KR100442196B1 - 후증폭인큐베이팅(postamplificationincubation)단계를이용한타겟핵산의증폭및검출방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 타겟 핵산 서열을 증폭 및 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 타겟 핵산이 증폭되는 조건하에서, 상기 타겟 핵산 서열을 함유하고 있을 것으로 여겨지는 샘플을 내열성 DNA 중합 효소 및 실질적으로 타겟 핵산에 상보적인 2 개의 프라이머와 접촉시켜 타겟 핵산 서열을 증폭시키는 것을 포함한다. 이후 상기 증폭된 타겟 핵산은 변성시켜 단일 가닥 핵산을 생성한다. 증폭시킨후, 상기 샘플을 검출-전 (pre - detection) 인큐베이팅 단계에 도입시킨다. 95 - 120 ℃ 에서 1 초- 30 분 동안 샘플을 인큐베이팅하여 상기 중합제 (polymerization agent) 를 비활성화 (inactivation) 시킨다. 최종적으로, 증폭된 핵산의 존부를 검출할 수 있다.

Description

후 증폭 인큐베이팅 (post amplification incubation) 단계를 이용한 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법
본 발명은 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법에 관한다. 구체적으로, 핵산의 증폭 생성물을 검출하는 개선된 방법에 관한다. 본 발명은 다양한 의학적 및 탐색적 연구, 법의학적 연구, 및 예를 들어 유전적 결함 또는 감염성 질병을 검출하는 것과 같은 진단 방법에 이용될 수 있다.
중합 효소 사슬 반응 (Polymerase Chain Reaction ; PCR) 과 같이 증폭 기술에 프루브를 사용하는 매우 정교한 하이브리드 검정법에 있어서의 발전을 포함하여 미소량의 핵산을 검출하는 기술은 지난 20 여년 동안 급속도로 발전되어 왔다. 연구자들은 인간 및 동물의 테스트 표본의 유전적 특징 및 질병을 검출시키는 이러한 기술의 가치를 이미 인식하고 있다. 핵산의 증폭 및 검출 방법에서 프라이머 및 프루브를 사용하는 것은 상보성 즉, 상보적인 뉴클레오티드 (뉴클레오티드 쌍이라고 알려진) 사이에서 2 가닥의 핵산을 수소 결합에 의하여 결합시킨다는 개념을 기초로 한다.
소량의 DNA 를 증폭시켜 검출하는 방법을 알아내기 위한 많은 연구들이 수행되었다. 다양한 방법들이 공지되어 있으며 검출용 표본내 핵산의 수를 상당히 증가시키거나 핵산을 증폭시키는데에 이용되어 오고 있다. 이러한 증폭 기술에는 PCR, 리가제 사슬 반응 (Ligase chain reaction ; LCR) 및 분지된 DNA (branched DNA) 를 포함한다.
상기 증폭 방법들중 PCR 이 가장 널리 공지된 방법이다. PCR 에 대하여는 업계에 잘 기술되어 있는데, 예를 들어, U.S. 특허 제 4,638,195 호 (Mullis 와 그의 동료), 제 4,683,202 호 (Mullis) 및 제 4,965,188 호 (Mullis 와 그의 동료) 를 포함한다. 보다 상세히 설명할 필요 없이, PCR 은 적당한 조건하에서 중합제 및 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트가 존재할 경우 타겟 핵산 사슬에 프라이머를 하이브리드시키는 것을 포함한다. 그 결과, 프라이머 증폭 생성물이 주형을 따라 생성되는데, 상기 생성물은 그것에 가하여진 주형과 상보적인 뉴클레오티드를 갖는다.
일단 프라이머 증폭 생성물이 변성되면 주형의 복사체가 1 부 제조되며, 프라이밍 (priming), 증폭 및 변성의 주기가 타겟 핵산과 동일한 서열을 갖는 핵산의 양을 기하 급수적으로 증가시키기에 바람직한 횟수만큼 수행될 수 있다. 실제로, 타겟 핵산은 수회 복제 (또는 "증폭") 되어 보다 용이하게 검출된다. 일단 타겟 핵산을 충분히 증폭시키면, 질적으로 및 / 또는 양적으로 타겟의 존재를 검출하는데에 여러 가지 검출 방법이 사용될 수 있다.
일단 타겟 핵산이 충분히 증폭되면, 다양한 검출 방법으로 이의 존재를 검출하는데에 사용될 수 있다. PCR 생성물을 검출하는데에 사용되는 표준 검출 방법은에티듐 브로마이드 염색된 아가로스 겔을 사용하는 방법이다. 그러나, 에티듐 브로마이드 염색된 아가로스 겔을 사용하는 데에는 예를 들어, 상대적으로 감도 및 특이성이 열등하다는 것을 포함하여 몇가지 단점이 있다.
방사능 표지 및 전기 영동법을 사용하지 않는 개선된 PCR 생성물 검출 방법이 개발되어 왔다. 이러한 비동위 원소성 올리고뉴클레오티드 포획 검출 방법 (nonisotopic oligonucleotide capture detection method) 은 프루브으로의 특이적 하이브리드 및 효소 시그널 발생에 의한다. 이러한 비동위 원소성 올리고뉴클레오티드 포획 검출 방법, 즉 역 도트 검출 방법 (reverse dot detection) 이라고도 알려진 방법은 U.S. 특허 제 5,229,297 호 (Schnepilsky 와 그의 동료), 제 5,328,825 호 (Warren 과 그의 동료), 및 제 5,422,271 호 (Chen 과 그의 동료) 에 기술되어 있다. 이러한 방법은 또한 Findlay 와 그의 동료에 의한 Clinical Chemistry, 39 : 1927 - 1933 (1993) 에 기술되어 있다.
상기 비동위 원소성 검출 방법은 에티듐 브로마이드 염색 검출방법보다 더 높은 감도 및 특이성을 가지며 방사능은 사용하지 않는다. 증폭된 핵산을 검출하기 위하여 본 방법은 바이오틴이 부착된 프라이머 (biotinylated primer) 로 증폭시키거나 또는 바이오틴이 부착된 프루브를 사용하여 수행된다. 바이오틴이 부착된 생성물 또는 프루브는 결과적으로 아비딘 또는 호오스래디쉬 퍼옥시다제 (Horseradish peroxidase ; HRP) 와 같은 스트렙트아비딘과 결합된 효소와 반응하게 된다. 이후 염료 전구체 (또는 광 발생 시그널 시약) 는 효소와 접촉하여 염료 (형광) 로 전환되어 검출 가능한 시그널을 발생시킨다.
그러나, 비동위 원소성 올리고뉴클레오티드 포획 검출 방법은 결점을 가지고 있다. 비동위 원소성 올리고뉴클레오티드 포획 검출 방법이 농축되거나 또는 최소한으로 희석된 핵산 증폭 생성물을 변성시키기 위하여 표준 PCR 변성 조건 (95 ℃) 을 사용할 경우, 예를 들어, 내열성 중합 효소 또는 DNA 리가제와 같은 증폭 반응을 수행하는데에 사용된 효소들은 여전히 활성을 띈채로 존재할 것이다. 검출 과정동안 이러한 활성 효소들이 존재하면 증폭 생성물에 대하여 효소 및 프루브 사이에는 결합 경쟁 (binding completion) 이 일어나게 된다.
이러한 경쟁은 프루브에 결합된 증폭된 핵산의 양 및 검출되는 시그널을 감소시킬 수 있다.
이러한 문제점에 대한 한가지 해결책은 증폭 반응 이후 검출 이전에 PCR 증폭 혼합물에 많은 양의 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 킬레이터인 Mg+2를 가하는 것이다. EDTA 는 DNA 중합 효소 및 DNA 리가제를 포함하는, 활성에 Mg+2를 필요로하는 많은 효소들의 활성을 억제시킬 수 있다. 그러나, EDTA 를 사용하면 PCR 증폭 과정 및 검출 과정에 추가적인 단계를 필요로 한다. 더욱이, EDTA 를 사용할 경우에는 EDTA 를 가하기 위하여 반응 용기를 열 필요가 있다. 업계의 숙련자들이 알고 있듯이, 오염될 우려가 있기 때문에 반응 용기를 여는 것은 피해야 한다.
따라서, 검출 과정 동안 EDTA 또는 기타 이러한 효소 억제제를 가하여 증폭 과정을 블로킹 (blocking) 시키는 것은 바람직하지 않다. 차라리, 오염에 대한 위험부담을 증가시키지 않고 검출 과정 이전에 증폭 효소를 비활성화시키는 방법이 바람직하다.
본 발명의 목적은 증폭 효소를 비활성화시키기 위하여 검출 이전에 증폭-후 인큐베이팅 단계 (post amplification incubation step) 로써 상기 문제점들을 극복하는 것이다.
하나의 구체예에서, 본 발명은
(i) 타겟 핵산이 증폭되는 조건하에서 타겟 핵산을 함유할 것이라 여겨지는 샘플을 2 이상의 올리고뉴클레오티드 및 내열성 증폭 효소 [이중, 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 타겟 핵산의 일부와 상보적임] 와 접촉시키는 단계 ;
(ii) 단일 가닥 (single stranded) 핵산을 생성시키기 위하여 증폭된 타겟 핵산을 변성시키는 단계 ;
(iii) 상기 내열성 효소를 비활성화시키기 위하여 증폭-후 인큐베이팅 단계로서 상기 샘플을 1 초 - 30 분동안 95 - 120 ℃ 에서 인큐베이팅시키는 단계 ;
(iv) 증폭된 타겟 핵산의 존부를 검출하는 단계
를 포함하는 타겟 핵산 증폭 및 검출 방법에 관한다.
다른 구체예에서, 본 발명은
(i) 4 가지의 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트, 내열성 DNA 중합 효소, 및 2 이상의 프라이머 [이중, 프라이머는 실질적으로 타겟 핵산과 상보적임] 와 타겟 핵산을 함유할 것이라고 여겨지는 샘플을 접촉시키는 단계 ;
(ii) 단일 가닥 핵산을 생성시키기 위하여 증폭된 타겟 핵산을 변성시키는 단계 ;
(iii) 상기 중합제를 비활성화시키기 위하여 증폭-후 인큐베이팅 단계로서 상기 샘플을 1 초 - 30 분동안 95 - 120 ℃ 에서 인큐베이팅시키는 단계 ;
(iv) 증폭된 타겟 핵산의 존부를 검출하는 단계
를 포함하는 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법에 관한다.
또다른 구체예에서, 본 발명은
(i) 타겟 핵산이 증폭되는 조건하에서 4 가지의 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트, 내열성 DNA 중합 효소, 및 2 이상의 프라이머 [이중, 하나 이상의 프라이머는 바이오틴으로 표지되었으며 모든 프라이머는 실질적으로 타겟 핵산과 상보적임] 와 타겟 핵산을 함유할 것이라고 여겨지는 샘플을 접촉시키는 단계 ;
(ii) 상기 중합 효소를 비활성화시키기 위하여 증폭-후 인큐베이팅 단계로서, 상기 샘플을 0.5 - 5 분동안 105 ℃ 에서 인큐베이팅시키는 단계 ;
(iii) 증폭된 바이오틴화 타겟 핵산을 스트렙트아비딘 - 효소 결합체와 반응시켜 증폭된 바이오틴화 타겟 핵산의 존부를 검출시킨후, 검출 가능한 비색계 (colorimetric ; 比色計) 시그널 또는 화학 발광 (chemiluminescent) 시그널을 발생시키기 위하여 상기 효소를 기질 시약과 반응시키는 단계
를 포함하는 타겟 핵산을 증폭 및 검출시키는 방법에 관한다.
본 발명의 다양한 기타의 목적 및 이점은 다음의 본 발명에 관한 상세한 설명으로부터 명확해질 것이다.
PCR을 이용한 핵산의 증폭 및 검출 방법에 대한 일반적 원리 및 조건은 비교적 널리 공지되어 있는데, 모두 본원에 참고 문헌으로 포함되어 있는 U.S. 특허 제 4,683,195 호 (Mullis 와 그의 동료), 제 4,683,202 호 (Mullis), 및 제 4,965,188 호 (Mullis 와 그의 동료) 를 포함하는 많은 참고 문헌에 제공되어 있다. 따라서 업계에 알려진바 또는 본원에 제공된 특정 사실의 관점에서, 업계의 숙련자들은 검출 감도를 증가시키기 위해서 본원에 알려진 생성물 검출 과정 이전에 증폭 효소를 비활성화시키는 증폭-후 인큐베이팅 단계를 첨가하여 본 발명을 실시하는데에 어려움은 없을 것이다.
내열성 효소를 사용하는 기타의 증폭 및 검출 방법은 본 발명을 수행하는데에도 사용될 수 있다. 본 발명에서는 증폭-후 방법을 위하여 증폭 과정 동안 사용된 내열성 효소를 비활성화시키는 검출-전 (pre - detection) 인큐베이팅 단계를 제공한다. 그러므로, 본 발명은 내열성 효소를 사용하는 증폭 방법을 사용하는데에 적당하다. 다른 내열성 증폭 방법에는 예를 들어 EP-A-0 320 308 (1987, 12 월 발행) 및 EP-A-0 439 182 (1990, 1 월 발행) 기술된 바와 같은 리가제 사슬 반응 (Ligase chain reaction ; LCR) 이 있는데, 이 경우 내열성 DNA 리가제로써 인접한 프루브를 연결시켜 상보적 핵산 서열을 생성시킨다. LCR 에서 타겟 핵산은 4 개의 올리고뉴클레오티드 프루브 및 내열성 DNA 리가제를 사용하여 증폭된다. 올리고뉴클레오티드 프루브중 2개는 증폭될 DNA 주형의 하나의 사슬에 존재하는 인접 부위와 상보적이다. 상기 프루브들은 DNA 사슬에 하이브리드되어 상기 2 개의 프루브사이에 닉이 형성된다. 이후 상기 닉은 내열성 DNA 리가제로 봉인되어 타겟과 상보적인 새로운 DNA 사슬을 만든다. 제 3 및 제 4 프루브들은 DNA 주형의 제 2 사슬과 상보적이며 프루브의 제 1 짝과 같은 기능을 하여 상보적 DNA 를 생성시킨다. LCR 증폭 생성물은 표준 검출 방법으로 검출될 수 있다. 본 발명의 증폭-후, 검출-전 인큐베이팅 단계는 검출 과정 이전에 DNA 리가제를 비활성화시키기 위하여 LCR 과 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 교지에 의하여 업계의 숙련자는 PCR 에서 보여주고 있는 증폭-후 효소 변성 단계를 공지된 기타 증폭 및 검출 방법에 적용시킬 수 있을 것이다. 본원의 나머지 사항들은 기술된 목적을 달성하기 위하여 PCR 을 사용하는 본 발명의 실시에 관한 것이다.
본 발명은 검출 감도를 개선시키기 위하여 공지된 방법인 PCR 을 수정하여 제공된다.
놀랍게도 본 발명에 의하여, 핵산 증폭-후 방법, 검출-전 인큐베이팅 단계는 중합제를 비활성화시키고 프루브 및 증폭된 타겟 핵산용 제제 사이의 결합 경쟁을 감소시키는데에 사용될 수 있다. 이와 같이 경쟁이 감소되면 검출 감도는 증가한다.
본 발명은 테스트 표본내 존재하는 하나 이상의 타겟 핵산을 증폭 및 검출시키는 방법에 관한다. 테스트 표본은 세포 또는 바이러스 재료, 체액 또는 검출될 수 있는 유전학적 DNA 또는 RNA 를 함유하는 기타 세포성 재료를 포함할 수 있다.
증폭 및 검출될 핵산은 근원 (예를 들어 박테리아, 효모, 바이러스 식물, 고등 동물 또는 인간과 같은) 에서 얻은 플라스미드 및 천연 DNA 또는 RNA 를 포함하는 다양한 근원에서 얻을 수 있다. 이는 다양한 혈액, 말초 혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cell ; PBMC), 조직 재료 또는 업계에 공지된 다른 근원들 (이에 한정되는 것은 아님) 에서 공지된 방법을 사용하여 추출될 수 있다. 본 발명은 제놈성 DNA, 박테리아 DNA, 곰팡이 DNA, 바이러스 RNA 또는 박테리아 또는 바이러스 감염된 세포에서 관찰되는 DNA 또는 RNA 에서 관찰할 수 있는 하나 이상의 핵산 서열을 증폭 및 검출하는데에 특히 유용하다.
본원에 기술된 방법은 감염성 질병, 유전적 이상 및 암과 같은 세포성 이상과 관련된 타겟 핵산을 증폭 및 검출시키는데에 사용될 수 있다. 또한 법의학적 연구 및 DNA 타이핑에도 사용될 수 있다. 특히 감염성 병원체, 예를 들어 박테리아 및 바이러스를 이들과 관련된 핵산을 검출시켜 검출할 수 있다. 이의 특히 매우 높은 감도를 요하는 경우 및/또는 정량시 유용하다.
본 발명에 의하여 검출될 수 있는 박테리아는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 살모넬라종 (Salmonella species), 스트렙토코커스종 (Streptococcus species), 클라미디아종 (Chlamydia species), 고노코칼종 (Gonococcal species), 미코박테리아종 (Mycobacteria species) [예를 들어, 미코박테리움 튜베르큘로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 및 미코박테리움 아비움 (Mycobacterium avium) 복합체], 미코플라스마종 (Mycoplasma species) [예를 들어, 미코플라스마 헤모필러스 (Mycoplasma Hemophilus) 인플루엔자 및 미코플라스마 뉴모니애 (Mycoplasma pneumoniae), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pneumophila), 보렐리아 버그도르페레이 (Borrelia burgdorferei), 뉴모시스티스카리니 (Pneumocystis carinii), 클로스트리디움 디피실레 (Clostridium difficille), 캄플리오박테리종 (Camplyobacteri species), 여시니아종 (Yersinia species), 쉬겔라종 (Shigella species) 및 리스테리아종 (Listeria species) 과 같은 인간의 혈액에서 발견되는 박테리아이다.
검출 가능한 바이러스로서는 이에 한정되는 것은 아니지만, 싸이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus), 헤르피스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus), 엡스타인 바 (Epstein Barr) 바이러스, 인간 파필로마 (papilloma) 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 헤파티티스 (hepatitis) 바이러스 및 리트로바이러스 (예를 들어, HTLV-I, HTLV-II, HIV-I 및 HIV-II) 가 있다. 원생류 기생충, 효모 및 사상균 (mold) 역시 본 발명에 의하여 검출될 수 있다. 기타 검출 가능한 종은 업계의 숙련자에게 용이하게 알려졌을 것이다.
"PCR 시약 (PCR reagent)" 이란 PCR 에 필수적이라고 간주되는 시약, 즉 각각의 타겟 핵산에 대한 프라이머, DNA 중합 효소, DNA 중합 효소 보조 인자, 및 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오시드 - 5' - 트리포스페이트 (dNTP's) 집합을 의미한다. PCR 에 사용되는 기타 임의의 시약 및 재료는 하기되어 있다.
"프라이머 (primer)" 란 천연의 또는 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미하는 것으로서, 핵산 사슬 (즉, 주형) 과 상보적인 프라이머 증폭 생성물의 합성을 유도하는 조건하에 존재할 경우 합성의 개시점으로서의 역할을 할 수 있는 것을 말하는데, 상기 조건에는 다른 PCR 시약, 및 적당한 온도 및 pH 이 포함된다.
본 발명의 프라이머는 프라이밍 및 증폭될 특이 핵산 서열에 "실질적으로 상보적인" 것이 선택될 수 있다. 이는 곧 이들이 원하는 하이브리드 생성물을 형성한후 DNA 중합 효소에 의하여 증폭 가능한 각각의 핵산 서열과 하이브리드 되기에 충분히 상보적이어야 함을 의미한다. 통상적으로, "실질적으로 상보적인" 프라이머는 타겟 서열과 상보적인 70 % 이상의 염기를 함유할 것이다. 더욱 바람직하게는 염기의 80 %, 더더욱 바람직하게는 염기의 90 % 가 상보적이다.
가장 바람직한 조건에서, 상기 프라이머는 타겟 핵산 서열과 90 - 100 % 로 정확히 상보적이다.
상기 프라이머는 증폭 과정에서 최대 효율을 위하여 단일 가닥이 바람직하지만, 원한다면 이중 가닥 (double stranded) 부위도 함유할 수 있다. DNA 중합 효소의 존재하 증폭 생성물의 합성을 프라이밍시키기에 충분할 만큼 길어야 한다. 각각의 프라이머의 정확한 크기는 예정된 용도, 프라이머의 농도 및 서열, 타겟 서열의 복합성 (complexity), 반응 온도, 및 프라이머의 출처에 따라 다양할 것이다.
일반적으로, 본 발명에 사용된 프라이머는 12 - 60 뉴클레오티드, 바람직하게는 16 - 40 뉴클레오티드일 것이다. 더욱 바람직하게, 각각의 프라이머는 18 - 35 뉴클레오티드이다.
본원에 유용한 프라이머는 예를 들어 ABI DNA Synthesizer (Applied Biosystems 에서 시판) 또는 Biosearch 8600 Series 또는 8800 Series Synthesizer (Milligen - Bioresearch, Inc. 에서 시판) 를 포함하는 공지된 기술 및 장치를 사용하여 제조될 수 있다. 상기 장치를 사용하는 방법은 널리 공지되어 있으며 예를 들어 본원에 참고 문헌으로 포함되어 있는 U.S. 특허 제 4,965,188 호 (Gelfand 와그의 동료) 에 기술되어 있다. 생물학적 근원에서 분리한 천연 (natural occuring) 프라이머도 유용 (예를 들어 제한 엔도뉴클레아제 절단물) 할 수 있다.
각각의 타겟 핵산에 일반적으로 2 이상의 프라이머 집합이 사용된다. 따라서, 복수개의 타겟 핵산을 증폭시키기 위하여 복수개의 프라이머 집합이 동시에 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 "프루브 (probe)" 이란 타겟 핵산의 핵산 서열과 실질적으로 상보적이며 증폭된 타겟 핵산을 검출 및 포획 (capture) 하는데에 사용되는 올리고뉴클레오티드이다.
본 발명에 사용된 프라이머 및 / 또는 프루브는 임의로 표지될 수 있다. 업계에 공지된 방법을 사용할 경우, 프라이머 및 / 또는 프루브는 특이 결합 리간드 (예를 들어 바이오틴), 효소 (예를 들어 글루코즈 옥시다제, 퍼옥시다제, 우리카제, 및 알카리성 포스파타제), 방사성 동위원소, 전자-고밀도 시약, 색소원, 형광원, 인광 부분 또는 페리틴으로 표지될 수 있다. 상기 표지는 특이 결합 리간드가 바람직하다. 상기 표지는 바이오틴 또는 이의 유도체, 스트렙트아비딘 또는 이의 유도체 또는 햅텐이 더욱 바람직하다.
PCR 에 필요한 추가적인 PCR 시약에는 DNA 중합 효소 (바람직하게는 내열성 DNA 중합 효소), DNA 중합 효소 보조 인자 및 적당한 dNTP's 를 포함한다. 상기 시약들은 독립적으로 제공되거나 또는 테스트 기기의 일부분으로서, 또는 테스트 장치의 시약 챔버내에 포함되어 제공될 수 있다.
DNA 중합 효소는 데옥시뉴클레오시드 모노포스페이트 분자를 프라이머 및 주형의 복합체내 프라이머의 3'-하이드록시 말단에 결합시키는 효소인데, 가하여지는 방식은 주형 의존성 방식이다.
일반적으로 증폭 생성물은 합성이 종결될 때까지 새로 합성된 사슬의 5' ---> 3' 방향으로 합성된다. 유용한 DNA 중합 효소에는 예를 들어, E. Coli DNA 중합 효소 I, T4DNA 중합 효소, Klenow 중합 효소, 역전사 효소 및 업계에 공지된 기타 효소를 포함한다. 바람직하게, DNA 중합 효소는 가열시에도 안정하고 바람직하게는 더욱 높은 온도, 특히 프라이밍 및 DNA 스트랜드의 중합으로 사용되는 온도에서도 활성을 갖는 내열성이다. 더욱 구체적으로, 내열성 DNA 중합 효소는 본원에 기술된 중합 효소 사슬 반응에 사용된 고온에서 실질적으로 활성을 갖는다. 이러한 온도는 pH, 뉴클레오티드 조성, 프라이머 길이, 염 농도 및 업계에 공지된 기타 조건을 포함하는 반응 조건의 수에 따라서 다양할 것이다.
업계에 보고된 바 있는 내열성 DNA 중합 효소는 모두 본원에 참고 문헌으로 포함되어 있는 U.S. 특허 제 4,965,188 호 (Gelfand 와 그의 동료) 및 제 4,889,818 gh (Gelfand 와 그의 동료)에 상세히 언급된 효소들을 포함한다. 특히 유용한 중합 효소는 예를 들어 서머스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus), 서머스 필리포르미스 (Thermus filiformis), 서머스 서모필러스 (Thermus thermophilus), 및 서머스 플라버스 (Thermus flavus) 와 같은 다양한 서머스 (Thermus) 박테리아종에서 얻은 효소이다. 다른 유용한 내열성 중합 효소는 서모코커스 리테랄리스 (Thermococcus literalis), 피로코커스 푸리오서스 (Pyrococcus furiosus), 서모토가종 (Thermotoga) 및 WO-A-89/06691 호 (1989, 7 월 27 일 발행) 에 기술된 다양한 미생물 근원에서 얻은 효소이다. 몇몇 내열성 중합 효소는 상업적으로 시판되는데, 예를 들어, AppliTaq 상표의 제품, Tth, 및 UlTman 상표의 제품 (Perkin Elmer 社), 및 Stratagene 의 Pfu, 및 New England Biolabs 의 Vent 및 Deep-Vent 이다. 또한 유기체에서 천연 중합 효소를 분리하기 위하여 및 재조합 기술을 사용하여 유전적으로 조작된 효소를 생성하기 위한 수 많은 기술들이 공지되어 있다.
DNA 중합 효소 보조 인자란 효소활성이 의존하는 비단백질 화합물이다. 따라서, 상기 효소는 보조 인자가 존재하지 않으면 촉매적으로 비활성이다. 다수의 재료는 망간 및 마그네슘, 염화물, 클로라이드, 황산염, 아세테이트 및 지방산 염과 같은 염을 포함하는 [이에 한정되는 것은 아님] 공지된 보조 인자이다. 마그네슘 클로라이드 및 설페이트가 바람직하다.
PCR 에는 또한 2 이상의 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 및 dUTP 와 같은 2 이상의 데옥시리보뉴클레오시드 - 5' - 트리포스페이트를 필요로 한다. 예를 들어. dITP 및 7-데아자-dGTP 와 같은 유사체 또한 유용하다. 바람직하게는, 4 개의 일반적인 트리포스페이트 (dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 가 함께 사용된다.
타겟 핵산 증폭물을 제공하기 위하여 본원에 기술된 PCR 시약이 제공되어 적당한 농도로 PCR 에 사용된다. 증폭에 요구되는 프라이머, DNA 중합 효소, 보조 인자 및 데옥시리보뉴클레오시드-5'-트리포스페이트의 최소량 및 각각의 양에 대한 적당한 범위가 업계에 널리 공지되어 있다. DNA 중합 효소의 최소량은 일반적으로 용액의 약 0.5 units/100 μl 이상인데, 용액의 약 2 - 약 25 units/100 μl 가 바람직하며 약 7 - 약 20 units/ 100 μl 가 더욱 바람직하다. 증폭 시스템에 주어진 다른 양이 유용할 수 있다. 본원에 정의된 "unts" 란 총 10 nmole 의 뉴클레오티드 (dNTP's) 를 74 ℃에서 30 분동안 핵산 사슬에 결합시키는데에 필요한 효소 활성량을 의미한다. 프라이머의 최소량은 약 0.075 μmole 이상인데, 약 0.1 - 약 2 moleμ이 바람직하지만 다른양이 업계에 널리 공지되어 있다. 일반적으로 보조 인자는 약 2 - 약 15 nmole 의 양으로 존재한다. 각각의 dNTP 의 양은 일반적으로 약 0.25 - 약 3.5 mole 이다.
상기 PCR 시약들은 독립적으로 또는 여러 가지 조합에 의하여 공급될 수 있거나, 또는 pH 가 약 7 - 약 9 의 범위인 적당한 완충액을 사용하여 완충된 용액내에 모두 존재할 수 있는데, 시약들중 대부분이 업계에 공지되어 있다.
PCR 에 사용될 수 있는 다른 시약으로서는 예를 들어, 내열성 DNA 중합 효소에 특이적인 항체, 엑소뉴클레아제 및 / 또는 글리코실라제를 포함한다. 증폭 이전에 중합 효소를 억제하기 위하여 항체가 사용될 수 있다. 본 발명에 유용한 항체는 내열성 DNA 중합 효소에 특이적인 것으로서, 약 50 ℃ 이하의 온도에서 DNA 중합 효소의 효소 활성을 억제시키며, 더욱 높은 온도에서 불활성화되는 것이다. 유용한 항체로서는 모노 클론 항체, 폴리 클론 항체 및 항체 단편을 포함한다. 상기 항체는 모노 클론 항체가 바람직하다. 본 발명에 유용한 항체들은 Harlow 와 그의 동료에 의하여 Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1988) 에 기술된 바와 같은 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
대표적인 모노 클론 항체가 U.S. 특허 제 5,338,671 호 (Scalice 와 그의 동료) 에 기술되어 있는데, 함량은 본원에 참고 문헌으로서 포함되어 있다. 2 개의 이러한 모노 클론 항체는 종래의 방법을 사용하여 숙련자에 의해서 용이하게 얻을 수 있으며, 출발 재료는 American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD) 에 기탁되어 있는 교잡 세포계(hybridoma) HB 11126 또는 HB11127 을 포함한다. 모노 클론 항체는 DNA 중합 효소에 대하여 약 5:1 - 약 500:1 의 몰비로서 존재한다.
1995 년 2 월 7 일자 "Use of exonuclease and/or glycosylase as supplements to anti-polymerase antibody to increase specificity in Polymerase Chain Reaction" 라는 제목으로 Sutherland 와 그의 동료에 의하여 출원된 U.S. 출원 제 08/385,019 에 기술된 바와 같이 내열성 DNA 중합 효소에 특이적인 항체만이 본 발명에 사용될 수 있거나 또는 엑소뉴클레아제 및 / 또는 글리코실라제와 함께 사용될 수 있다. 항체를 함께 사용하는 방법에서, 엑소뉴클레아제 및 글리코실라제는 제로 순환 인공물 (zero cycle artifacts) 의 형성을 감소시킨다. PCR 에 사용하기 적당한 엑소뉴클레아제로서는, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 엑소뉴클레아제 III, 엑소뉴클레아제 I, 엑소뉴클레아제, T7 엑소뉴클레아제, 리보뉴클레아제 II, 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제 및 BAL 31 뉴클레아제가 있다. 이러한 엑소뉴클레아제는 시판되거나 또는 업계에 공지된 방법으로 얻을 수 있다. 본 발명에 유용한 글리코실라제는 일반적인 것이 아닌 염기, 즉 DNA 의 A, G, C 또는 T 및 RNA 의 A, G, C 및 U 이외의 염기를 특이적으로 절단하는 효소이다. 바람직한 글리코실라제로서는 우라실 - N - 글리코실라제 (UNG), 하이포크산틴 - DNA - 글리코실라제 및 3 - 메티아데닌 - DNA 글리코실라제 I 및 II 를 포함한다. 바람직한 구체예에서는, Taq 중합 효소, Taq 중합 효소에 대한 모노 클론 항체, 엑소뉴클레아제 III 및 우라실 - N - 글리코실라제가 사용된다.
타겟 핵산 (DNA 또는 RNA) 은 상기된 다양한 근원들로부터 얻을 수 있다. 일반적으로, 상기 샘플은 프라이머 및 다른 PCR 시약들과 DNA 가 접촉할 수 있도록 하는 방식으로 처리된다. 보통 이는 업계에 공지된 여러가지 방법들중 하나를 사용하여 샘플로 부터 원하지 않는 단백질 및 세포성 물질을 제거시키는 것을 의미한다.
종종 증폭되어 검출된 핵산은 이중 가닥의 형태로 존재하므로, 2개의 사슬들은 분리된후 프라이밍 및 증폭되어야 한다. 변성 과정은 상기 사슬들을 분리시키기 위하여 업계에 공지된 바와같이 열처리만으로써 또는 기타 적당한 물리적, 화학적 또는 효소적 방법과 함께 수행될 수 있다. 초기 변성 과정은 일반적으로 처음 온도 약 85 - 약 100 ℃, 적당한 시간 예를 들어, 약 1 초 - 3 분동안 타겟 핵산을 함유할 것으로 여겨지는 샘플들을 가열시켜 수행된다.
이후 변성된 사슬들은 사슬들을 프라이밍시키기 위하여 일반적으로 약 55 - 약 70 ℃ 의 범위로 냉각된다. 초기 변성 과정 이후에 사슬을 냉각시키는데에 필요한 시간은 PCR 에 사용된 장치의 형태에 따라서 다양할 것이다.
일단, 변성된 사슬들을 제 2 온도로 냉각시킨후 변성된 사슬을 사슬에 프라이머를 어닐링 (하이브리드) 시킨후 상기 프라이머를 증폭시켜 프라이머 증폭 생성물을 생성시키기에 적당한 온도에서 PCR 반응 혼합물과 함께 인큐베이팅 시킨다.일반적으로 이러한 온도는 약 50 ℃ 이상, 바람직하게는 약 62 - 약 75 ℃ 의 범위이다. 인큐베이팅 시간은 인큐베이팅 온도 및 원하는 증폭 생성물의 길이에 따라 매우 다양할 수 있으나, 바람직한 구체예에서는, 약 1 - 약 120 초이다. 각각의 PCR 순환은 2 가지 또는 3 가지의 상이한 온도에서 수행될 수 있는데, 하나는 변성 과정에, 두번째 또는 세 번째 온도는 프라이밍 및 / 또는 프라이머 증폭 생성물 생성 과정에 적용될 수 있다.
하나 이상의 프라이머 증폭 생성물을 생성시킨후의 어느 시점에서, 증폭을 정지시키고 타겟 프라이머 증폭 생성물 ("증폭된" 타겟) 을 검출시킬 수 있다. 그러나, 하이브리드된 프라이머 증폭 생성물이 이후 변성되면, 기술된 바와 같은 PCR 의 프라이밍, 증폭, 및 변성과정은 계속하여 수행될 수 있다. 수행된 PCR 순환은 부분적으로는, 원하는 증폭 타겟의 양에 의존할 것이며 업계의 숙련자들에 의하여 용이하게 측정될 수 있을 것이다. 일반적으로, 순환은 20 회 이상 수행될 것인데, 약 20 - 50 회가 바람직할 것이다.
다중성 타겟 핵산 (multiple target nucleic acid) 을 증폭시키는 경우, 특히 타겟중 하나가 더욱 적은 수의 복사체이고 다른 하나가 많은 수의 복사체인 경우, Backus 와 그의 동료에 의하여 "Method of Amplification Using Intermediate Renaturation Step." 의 제목으로 1994 년 6 월 6 일자 출원된 U.S. 출원 제 08/264,102 호에 기술된 바와 같이, 제 2 재변성 (renaturation) 단계는 1 차 PCR 순환 이후에 수행될 수 있다. 15 회 이상 1 차 증폭 순환을 수행시킨 이후 (1 차 증폭 순환은 변성, 프라이밍 및 증폭 과정을 포함), 2 차 증폭 순환은 프라이머를어닐링 시키기전 각 변성 단계를 거친후 및 프라이머 어닐링전 변성 단계를 포함된다는 것을 제외하고는 상기와 동일한 단계로 수행된다. 재변성은 U.S. 출원 제 08/264,102 호에 기술된 바와 같이 반응 혼합물을 제 4 온도까지 냉각시켜 수행된다.
본 발명에서, 원하는 횟수만큼 PCR 순환을 수행시켜 타겟 핵산을 증폭시킨 이후, DNA 중합 효소를 비활성화시키기 위하여 증폭-후, 검출-전 인큐베이팅 단계를 수행하여 검출 감도를 증가시킨다. 증폭-후 인큐베이팅 단계가 수행되는 조건은 사용된 내열성 효소에 의존하며, 효소는 비활성화시키는 온도 및 인큐베이팅 기간의 조합일 것이다. 바람직하게는, 상기 증폭-후 인큐베이팅 단계는 약 95 - 약 120 ℃, 약 1 초 - 약 30 분동안 증폭된 타겟을 함유하는 PCR 증폭 혼합물을 인큐베이팅시켜 수행된다. 바람직하게는, 상기 증폭-후 인큐베이팅 단계는 100 - 110 ℃, 15 초 - 10 분 동안, 더욱 바람직하게는 약 105 ℃, 5 분 이하 동안 가열시키는 것을 포함한다.
일단 증폭-후 인큐베이팅이 수행되면, 증폭된 핵산 타겟은 검출될 수 있다. 검출은 U.S. 특허 제 4,965,188 호 (Gelfand 와 그의 동료) 에 기술된 바와 같이 공지된 다양한 기술로 수행될 수 있다. 예를 들어, 증폭된 핵산은 표지된 프루브에 의한, 서던 블럿 (southern blotting), 도트 블럿 기술 (dot blot techniques) 또는 비동위 원소 올리고뉴클레오티드 포획 검출법으로 검출될 수 있다. 이와는 달리, 증폭 과정은 적당히 표지된 프라이머를 사용하여 수행될 수 있으며, 증폭된 프라이머 증폭 생성물은 표지를 검출하는 장치 및 방법을 사용하여 검출될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 증폭된 타겟 핵산은 검출하기 위하여 표지된 올리고뉴클레오티드 프루브으로 검출되며 직접적으로 또는 간접적으로 증폭된 타겟과 하이브리드될 수 있다. 상기 프루브는 가용성일 수 있거나 또는 고체 지지체에 결합될 수 있다. 다른 구체예에서, 타겟 핵산을 증폭시키기 위하여 사용된 하나 이상의 프라이머가 예를 들어, 특이 결합 부분 (specific binding moiety) 으로 표지될 수 있다. 표지된 프라이머가 결합된 상기 결과의 프라이머 증폭 생성물은 프루브으로 포획 (capture) 될 수 있다. 프루브에 하이브리드된 증폭 타겟은 업계에 널리 공지된 방법 또는 검출 장치를 사용하여 표지된 프루브 또는 표지된 증폭 타겟의 존재를 검출하여 검출될 수 있다. 상기 표지는 검출 장치를 사용하지 않고서도 눈으로 관찰할 수 있다.
더욱 바람직한 구체예에서, 타겟 핵산을 증폭시키는 데에 사용된 하나 이상의 프라이머는 고체 지지체에 결합된 프루브와 하이브리드된 바이오틴 및 바이오틴이 부착되고 (biotinylated) 증폭된 타겟 핵산으로 표지될 수 있다.
이후 결합된 타겟은 예를 들어 과산화수소, 및 적당한 염료 - 제공 시약과 같은 산화체의 존재하에서, 스트렙트아비딘 - 퍼옥시다제 컨주게이트 (conjugate) 와 접촉하여 검출된다. 유용한 염료 - 제공 시약은 U.S. 특허 제 4,089,747 호 (Bruschi) 에 기술된 바와 같이 예를 들어, 테트라메틸벤즈이딘 및 이의 유도체, 및 예를 들어 트리아릴이미다졸 류코 염료와 같은 류코 (leuco) 염료를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 시간에 관하여 "약" 의 의미는 그 시간의 한계에서 ± 10 % 인 경우를 말한다. 온도에 관하여 "약" 이란 의미는 ± 5 ℃ 인 경우를말한다.
하기의 실시예들은 본 발명의 실행을 설명하기 위하여 포함할 수 있는 것이지, 어떠한 방식으로도 제한하는 것은 아니다. 모든 퍼센트 값은 별도의 지시가 없는한 중량당 값이다.
[실시예]
재료 (materials)
서머스 아쿠아티쿠스에서 얻은 재조합 DNA 중합 효소를 EP-A-0 482 714 호에 기술된 바와 같은 공지된 방법으로 제조하였으며 상기 효소의 활성은 단백질의 약 250,000 units/mg 이었다.
하기 실시예에 사용된 프라이머는 다음과 같은 서열을 가졌다.
[서열 1]
Figure pat00001
[서열 2]
Figure pat00002
포획 프루브의 서열은 하기와 같았다.
[서열 3]
Figure pat00003
공지된 출발 재료 및 Applied Biosystems Model 380B, 표준 포스포르아미다이트 (phosphoramidite) 화학 물질 및 ABI 1 μmole 을 사용하는, 빠른 순환 과정의, 3개의 칼럼 DNA 합성기를 사용하여 하기 실시예에 사용된 프라이머 및 프루브를 제조하였다. 뉴클레오시드 - 3' - 포스포르아미다이트 및 뉴클레오시드에 의하여 유도된 제한 구멍 유리 지지체 (controlled pore glass support) 를 Applied Biosystems 에서 얻었다. 프라이머는 상기 서열을 가졌다. U.S. 특허 제 4,962,029 호에 의하면, 상기 프라이머는 5' 말단 2 개의 아미노 테트라에틸렌 글리콜 스페이서 (spacer) 로 관능화되며, Dupont 社 에 의하여 상업적으로 시판되는 단일 바이오틴 포스포르아미다이트가 바로 다음에 위치한다. U.S. 특허 제 4,914,210 호에 의하면, 프루브는 3' 말단 2 개의 테트라에틸렌 글리콜 스페이서에 의하여 관능화되며 단일 아미노디올 결합 그룹이 다음에 위치한다. 모든 분리 과정은 핵산 분리 칼럼을 사용한후, 역상 HPLC 기술 (reverse phase HPLC technique) 에 의하여 수행된다. 데옥시리보뉴클레오티드 (dNTP's) 는 Sigma Chemical Co. 에서 구입하였다.
시판되고 있는 (Signal Chemical Co.) 스트렙트아비딘 및 호오스래디쉬 퍼옥시다제의 컨주게이트, 카제인 (0.5 %), 및 포스페이트 완충된 소금 용액 (24 mmole 소듐 포스페이트 및 75 mmole 소듐 클로라이드) 내 메르티올레이트 (0.5 %), 스트렙트아비딘 - 퍼옥시다제 컨주게이트를 포함하는 용액이 사용되었다. 컨주게이트 안정화제로서 10 mmole 의 4' - 하이드록시아세트아닐리드를 가하였다. 실시예 1 및 실시예 2 에서 컨주게이트의 최종 농도는 1.1 nM 이었다. 실시예 3 에서 컨주게이트의 최종 농도는 0.28 nM 이었다.
싸이토메갈로바이러스, 균주 AD 169 DNA 를 Applied Biotechnology Inc. 에서 구입하였다. 간단히 말해서, 종래의 방법으로 상기 DNA 를 인간 포피 결합 조직형성 세포계 (foreskin fibroblast cell line) 에서 분리한 것이다.
바이러스 목록 명세
Figure pat00004
DNA 추출물 명세
Figure pat00005
Figure pat00006
상기 루코 염료 분산액은 아가로즈(0.5 %), 4,5-비스(4-디메틸아미노페닐)-2-(4 하이드록시-3-메톡시페닐)이미다졸 루코 염료 (250 μmole), 디에틸렌트리아민 펜트아세트산 (100 μmole), 3'-클로로-4'-하이드록시아세트아닐리드 (5 mmole), 폴리비닐피롤리돈 (112 mmole), 및 소듐 포스페이트, 1 염기산, 1-수화물 (10 mmole) 및 과산화수소 (8.82 mmole) 을 함유하였다.
세척 용액 (pH 7.4) 은 소듐 클로라이드 (373 mmole), (에틸렌디니트릴로)테트라아세트산 디소듐 염 (2.5 mmole), 데실 소듐 설페이트 (38 mmole) 및 에틸세리티오 살리실산, 소듐 포스페이트내 소듐염 (25 μmole), 1 염기산 1-수화물 완충액 (25 mmole) 을 함유하였다.
모노 클론 항체가 본 반응 혼합물내에 사용되었다. "TP1-12.2" 및 "TP4-9.2" 와 같은 항체들은 서머스 아쿠아티쿠스에서 얻은 DNA 중합 효소로서, Sutherland 와 그의 동료들에 의하여, "Use of exonuclease and/or glycosylase as supplements to anti-polymerase antibody to increase specificity in Polymerase Chain Reaction" 이라는 제목으로 1995 년 2 월 7 일자 출원된 U.S. 출원 제 08/385,019 호에 보다 상세히 기술되어 있다.
상기 중합 효소 사슬 반응 혼합물 (75 mL) 은 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 완충액 (10 mmole, pH 8.0), 포타슘 클로라이드 (50 mmole), 마그네슘 클로라이드 (4 mmole), dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP (각각 0.3 mM), 서열 1 및 서열 2 의 프라이머 (각각 0.4 μmole), 타입 IV 젤라틴 (100 mg/mL), Taq 중합 효소 (16 units/100 μl), 및 글리세롤 (9.5 %) 를 함유하였다. 50 배 몰 초과량 (중합 효소에 대하여) 의 TP1-12.2 및 5 X 초과량의 TP4-9.2 가 사용되었다.
U.S. 특허 제 5,089,233 호에 기술된 자동화 PCR 프로세서를 사용하여 PCR 증폭 반응을 수행하였다.
포획 시약 (capture reagent) 을 제조하기 위하여, 종래의 유탁액 중합 기술 (emulsion polymerization) 로 폴리[스티렌-코-3(p-비닐-벤질티오)프로피온산] (중량비 95 : 5, 평균 지름 1 ㎛) 에서 얻은 중합체 입자 (평균 지름이 1 ㎛) 와 프루브를 공유 결합시켰다. 수중 입자의 현탁액을 2-(N-모폴리노)에탄설폰산 완충액 (0.1 mole, pH 6) 으로 세척시켜 고체를 약 10 % 로 현탁시켰다. 세척된 입자의 샘플 고체 (3.3 ml) 를 완충액 [0.1 mole, 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드 (84 mg/ml 물의 2.1 ml) 및 44.44 OD/ml 미소량의 순수한 물의 983 μl 프루브와 혼합됨] 내 3.33 % 로 희석시켰다. 결과의 현탁액을 50 ℃ 수조에서 약 2 시간 동안 간헐적으로 혼합시켜 주면서 가열하고 원심 분리시켰다. 이후 입자를 (에틸렌디니트릴로)테트라아세트산 디소듐 염 (0.001 mole) 을 함유하는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 완충액 (0.01 mole, pH 8) 으로 3 회 세척시킨후 4 % 고체로 재현탁시켰다. 이후 글루 (glue) 로 함유하는 2 % 고체로 상기 입자들을 Clinical Diagnostic's PCR 파우취의 각각의 지점에 고정시켰다. Clinical Diagnostic's PCR 파우취 검출 시스템을 사용하여 PCR 생성물을 검출하였다. 다른 시약 및 재료는 시판되고 있는 근원 (source) 에서 얻어졌거나 또는 용이하게 사용할 수 있는 출발 재료 및 종래의 방법을 사용하여 제조되었다.
검출 감도를 높이기 위하여 생성물 검출 이전에 수행되는 증폭-후 인큐베이팅 단계 (post amplification incubation step).
실시예 1.
본 실시예는 중합 효소를 변성시키기 위하여 증폭-후 인큐베이팅 단계를 적용시키는 PCR 을 사용하여 제조된 핵산 생성물을 검출하는 본 발명에 대하여 설명하고 있다.
하기 과정을 40 - 45 회 수행하여 CMV 타겟을 증폭시켜 양성 풀 (positive pool) 을 제조하였다.
1. 95 ℃ 에서 15 초 동안 가열하여 변성시키는 단계 ; 및
2. 70 ℃ 에서 30 초 동안 프라이밍 및 증폭 순환 시키는 단계.
생성물의 농도를 기지의 DNA 표준 (DNA standard) 으로 젤 전기 영동시켜 정량하였다. 이후 결과의 증폭-후 PCR 반응 혼합물을 하기와 같이 사용하였다.
후 - PCR 반응 혼합물을 생성함과 아울러, 상기 PCR 과정을 수행하여 CMV DNA 타겟을 가하지 않은 PCR 반응 혼합물을 PCR 증폭시켜 음성 풀 (negative pool) 생성물을 제조하였다.
상기 증폭-후 PCR 반응 혼합물 (10-7- 10-8M) 을 CMV 음성 풀 생성물에 의하여 1:100 - 1:5000 로 희석시켜 최종 CMV DNA 농도가 1 X 10-10M, 2.5 X 10-11M 또는 5 X 10-11M 이 되었다. 이후 상기 희석된 증폭-후 PCR 반응 혼합물을 증폭-후 인큐베이팅시켜 중합 효소를 불활성화시켰다.
상기 증폭-후 인큐베이팅 단계를 97 ℃ 또는 100 ℃ 에서 2 분 동안, 또는 100 ℃ 에서 5 분 동안 수행하였다.
증폭-후 인큐베이팅시킨후, 58 ℃, 5 분 동안 Clinical Diagnostic's PCR 파우취내에서 포획 시약으로 타겟 핵산을 포획하여 증폭된 생성물을 검출하였다. 이후 포획된 생성물을 스트렙트아비딘-퍼옥시다제 컨주게이트 용액으로 접촉시킨후, 55 ℃, 1 분 동안 인큐베이팅 시켰다. 염료 - 제공 조성물을 가한후 40 ℃ 에서 4 분 동안 인큐베이팅시킨후, 55 ℃ 에서 1 분 동안 세척 용액으로 세척시켰다.
결과의 시그널을 라인 어레이 스캐너 (line array scanner) 로 읽었다. 상기 스캐너는 반사 밀도 (reflectance density ; △ Dr) 의 변화를 측정하였다.
△ Dr 은 염료 현색의 개시전 처음 측정되는 밀도 및 염료 현색 4 분후 최종적으로 측정되는 밀도 사이의 반사 밀도의 차이를 의미한다.
시각적으로 음성인 포획 비드 (bead) 의 스캐너 기저치는 0.05 - 0.1 Dr units 였다.
하기 결과는 증폭-후 인큐베이팅 단계에 의하여 검출 감도가 증가되었다는것을 나타낸다.
Figure pat00007
상기 결과는 100 ℃ 에서 5 분동안의 증폭-후 인큐베이팅 단계가 검출 유효 한계 (effective detection limit) 를 4 배 이상 및 아마도 5 배 이상 기저치 이상으로 증가시켰다는 것을 나타낸다. 상기 결과를 기초로 하였을때, 특히 100 ℃ 에서 인큐베이팅 시간을 2 분 - 5 분으로 증가시켰을 경우 개선되었으며, 두 번째 실험은 100 ℃ 에서 15 분 동안 증폭-후 인큐베이팅시켜 수행되었다.
실시예 2.
본 두 번째 실험에서, CMV DNA 를 실시예 1 에 기술된 바와 같이 증폭시켰다. 결과의 증폭-후 PCR 반응 혼합물을 CMV 음성 풀 생성물로 희석시킨후 실시예 1 에 기술된바와 같이 중합 효소를 비활성화시키기 위하여 증폭-후 인큐베이팅시켰다. 상기 증폭-후 인큐베이팅 단계를 100 ℃ 에서 15 분 동안 수행하였다. 증폭-후 인큐베이팅시킨후, 증폭된 생성물을 실시예 1 에 기술된 바와 같이 검출하였다.
하기 결과는 증폭-후 단계에 의하여 검출 감도가 증가되었음을 나타낸다 :
Figure pat00008
상기 결과들은 100 ℃ 에서 증폭-후 인큐베이팅 시간을 증가시키면 이점을 추가적으로 얻을 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 3.
인큐베이팅 온도를 증가시켜 검출 감도를 높일 수 있는지 여부를 측정하기 위하여, CMV DNA 를 실시예 1 에 기술된 바와 같이 증폭시킨후 100 ℃ 또는 103 ℃ 에서 증폭-후 인큐베이팅시켰다. 103 ℃ 에서 인큐베이팅 시간을 다양하게 설정하여 측정하였다. 더욱이, 본 실험은 최종 컨주게이트 농도가 0.28 nM 인 약한 감도를 가진 화학 물질로 수행되었다. 본 실험의 결과는 하기와 같았다.
Figure pat00009
상기 결과들은 증폭-후 인큐베이팅 단계의 온도를 100 ℃ 에서 103 ℃ 로 증가시키고 인큐베이팅 시간을 5 분동안 유지시킬 경우 2 배 이상 및 아마도 3배 이상 추가로 증가될 수 있음을 나타낸다.
Figure pat00014
상기 언급된 모든 공개 자료들은 본원에 참고 문헌으로 포함되어 있다.
명확화 및 이해의 목적으로 상기 발명을 좀더 상세히 기술하였으며, 본원에 형태적으로 다양한 변화가 가하여지더라도 업계의 숙련자에 의하여 이해될 것이며본 발명의 진정한 범위내에서 다양한 형태 및 세부사항의 변경이 가능하다.
Figure pat00010
Figure pat00011
Figure pat00012
Figure pat00013
본 발명은 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 핵산의 증폭 생성물을 검출하는 개선된 방법에 관한다. 본 발명은 다양한 의학적 및 탐색적 연구, 법의학적 연구, 및 예를 들어 유전적 결함 또는 감염성 질병을 검출하는 것과 같은 진단 방법에 이용될 수 있다.
본 발명의 목적은 증폭 효소를 비활성화시키기 위하여 검출 이전에 증폭-후 인큐베이팅 단계 (post amplification incubation step) 로써 상기 문제점들을 극복하는 것이다.
하나의 구체예에서, 본 발명은
(i) 타겟 핵산이 증폭되는 조건하에서, 상기 타겟 핵산을 함유할 것이라 여겨지는 샘플을 2 이상의 올리고뉴클레오티드 및 내열성 증폭 효소 [이 중, 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 타겟 핵산의 일부와 상보적임] 와 접촉시키는 단계 ;
(ii) 단일 가닥 핵산을 생성시키기 위하여 증폭된 타겟 핵산을 변성시키는 단계 ;
(iii) 상기 내열성 효소를 비활성화시키기 위하여 증폭-후 인큐베이팅 단계로서 상기 샘플을 1 초 - 30 분동안 95 - 120 ℃ 에서 인큐베이팅시키는 단계 ;
(iv) 증폭된 타겟 핵산의 존부를 검출하는 단계
를 포함하는 타겟 핵산 증폭 및 검출 방법에 관한다.
다른 구체예에서, 본 발명은
(i) 4 가지의 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트, 내열성 DNA 중합 효소, 및 2 이상의 프라이머 [이중, 프라이머는 실질적으로 타겟 핵산과 상보적임]와 타겟 핵산을 함유할 것이라고 여겨지는 샘플을 접촉시키는 단계 ;
(ii) 단일 가닥 핵산을 생성시키기 위하여 증폭된 타겟 핵산을 변성시키는 단계 ;
(iii) 상기 중합제를 비활성화시키기 위하여 증폭-후 인큐베이팅 단계로서 상기 샘플을 1 초 - 30 분동안 95 - 120 ℃ 에서 인큐베이팅시키는 단계 ;
(iv) 증폭된 타겟 핵산의 존부를 검출하는 단계
를 포함하는 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법에 관한다.
또다른 구체예에서, 본 발명은
(i) 타겟 핵산이 증폭되는 조건하에서 4 가지의 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트, 내열성 DNA 중합 효소, 및 2 이상의 프라이머 [이중, 하나 이상의 프라이머는 바이오틴으로 표지되었으며 모든 프라이머는 실질적으로 타겟 핵산과 상보적임]와 타겟 핵산을 함유할 것이라고 여겨지는 샘플을 접촉시키는 단계 ;
(ii) 상기 중합 효소를 비활성화시키기 위하여 증폭-후 인큐베이팅 단계로서, 상기 샘플을 0.5 - 5 분동안 105 ℃ 에서 인큐베이팅시키는 단계 ;
(iii) 증폭된 바이오틴화 타겟 핵산을 스트렙트아비딘 - 효소 결합체와 반응시켜 증폭된 바이오틴화 타겟 핵산의 존부를 검출시킨후, 검출 가능한 비색계 (colorimetric ; 比色計) 시그널 또는 화학 발광 (chemiluminescent) 시그널을 발생시키기 위하여 상기 효소를 기질 시약과 반응시키는 단계
를 포함하는 타겟 핵산을 증폭 및 검출시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다양한 기타의 목적 및 이점은 다음의 본 발명에 관한 상세한 설명으로부터 명확해질 것이다.

Claims (21)

  1. (i) 타겟 핵산이 증폭되는 조건 하에서, 상기 타겟 핵산을 함유할 것으로 여겨지는 샘플을 상기 타겟 핵산의 일부분과 상보적인 2 이상의 올리고뉴클레오티드 및 내열성 증폭 효소와 접촉시키는 단계;
    (ii) 단일 가닥 핵산을 생성하기 위하여 증폭된 타겟 핵산을 변성시 키는 단계 ;
    (iii) 상기 내열성 증폭 효소를 불활성화시키기 위한 증폭-후 인큐베이팅 단계 (post amplification incubation step) 로서, 상기 샘플을 1 초 - 30 분 동안 95 - 120 ℃ 에서 인큐베이팅하는 단계 ; 및
    (iv) 상기 증폭된 타겟 핵산의 존부를 검출하는 단계
    를 포함하는 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 4 개의 올리고뉴클레오티드 및 내열성 DNA 리가제를 사용하는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법.
  3. (i) 타겟 핵산이 증폭되는 조건 하에서, 상기 타겟 핵산을 함유할 것으로 여겨지는 샘플을 4 개의 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트, 내열성 DNA 중합 효소 및 상기 타겟 핵산과 상보적인 2 개의 프라이머와 접촉시키는 단계 ;
    (ii) 단일 가닥 핵산을 생성하기 위하여 증폭된 타겟 핵산을 변성시키는 단계 ;
    (iii) 상기 중합제 (polymerization agent) 를 불활성화시키기 위한 증폭-후 인큐베이팅 단계로서, 상기 샘플을 1 초 - 30 분동안 95 - 120 ℃ 에서 인큐베이팅하는 단계 ;
    (iv) 상기 증폭된 타겟 핵산의 존부를 검출하는 단계
    를 포함하는 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 증폭-후 인큐베이팅 단계를 100 - 110 ℃ 에서 15 초 - 10 분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 증폭-후 인큐베이팅 단계를 100 - 110 ℃ 에서 0.5 분 - 5 분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법.
  6. 제 3 항에 있어서, 상기 타겟 핵산이 DNA 또는 RNA 인 것을 특징으로 하는 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 타겟 핵산이 DNA 인 것을 특징으로 하는 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 타겟 핵산이 RNA 인 것을 특징으로 하는 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법.
  9. 제 3 항에 있어서, 상기 뉴클레오시드 트리포스페이트가 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트인 것을 특징으로 하는 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트가 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 인 것을 특징으로 하는 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법.
  11. 제 3 항에 있어서, 상기 내열성 DNA 중합 효소가 서머스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus) 중합 효소, 서머스 서모필러스 (Thermus thermophilus) 중합 효소 및 서모코커스 리토랠리스 (Thermococcus litoralis) 중합 효소로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법.
  12. 제 3 항에 있어서, 상기 2 개의 프라이머 중 하나 이상의 프라이머가 표지된 것을 특징으로 하는 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법.
  13. 제 3 항에 있어서, 상기 프라이머가 표지된 것을 특징으로 하는 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법.
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 2 개의 프라이머 중 하나 이상의 프라이머가 특이결합 리간드로 표지된 것을 특징으로 하는 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 특이 결합 리간드가 바이오틴인 것을 특징으로 하는 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법.
  16. 제 3 항에 있어서, 상기 증폭된 타겟 핵산을 상기 증폭된 타겟 핵산 중 하나와 하이브리드될 수 있는, 표지된 프루브를 사용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 표지된 프루브가 고체 지지체에 결합된 것을 특징으로 하는 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법.
  18. 제 3 항에 있어서, 상기 2 개의 프라이머 중 하나 이상의 프라이머를 특이 결합 부분 (specific binding moiety) 으로 표지하고, 상기 증폭된 타겟 핵산을 상기 증폭된 타겟 핵산 중 하나와 하이브리드될 수 있는 프루브를 사용하여 검출하는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 프루브가 고체 지지체에 결합된 것을 특징으로 하는 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법.
  20. (i) 타겟 핵산이 증폭되는 조건 하에서, 상기 타겟 핵산을 함유할 것으로 여겨지는 샘플을 4 개의 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트, 내열성 DNA 중합 효소 및 상기 타겟과 상보적이며 2 개 중 하나 이상은 바이오틴으로 표지된 2 개의 프라이머와 접촉시키는 단계;
    (ii) 상기 중합 효소를 불활성화시키기 위한 증폭-후 인큐베이팅 단계로서, 0.5 분 - 5 분동안 100 - 110 ℃ 에서 상기 샘플을 인큐베이팅하는 단계; 및
    (iii) 상기 바이오틴이 부착된 증폭 타겟 핵산을 아비딘 - 효소 컨주게이트와 반응시킨 후 상기 효소를 기질 시약과 반응시켜 검출 가능한 비색계 (比色計 ; colorimetric) 또는 화학 발광 (chemiluminescent) 시그널을 발생시킴으로써 상기 바이오틴이 부착된 증폭 타겟 핵산의 존부를 검출하는 단계
    를 포함하는 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 바이오틴이 부착된 증폭 타겟 핵산을 아비딘 - 퍼옥시다제 컨주게이트와 접촉시킨 후, 산화체 존재 하에서 퍼옥시다제를 루미놀 (luminol) 과 반응시켜 검출 가능한 화학 발광 시그널을 발생시키거나, 루코 염료와 반응시켜 검출 가능한 비색계 시그널을 발생시킴으로써 상기 바이오틴이 부착된 증폭 타겟 서열을 검출하는 것을 특징으로 하는 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법.
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