KR970065730A - 후 증폭 인큐베이팅 (post amplification incubation) 단계를 이용한 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법 - Google Patents

후 증폭 인큐베이팅 (post amplification incubation) 단계를 이용한 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 타겟 핵산 서열을 증폭 및 검출하는 방법에 관한다. 본 방법은 타겟 핵산이 증폭되는 조건하에서 타겟 핵산 서열을 함유하고 있을 것으로 여겨지는 샘플을 내열성 DNA 중합 효소 및 실질적으로 타겟 핵산에 상보적인 2개의 프라이머와 접촉시켜 타겟 핵산 서열을 증폭시키는 것을 포함한다. 이후 상기 증폭된 타겟 핵산은 변성되어 1본쇄 핵산으로 생성된다. 증폭시킨후, 상기 샘플을 전-보호(pre-protection) 인큐베이팅 단계에 도입시킨다. 95-120℃에서 1초-30분 동안 샘플을 인큐베이팅시켜 상기 중합체(polymerization agent)를 비활성화(inactivation)시킨다. 최종적으로, 증폭된 핵산의 존부를 측정할 수 있다.

Description

후 증폭 인큐베이팅(post amplification incubation)단계를 이용한 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법.
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음

Claims (21)

  1. (ⅰ)타겟 핵산이 증폭되는 조건하, 타겟 핵산을 함유할 것으로 여겨지는 샘플을 실질적으로 상기 타겟핵산의 일부분과 상보적인 2이상의 올리고누클레오티드 및 내열성 증폭 효소와 접촉시키는 단계; (ⅱ)1본쇄 핵산을 생성하기 위하여 증폭된 타겟 핵산을 변성시키는 단계; (ⅲ)상기 내열성 증폭 효소를 불활성화시키기 위한 후 증폭 인큐베이팅 단계(post amplification ancubation step)로서, 상기 샘플을 1초-30분 동안 95-120℃에서 인큐베이팅시키는 단계; (ⅳ)상기 증폭된 타겟 핵산의 존부를 검출하는 단계를 포함하는 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서, 4개의 올리고누클레오티드 및 내열성 DNA 리가제가 사용된 방법.
  3. (ⅰ)타겟 핵산이 증폭되는 조건하, 타겟 핵산을 함유할 것으로 여겨지는 샘플을 4개의 상이한 누클레오시드 트리포스페이트, 내열성DNA 중합 효소, 및 실질적으로 상기 타겟 핵산과 상보적인 2개의 프라이머와 접촉시키는 단계; (ⅱ)1본쇄 핵산을 생성하기 위하여 증폭된 타겟 핵산을 변성시키는 단계;(ⅲ)상기 중합체(polymerization agent)를 불활성화시키기 위한 후 증폭 인큐베이팅 단계로서, 상기 샘플을 1초-30분동안 95-120℃에서 인큐베이팅시키는 단계; (ⅳ)상기 증폭된 타겟 핵산의 존부를 검출하는 단계를 포함하는 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 후 증폭 인큐베이팅 단계를 100-110℃에서 15초-5분 동안 수행하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 후 증폭 인큐베이팅 단계를 약 105℃에서 0.5분-5분 동안 수행하는 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 타겟 핵산이 DNA 또는 RNA인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 타겟 핵산이 DNA인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 타겟 핵산이 RNA인 방법.
  9. 제3항에 있어서, 상기 누클레오시드 트리포스페이트가 데옥시리보누클레오시드 트리포스페이트인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 데옥시리보누클레오시드 트리포스페이트가 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP인 방법.
  11. 제3항에 있어서, 상기 내열성 DNA 중합 효소가 서머스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)중합 효소, 서머스 서모필러스(Thermus thermophilus)중합 효소 및 서모코커스 리토랠리스(thermococcus litoralis)중합 효소를 포함하는 그룹에서 선택된 방법.
  12. 제3항에 있어서, 하나 이상의 상기 프라이머가 표지된 방법.
  13. 제3항에 있어서, 상기 프라이머가 표지된 방법.
  14. 제12항에 있어서, 하나 이상의 상기 프라이머가 특이 결합 리간드로 표지된 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 특이 결합 리간드가 바이오틴인 방법.
  16. 제3항에 있어서, 상기 증폭된 타겟 핵산을 하나 이상의 타겟 핵산중 하나와 잡종화될 수 있는 표지된 탐침을 사용하여 검출하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 표지된 탐침이 고체 지지체에 결합된 방법.
  18. 제3항에 있어서, 하나 이상의 상기 프라이머를 특이 결합 부분(specific binding moiety)으로 표지하고 상기 증폭된 타겟 핵산을 하나 이상의 타겟 핵산중 하나와 잡종화될 수 있는, 탐침을 사용하여 검출하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 탐침이 고체 지지체에 결합된 방법.
  20. (ⅰ)타겟 핵산이 증폭되는 조건하, 타겟 핵산을 함유할 것으로 여겨지는 샘플을 4개의 상이한 누클레오시드 트리포스페이트, 내열성 DNA중합 효소, 및 하나 이상이 바이오틴으로 표지되었고 실질적으로 상기 타겟 핵산과 상보적인 2개의 프라이머와 접촉시키는 단계; (ⅱ)상기 중합 효소를 불활성화시키기 위한 후 증폭 인큐베이팅 단계로서, 0.5분-5분동안 약 105℃에서 상기 샘플을 인큐베이팅시키는 단계; 및(ⅲ)바이오틴화된(biotinylated)증폭 타겟 핵산을 아비딘-효소 컨쥬게이트와 반응시킨후 상기 효소를 기질 시약과 반응시켜 검출 가능한 비색계(比色計;colorimetric)또는 화학 발광(chemiluminescent)시그널을 발생시킴으로써 상기 바이오틴화된 증폭 타겟 핵산의 존부를 검출하는 단계를 포함하는 타겟 핵산의 증폭 및 검출 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 바이오틴화된 증폭 타겟 핵산을 아비딘-퍼옥시다제 컨쥬게이트와 접촉시킨후, 산화제 존재하에, 퍼옥시다제를 루미놀(luminol)과 반응시켜 검출 가능한 화학 발광 시그널을 발생시키거나, 또는 루코 염료와 반응시켜 검출 가능한 비색계 시그널을 발생시킴으로써 상기 바이오틴화된 증폭 타겟 서열을 검출하는 방법.
    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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