blakeslee og Baines The antibody is readily labeled with 5-(4,6-dichlorotriazin-2-yl)-aminofluorescein (DTAF) (Molecular Probes, Inc., Junction City, Oregon) by the method of Blakeslee and Baines
(1976) J. Immunol. Meth. 13, 305. En oppløsning som inneholder 1,44 mikromol ((imol) DTAF i 361 mikroliter {[ il) (1976) J. Immunol. Meth. 13, 305. A solution containing 1.44 micromoles ((imol) DTAF in 361 microliters {[ il)
av boratbuffer, tilsettes til 2,4 ml 0,014 mM antistoff og får reagere i 1 time ved 25°C. Reaksjonsblandingen kromatograferes på en 1 x 25 cm "Biogel P-6DG" kolonne med 0,IM natriumfosfat buffer, pH 7,0, 0,IM NaCl som eluent. Absorbansene ved 280 nm av . 1 ml fraksjoner kontrolleres of borate buffer, is added to 2.4 ml of 0.014 mM antibody and allowed to react for 1 hour at 25°C. The reaction mixture is chromatographed on a 1 x 25 cm "Biogel P-6DG" column with 0.1M sodium phosphate buffer, pH 7.0, 0.1M NaCl as eluent. The absorbances at 280 nm of . 1 ml fractions are checked
og de som innbefatter den første toppen samles. Det molare DTAF/proteinforholdet bestemmes ved fremgangsmåten ifølge The og Feltkamp (1970) Immunology 18, 865. and those comprising the first peak are collected. The DTAF/protein molar ratio is determined by the method of The and Feltkamp (1970) Immunology 18, 865.
Frie tiol-grupper innføres i antistoffet ved reaksjon med N-ravsyreimidyl 3-(2-pyridylditio)propionat og etterfølgende mild reduksjon med ditiotreitol /Carlson et al., (1978) Biochem. J. 173, 723/. Free thiol groups are introduced into the antibody by reaction with N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate and subsequent mild reduction with dithiothreitol /Carlson et al., (1978) Biochem. J. 173, 723/.
B. Et glukoseoksydase antistoff konjugat fremstilles på følgende måte. Maleimid-grupper innføres i glukoseoksydase (tilgjengelig fra Miles Scientific, Naperville, IL) ved reaksjon med N-hydroksyravsyreimidester av N-(4-karboksy-cykloheksylmetyl)-maleimid (SMCC) som beskrevet av /Yoshi-toake, et al., (1979)0 Eur. J. Biochem. 101, 395 (1979]_/. B. A glucose oxidase antibody conjugate is prepared as follows. Maleimide groups are introduced into glucose oxidase (available from Miles Scientific, Naperville, IL) by reaction with N-hydroxysuccinic acid imide ester of N-(4-carboxy-cyclohexylmethyl)-maleimide (SMCC) as described by /Yoshi-toake, et al., ( 1979)0 Eur. J. Biochem. 101, 395 (1979)_/.
Denne glukoseoksydasen kombineres øyeblikkelig med detThis glucose oxidase immediately combines with it
dobbelte av den molare mengde av det tiol-derivatiserte twice the molar amount of the thiol-derivatized
antistoffet beskrevet ovenfor. Reaksjonsbetingelsene og rensefremgangsmåtene ifølge Yoshitake et al. følges. Enzyminnholdet i det rensede konjugatet bestemmes ved måling the antibody described above. The reaction conditions and purification procedures according to Yoshitake et al. is followed. The enzyme content in the purified conjugate is determined by measurement
av enzymaktiviteten og antistoffinnholdet bestemmes ved måling av DTAF innholdet som beskrevet av The og Feltkamp, supra. of the enzyme activity and the antibody content is determined by measuring the DTAF content as described by The and Feltkamp, supra.
C. Pepperrot peroksydase reageres med SMCC og koblesC. Horseradish peroxidase is reacted with SMCC and coupled
til det tiol-derivatiserte antistoffet ved fremgangsmåten ifølge Ishikawa et al., (1983) J. Immunoassay 4:209. D. Et 565 basepar fragament fra en gene for det 16. ribosomale RNA fra E.coli er klonet mellom Hind III posisjonene på en pBR322 vektor /Brosius (1978) Proe. Nat'. Acad. Sei. 75:4801/. Fragmentet deles ved nedbrytning med Hind III restriksjons endonuklease. to the thiol-derivatized antibody by the method of Ishikawa et al., (1983) J. Immunoassay 4:209. D. A 565 base pair fragment from a gene for the 16th ribosomal RNA from E.coli is cloned between the Hind III positions of a pBR322 vector /Brosius (1978) Proe. Night'. Acad. Pollock. 75:4801/. The fragment is cleaved by digestion with Hind III restriction endonuclease.
E. En urinprøve som inneholder mer enn 10^ bakterierE. A urine sample containing more than 10^ bacteria
pr. ml, fortynnes til det tredobbelte volum til en anriket kulturbuljong og inkuberes ved 35°C inntil cellepopulasjonen nåo r ca. 10 9 organismer pr. ml. Deler av kulturen overføres til en serie rør, slik at hvert rør inneholder 10"<*>til 10 9 bakterier. Rørene sentrifugeres ved 10 000 x g i 10 minutter og overvæskene fjernes. Cellene lyses i 20 |_il pr. rør av 10 milligram eggehvitelysozym (Sigma CHemical Co., St. Louis, MO) i 10 mM tris-hydrokloridbuffer, pH per ml, diluted to three times the volume of an enriched culture broth and incubated at 35°C until the cell population reaches approx. 10 9 organisms per ml. Parts of the culture are transferred to a series of tubes, so that each tube contains 10"<*> to 10 9 bacteria. The tubes are centrifuged at 10,000 x g for 10 minutes and the supernatants are removed. The cells are lysed in 20 µl per tube of 10 milligrams of egg white lysozyme ( Sigma CHemical Co., St. Louis, MO) in 10 mM Tris-hydrochloride buffer, pH
8,0, 0,IM NaCl og 5 mM etylendiamintetraeddiksyre. 158.0, 0.1M NaCl and 5mM ethylenediaminetetraacetic acid. 15
minutter senere tilsettes 80 |il av en oppløsning sammensatt av 60% formamid og 40% 0,16 M natriumfosfatbuffer, pH 6,5, minutes later, 80 µl of a solution composed of 60% formamide and 40% 0.16 M sodium phosphate buffer, pH 6.5, is added
1,44 M NaCl, og 0,1% (vekt/volum) natriumdoedcylsulfat).1.44 M NaCl, and 0.1% (w/v) sodium dodecyl sulfate).
DNA proben beskrevet i avsnitt D ovenfor, i 0,2 M natriumfosfatbuffer, pH 6,5, denatureres i et kokende vannbad i 5 minutter og avkjøles på is. 20 mikroliters prøver (80 ng DNA) tilsettes til hvert rør og inkuberes ved 55°C The DNA probe described in section D above, in 0.2 M sodium phosphate buffer, pH 6.5, is denatured in a boiling water bath for 5 minutes and cooled on ice. 20 microliter samples (80 ng DNA) are added to each tube and incubated at 55°C
i 18 timer. Deretter tilsettes 500 (il av peroksydasemerket antistoff og glukoseoksydase-merket antistoff til hvert for 18 hours. Then 500 µl of peroxidase-labeled antibody and glucose oxidase-labeled antibody are added to each
rør som får så ved romtemperatur i 2 timer. Konsentrasjonen av disse enzymkonjugatene optimaliseres i innledende forsøk, slik at man oppnår optimale signal-til-bakgrunns-forhold. tube that gets so at room temperature for 2 hours. The concentration of these enzyme conjugates is optimized in initial experiments, so that optimal signal-to-background ratios are achieved.
Følgende substratreagens fremstilles og benyttes innenThe following substrate reagent is prepared and used within
3 timer: 0,IM natriumfosfat, pH 6,5, 0,1% bovinserumalbumin, 20 mM 3,5-dikloro-2-hydroksybenzensulfonat, 0,IM glukose, 0,01 enhet katalase/ml og 0,2 mM 4-aminoantipyrin. 1 ml av substratreagens tilsettes til hvert rør og inkuberes ved 37°C i 30 minutter. Absorbansene ved 510 nm registreres. Når antallet bakterier pr. rør øker, vil mengden av ribosomalt RNA"DNA hybrid øke, og som er resultat, vil absorbansen avta. 3 hours: 0.IM sodium phosphate, pH 6.5, 0.1% bovine serum albumin, 20 mM 3,5-dichloro-2-hydroxybenzenesulfonate, 0.IM glucose, 0.01 unit catalase/ml and 0.2 mM 4- aminoantipyrine. 1 ml of substrate reagent is added to each tube and incubated at 37°C for 30 minutes. The absorbances at 510 nm are recorded. When the number of bacteria per tube increases, the amount of ribosomal RNA"DNA hybrid will increase, and as a result, the absorbance will decrease.
Eksempel II.Example II.
Hybridiseringsanalyse for deteksjon av bakterielt ribosomalt RNA ved bruk av biotinylert DNA probe. Hybridization assay for the detection of bacterial ribosomal RNA using a biotinylated DNA probe.
A. Biotin-ll-dUTP og streptavidin-pepperrot peroksydase-konjugat er tilgjengelig fra Enzo Biochem., Inc., New York, A. Biotin-II-dUTP and streptavidin-horseradish peroxidase conjugate are available from Enzo Biochem., Inc., New York,
NY. NEW.
B. 565 basepar proben for ribosomal RNA merkes med biotin-11-dUTP ved fremgangsmåten etter Langer et al., (1981) B. The 565 base pair probe for ribosomal RNA is labeled with biotin-11-dUTP by the method of Langer et al., (1981)
Proe. Nati., Acad. Sei., 78:6633.Pro. Nat., Acad. Sci., 78:6633.
C.Bakterier bearbeides som beskrevet i eksempel I, delC. Bacteria are processed as described in example I, part
E ovenfor. Lysatene kombineres med 80 ul av en oppløsning bestående av 60% formamid og 40% 0,16M natriumfosfatbuffer, E above. The lysates are combined with 80 µl of a solution consisting of 60% formamide and 40% 0.16M sodium phosphate buffer,
pH 6,5, 1,44M NaCl og 0,1% (vekt/volum) natriumdodecylsulfat. Den biotinylerte DNA proben denatureres i et kokende vannbad i 5 minutter og avkjøles så på is. Proben er i 0,2M natriumfosfatbuffer, pH 6,5, og 20 ul porsjoner som inneholder80ng probe tilsettes til hvert ekstrakt og inkuberes ved65°C i 18 timer. Deretter tilsettes 500 ul av peroksydase- pH 6.5, 1.44M NaCl and 0.1% (w/v) sodium dodecyl sulfate. The biotinylated DNA probe is denatured in a boiling water bath for 5 minutes and then cooled on ice. The probe is in 0.2M sodium phosphate buffer, pH 6.5, and 20 µl aliquots containing 80ng probe are added to each extract and incubated at 65°C for 18 hours. 500 ul of peroxidase is then added
merket streptavidin og glukoseoksydasemerket antistoff mot RNA"DNA hybrid til hvert rør som får stå ved romtemperatur i 2 timer. Konsentrasjonene av disse enzymkonjugatene optimaliseres i innledende forsøk, slik at man oppnås maksi-male signal-til-bakgrunn forhold. labeled streptavidin and glucose oxidase labeled antibody against RNA"DNA hybrid to each tube which is allowed to stand at room temperature for 2 hours. The concentrations of these enzyme conjugates are optimized in initial experiments so that maximal signal-to-background ratios are achieved.
Enzymreaksjonene initieres ved tilsats av 1 ml av substratreagensen beskrevet i eksempel I, seksjon D. Disse reak-sjonene får forløpe ved 37°C i 30 minutter og deretter registreres absorbansene ved 510 nm. Absorbansene vil øke når antallet bakterier tilsatt pr. rør øker. The enzyme reactions are initiated by the addition of 1 ml of the substrate reagent described in example I, section D. These reactions are allowed to proceed at 37°C for 30 minutes and then the absorbances are recorded at 510 nm. The absorbances will increase when the number of bacteria added per pipe increases.
Eksempel III.Example III.
Hybridiseringsanalyse for bakteriell ribosomal RNA ved anvendelse av en probe interkalert med etidiumbromid. Hybridization assay for bacterial ribosomal RNA using a probe intercalated with ethidium bromide.
A. Kalvetymus DNA (Sigma Chemical Co.) behandles medA. Calve thymus DNA (Sigma Chemical Co.) is treated with
pronase for å nedbryte proteinforurensninger og oppløses deretter i etanol. DNA oppløses i 20 mM Tris-hydrokloridbuffer, pH 8,0, 0,2 M NaCl. pronase to degrade protein contaminants and then dissolved in ethanol. DNA is dissolved in 20 mM Tris-hydrochloride buffer, pH 8.0, 0.2 M NaCl.
Et fotoreaktivt derivat av etidiumbromid, 8-azidoetidium, fremstilles ved fremgangsmåten ifølge Graves et al., (1977) Biochim. Biophys. Acta, 479:98. Det fremstilles en oppløs-ning som inneholder ca. 1 mM basepar av DNA og 0,5 mM 8-azidoetidium. Denne oppløsningen omrøres i et reaksjons- A photoreactive derivative of ethidium bromide, 8-azidoethidium, is prepared by the method of Graves et al., (1977) Biochim. Biophys. Acta, 479:98. A solution containing approx. 1 mM base pair of DNA and 0.5 mM 8-azidoethidium. This solution is stirred in a reaction
kar av glass som befinner seg i et vannbad som holdes ved 20-30°C, og fotolyseres 10-20 cm fra en 150 watts lyskaster i 60 minutter. Etter fotolysen fjernes ikke-kovalent bundet etidiumderivat ved ekstraksjoner med n-butanol mettet med vann. Mengden av etidium koblet til DNA estimeres ved bruk glass vessels located in a water bath maintained at 20-30°C, and photolyzed 10-20 cm from a 150 watt spotlight for 60 minutes. After the photolysis, non-covalently bound ethidium derivative is removed by extractions with n-butanol saturated with water. The amount of ethidium linked to DNA is estimated by use
3—1—1 3—1—1
av ekstinsjonskoeffesienter på E4 .ny un<=>4x10 M cm for fotolysert etidiumazid, relasjonen mellom A260°^A490of extinction coefficients of E4 .ny un<=>4x10 M cm for photolysed ethidium azide, the relation between A260°^A490
for fotolysert etidium bundet til DNA /& 2eo = /A4<gg><=>(<A>49g x 3,4)-0,01l7/og & 260~l'32xlO^M ^ cm 1 for konsentrasjonen av DNA basepar for en gitt DNA som merkes. for photolysed ethidium bound to DNA /& 2eo = /A4<gg><=>(<A>49g x 3.4)-0.01l7/og & 260~l'32xlO^M ^ cm 1 for the concentration of DNA base pairs for a given DNA being labeled.
B. Fremstilling av metylert tyroglobulin.B. Preparation of methylated thyroglobulin.
100 mg av bovintyroglobulin (Sigma) kombineres med 10 ml vannfri metanol og 400 (il av 2,55 M HC1 i metanol. Denne blandingen omrøres på en rotasjonsblander ved romtemperatur 1 5 dager. Bunnfallet samles ved sentrifugering og vaskes 100 mg of bovine thyroglobulin (Sigma) is combined with 10 ml of anhydrous methanol and 400 µl of 2.55 M HCl in methanol. This mixture is stirred on a rotary mixer at room temperature for 15 days. The precipitate is collected by centrifugation and washed
2 ganger med metanol og 2 ganger med etanol. Deretter tørkes det under vakuum over natten. Det oppnås ca. 82 2 times with methanol and 2 times with ethanol. It is then dried under vacuum overnight. It is achieved approx. 82
mg tørt pulver.mg dry powder.
C. Det fremstilles et immunogen ved å kombinere DNA-etidiumkomplekset med metylert tyroglobulin som angitt av Stoller (1980) Methods in Enzymology 70:70. C. An immunogen is prepared by combining the DNA-ethidium complex with methylated thyroglobulin as indicated by Stoller (1980) Methods in Enzymology 70:70.
20-50 mikrogram av immunogenet i Freunds hjelpestoff injiseres pr. mus og forsterkningsinjeksjoner gis ukentlig med begynnelse 2 uker etter den innledende immuniseringen. Antistofftitere måles ved hjelp av en ELISA prosedyre og hybridomas fremstilles og undersøkes med hensyn til anti- 20-50 micrograms of the immunogen in Freund's adjuvant is injected per mice and booster injections are given weekly starting 2 weeks after the initial immunization. Antibody titers are measured using an ELISA procedure and hybridomas are prepared and examined for anti-
stoff ved standard prosedyrer /Galfre og Milstein, (1981)substance by standard procedures /Galfre and Milstein, (1981)
Meth. Enzymol. 73:1; Poirier, et al., )1982) PRoc. Nati.Meth. Enzymol. 73:1; Poirier, et al., (1982) PROc. Nati.
Acad. Sei., 79:6443/. Utvelgelsesprosedyrer ble utformetAcad. Sei., 79:6443/. Selection procedures were designed
for antistoffer som binder DNA-etidiumkomplekset med asso-siasjonskbnstanter på 10"^ eller større, men som ikke bindes til enkelt- eller dobbeltkjedet DNA eller etidiumresiduet alene. for antibodies that bind the DNA-ethidium complex with association coefficients of 10"^ or greater, but which do not bind to single- or double-stranded DNA or the ethidium residue alone.
Antistoff isoleres fra bukhinnevæske som beksrevet i eksempelAntibody is isolated from peritoneal fluid such as the tear in the example
I, del A, for antistoff til RNA"DNA hybrid. Dette antistoffet merkes også lett med DTAF og kobles til glukoseoksydase. I, part A, for antibody to RNA"DNA hybrid. This antibody is also readily labeled with DTAF and coupled to glucose oxidase.
D. 565 basepar fragmentet fra pKK115 plasmidet klonesD. The 565 base pair fragment from the pKK115 plasmid is cloned
inn i Hind III posisjonen på M13 mp9 /Messing og Vieria,into the Hind III position on M13 mp9 /Brass and Vieria,
(1982) Gene 19, 269; kommersielt tilgjengelig fra New Eng- (1982) Gene 19, 269; commercially available from New Eng-
land Biolabs, Beverly, MA/. Fragmentet innskytes i to orienteringer og en kloning med virion DNA sekvensen komplementært til ribosomal RNA velges for videre arbeid. land Biolabs, Beverly, MA/. The fragment is inserted in two orientations and a clone with the virion DNA sequence complementary to the ribosomal RNA is selected for further work.
Den modifiserte M13 mp9 progageres i E.coli JM103 /Alac, pro)thi, strA, supE, endA, sbcB15, hsdR4, F'traD36, proAB, laclq, ZAM15/ tilgjengelig fra bethesda Research Laborato-ries, Gaitherburg, MD. Fagen isoleres fra kulturbuljongen ved utfelling med polyetylenglukol og virion DNA renses ved fenol/kloroform ekstraksjon /Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor/. The modified M13 mp9 is propagated in E.coli JM103 /Alac, pro)thi, strA, supE, endA, sbcB15, hsdR4, F'traD36, proAB, laclq, ZAM15/ available from Bethesda Research Laboratories, Gaitherburg, MD. The phage is isolated from the culture broth by precipitation with polyethylene glycol and the virion DNA is purified by phenol/chloroform extraction /Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor/.
En oligonukleotid primer (CACAATTCCACACAAC; tilgjengeligAn oligonucleotide primer (CACAATTCCACACAAC; available
fra New England Biolabs) er komplementær til M13 mp9 vektoren på 5'-0H siden av den innskutte ribosomale RNA proben. from New England Biolabs) is complementary to the M13 mp9 vector on the 5'-0H side of the inserted ribosomal RNA probe.
Denne primeren benyttes til å initiere replikeringen avThis primer is used to initiate the replication of
M13 sekvensen ved hjelp av E.coli DNA polymerase (Klenow fragment) i nærvær av begrensede mengder av deoksynukleo-tid trifosfater. Replikeringen begrenses til et slik omfang at den innskutte ribosomale RNA proben forblir enkeltkjedet og tilgjengelig for hybridisering /Hu og Messing (1982) the M13 sequence using E.coli DNA polymerase (Klenow fragment) in the presence of limited amounts of deoxynucleotide triphosphates. Replication is limited to such an extent that the inserted ribosomal RNA probe remains single-stranded and available for hybridization /Hu and Messing (1982)
Gene 17:271/. Gene 17:271/.
Denne modifiserte M 13 proben blandes med 8-azidoetidium, fotolyseres og renses som beskrevet i del A ovenfor. This modified M 13 probe is mixed with 8-azidoethidium, photolyzed and purified as described in part A above.
E. Bakterier fremstilles og lyses som beskrevet i eksempel I, del A. Lysatene blandes med 80 ul av formamid hybridi-seringsoppløsningen beskrevet i eksempel I, del E. 20 mikroliter av etidium-probe komplekset (100 ng DNA) (del E. Bacteria are prepared and lysed as described in Example I, Part A. The lysates are mixed with 80 µl of the formamide hybridization solution described in Example I, Part E. 20 microliters of the ethidium probe complex (100 ng DNA) (part
D) tilsettes til ekstraktene og inkuber.es ved 65°C i 18 timer, og deretter tilsettes 500 ul av peroksydasemerket antistoff til RNA"DNA og glukoseoksydasemerket antistoff D) is added to the extracts and incubated at 65°C for 18 hours, and then 500 ul of peroxidase-labeled antibody to RNA"DNA and glucose oxidase-labeled antibody are added
til etidium-DNA kompleks til hvert rør. Blandingene får stå ved romtemperatur i 2 timer. to the ethidium-DNA complex to each tube. The mixtures are allowed to stand at room temperature for 2 hours.
Ved avslutningen av denne inkuberingen, tilsettes 1,0 mlAt the end of this incubation, add 1.0 ml
av substratreagensen, eksempel I, del E, og inkuberes ved 37°C i 30 minutter. Deretter registreres absorbansen ved 510 nm. Når antallet bakterier pr. rør økes, vil absorbansen avta. of the substrate reagent, Example I, Part E, and incubate at 37°C for 30 minutes. The absorbance is then recorded at 510 nm. When the number of bacteria per tube is increased, the absorbance will decrease.
Eksempel IV.Example IV.
Hybridiseringsanalyser for cytomegalovirus kontollert med et fluorescerende-lukkende par. Hybridization assays for cytomegalovirus controlled with a fluorescent-cloning pair.
A. Et 1500 basepar fragment av cytomegalovirus genomet klones inn i M13 mp 8 vektoren. En komplementær kopi av det innskutte fragmentet syntetiseres in vitro med DNA polymerase i nærvær av et biotinylert nukleotid trifosfat slika at det tilveiebringes en biotinylert probe. Proben modifiseres videre ved kovalent inkorporering av etidium-residuer som interkaleringskomplekser. A. A 1500 base pair fragment of the cytomegalovirus genome is cloned into the M13 mp 8 vector. A complementary copy of the inserted fragment is synthesized in vitro with DNA polymerase in the presence of a biotinylated nucleotide triphosphate so that a biotinylated probe is provided. The probe is further modified by covalent incorporation of ethidium residues as intercalation complexes.
Et EcoRI nedbrytningselement av cytomegalovirus DNA fremstilles og fragmentene klones inn i plasmidet pACYC184 /Ta,asjorp et al., (1982) J. Virology 42:547/. Plasmidene propageres i E.coli stamme HB101 Ree A og EcoRI e fragmentet beskrevet av Tamashiro benyttes for fremstilling av proben. Fragmentet fjernes fra plasmidet ved nedbrytning med EcoRI restriksjonsenzym og klones inn i EcoRI posisjonen på Ml3mp8 vektoren (New England Biolabs) som propageres i E.coli K12JM101 verten. Viruset isoleres fra kulturvæsken ved utfelling med polyetylenglykol og DNA renses ved fenol/ kloroformekstraksjon. An EcoRI degradation element of cytomegalovirus DNA is prepared and the fragments are cloned into the plasmid pACYC184 /Ta,asjorp et al., (1982) J. Virology 42:547/. The plasmids are propagated in E.coli strain HB101 Ree A and the EcoRI e fragment described by Tamashiro is used to prepare the probe. The fragment is removed from the plasmid by digestion with the EcoRI restriction enzyme and cloned into the EcoRI position on the Ml3mp8 vector (New England Biolabs) which is propagated in the E.coli K12JM101 host. The virus is isolated from the culture liquid by precipitation with polyethylene glycol and the DNA is purified by phenol/chloroform extraction.
DNA rekombineres med en 17 baseprimer med sekvensen GTAAAACGACGGCCAGT (New England Biolabs) som er komplementær med et område av Ml3mp8 sekvensen nær 3'-OH enden av EcoRI The DNA is recombined with a 17 base primer with the sequence GTAAAACGACGGCCAGT (New England Biolabs) which is complementary to a region of the Ml3mp8 sequence near the 3'-OH end of EcoRI
e innskuddet. DNA i 20 mM tris-hydrokloridbuffer, pH 8,0, som inneholder 10 mM MgC^ kombineres med et molart over-skudd av primeren og inkuberes med 55°C i 45 minutter. /Bankier og Barrell (1983) Techniques in Nucleic Acid Bio-chemistry, Elsevier, Ireland/. Reaksjonsblandingen gjøres 15 mM med hensyn på dATP, dCTP, dGTP og Bio-ll-dUTP (tilgjengelig fra Enzo Biochem) og endelig tilsettes Klenow fragmentet av DNA polymerase I. Denne reaksjonen inkuberes ved 25°C i et tidsrom som bestemmes ved innledende forsøk. e the deposit. DNA in 20 mM Tris-hydrochloride buffer, pH 8.0, containing 10 mM MgCl 2 is combined with a molar excess of the primer and incubated at 55°C for 45 minutes. /Bankier and Barrell (1983) Techniques in Nucleic Acid Biochemistry, Elsevier, Ireland/. The reaction mixture is made 15 mM with regard to dATP, dCTP, dGTP and Bio-ll-dUTP (available from Enzo Biochem) and finally the Klenow fragment of DNA polymerase I is added. This reaction is incubated at 25°C for a period of time determined by initial experiments.
I disse forsøkene tas prøver fra reaksjonsblandingen ved forskjellige tider, og elektroforeres i alkalisk agarosegel /Maniatis et al., supra/. Målet er å finne reaksjonsbe-tingelser som gir biotinmerkede prober som strekker seg gjennom EcoRI e innskuddet. Denne fremgangsmåten vil tilveiebringe biotinmerket DNA med noe varierende lengde; imidlertid er utvidelse av det merkede DNA ut over EcoRI In these experiments, samples are taken from the reaction mixture at different times and electrophoresed in alkaline agarose gel /Maniatis et al., supra/. The goal is to find reaction conditions that give biotin-labeled probes that extend through the EcoRI e insert. This method will provide biotin-labeled DNA of somewhat variable length; however, extension of the labeled DNA is beyond EcoRI
e innskuddet inn i M13 aksepterbart for foreliggende formål. e the deposit into M13 is acceptable for present purposes.
Det neste trinnet er den kovalente koblingen av etidium-residuer til det biotinmerkede DNA som interkaleringskomplekser. Dette oppnås ved fotolyse av DNA med 8-azidoetidium fremstilt ved fremgangsmåten ifølge Graves et al., supra. Biotinmerket DNA ekstraheres med fenol/kloroform og utfelles med etanol. Det oppløses i 20 mM tris-hydrokloridbuffer, The next step is the covalent coupling of ethidium residues to the biotin-labeled DNA as intercalation complexes. This is achieved by photolysis of DNA with 8-azidoethidium prepared by the method according to Graves et al., supra. Biotin-labeled DNA is extracted with phenol/chloroform and precipitated with ethanol. It is dissolved in 20 mM Tris-hydrochloride buffer,
pH 8,0, 0,2 M NaCl, slik at det gir ca. 50 ug DNA/ml og gjøres 0,5 mM med hensyn på 8-azidoetidium. Blandingen fotolyseres i 1 time 10-20 cm. fra en 150 watts lyskaster. Blandingen omrøres under dette tidsrommet i et reaksjonskar av glass som er plassert i et vannbad av glass. Badet opprettholder en reaksjonstemperatur på 20-30°C. pH 8.0, 0.2 M NaCl, so that it gives approx. 50 µg DNA/ml and made 0.5 mM with respect to 8-azidoethidium. The mixture is photolyzed for 1 hour 10-20 cm. from a 150 watt floodlight. The mixture is stirred during this time in a glass reaction vessel which is placed in a glass water bath. The bath maintains a reaction temperature of 20-30°C.
Deretter fjernes det ikke-kovalent bundne 8-azidoetidiumThe non-covalently bound 8-azidoethidium is then removed
og fotolysebiproduktene ved hjelp av suksessive ekstraksjoner med n-butanol mettet med vann. DNA utfelles med etanol og oppløses i tris-bufferen. Det kovalent bundne etidium måles spektrofotometrisk som beskrevet i eksempel III, and the photolysis by-products by means of successive extractions with n-butanol saturated with water. DNA is precipitated with ethanol and dissolved in the tris buffer. The covalently bound ethidium is measured spectrophotometrically as described in example III,
del A.part A.
8-azidoetidium bindes kovalent til DNA nesten utelukkende i det dobbeltkjedede området hvor interkaleringskomplekser kan dannes. Måler er å kovalent koble et etidiumresidu pr. 10-50 basepar. Siden den fotolytiske reaksjonen for-løper nesten fullstendig i løpet av 1 time, kan inkorporer-ingen reduseres ved å redusere reaksjonstiden eller ved å redusere konsentrasjonen av 8-azidoetidium. Inkorporerin-gen kan økes ved å gjenta fotolysen med frisk 8-azidoetidium. 8-azidoethidium binds covalently to DNA almost exclusively in the double-stranded region where intercalation complexes can form. Measure is to covalently link an ethidium residue per 10-50 base pairs. Since the photolytic reaction proceeds almost completely within 1 hour, the incorporation can be reduced by reducing the reaction time or by reducing the concentration of 8-azidoethidium. Incorporin gene can be increased by repeating the photolysis with fresh 8-azidoethidium.
Det endelige trinnet er separering av den biotinmerkede/ etidium modifiserte proben fra M13mp8 sjablongen. Den merkede proben er vesentlig mindre enn Ml3mp8 sjablongen og kan isoleres ved alkalisk agarosegel elektroforese, /Maniatis et al., supra/. Delen som inneholder proben skjæres fra stykket av agarosegel og utvinnes ved elektro-eluering som beskrevet av Maniatis. The final step is separation of the biotin-labelled/ethidium modified probe from the M13mp8 template. The labeled probe is substantially smaller than the Ml3mp8 template and can be isolated by alkaline agarose gel electrophoresis, /Maniatis et al., supra/. The part containing the probe is cut from the piece of agarose gel and recovered by electro-elution as described by Maniatis.
B. Fluoresceinmerket antistoff til etidium-DNA inter-kaleringskompleks. B. Fluorescein-labeled antibody to ethidium-DNA intercalation complex.
Monoklonalt antistoff til etidium-DNA kompleks beskrevetMonoclonal antibody to ethidium-DNA complex described
i eksempel III, del B ovenfor, dialyseres i 0,IM natrium-borat buffer, pH 9,0, og 0,5 ml som inneholder 5 mg antistoff, kombineres med 0,5 ml av 10 mM 5 (4,6-diklorotriazin-2-yl)-aminofluorescein (Molecular Probes, In., Junction City, OR) i boratbufferen. Blandingen får stå i 7 timer in Example III, Part B above, dialyze into 0.1M sodium borate buffer, pH 9.0, and 0.5 ml containing 5 mg of antibody, combine with 0.5 ml of 10 mM 5 (4,6-dichlorotriazine -2-yl)-aminofluorescein (Molecular Probes, In., Junction City, OR) in the borate buffer. The mixture is allowed to stand for 7 hours
ved romtemperatur og kromatograferes så på en 1x26 cm kolonne av "Biogel P6DG" harpiks i 0,1 M tris-hydrokloridbuffer, at room temperature and then chromatographed on a 1x26 cm column of "Biogel P6DG" resin in 0.1 M tris-hydrochloride buffer,
pH 8,0. Absorbansene ved 280 nm av 1,0 ml fraksjoner måles, og fraksjonene fra den første eluerte toppen samles. Fluorescein/protein-forholdet måles spektrofotometrisk pH 8.0. The absorbances at 280 nm of 1.0 ml fractions are measured, and the fractions from the first eluted peak are pooled. The fluorescein/protein ratio is measured spectrophotometrically
ved fremgangsmåten ifølge The og Feltkamp (1970) Immunology 18:865. C. Fremstilling av streptavidin merket med 4,5-dimetoksy-6-kårboksyfluorescein. by the method according to The and Feltkamp (1970) Immunology 18:865. C. Preparation of streptavidin labeled with 4,5-dimethoxy-6-dicarboxyfluorescein.
N-hydroksyravsyreimidesteren av 4', 5'-dimetoksy-6-karboksyfluorescein syntetiseres ved fremgangsmåtene ifølge Khanna og Ullman (1980) Anal. Biochem. 108:156. (Denne syntesen gir i praksis en blanding av 5 og 6-karboksyfluorescein isomerene). Streptavidin isolert fra Streptomyces avidini /Hoffman et al., (1980) Proe. Nati. Acad. Sei. 77:4666/ merkes med N-hydroksyravsyreimidesteren av 4',5<1->dimetoksy-6-karboksyfluorescein ved fremgangsmåten beskrevet avKhanna og Ullman for merking av immunoglobuliner. The N-hydroxysuccinimide ester of 4', 5'-dimethoxy-6-carboxyfluorescein is synthesized by the methods of Khanna and Ullman (1980) Anal. Biochem. 108:156. (This synthesis gives in practice a mixture of the 5 and 6-carboxyfluorescein isomers). Streptavidin isolated from Streptomyces avidini /Hoffman et al., (1980) Proe. Nati. Acad. Pollock. 77:4666/ is labeled with the N-hydroxysuccinic acid imide ester of 4',5<1->dimethoxy-6-carboxyfluorescein by the method described by Khanna and Ullman for labeling immunoglobulins.
D. Hybridiseringsanalyse for cytomegalovirus i urin.D. Hybridization assay for cytomegalovirus in urine.
Ved denne fremgangsmåten benyttes sentrifugering til å isolere viruset fra urinen og den virale DNA hybridiseres i oppløsning med den biotinmerkede/etidiummodifiserte proben. Deretter får det merkede avidin og antistoffet til etidium-DNA interkaleringskomplekset danne binding til hybridene In this method, centrifugation is used to isolate the virus from the urine and the viral DNA is hybridized in solution with the biotin-labelled/ethidium-modified probe. Then, the labeled avidin and the antibody to the ethidium-DNA intercalation complex are allowed to bind to the hybrids
som er dannet og fluorescens benyttes for å estimere mengden av hybrid som er tilstede. that is formed and fluorescence is used to estimate the amount of hybrid present.
Celleformede og partikkelformede materialer fjernes fra urinen ved sentrifugering i en "Sorvall GLC-3" sentrifuge ved 3000 rpm i 5 minutter. Overvæsken plasseres i et poly-allomert ultrasentrifugerør og kjøres ved 25 000 rpm i en "Beckman Ti50" rotor i 75 minutter. Pelletsen oppløses i 0,1 M NaOH og inkuberes ved 37°C i 30 minutter. Cellular and particulate materials are removed from the urine by centrifugation in a "Sorvall GLC-3" centrifuge at 3000 rpm for 5 minutes. The supernatant is placed in a poly-alloyed ultracentrifuge tube and run at 25,000 rpm in a "Beckman Ti50" rotor for 75 minutes. The pellet is dissolved in 0.1 M NaOH and incubated at 37°C for 30 minutes.
150 mikroliter 0,2 M natriumfosfatbuffer, pH 6,0, som inneholder 1,8 M NaCl, 0,1% natriumdodecylsulfat (vekt/volum) 150 microliters of 0.2 M sodium phosphate buffer, pH 6.0, containing 1.8 M NaCl, 0.1% sodium dodecyl sulfate (w/v)
og 1 mM EDTA tilsettes. Deretter tilsettes 20 ul av den biotinmerkede/etidium-modifiserte proben (50 mg) og hybridi-seringsblandingen inkuberes ved 65°C i 10 timer. Etter hybridiseringsreaksjonen tilsettes 650 ul av 0,1 M tris-hydroklorid-buffer, pH 8,2, som inneholder det merkede avidin og antistoff til etidium-DNA interkaleringskomplekset. Konsentrasjonen av de merkede proteiner i denne reagensen optimaliseres i innledende forsøk for å maksimere forholdet mellom fluorescens-lukkingen og bakgrunnen. Proteinbind-ingsreaksjonene får foregå ved romtemperatur i 1 time. and 1 mM EDTA is added. Then 20 µl of the biotin-labelled/ethidium-modified probe (50 mg) is added and the hybridization mixture is incubated at 65°C for 10 hours. After the hybridization reaction, 650 µl of 0.1 M tris-hydrochloride buffer, pH 8.2, containing the labeled avidin and antibody to the ethidium-DNA intercalation complex is added. The concentration of the labeled proteins in this reagent is optimized in initial experiments to maximize the ratio of fluorescence shutoff to background. The protein binding reactions are allowed to take place at room temperature for 1 hour.
Deretter registreres fluorescensen for reaksjonsblandingen ved å benytte 495 nm lys for eksitering og 519 nm for emmisjon. En referanseanalyse kjøres parallelt med en urin-prøve som vites å være fri for cytomegalovirus, og fluorescenssignalet som oppnås ved denne referanseanalysen vil være høyere enn signalene som oppnås for prøver som inneholder viruset, følgelig vil fluorescenssignalet avta når viruskonsentrasjonen øker. The fluorescence of the reaction mixture is then recorded using 495 nm light for excitation and 519 nm for emission. A reference assay is run in parallel with a urine sample known to be free of cytomegalovirus, and the fluorescence signal obtained by this reference assay will be higher than the signals obtained for samples containing the virus, consequently the fluorescence signal will decrease as the virus concentration increases.
Claims (15)
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US56042983A | 1983-12-12 | 1983-12-12 | |
US66825784A | 1984-11-07 | 1984-11-07 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO844849L true NO844849L (en) | 1985-06-13 |
Family
ID=27072332
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO844849A NO844849L (en) | 1983-12-12 | 1984-12-04 | HYBRIDIZATION ANALYSIS USING LABELED COUPLES OF HYBRID BINDING REAGENTS |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
AU (1) | AU578641B2 (en) |
CA (1) | CA1239580A (en) |
IL (1) | IL73580A0 (en) |
NO (1) | NO844849L (en) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL79112A (en) * | 1985-06-13 | 1992-01-15 | Abbott Lab | Method for the isolation of a nucleic acid sequence and kit for performing a hybridization assay |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1219824A (en) * | 1981-04-17 | 1987-03-31 | David C. Ward | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
AU9094982A (en) * | 1982-02-01 | 1983-08-11 | Miles Laboratories Inc. | Photogenic labels to alleviate quenching in immuno assays |
EP0095089B1 (en) * | 1982-05-24 | 1986-03-05 | Miles Laboratories, Inc. | Improved homogeneous binding assay method and reagent system, test kit and test device therefor |
-
1984
- 1984-11-21 IL IL73580A patent/IL73580A0/en unknown
- 1984-12-04 NO NO844849A patent/NO844849L/en unknown
- 1984-12-12 AU AU36561/84A patent/AU578641B2/en not_active Ceased
- 1984-12-12 CA CA000469906A patent/CA1239580A/en not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU578641B2 (en) | 1988-11-03 |
AU3656184A (en) | 1985-06-20 |
CA1239580A (en) | 1988-07-26 |
IL73580A0 (en) | 1985-02-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0144914A2 (en) | Hybridization assay employing labeled pairs of hybrid binding reagents | |
US4743535A (en) | Hybridization assay employing labeled probe and anti-hybrid | |
EP0770142B1 (en) | Method for increasing the sensitivity of detecting nucleic acid-probe target hybrids | |
CA1272443A (en) | Solution-phase dual hybridization assay for detecting polynucleotide sequences | |
US4563417A (en) | Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes | |
US5985548A (en) | Amplification of assay reporters by nucleic acid replication | |
US5869252A (en) | Method of multiplex ligase chain reaction | |
US4777129A (en) | Nucleic acid probe detectable by specific nucleic acid binding protein | |
EP0163220B1 (en) | Nucleic acid hybridization assay employing detectable anti-hybrid antibodies | |
AU656965B2 (en) | Detection of DNA/RNA by fluorescence polarization | |
EP0892856B1 (en) | A method for the amplification and detection of a nucleic acid fragment of interest | |
EP0144913A2 (en) | Hybridization assay employing labeled probe and anti-hybrid | |
CA2129444A1 (en) | Amplification of assay reporters by nucleic acid replication | |
EP0146039A2 (en) | Hybridization assay with immobilization of hybrids by antihybrid binding | |
WO1997032044A9 (en) | A method for the amplification and detection of a nucleic acid fragment of interest | |
EP0146815B1 (en) | Nucleic acid hybridization assay employing antibodies to intercalation complexes | |
JP2613203B2 (en) | Solution-phase single-cross assays for detection of polynucleotide sequences | |
US6294326B1 (en) | Analyte detection process using dual labeled probes | |
KR100442196B1 (en) | Method for amplification and detection of target nucleic acid using postamplificationincubation step | |
EP0209702A1 (en) | Solid-phase hybridization assay using anti-hybrid antibodies | |
NO844849L (en) | HYBRIDIZATION ANALYSIS USING LABELED COUPLES OF HYBRID BINDING REAGENTS | |
US6306657B1 (en) | Polynucleotide probe and kit for amplifying signal detection in hybridization assays | |
JPS60179657A (en) | Hybrid formation analyzing method using mark probe and anti-hybrid | |
NO844846L (en) | HYBRIDIZATION ANALYSIS USING A LABELED TEST AND ANTI-HYBRID | |
CA1250232A (en) | Hybridization assay with immobilization of hybrids by anti-hybrid binding |