KR910006497A - 프라이머 3' 말단에서의 프라이머-표적 오합(mismatch)을 극복한 진단 및 증폭방법 - Google Patents

프라이머 3' 말단에서의 프라이머-표적 오합(mismatch)을 극복한 진단 및 증폭방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음

Description

프라이머 3′말단에서의 프라이머-표적 오합(mismatch)을 극복한 진단 및 증폭 방법
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음
제1도는 증폭 반응이 높은 염 농도 및 높은 하이브리드 온도에서 수행되고, 다양한 3′말단의 오합을 사용한 증폭 결과의 매트릭스 요약으로 전기영동 결과가 양성(+) 또는 음성(-) 어느 하나로, 프로브 결과는 관찰된 색소 밀도에 상응하는색상 챠트값으로 나타난다(실시예 1에서 참조된다).
제2도는 증폭 반응이 낮은 염 농도에서 수행된, 탐지 가능한 프로브와의 하이브리화의 결과를 나타낸 제1도와 같은 매트릭스이다.
제3도는 증폭 반응이 높은 염 농도 및 낮은 하이브리화 온도에서 수행된 실시예 3의 결과에 대한 제1도와 같은 매트릭스이다.

Claims (10)

  1. A. 핵산을 포함하는 시료와 프라이머 조성물을 접촉시키고, B. 실질적으로 동시에, 핵산이 생성된 혼합물중에서 증폭되는 조건하에 시료를 중합화 시약과 접촉시키는 것을 동시에 포함하는 적어도 하나의 핵산을 증폭시키는 방법에 있어서, 프라이머 조성물이 필수적으로 프라이머의 3′말단 또는 그 부근의 하나의 위치를 제외한 모든 위치에서 핵산의 서열에 상보적이어서 프라이머와 핵산 서열 사이에 단일 위치에서 단일 오합을 갖게 되는 프라이머로 구성되며, 상기 프라이머가 상기 오합 위치에 티민 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 가짐을 특징으로 하는 방법.
  2. A. 프라이머와 핵산의 하이브리드화 생성물을 형성시키기 위하여 핵산을 포함하는 시료와 프라이머 조성물을 접촉시키고, B. 하이브리드화된 생성물중 프라이머 연장 생성물을 형성시키고, 프라이밍시키며, 연장시켜 프라이머 연장 생성물을 증폭시키고, C. 생성된 프라이머 연장 생성물을 분리하고, 이들을 탐지 또는 포획 올리고 뉴클레오타이드 프로브와 접촉시켜 상보적인 생성물을 형성하고, D. 시료중에 표적 핵산의 존재를 나타내는 것으로서 상보적 생성물의 존재를 탐지하는 것을 포함하는 표적 핵산의 탐지 방법에 있어서, 프라이머 조성물이 필수적으로 프라이머의 3′말단 또는 그 부근의 하나의 위치를 제외한 모든 위치에서 핵산의 서열에 상보적이어서 프라이머와 핵산 서열 사이에 단일 위치에서 단일 오합을 갖게 되는 프라이머로 구성되며, 상기 프라이머가 상기 오합 위치에 티민 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 가짐을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 포획 올리고 뉴클레오타이드를 사용하고, 탐지를 비오티닐화 프라이머 및 아비딘-효소 결합물을 사용하여 달성하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 결합물이 퍼옥시다제를 포함하는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 탐지를 효소로 표지하거나 표지할 수 있는 프로브를 사용하여 달성하는 방법.
  6. 제2항에 있어서, 프라이머들중 하나를 불용성 기질에 부착시키거나 부착시킬 수 있는 방법.
  7. A. 생물학적 시료중의 2본쇄 핵산의 상보적 본쇄들을 변성시키고, B. 프라이머와 핵산 분쇄의 하이브리드화 생성물을 형성하기 위해서, 시료를 프라이머와 3′말단 또는 그 부근의 하나의 위치를 제외한 모든 위치에서 핵산 분쇄중 하나의서열에 상보적이어서 프라이머와 핵산 본쇄 사이에서의 단일 위치에서 단일 오합을 갖게 되고, 상기 오합 위치에 티민 염기를 갖는 뉴클레오타이드를 갖는 프라이머로 필수적으로 구성되는 프라이머 조성물과 접촉시키며, 동시에 핵산의 다른 나머지 본쇄와 실질적으로 상보적인 하나 이상의 추가적 프라이머들을 접촉시키고, C. 열안정성 중합효소 및 데옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP의 존재하에, 하이브리드화 생성물 형태로 프라이머의 연장 생성물(이 연장 생성물은 상보물(complement)로부터 분리되었을 때, 프라이머의 연장 생성물의 합성을 위한 주형으로서 작용할 수 있다)을 형성시키고, D. 프라이머 연장 생성물을 그들이 합성된 주형으로부터 분리시키며, E. 분리된 연장 생성물 및 예정된 핵산을 본쇄들에 상보적인 추가의 프라이머들과 접촉시켜 상보적인 생성물을 형성하는 핵산의 증폭을 가져오며, F. 단계E에서 형성된 상보적 생성물로부터 프라이머 연장 생성물을 분리하고, G. 단계F에서 분리된 적어도 하나의 프라이머 연장 생성물과 여기에 상보적인 탐지 또는 포획용의 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브를 접촉시켜 프로브와 프라이머 연장 생성물의 상보적 생성물을 형성시키고, H. 시료중의 예정된 핵산의 존재를 나타내는 것으로써 단계G에서 형성된 상보적 생성물을 탐지하는 것을 포함하는 두 개의 상보적 본쇄를 갖는 적어도 하나의 예정된 핵산의 탐지 방법.
  8. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서, 중합효소가 써머스 아쿠아티쿠스(Thermus aqua-ticus) 또는 써머스 써모필러스(Thermus thermo-phlius)로부터 분리되거나, 또는 합성된 그의 등가물인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항중 어느 한 항에 있어서, HIV-DNA를 증폭하거나 또는 탐지하기 위한 방법.
  10. 제1항 내지 제9항중 어느 한 항에 있어서, 프라이머와 증폭 또는 탐지된 핵산 사이의 단일 오합이 프라이머의 3′말단에 있거나 또는 이로부터 한 위치 떨어진 곳에 있는 방법.
    ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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