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Hintergrundinformation
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Bereich der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft
ein Verfahren zur Amplifizierung und dem Nachweis von Zielnukleinsäuren. Insbesondere
betrifft es verbesserte Verfahren zum Nachweis von amplifizierten
Nukleinsäureprodukten.
Die vorliegende Erfindung kann in zahlreichen medizinischen und
Forschungs-Untersuchungen, forensischen Untersuchungen und diagnostischen
Verfahren, wie zum Beispiel für
den Nachweis von genetischen Erkrankungen oder infektiösen Erkrankungen,
verwendet werden.
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Hintergrund der Erfindung
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Die Technologie, um geringe Mengen
von Nukleinsäuren
nachzuweisen, wurde über
die letzten zwei Jahrzehnte hinweg schnell verbessert, einschließlich der
Entwicklung von hochkomplexen Hybridisierungstest unter der Verwendung
von Sonden in Amplifikationstechniken, wie zum Beispiel der Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
Die Forscher haben den Weit einer solchen Technologie schnell erkannt,
um Erkrankungen und genetische Merkmale in menschlichen und tierischen
Testproben nachzuweisen. Die Verwendung von Primern und Sonden bei
der Amplifikation und dem Nachweis von Nukleinsäuren basiert auf dem Konzept
der Komplementarität,
gemeint ist, der Bindung von zwei Strängen einer Nukleinsäure durch
Wasserstoffbrücken
zwischen komplementären
Nukleotiden (die als Nukleotidpaare bekannt sind).
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Viel Forschung wurde durchgeführt, um
Wege zu finden, kleine Mengen von DNA zur amplifizieren und nachzuweisen.
Verschiedene Verfahren sind bekannt und wurden dazu verwendet, die
Zahl von Nukleinsäuren in
einer Probe zum Nachweis zu amplifizieren oder stark zu vervielfachen.
Solche Amplifikationsechniken schließen PCR, Ligase-Kettenreaktion
(LCR) und verzweigte DNA ein.
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PCR ist die am besten bekannte dieser
Amplifikationsverfahren. Details der PCR sind im Stand der Technik
gut beschrieben, einschließlich,
zum Beispiel in U.S. Patenten Nm 4,638,195 (Mullis et al.), 4,683,202 (Mullis)
und 4,965,188 (Mullis et al.). Ohne in ausführliche Details gehen zu wollen,
schließt
die PCR ein Hybridisieren von Primern an die Stränge einer Zielnukleinsäure in der
Anwesenheit eines Polymerisierungsmittels (wie zum Beispiel einer
DNA-Polymerase) und Desoxyribonukleosidtriphosphaten unter den geeigneten
Be dingungen ein. Das Ergebnis ist die Erzeugung von Primer-Verlängeungsprodukten
zusammen mit dem Templat, wobei den Produkten Nukleotide hinzugefügt werden,
die komplementär
zu den Templaten sind.
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Sobald die Primer-Verlängerungsprodukte
denaturiert sind und eine Kopie der Template hergestellt wurde,
kann der Zyklus von Primen, Verlängern
und Denaturieren so viele Male wie gewünscht durchgeführt werden,
um eine exponentielle Zunahme in der Menge von Nukleinsäure zur
Verfügung
zu stellen, die dieselbe Sequenz aufweist, wie die Zielnukleinsäure. Im
Endeffekt wird die Zielnukleinsäure
viele Male verdoppelt (oder "amplifiziert"), so daß sie leichter
nachgewiesen werden kann. Sobald die Zielnukleinsäure ausreichend
amplifiziert wurde, können
verschiedene Nachweisverfahren dazu verwendet werden, die Anwesenheit
des Ziels, qualitativ und/oder quantitativ nachzuweisen.
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Sobald die Zielnukleinsäure ausreichend
amplifiziert wurde, können
verschiedene Nachweisverfahren dazu verwendet werden, ihre Anwesenheit
nachzuweisen. Ein Standardnachweisverfahren, das dazu verwendet
wird, PCR-Produkte nachzuweisen, waren Ethidiumbromid-gefärbte Agarosegele.
Die Verwendung von Ethidiumbromid-gefärbten Gelen weist jedoch mehrere
Nachteile auf einschließlich,
zum Beispiel der relativ schlechten Sensitivität und Spezifität.
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Verbesserte Verfahren zum Nachweis
von PCR-Produkten wurden entwickeln, die die Verwendung von Radiomarkern
und Elektrophorese beseitigen. Diese nicht-isotopischen Oligonukleotid-Fangnachweisverfahren
beruhen auf der spezifischen Hybridisierung an Sonden und enzymatischer
Signalerzeugung. Solche nicht-isotopischen Oligonukleotid-Fangnachweisverfahren,
auch als reverser Dot-Blot-Nachweis
bekannt, sind in U.S. Patenten Nm. 5,229,297 (Schnepilsky et al.),
5,328,825 (Warren et al.) und 5,422,271 (Chen et al.) beschrieben.
Solch ein Verfahren wird auch in Findlay et al., Clinical Chemistry,
39:1927–1933
(1993) beschrieben.
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Diese nicht-isotopischen Nachweisverfahren
weisen eine höhere
Sensitivität
und Spezifität
auf, als Ethidiumbromid-Färbenachweis
und vermeiden die Verwendung von Radioaktivität. Die Verfahren funktionieren
durch entweder Durchführen
der Amplifikation mit biotinylierten Primern oder der Verwendung
einer biotinylierten Sonde, um die amplifizierten Nukleinsäuren nachzuweisen.
Biotinylierte Produkte oder Sonden werden anschließend mit
einem Avidin- oder Streptavin-konjugierten Enzym, wie zum Beispiel
Meerrettichperoxidase (HRP) reagiert. Ein Farbvorläufer (oder
Licht erzeugendes Signalreagenz) kann dann in Kontakt mit dem Enzym
gebracht werden und in einen Farbstoff konvertiert werden (Lumineszenz),
wodurch ein nachweisbares Signal erzeugt wird.
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Nicht isotopische Oligonukleotid-Fangnachweisverfahren
sind jedoch nicht ohne ihre eigenen Nachteile. Falls ein nicht-isotopischer
Oligonukleotid-Fangnachweis unter der Verwendung von Standard-PCR
denaturierenden Bedingungen (95°C)
durchgeführt
wird, um konzentrierte oder minimal verdünnte amplifizierte Nukleinsäureprodukte
zu denaturieren, werden die Enzyme, die dazu verwendet wurden die
Amplifikationsreaktion durchzuführen,
wie zum Beispiel die thermostabilen Polymerasen oder DNA-Ligasen,
immer noch vorhanden und aktiv seien. Die Anwesenheit von solchen
aktiven Enzymen während
des Nachweises führt
zur kompetitiven Bindung zwischen dem Enzym und der Sonde um das
Amplifikationsprodukt Solche Kompetition kann die Menge von amplifizierten
Nukleinsäureprodukten,
die an Sonde gebunden sind und daher das Nachweissignal verringern.
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Eine Lösung für dieses Problem war es, hohe
Spiegel von Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), einen Chelatbildner
von Mg++ zu dem PCR-Amplifikationsgemisch
hinzufügen
nachdem die Amplifikation durchgeführt wurde, jedoch vor dem Nachweis.
EDTA ist in der Lage, viele Enzyme zu inhibieren, die Mg++ für
ihre Aktivität
benötigen,
einschließlich
DNA-Polymerasen und DNA-Ligasen. Die Verwendung von EDTA fügt jedoch
einen weiteren Schritt zum PCR Amplifikations- und Nachweisprozeß hinzu.
Zusätzlich
erfordert die Verwendung von EDTA ein Öffnen des Reaktionsgefäßes, um
das EDTA hinyufügen.
Wie der Fachmann weiß, muß ein Öffnen des
Reaktionsgefäßes aufgrund
von Kontaminations-Bedenken vermieden werden.
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Daher ist das Blockieren des Amplifikationsprozesses
während
des Nachweises durch die Hinzufügung
von EDTA oder anderen solcher Enzyminhibitoren nicht erwünscht. Stattdessen
ist es wünschenswert, ein
Verfahren zur Inaktivierung der Amplifikationsenzyme vor dem Nachweis
ohne ein erhöhtes
Risiko von Kontamination zu haben.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Es ist eine Aufgabe der vorliegenden
Erfindung, die oben angegebenen Probleme, durch Verwendung eines
post-Amplifikationsinkubierungsschritts vor dem Nachweis, um die
Amplifikationsenzyme zu inaktivieren zu überwinden.
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In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende
Erfindung ein Verfahren zur Amplifizierung und dem Nachweis einer
Zielnukleinsäure,
umfassend:
- (i) In Kontakt bringen einer Probe,
von der vermutet wird, daß sie
die Zielnukleinsäure
enthält,
mit mindestens zwei Oligonukleotiden und einem thermostabilen Amplifikationsenzym,
wobei die Oligonukleotide im wesentlichen komplementär zu einem
Teil der Zielnukleinsäure
sind, unter Bedingungen, so daß die
Zielnukleinsäure
amplifiziert wird.
- (ii) Inkubieren der Probe für
zwischen einer Sekunde und 30 Minuten bei zwischen 105°C und 120°C als ein
post-Amplifikations-Inkubationsschritt, um die thermostabilen Amplifikationsenzyme
zu inaktivieren; und
- (iii) Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit der amplifizierten
Zielnukleinsäuren.
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In einer weiteren Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Amplifizierung und
dem Nachweis einer Zielnukleinsäure,
umfassend:
- (i) In Kontakt bringen einer Probe,
von der vermutet wird, daß sie
die Zielnukleinsäure
mit vier verschiedenen Nukleosidtriphosphaten, einer thermostabilen
DNA-Polymerase und mindestens zwei Primern, wobei die Primer im
wesentlichen komplementär
zu der Zielnukleinsäure
sind, unter Bedingungen, so daß die
Zielnukleinsäure
amplifiziert wird;
- (ii) Inkubieren der Probe für
zwischen einer Sekunde und 30 Minuten bei zwischen 105°C und 120°C als ein
post-Amplifikationsinkubationsschritt, um das polymerisieren Mittel
zu inaktivieren; und
- (iii) Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit der amplifizierten
Zielnukleinsäuren.
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In einer anderen Ausführungsform
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Amplifizierung und
dem Nachweis einer Zielnukleinsäure,
umfassend:
- (i) In Kontakt brigen einer Probe,
von der vermutet wird, daß sie
die Zielnukleinsäure
enthält,
mit vier verschiedenen Nukleosidtriphosphaten, einer thermostabilen
DNA-Polymerase und mindestens zwei Primern, wobei mindestens einer
der Primer mit Biotin markiert ist und alle Primer im wesentlichen
zu der Zielnukleinsäure
komplementär
sind, unter Bedingungen, so daß die
Zielnukleinsäure
amplifiziert wird;
- (ii) Inkubieren der Probe für
zwischen 0,5 Minuten und 5 Minuten bei ungefähr 105°C als ein post-Amplifikationsinkubationsschritt,
um die Polymerase zu inaktivieren; und
- (iii) Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit der biotinylierten
amplifizierten Zielnukleinsäuren durch
Reagieren der biotinylierten amplifizierten Zielnukleinsäuren mit
einem Streptavidin- Enzymkonjugat, gefolgt
von Reaktion des Enzyms mit einem Substratreagenz um ein nachweisbares
colorimetrisches oder chemilumineszentes Signal zu produzieren.
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Zahlreiche andere Aufgaben und Vorteile
der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung
der Erfindung ersichtlich werden.
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Genaue Beschreibung der
Erfindung
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Die allgemeinen Prinzipien und Bedingungen
für die
Amplifikation und den Nachweis von Nukleinsäuren unter der Verwendung der
Polymerase-Kettenreaktion sind relativ gut bekannt, wobei die Details
davon in zahlreichen Referenzen, einschließlich U.S. Patenten Nm 4,683,195
(Mullis et al.), 4,683,202 (Mullis) und 4,965,188 (Mullis et al.)
zur Verfügung
gestellt werden. Daher sollte ein Fachmann im Stand der Technik
im Hinblick auf die Lehre im Stand der Technik und die hier zur
Verfügung
gestellte spezifische Lehre keine Schwierigkeiten bei der Durchführung der
vorliegenden Erfindung durch Hinzufügen eines post-Amplifikationsinkubationsschrittes,
um die Amplifikationsenzyme, vor dem Produknachweis, wie hier gelehrt,
zu inaktivieren, um die Nachweissensitivität zu erhöhen.
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Andere Amplifikations- und Nachweisverfahren,
die thermostabile Enzyme verwenden, können bei der Durchführung dieser
Erfindung auch verwendet werden. Die vorliegende Erfindung stellt
einen post-Amplifikations-,
prä-Nachweisinkubationsschritt
zur Verfügung,
der das thermostabile Enzym/die thermosabilen Enzyme, die während der
Amplifikation verwendet werden, inaktiviert. Daher ist die vorliegende
Erfindung zur Verwendung mit jedem Amplifikationsverfahren geeignet,
das ein themostabiles Enzym angewendet. Andere themostabile Amplifikationsverfahren
schließen
die Ligase-Kettenreaktion (LCR) wie, zum Beispiel in EP-A-0 320 308
(veröffentlicht
im Dezember 1987) und EP-A-0 439182 (veröffentlicht Januar 1990) beschrieben,
ein, die eine thermostabile DNA-Ligase verwendet, um aneinandergrenzende
Sonden zu ligieren, wodurch eine komplementäre Nukleinsäuresequenz erzeugt wird. In
der LCR werden Zielnukleinsäuren
unter der Verwendung von vier Oligonukleotidsonden und einer thermostabilen
DNA-Ligase amplifiziert. Zwei der Oligonukleotidsonden sind komplementär zu aneinandergrenzenden
Stellen auf einem Strang des DNA-Templats, das amplifiziert werden
soll. Diese Sonden hybridisieren an den DNA-Strang auf solche Weise,
daß eine
Lücke zwischen den
zwei Sonden gebildet wird. Diese Lücke wird dann durch eine thermostabile
DNA-Ligase geschlossen, wodurch ein neuer Strang an DNA erzeugt
wird, der zu den Ziel komplementär
ist. Die dritten und vierten Sonden sind zu dem zweiten Strang des
DNA-Templats komplementär
und dienen wie das erste Paar von Sonden dazu, eine komplementäre DNA zu
erzeugen. Die amplifizierten Produkte der LCR können unter der Verwendung von
Standardnachweisverfahren nachgewiesen werden. Der post-Amplifikations,
prä-Nachweisinkubationsschritt
der vorliegenden Erfindung kann mit der LCR verwendet werden, um
die DNA-Ligase vor
dem Nachweis zu inaktivieren. Daher würden es die hier zur Verfügung gestellten
Lehren einem Fachmann im Stand der Technik erlauben, den post-Amplifikationsenzym-Denaturierungsschritt,
der für
die PCR gezeigt wurde, an diese anderen bekannten Amplifikations-
und Nachweisverfahren anzupassen. Der Rest dieser Beschreibung ist
auf die Durchführung
der Erfindung unter der Verwendung der PCR für illustrative Zwecke gerichtet.
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Die vorliegende Erfindung stellt
eine Modifikation der bekannten Verfahren der PCR zur Verfügung, um
die Nachweissensitivität
zu verbessern. Es wurde überraschenderweise
in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung gefunden, daß ein post-Amplifikations-,
prä-Nachweisinkubationsschritt
dazu verwendet werden kann, um das polymerisierende Mittel zu inaktivieren
und die Bindungskompetition zwischen der Sonde und der Mittel um
die amplifizierten Zielnukleinsäuren
zu verringern. Diese verringerte Kompetition erhöht die Nachweissensivität.
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Die vorliegende Erfindung ist auf
die Amplifikation und den Nachweis von einer oder mehrerer Zielnukleinsären gerichtet,
die in einer Testprobe vorhanden sind. Testproben können zelluläre oder
virale Materialien, Körperfüssigkeiten
oder andere zielluläre
Materialien einchließen,
die genetische DNA oder RNA enthalten, die nachgewiesen werden kann.
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Nukleinsäuren, die amplifiziert und
nachgewiesen werden sollen, können
aus zahlreichen Quellen, einschließlich Plasmiden und natürlich auftretender
DNA oder RNA aus jeder Quelle (wie zum Beispiel Bakterien, Hefen,
Viren, Pflanzen, höheren
Tieren oder Menschen) erhalten werden. Sie kann aus verschiedenen Geweben,
einschließlich,
jedoch nicht begrenzt auf Blut, periphere Blut-mononukleare Zellen
(PBMC), Gewebematerial oder anderen im Stand der Technik bekannten
Quellen, unter der Verwendung von bekannten Verfahren extrahiert
werden. Die vorliegende Erfindung ist besonders für die Amplifikation
und den Nachweis von einer oder mehrerer Nukleinsäuresequenzen
geeignet, die in genomischer DNA, bakterieller DNA, Pilz DNA, viraler
DNA oder DNA oder RNA, die in bakteriell oder vital infizierten
Zellen gefunden wird.
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Das hier beschriebene Verfahren kann
dazu verwendet werden, Zielnukleinsäuren zu amplifizieren und nachzuweisen,
die mit infektiösen
Erkrankungen, genetischen Erkrankungen und zellulären Erkrankungen,
wie zum Beispiel Krebse assoziiert sind. Es kann auch für forensische
Untersuchungen und die DNA-Typisierung verwendet werden. Es ist
besonders für
den Nachweis von infektiösen
Agentien, wie zum Beispiel Bakterien und Viren, durch den Nachweis
der damit assozierten Nukleinsäuren
brauchbar. Es weist eine besondere Brauchbarkeit auf, wenn eine
sehr hohe Sensitivität
und/oder Quantifizierung erforderlich ist.
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Bakterien, die durch die vorliegende
Erfindung nachgewiesen werden können,
schließen
ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Bakterien, die im menschlicher
Blut gefunden werden, wie zum Beispiel Salmonella-Spezies, Streptococcus-Spezies,
Chlamydia-Spezies, Gonococcen-Spezies, Mycobakterien-Spezies (wie zum
Beispiel Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium avium-Komplex),
Mycoplasma-Spezies (wie zum Beispiel Mycoplasma, Haemophilus influenzae
und Mycoplasma pneumoniae), Legionella pneumophila, Borrelia burgdorferii,
Pneumocyctis carinii, Clostridium difficile, Campylobacter-Spezies,
Yersinia-Spezies, Shigella-Spezies und Listeria-Spezies. Viren,
die nachweisbar sind, schließen
ein, sind jedoch nicht beschränkt
auf, Cytomegalovirus, Herpes Simplex Virus, Epstein Barr Virus,
menschliche Papilloma-Viren, Influenzaviren, Hepatitisviren und
Retroviren (wie zum Beispiel HTLV-I, HTLV-II, HIV-I und HIV-II).
Protozoen-Parasiten, Hefen und Schimmelpilze sind durch die vorliegende
Erfindung auch nachweisbar. Andere nachweisbare Spezies wären einem
Fachmann im Stand der Technik leicht ersichtlich.
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Ein "PCR-Reagenz" betrifft jedes der für die PCR
als wesentlich angesehene Reagentien, nämlich ein Set von Primem für jede Zielnukleinsäure, eine
DNA-Polymerase, einen DNA-Polymerase Cofaktor und ein oder mehrere
Desoxyribonukleosid-5'-triphosphate
(dNTP's). Andere
optionelle Reagentien und Materialien, die in der PCR verwendet
werden, sind unten beschrieben.
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Der Begriff "Primen" betrifft ein Oligonukleolid, ob natürlich vorkommend
oder synthetisch hergestellt, das in der Lage ist, als ein Startpunkt
der Synthese zu dienen, wenn unter Bedingungen gebracht, in denen die
Synthese eines Primen-Verlängerungsprodukts
induziert wird, daß zu
einem Nukleinsäurestrang
(gemeint ist, Templat) komplementär ist, wobei solche Bedingiungen
die Anwesenheit von anderen PCR-Reagentien und geeigneter Temperatur
und pH einschließen.
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Die Primen der vorliegenden Erfindung
werden so ausgewählt,
um "im wesentlichen
komplementär" zu der spezifischen
Nukleinsäuresequenz,
die geprimed und amplifiziert werden soll, zu sein. Dies bedeutet, daß sie ausreichend
komplementär
sein müssen,
um mit den jeweiligen Nukleinsäuren
zu hybridisieren, um die gewünschten
hybridisierten Produkte zu bilden und dann durch eine DNA-Polymerase
verlängbar
zu sein. Typischerweise wird ein "im wesentlichen komplementärer" Primer mindestens
70% oder mehr Basen enthalten, die mit der Zielsequenz komplementär sind Weiter
bevorzugt sind 80% der Basen komplementär und noch weiter bevorzugt
sind 90% der Basen komplementär.
In den am meisten bevorzugten Situationen weisen die Primer zwischen
90% und 100% exakter Komplementarität zu der Zielnukleinsäuresequenz
auf.
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Der Primer ist für die maximale Effizienz bei
der Amplifikation bevorzugterweise einzelsträngig kann jedoch eine doppelstiängige Region
enthalten, falls dies gewünscht
wird. Er muß lang
genug sein, um die Synthese von Verlängerungsprodukten in der Anwesenheit
der DNA-Polymesse zu starten. Die genaue Größe jedes Primers wird in Abhängigkeit
von der vorhergesehenen Verwendung, der Konzentration und der Sequenz des
Primen, der Komplexität
der Zielsequenz, der Reaktionstemperatur und der Quelle des Primers
variieren. Im allgemeinen werden die in dieser Erfindung verwendeten
Primer von 12 bis 60 Nukleotide aufweisen, und bevorzugterweise
weisen sie von 16 bis 40 Nukleotide auf. Am meisten bevorzugt weist
jeder Primer von 18 bis 35 Nukleotide auf.
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Hier brauchbare Primer können unter
der Verwendung von bekannten Techniken und Ausrüstung hergestellt weiden, einschließlich zum
Beispiel eines ABI DNA Synthesizers (erhältlich von Applied Biosystems) oder
einem Biosearch 8600 Serie oder 8800 Serie Synthesizer (erhältlich von
Milligen-Biosearch, Inc.). Verfahren zur Verwendung dieser Ausrüstung sind
gut bekannt und zum Beispiel in U.S. Patent Nr. 4,965,188 (Gelfand
et al.) beschrieben. Aus biologischen Quellen isolierte natürlich auftretende
Primer können
auch brauchbar sein (wie zum Beispiel Restriktions-Endonukleaseverdaus).
Ein Set von mindestens zwei Primern wird im allgemeinen für jede Zielnukleinsäure verwendet.
Daher kann eine Vielzahl von Sets von Primern gleichzeitig verwendet
werden, um eine Vielzahl von Zielnukleinsäuren zu amplifizieren.
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Wie hier verwendet ist eine "Sonde" ein Oligonukleotid,
das zu einer Nukleinsäuresequenz
der Zielnukleinsäure
im wesentlichen komplementär
ist und das dazu verwendet wird, die amplifizierte Zielnukleinsäure nachzuweisen
oder zu fangen.
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Die in der vorliegenden Erfindung
verwenden Primen und/oder Sonden können gegebenenfalls markiert
sein. Unter der Verwendun von im Stand der Technik bekannten Verfahren
können
die Primer und/oder Sonden mit einem spezifischen Bindungsliganden
(wie zum Beispiel Biotin), einem Enzym (wie zum Beispiel Glucoseoxidase,
Peroxidasen, Urikase und alkalischer Phosphatase), Radioisotopen,
Elektronen-dichten Reagenzien, Chromogenen, Fluorogenen, phosphoreszenten
Gruppen oder Ferritin markiert werden. Bevorzugterweise ist der
Marken ein spezifischer Bindungsligand. Weiter bevorzugt ist der
Marker Biotin oder ein Derivat davon, Streptavidin oder ein Derival
davon oder ein Hapten.
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Zusätzliche für die PCR erforderlichen PCR
Reagenzien schließen
eine DNA-Polymerase (bevorzugterweise eine thermostabile DNA Polymesse),
einen DNA-Polymerase Cofaktor und geeignete dNTP's ein. Diese Reagenzien können einzeln
zur Verfügung
gestellt werden, als Teil eines Testkits oder in Reagenzkammern
von Testvorrichtungen. Eine DNA-Polymerase ist ein Enzym, das Desoxynukleosidmonophosphatmole küle an das
3'-Hydroxyende des
Primers in einem Komplex von Primer und Templat hinzufügen wird,
wobei diese Hinzufügung
auf eine Templat-abhängige
Weise erfolgt. Im allgemeinen schreitet die Synthese von Verlängerungsprodukten
in der 5'- zur 3'-Richtung des neu
synthetisierten Stranges fort, bis die Synthese abgebrochen wird.
Brauchbare DNA-Polymerasen schließen zum Beispiel, E. coli DNA-Polymerase
I, T4 DNA-Polymerase,
Klenow-Polymerase, reverse Transkripase und andere im Stand der
Technik bekannte ein. Bevorzugterweise ist die DNA-Polymerase thermostabil,
was bedeutet daß sie
gegenüber
Hitze stabil ist und bevorzugterweise bei höheren Temperaturen aktiv ist,
insbesondere den hohen Temperaturen, die für das Primen und der Verlängerung
von DNA-Strängen
verwendet werden. Genauer gesagt, sind thermostabile DNA-Polymerasen bei den
hohen Temperaturen, die bei den hier beschriebenen Polymerase-Kettenreaktionen
verwendet werden nicht wesentlich inaktiv. Solche Temperaturen werden
in Abhängigkeit
einer Zahl von Reaktionsbedingungen variieren, einschließlich pH,
Nukleotidzusammensetzung, Länge
der Primer, Salzkonzentration und anderen em Stand der Technik bekannten
Bedingungen.
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Eine Zahl von thermostabilen DNA-Polymerasen
wurden im Stand der Technik berichtet, einschlißlich denjenigen, die genauer
in U.S. Patenten Nm 4,965,188 (Gelfand et al.) und 4,889,818 (Gelfand
et al.) erwähnt wurden.
Besonders brauchbare Polymerasen sind diejenigen, die aus verschiedenen
Thermus bakteriellen Spezies erhalten wurden, wie zum Beispiel Thermus
aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus filiformis und Thermus
flavus. Andere brauchbare thermostabile Polymerasen werden aus verschiedenen
mikrobiellen Quellen erhalten, einschließlich Thermococcus literalis,
Pyrococcus furiosus, Thermotoga sp. und denjenigen, die in WO-A-89/06691
(veröffentlicht
am 27. Juli 1989) beschrieben wurden. Einige brauchbare thermostabile
Polymerasen sind käuflich
erhältlich,
wie zum Beispiel AppliTaq®, Tth und UlTmaTM von Perkin Elmer, Pfu von Stratagene und
Vent und Deep-Vent von New England Biolabs. Eine Zahl von Techniken
sind auch zur Isolierung von natürlich-auftretenden
Polymerasen aus Organismen und zur Herstellung von genetisch bearbeiteten Enzymen
unter der Verwendung von rekombinanten Techniken bekannt.
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Ein DNA-Polymerase Cofaktor betrifft
eine nicht-Proteinverbindung, von dem das Enzym für seine
Aktivität
abhängig
ist. Daher ist das Enzym ohne die Anwesenheit von Cofaktor katalytisch
inaktiv. Eine Zahl von Materialien sind bekannte Cofaktoren, einschließlich, jedoch
nicht begrenzt auf Mangan und Magnesiumsalzen, wie zum Beispiel
Chloride, Sulfate, Acetate und Fettsäuresalze. Magnesiumchloride
und Sulfate sind bevorzugt.
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Auch für die PCR benötigt werden
zwei oder mehr Desoxyribonukleosid-5'-triphosphate, wie zum Beispiel zwei
oder mehr von dATP, dCTP, dGTP, dTTP und dUTP. Analoga, wie zum
Beispiel dITP und 7- Deaza-dGTP
sind ebenfalls brauchbar. Bevorzugterweise werden die vier herkömmlichen
Triphosphate (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) zusammen verwendet.
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Die hier beschriebenen PCR Reagenzien
werden in der PCR in geeigneten Konzentrationen zur Verfügung gestellt
und verwendet, um eine Amplifikation der Zielnukleinsäure zur
Verfügung
zu stellen Die minimalen Mengen von Primem, DNA-Polymerase, Cofaktoren
und Desoxyribonukleosid-5'-triphosphaten,
die für die
Amplifikation erforderlich sind, und die geeigneten Bereiche jedes
dieser sind im Stand der Technik gut bekannt. Die minimale Menge
von DNA-Polymerase beträgt
im allgemeinen mindestens ungefähr
0,5 Einheiten/100 μl
von Lösung,
wobei von ungefähr
2 bis ungefähr
25 Einheiten/100 μl
von Lösung
bevorzugt ist und von 7 bis ungefähr 20 Einheiten/100 μl an Lösung am
meisten bevorzugt ist Andere Mengen können für bestimmte Amplifiktionsszsteme
sein. Eine "Einheit" wird hier als die
Menge von Enzymaktivität
definiert, die erforderlich ist, um 10 nM von Gesamtnukleotiden
(dNTP's) in eine
sich verlängernde
Nukleinsäurekette
in 30 Minuten bei 74°C
zu inkorporieren. Die minimale Menge von Primer ist mindestens ungefähr 0,075 μM, wobei von
ungefähr
0,1 bis ungefähr
2 μM bevorzugt
sind, jedoch sind andere Mengen im Stand der Technik gut bekannt
Der Cofaktor ist im allgemeinen in einer Menge von ungefähr 2 bis
ungefähr
15 mM vorhanden. Die Menge von jedem dNIP beträgt im allgemeinen von ungefähr 0,25
bis ungefähr
3,5 mM.
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Die PCR-Reagenzien können einzeln
hinzugefügt
werden oder in verschiedenen Kombinationen oder alle in einer gepufferten
Lösung,
die einen pH im Bereich von ungefähr 7 bis ungefähr 9 aufweist,
unter der Verwendung jedes geeigneten Puffers, von denen viele im
Stand der Technik bekannt sind.
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Andere Reagenzien, die in der PCR
verwendet werden können,
schließen
zum Beispiel Antikörper,
die für
die thermostabile DNA-Polymesse spezifisch sind, Exonukleasen und/oder
Glycosylasen ein Antikörper können dazu
verwendet werden, die Polymerase vor der Amplifikation zu inhibieren.
In der vorliegenden Erfindung brauchbare Antikörper sind für die thermostabile DNA-Polymerase
spezifisch, inhibieren die enzymatische Aktivität der DNA-Polymerase bei Temperaturen
von unterhalb 50°C
und werden bei höheren
Temperaturen deaktiviert. Brauchbare Antikörper schließen monoklonale Antikörper, polyklonale
Antikörper
und Antikörperfragmente
ein. Bevorzugterweise ist der Antikörper monoklonal. Die in der
vorliegenden Erfindung brauchbaren Antikörper können unter der Verwendung von
bekannten Verfahren, zum Beispiel denjenigen, die in Harlow et al.,
Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1988) beschrieben
sind, hergestellt werden.
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Repräsentative monoklonale Antikörper sind
in U.S. Patent Nr. 5,338,671 (Scalice et al.) beschrieben. Zwei
solche monoklonale Antikörper
werden durch einen Fachmann unter der Verwendung von herkömmli chen
Verfahren und Ausgangsmaterialien, die jede der Hybridomzellinien
HB 11126 oder 11127, hinterlegt bei der American Type Culture Collection
(ATCC) (Rockville, MD) einschließt, leicht erhalten. Der monoklonale
Antikörper
ist in einer Menge von ungefähr
5 : 1 bis ungefähr
500 : 1 molaren Verhältnis
zu der DNA-Polymerase vorhande.
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Zu der thermostabilen DNA-Polymerase
spezifische Antikörper
können
in der vorliegenden Erfindung allein oder in Kombination mit einer
Exonuklease und/oder einer Glycosylase verwendet werden, wie in
EP A-0 726 324 beschrieben.
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Die kombinierte Verwendung eines
Antikörpers,
einer Exonuklease und einer Glycosylase verringert die Bildung von
Null-Zyklus-Artefakten. Geeignete Exonukleasen zur Verwendung in
der PCR schließen
ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Exonuklease III, Exonuklease
I, Exonuklease, T7 Exonuklease, Ribonuklease II, Polynukleotidphosphorylase
und BAL 31 Nuklease. Solche Exonukleasen sind kommerziell erhältlich oder können durch
im Stand der Technik bekannte Verfahren erhalten werden. In der
vorliegenden Erfindung brauchbare Glycosylasen sind diejenigen,
die spezifisch unkonventionelle Basen spalten, d. h. Basen anders als
A, G, C oder T in DNA und A, G, C und U in RNA. Bevorzugte Glycosylasen
schließen
Uracil-N-Glycosylase (UNG), Hypoxanthin-DNA-Glycosylase und 3-Methyladenin-DNA-Glycosylasen
I und II ein. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Taq-Polymerase,
ein monoklonaler Antikörper
gegen Taq-Polymerase, Exonuklease III und Uracil-N-Glycosylase verwendet.
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Eine Zielnukleinsäure (entweder DNA oder RNA)
kann von jeder einer Vielzahl von Quellen, wie oben angegeben, erhalten
werden. Im allgemeinen wird die Probe auf irgendeine Weise behandelt,
um die DNA zum Kontakt mit den Primern und anderen PCR-Reagentien
verfügbar
zu machen. Dies bedeutet gewöhnlicherweise
das Entfernen von nicht erwünschten
Proteinen und zellulärer
Materie aus der Probe unter der Verwendung eines der zahlreichen
Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind.
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Da die zu amplifizierende und nachzuweisende
Nukleinsäure
oft in doppelsträngiger
Form vorliegt, müssen
die zwei Stränge
getrennt werden (gemeint ist, denaturiert), bevor ein Primen und
die Amplifikation stattfinden kann. Die Denaturierung kann unter
der Verwendung allein einer Hitzebehandlung oder in Kombination
mit jeden anderen geeigneten physikalischen, chemischen oder enzymatischen
Mitteln zur Trennung der Stränge,
wie im Stand der Technik beschrieben, erreicht werden. Die anfängliche
Denaturierung wird im allgemeinen durch Erhitzen der Probe, von
der vermutet wird, daß sie
die Zielnukleinsäure
enthält,
auf eine erste Temperatur von ungefähr 85°C bis ungefähr 100°C für eine geeignete Zeit, zum
Beispiel von ungefähr einer
Sekunde bis drei Minuten durchgeführt.
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Die denaturierten Stränge werden
dann auf eine Temperatur zum Primen der Stränge abgekühlt, die im allgemeinen im
Bereich von ungefähr
55°C bis
ungefähr
70°C beträgt. Die
zum Abkühlen
der Stränge
nach der anfänglichen
Denaturierung erforderliche Zeit wird in Abhängigkeit des Typs von Apparat,
der für
den PCR-Prozeß verwendet
wird, variieren.
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Sobald die denaturierten Stränge auf
die zweite Temperatur abgekühlt
sind, werden die denaturierten Stränge zusammen mit dem Reaktionsgemisch,
das die PCR-Reagenzien enthält,
bei einer geeigneten Temperatur inkubiert, um ein Annealing (Hybridisieren)
der Primer an die Stränge
und die Verlängerung
der Primer zu bewirken, um Primer-Verlängerungsprodukte zu bilden.
Im allgemeinen ist diese Temperatur mindestens ungefähr 50°C und liegt
bevorzugterweise im Bereich von ungefähr 62°C bis ungefähr 75°C. Die Zeit für die Inkubation
kann in Abhängigkeit
von der Inkubationstemperatur und der Länge der gewünschten Verlängerungsprodukte
abhängen,
in bevorzugten Ausführungsformen
liegt sie jedoch von ungefähr
1 bis ungefähr
120 Sekunden. Jeder Zyklus von PCR kann unter der Verwendung von
entweder zwei oder drei verschiedenen Temperaturen durchgeführt werden,
eine für
die Denaturierung und eine zweite oder dritte Temperatur zum Primen
und/oder der Primer-Verlängerungsproduktbildung.
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Zu jedem Punkt nach der Erzeugung
von mindestens einem Primer-Verlängungsprodukt
kann die Amplifikation gestoppt werden und das Zielprimer-Verlängerungsprodukt
(das "amplifizierte" Ziel) nachgewiesen weden.
Jedoch, falls die hybridisierten Primer-Verlängerungsprodukte dann denaturiert
werden, kann die PCR weiter in so vielen Zyklen von Primen, Verlängerung
und Denaturierung fortgeführt
werden, wie gewünscht. Die
Zahl von durchgeführten
PCR-Zyklen wird teilweise von der gewünschten Menge an amplifizierten
Ziel abhängen
und kann leicht durch den Fachmann im Stand der Technik bestimmt
weden. Im allgemeinen werden mindestens 20 Zyklen durchgeführt, wobei
von 20 bis 50 Zyklen bevorzugt sind.
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Wenn mehrere Zielnukleinsäuren amplifiziert
weden, insbesondere in Fällen
wo eines der Ziele ein Ziel niedriger Kopienzahl ist und ein anderes
ein Ziel hoher Kopienzahl ist, kann ein zweiter Renaturierungsschritt durchgeführt werden,
nachden die primären
PCR-Zyklen durchgeführt
wurden, wie in EP-A-0 694 617 beschrieben.
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Nach mindestens 15 primären Amplifikationszyklen
(wobei ein primärer
Amplifikationszyklus Denaturierung, Primen und Verlängerung
umfaßt)
werden sekundäre
Amplifikationszyklen durchgeführt,
die dieselben Schritte aufweisen, mit der Ausnahme, daß ein Renaturierungsschritt
nach jedem Denaturierungsschritt und vor den Primer-Annealing eingeschlossen
wird. Die Renaturierung wird durch Abkühlen des Reaktionsgemisches
auf eine vierte Temperatur erreicht, wie in EP-A-0 694 617 beschrieben.
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In der vorliegenden Erfindung wird,
nachdem die Zielnukleinsäure
unter der Verwendung der gewünschten
Zahl von PCR-Zyklen amplifiziert wurde, ein post-Amplifikations-,
prä-Nachweis-Inkubationsschritt durchgeführt, um
die DNA-Polymerase zu inaktivieren und dadurch die Nachweissensitivität zu erhöhen. Die Bedingungen,
unter denen der post-Amplifikations-Inkubationsschritt durchgeführt wird,
werden von dem verwendeten thermostabilen Enzym anhängen, jedoch
werden die kombinierte Temperatur und die Inkubationszeit so sein,
um das Enzym zu inaktivieren. Bevorzugterweise wird der post-Amplifikations-Inkubationsschritt durch
Inkubieren des PCR-Amplifikationsgemisches, das das amplifizierte
Ziel enthält,
bei einer Temperatur von zwischen ungefähr 105°C und ungefähr 120°C für zwischen ungefähr einer
Sekunde und ungefähr
30 Minuten durchgeführt.
Bevorzugterweise schließt
der post-Amplifikations-Inkubationsschritt ein Erhitzen bei einer Temperatur
von zwischen 105°C
und 110°C
für 15
Sekunden bis 10 Minuten ein, weiter bevorzugt bei einer Temperatur
von ungefähr
105°C für bis zu
5 Minuten.
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Sobald die post-Amplifikationsinkubation
durchgeführt
wurde, können
die amplifizierten Nukleinsäureziele
nachgewiesen werden. Der Nachweis kann auf eine Zahl von bekannten
Wegen erreicht werden, wie zum Beispiel denjenigen beschrieben in
U.S. Patent Nr. 4,965,188 (Gelfand et al). Zum Beispiel können die
amplifizierten Nukleinsäuren
unter der Verwendung von Southern Blotting, Dot-Blot-Techniken oder
nicht isotopischem Oligonukleotid-Fangnachweis mit einer markierten
Probe nachgewiesen werden. Alternativ kann die Amplifikation unter
der Verwendung von Primern durchgeführt werden, die geeignet markiert
sind, und die amplifizierten Primer-Verlängerungsprodukte können unter
der Verwendung von Verfahren und Ausrüstustung zum Nachweis des Markers
nachgewiesen werden.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
wird die amplifizierte Zielnukleinsäure unter der Verwendung einer
Oligonukleotidsonde nachgewiesen, die für den Nachweis markiert ist
und direkt oder indirekt mit dem amplifizierten Ziel hybridisiert.
Die Sonde kann löslich
sein oder an einem festen Träger
angebracht sein. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform
ist einer oder mehrere der Primer, die dazu verwendet werden, die
Zielnukleinsäure
zu amplifizieren markiert, zum Beispiel mit einer spezifischen Bindegruppe.
Das sich ergebende Primer-Verlängerungsprodukt,
in das der markierte Primer inkorporiert wurde, kann mit einer Sonde gefangen
werden. Der Nachweis des amplifizierten Ziels, hybridisiert an die
Sonde, kann durch Nachweisen der Anwesenheit der markierten Sonde
oder des markierten amplifizierten Ziels unter der Verwendung von
geeigneter Nachweistechnik und Verfahren erreicht werden, die im
Stand der Technik gut bekannt sind. Bestimmte Marker können für das Auge
ohne die Verwendung von Nachweisausrüstung sichtbar sein.
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In einer weiter bevorzugten Ausführungsform
ist einer oder mehrere der für
die Amplifikation der Zielnukleinsäure verwendeten Primer mit
Biotin markiert, und die biotinylierten amplifizierten Zielnukleinsäuren werden
an Sonden hybridisiert, die an einen festen Träger angebracht sind. Die gebundenen
Ziele werden dann durch in Kontakt bringen dieser mit einem Streptavidin-Peroxidasekonjugat
in Anwesenheit eines Oxidans, wie zum Beispiel Wasserstoffperoxid
und einer geeigneten Farb-bildenden Zusammensetzung nachgewiesen.
Zum Beispiel schließen
brauchbare Farbe zur Verfügung
stellende Reagenzien Tetramethylbenzidin und Derivate davon ein
und Leukofarbstoffe, wie zum Beispiel Triarylimidazol-Leukofarbstoffe,
wie beschrieben in U.S. Patent Nr. 4,089,747 (Bruschi).
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Wie hier in Bezug auf Zeit verwendet,
betrifft der Ausdruck "ungefähr" ±10% der Zeitgrenze. Wenn
in Bezug auf Temperaturen verwendet, betrifft der Begriff "ungefähr" ±5°C.
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Die folgenden Beispiele sind enthalten,
um die Durchführung
dieser Erfindung zu verdeutlichen und nicht dazu gedacht, auf irgendeine
Weise begrenzt zu sein. Alle Prozentwerte sind pro Gewicht, wenn
nicht anders angegeben.
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BEISPIELE
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Materialien
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Rekombinante DNA-Polymerase von Thermus
aquaticus wurde unter der Verwendung von bekannten Verfahren, wie
zum Beispiel denjenigen beschrieben in EP-A-0 482 714, hergestellt
und wies eine Aktivität
von ungefähr
250.000 Einheiten/mg an Protein auf.
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Die in den folgenden Beispielen verwenden
Primer wiesen die folgenden Sequenzen auf:
5'-CACCACGCAGCGGCCCTTGATGTIT-3' (SEQ ID NO: 1),
5'-TGCACTGCCAGGTGCTTCGGCTCAT-3'-(SEQ ID NO: 2).
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Die Fangprobe wies die folgende Sequenz
auf:
5'-GAACCGAGGGCCGGCTCACCTCTATGTTGG-3' (SEQ ID NO: 3).
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Die in den folgenden Beispielen verwendeten
Primer und Sonden wurden unter der Verwendung von bekannten Ausgangsmaterialien
und Verfahren unter der Verwendung eines Applied Biosystems Model
380B, drei Säulen
DNA-Synthtesizers unter der Verwendung von Standard-Phosphoramiditchemie
und dem ABI 1 μM
Maßstab
Schnell-Zyklusprotokoll hergestellt. Nukleosid-3'-phosphoramidite und Nukleosid-derivatisierte kontrollierte
Porenglasträger
wurden von Applied Biosystems erhalten. Die Primer wiesen die oben
angegebenen Sequenzen auf. Sie wurden am 5'-Ende mit zwei Aminotetraethylenglycol-Spacem
gemäß U.S.-Patent
Nr. 4,962,029 funktionalisiert, gefolgt von einem einzelnen käuflich erhältlichen
DuPont Biotin Phosphoramidit. Die Proben wurde am 3'-Ende mit zwei Tetraethylenglycol-Spacem
funktionalisiert, gefolgt von einer einzelnen Aminodiol-Verbindungsgruppe
gemäß U.S. Patent
Nr. 4,914,210. Alle Reinigungen wurden unter der Verwendung einer
Nukleinsäure-Reinigungssäule durchgeführt, gefolgt
durch reverse Phase HPLC-Techniken Desoxyribonukleotide (dNTP's) wurden von Sigma
Chemical Co. erhalten.
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Eine Streptavidin-Peroxidasekonjugatlösung wurde
verwendet, die ein kommerziell erhältliches (Sigma Chemical Co.)
Konjugat von Streptavidin und Rettichperoxidase, Casein (0,5%) und
Merthiolat (0,5%) in einer Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung (24
mM Natriumphosphat und 75 mM Nartiumchlorid) umfaßte. 10 mM
4'-Hydroxyacetanilid
wurde als ein Konjugatstabilisator hinzugefügt. In den Beispielen 1 und
2 war die finale Konjugatkonzentration 1,1 nM. In Beispiel 3 war
die finale Konjugatkonzentration 0,28 nM.
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Cytomegalovirus, Stamm AD 169 DNA,
wurde von Applied Biotechnology Inc. erhalten. Kurz gesagt wurde
die DNA von menschlichen Vorhaut-Fibroblastenzellinien unter der
Verwendung von herkömmlichen Verfahren
extrahiert: Virus-Chargen-Spezifikationen
| Virus | Cytomegalovirus,
Stamm AD 169 |
| Zellinie
zur Anzucht | Menschliche
Vorhaut-Fibroblasten |
| Virus-Herstellung | Saccharose-Dichtegradient-gereinigt,
1000-fache Konzentration |
| Virus-Partikelzahl | 1,65 × 1010 vp/ml bei 1000-mal |
| TCID50 Titer auf aktiven Virus | 107 TCID50 Einheiten/ml
bei 1000-mal |
DNA-Extrakt-Spezifikationen
| Volumen | 0,1
ml |
| Suspensionspuffer | 10
mM Tris/1 mM EDTA, pH 8,0 |
| Extraktherstellung | SDS,
Proteinase K-Verdau, gefolgt von Phenol/Chloroform-Extraktion und
Ethanol-Präzipitation.
Ein ml von Extrakt präpariert
aus 1 ml gereinigtem Virus. |
| Versand
und Lagerung | 6 × 0,1 ml
versandt, gefroren bei 70°C.
Gelagert bei –20°C oder kälter. |
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Die Leuco-Farbstoffdispersion enthielt
Agarose (0,5%), 4,5-bis(4-Dimethylaminophenyl)-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)imidazol-Leucofarbstoff
(250 μM,
Diethylentriaminpentaessigsäure
(100 μM, 3'-Chlor-4'-hydroxyacetanilid (51 μM), Polyvinylpyrrolidon
(112 mM) und Natriumphosphat, Monobase,1-Hydrat (10 mM) und Wasserstoffperoxid
(H2O2) (8,82 mM).
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Die Waschlösung (pH 7,4) enthielt Natriumchlorid
(373 mM), (Ethylendinitrolo)tetraessigsäure-Dinatriumsalz (2,5 mM), Decylnatriumsulfat
(38 mM) und Ethylcerithiosalicylsäure, Natriumsalz (25 mM) in
Natriumphosphat, Monobase 1-Hydratpuffer (25 mM).
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Monoklonale Antikörper wurden in dem Reaktionsgemisch
verwendet. Diese Antikörper "TP1-122" und "TP4-9.2" sind für die DNA-Polymerase
von Thermus aquaticus spezifisch und sind genauer in EP-A-0 726
324, beschrieben.
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Das Polymerase-Kettenreaktionsgemisch
(75 ml) enthielt Tris(hydroxymethyl)aminomethanpuffer (10 mM, pH
8), Kaliumchlorid (50 mM), Magnesiumchlorid (4 mM), dATP, dCTP,
dGTP und dTTP (0,3 mM jeweils), die Primer SEQ ID NO: 1 und SEQ
ID NO: 2 jeweils 0,4 μM),
Typ IV Gelatine (100 mg/ml), Taq-Polymerase
(16 Einheiten/100 μl)
und Glyzerin (9,5%). Ein 50-facher molarer Überschuß (über die Polymerase) von TP1-122 und
ein 5-facher Überschuß von TP4-92
wurden verwendet.
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Die PCR Amplifikation wurde unter
der Verwendung eines automatisierten PCR Prozessors, beschrieben
in U.S. Patent Nr. 5,089,233 durchgeführt.
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Um Fangreagenzien zu bilden, wurden
die Proben kovalent an Polymerpartikel (1 μm durchschnittlicher Durchmesser)
angebracht, die unter der Verwendung von herkömmlichen Emulsionspolymerisationstechniken
aus Poly[styrol-co-3(p-vinyl-benzylthio)propionsäure] (95 : 5 Gewichtsverhältnis, 1 μm durchschnittlicher Durchmesser)
hergestellt wurden. Eine Suspension der Partikel in Wasser wurde
mit 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäurepuffer
(0,1 M, pH 6,0) gewaschen und auf ungefähr 10% Feststoffe suspendiert.
Eine Probe der gewaschenen Partikel (3,3 ml), verdünnt auf
3,33% Feststoffe in dem Puffer (0,1 M, wurde mit 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid
(2,1 ml von 84 mg/ml Wasser) und der Sonde 983 μl von 44,44 OD/ml nanoreines
Wasser) gemischt. Die erhaltene Suspension wurde auf 50°C in einem
Wasserbad für
ungefähr
zwei Stunden mit dazwischenliegendem Mischen und Zentrifugieren
erwärmt.
Die Partikel wurden dann 3-mal mit Tris(hydroxymethyl)aminomethanpuffer
(0,01 M pH 8), der (Ethylendinitrilo)tetraessigsäure-Dinatriumsalz (0,001 M)
enthielt gewaschen und darin auf 4% Feststoffe resuspendiert. Die
Partikel wurden dann in einzelnen Flecken in Clinical Diagnostic's PCR-Beuteln bei
2% Feststoffen plus Leim immobilisiert. Die PCR-Produkte wurden
unter der Verwendung des Clinical Diagnostic's Beutel-Nachweissystem nachgewiesen.
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Andere Reagenzien und Materialien
wurden entweder von käuflichen
Quellen erhalten oder unter der Verwendung von leicht erhältlichen
Ausgangsmaterialien und herkömmlichen
Verfahren präpariert.
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Post-Amplifikations-Inkubationsschritt
vor dem Produktnachweis für
erhöhte
Nachweissensitivität
-
Beispiel l
-
Dieses Beispiel zeigt, daß die vorliegende
Erfindung Nukleinsäureprodukte
nachweist, die unter der Verwendung von PCR hergestellt wurden,
durch Anwenden eines post-Amplifikationsinkubationsschritts, um die
Polymerase zu denaturieren.
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Positive Pools wurden durch Amplifizieren
von CMV-Ziel unter der Verwendung von 40–45 Zyklen des folgenden PCR-Protokolls
erzeugt:
- 1. Denaturierung durch Erhitzen auf
95°C für 15 Sekunden,
und
- 2. Zyklen von Primen und Verlängerung bei 70°C bei 30
Sekunden.
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Die Produktkonzentration wurde durch
die Elektrophorese mit bekannten Konzentrationen von DNA-Standards quantifiziert.
Das so erhaltene post-Amplifikations-PCR-Reaktionsgemisch wurde
dann wie im folgenden beschrieben verwendet.
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Zusätzlich zur Erzeugung des post-PCR-Reaktionsgemisches
wurde ein CMV negativer Produktpool durch Durchführen von PCR-Amplifikation
mit dem PCR-Reaktionsgemisch ohne die Zugabe von CMV DNA-Ziel unter
der Verwendung des oben genannten PCR Protokolls hergestellt.
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Das post-Amplifikations-PCR-Reaktionsgemisch
(10–7 bis
10–8 M)
wurde 1 : 100 bis 1 : 5000 mit CMV negativem Produktpool verdünnt, um
eine finale CMV DNA-Konzentration von 1 × 10–11 M
oder 5 × 10–11 M
zu erhalten. Das verdünnte
post-Amplifikations-PCR-Reaktionsgemisch wurde dann einer post- Amplifikationsinkubation
unterzogen, um die Polymerase zu deaktivieren. Der post-Amplifikations-Inkubationsschritt
wurde für 2
Minuten bei 97°C
oder 100°C
oder für
5 Minuten bei 100°C
durchgeführt.
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Nach der post-Amplifikationsinkubation
wurde das amplifizierte Produkt durch Fangen der Zielnukleinsäuren mit
den Fangreagenzien bei 58°C
für 5 Minuten
innerhalb eines Clinical Diagnostic's PCR Beutels nachgewiesen. Die gefangenen
Produkte wurden dann mit der Streptavidin-Peroxidasekonjugatlösung bei 55°C für 1 Minute
in Kontakt gebracht und inkubiert. Eine Waschung wurde unter der
Verwendung der Waschlösung
für eine
Minute bei 55°C
durchgeführt,
wonach die Farbe zur Verfügung
stellende Zusammensetzung hinzugefügt wurde und es ihr ermöglicht wurde,
für 4 Minuten
bei 40°C
zu inkubieren. Das sich ergebende Signal wurde mit einem Linien-Array-Scanner
abgelesen. Der Scanner bestimmte die Veränderung in der Reflektionsdichte
(ΔDr). ΔDr ist die
Differenz in der Reflektionsdichte zwischen einer anfänglichen
Ablesung vor Beginn der Farbstoffentwicklung und einer finalen Ablesung,
4 Minuten nach Farbentwicklung abgenommen. Der Scannerhintergrund
auf visuell negative Fangperlen reichte von 0,05 bis 0,1 Dr-Einheiten.
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Die folgenden Ergebnisse zeigen,
daß ein
post-Amplifikations-Inkubationsschritt die Nachweissensitivität erhöht:
-
Diese Ergebnisse zeigen, daß ein 5
Minuten post-Amplifikations-Inkubationsschritt bei 100°C die effektive
Nachweisgrenze über
den Hintergrund um mindestens 4-fach und möglicherweise um mindestens 5- fach anhebt Basierend
auf diesen Ergebnissen, insbesondere der Verbesserung durch Erhöhen der
Inkubationsperiode bei 100°C
von 3 Minuten auf 5 Minuten, wurde ein zweites Experiment mit einer
15 Minuten post-Amplifikations-Inkubation
bei 100°C
durchgeführt.
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Beispiel 2
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In diesem zweiten Experiment wurde
die Amplifikation der CMV DNA wie beschrieben in Beispiel 1 durchgeführt. Das
erhaltene post-Amplifikations-PCR-Reaktionsgemisch wurde mit einem
CMV-negativen Produktpool verdünnt
und einer post-Amplifikations-Inkubation unterzogen, um die Polymerase
zu inaktivieren, wie in Beispiel 1 beschrieben. Der post-Amplifikations-Inkubationsschritt
wurde für
15 Minuten bei 100°C durchgeführt. Nach
der post-Amplifikations-Inkubation wurde das amplifizierte Produkt
wie in Beispiel 1 beschrieben nachgewiesen.
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Die folgenden Ergebnisse zeigen,
daß ein
post-Amplifikations-Inkubationsschritt die Nachweissensitivität erhöht:
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Diese Ergebnisse lassen vermuten,
daß ein
Erhöhen
der post-Amplifikations-Inkubationszeit bei 100°C weitere Vorteile mit sich
bringt.
-
Beispiel 3
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Um zu bestimmen, ob ein zusätzlicher
Nachweissensensitivitätsvorteil
durch Erhöhen
der Inkubationstemperatur realisiert werden konnte, wurde die Amplifikation
von CMV DNA wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt und
einer post-Amplifikations-Inkubation bei 100°C oder 103°C unterzogen. Verschiedene Inkubationszeiten
bei 100°C
wurden untersucht. Zusätzlich
wurde dieses Experiment mit einer weniger sensitiven Nachweischemie
durchgeführt,
die eine finale Konjugatkonzentration von 0,028 nM aufwies. Die
Ergebnisse dieses Experiments waren:
-
Diese Ergebnisse zeigen, daß mindestens
eine weitere zweifache Zunahme und möglicherweise eine dreifache
Zunahme durch Erhöhung
der post-Amplifikations-Inkubations-Schrittemperatur von 100°C auf 103°C und ein
Beibehalten der 5-minütigen
Inkubationsperiode erhalten werden kann.
