DE69524560T2

DE69524560T2 - Verfahren zum Einfangen und selektiven Freisetzen von Nukleinsäure

Info

Publication number: DE69524560T2
Application number: DE69524560T
Authority: DE
Inventors: John Wesley Backus; Tobias E. Ekeze; Joanne Hansen Kerschner; David John Sharkey; Richard Calvin Sutton
Original assignee: Johnson and Johnson Clinical Diagnostics Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1994-09-13
Filing date: 1995-09-12
Publication date: 2002-05-29
Anticipated expiration: 2015-09-13
Also published as: EP0726312B1; US5622822A; DE69524560D1; EP0726312A2; JPH08173159A; JP3727692B2; CA2157968A1; CA2157968C; EP0726312A3; ATE210725T1

Description

Gebiet der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer Probe duch Einfangen und selektives Freisetzen von Nukleinsäuren zur Detektion. Insbesondere bezieht sie sich auf ein Verfahren zum Einfangen und Freisetzen von Nukleinsäuren zur anschließenden Bearbeitung Amplifikation. Sie bezieht sich auch auf einen Testkit zur Verwendung in diesem Verfahren.

Hintergrund der Erfindung

Die Technologie zur Detektion geringster Mengen von Nukleinsäuren hat sich in den letzten 20 Jahren stark verbessert, beinhaltend die Entwicklung von hochentwickelten Amplifikationstechniken wie Polymerasekettenreaktion (PCR) (PCR) und Ligasekettenreaktion (LCR). Diese Wissenschaftler haben bereitwillig den Wert von solcher Technologie erkannt, um Krankheiten und genetische Besonderheiten in menschlichen oder tierischen Testproben zu detektieren. Die Verwendung von Sonden und Primern in solcher Technologie basiert auf dem Konzept der Komplementarität, was die Bindung von zwei Strängen von einer Nukleinsäure durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen komplementären Nukleotiden ist (auch bekamt als Nukleotidpaare).
PCR ist ein wesentlicher Vorteil im Stand der Technik, um die Detektion von sehr geringen Konzentrationen einer Zielnukleinsäure zu ermöglichen. Die Details der PCR sind z. B. in US-A-4,683,195 (Mullis et al), US-A-4,683,202 (Mullis) und US-A-4,965,188 (Mullis et al) beschrieben, obwohl es eine rasch expandierende Menge von Literatur auf diesem Gebiet gibt.
Um eine Zielnukleinsäure wirksam zu amplifizieren und zu detektieren ist es im allgemeinen notwendig, diese Nukleinsäure von zellulären und anderen Probentrümmern zu isolieren. Verschiedene Lyseverfahren sind bekannt, beinhaltend Einfrieren, Behandlung mit verdauendem Enzym wie Proteasen (z. B. Proteinase K), Kochen, Verwenden von verschiedenen Datergenzien (s. z. B. U. S. S. N. 178,202, eingereicht am 6. April 1988 durch Higuchi und EP A-0 428 197, veröffentlicht am 22. Mai 1991), Lösungsmittelpräzipitationen und Erhitzungsprotokolle.
Sind die Nukleinsäuren einmal extrahiert, bleibt jedoch manchmal eine Notwendigkeit bestehen, sie von anderen Materialien in dem Lysat zu trennen, aufgrund des Vorhandenseins von Inhibitoren oder interferierenden Agenzien in dem Lysat. Ein Material, das bekannt ist, mit Nukleinsäuren zu komplexieren, ist Polyethylenimin. Es ist verwendet worden, um Nukleinsäuren als Kontaminanten in Verfahren zur Isolierung von Enzymen wie Q-Beta-Replikase (s. US-A-5,141,857 von DiFrancesco) zu präzipitieren. Affinitätssäulen, enthaltend Derivate von Polyethlenimin sind auch hergestellt worden, um Nukleinsäuren zu fangen, wie z. B. in US- A-5,092,992 (Crane et al) beschrieben.
Die reine Verwendung von Polyethylenimin, um Nukleinsäuren zu präzipitieren, ist unzureichend, um Zielanalyte zur Verfügung zu stellen, die für eine weitere Bearbeitung verwendbar sind. Das Präzipitat kann nicht in dieser Form verwendet werden tat das Freisetzen der Nukleinsäuren von denn Präzipitat ist schwer zu erreichen. Darüber hinaus könne die Nukleinsäuren, die an das Polyethylenimin gebunden haben, nicht unter Verwendung herkömmlicher Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Somit entsteht eine Reihe von Problemen beim selektiven Einfangen und Freisetzen Zielnukleinsäuren zur weiteren Bearbeitung und keine fertige Lösung für diese Probleme wird durch bekannte Verfahren vorgeschlagen.
Es bleibt daher ein Bedürfnis bestehen, für ein einfaches und simples Mittel zur Präparation von Nukleinsäuren in einer Probe zur Amplifikation oder anderen Hybridisierungsverfahren.

Zusammenfassung der Erfindung

Die oben genannten Probleme weiden mit einem Verfahren überwunden, das eine Nukleinsäure von einem Lysat zur Verfügung stellt das die Schritte umfaßt:
A) Kontaktierung eines Lysats, das vermutlich eine Nukleinsäure enthält, mit Polyethylenimin in einer ausreichenden Menge, um ein wasserunlösliches Prazipitat von Polyethylenimin mit allen in dem Lysat vorhandenen Nukleinsäuren zu bilden,
B) Trennendes wasserunlöslichen Präzipitats von dem Lysat,
C) Kontaktierung des getrennten, wasserunlöslichen Präzipitats mit einer starken Base, um die Nukleinsäuren von dem Polyethylenimin freizusetzen, und
D) gleichzeitige, mit oder nach Schritt C), Kontakierung der Nukleinsäuren mit einem anionischen, Phosphatestertensid, um die freigesetzten Nukleinsäuren in Lösung zu halten.
Diese Erfindung steift auch ein Verfähren zur Verfügung das die oben beschriebenen Schritte A) bis D) hat, zusammengenommen mit Schritt:
E) Einstellen des pHs von der Lösung enthaltend die freigesetzten Nukleinsäuren, auf ungefähr 6 bis ungefähr 9.
Diese Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Amplifikalion und Detektion einer Zielnukleinsäure zur Verfügung, umfassend:
I) zur Verfügung stellen einer Zielnukleinsäure von einem Lysat verwendend die Schritte von:
A) Kontaktierung eines Lysats, das vermutlich eine Nukleinsäure mit Polyethylenimin in einer ausreichenden Menge enthält, um ein wasserunlösliches Präzipitat von Polyethylenimin mit alle in dem Lysat vorhandenen Nukleinsäuren zu bilden, einschließlich einer Zielnukleinsäure,
B) Trennen des wasserunlöslichen Präzipitats von dem Lysat,
C) Kontaktierung des getrennten wasserunlöslichen Präzipitats mit einer Base, um die Nukleinsäuren von dem Polyethylenimin freizusetzen,
D) gleichzeitig mit oder anschließend an Schritt C), Kontaktierung der freigesetzten Nukleinsäuren mit einen anionischen Phosphatestertensid, um die freigesetzten Nukleinsäuren in Lösung zuhalte, und
E) Einstellen des pHs der Lösung, enthaltend die freigesetzten Nukleinsäuren, auf von ungefähr 6 bis ungefähr 9,
II) Amplifikation der Zielnukleinsäure unter den freigesetzten Nukleinsäuren, und
III) Detektion der amplifizierten Zielnukleinsäure.
Weiterhin ein Testkit zur Amplifikation einer Zielnukleinsäure, umfassend, einzeln verpackt:
a) ein Amplifikationsreaktionsgemisch, umfassend ein oder mehrere Amplifikationsreagenzien,
b) Polyethylenimin, und
c) ein anionisches Phosphatestartensid.
Die vorliegende Erfindung biete ein schnelles, einfaches und wirksames Verfähren zur selektiven Isolierung und zur Verfügungstellung von Nukleinsäuren zur weiteren Bearbeitung wie Hybridisierungstests oder Amplifikationsverfahren. Diese Erfindung überwindet die oben erwähnten Probleme in Verbindung mit der herkömmlichen Verwendung von Polyethylenimin durch zur Verfügung stelle eines Mittels zum Freisetzen eingefangener Nukleinsäuren von Polyethylenimin und in Dispersion halten der Nukleinsäuren, so daß sie nicht mit den Polyethylenimin erneut komplexieren. Das Verfahren der Probenpräparation dieser Erfindung ist nicht mühsam und benötigt ein Minimum von Schritten. Es kann normalerweise innerhalb von 15 Minuten durchgeführt werden (bevorzugt innerhalb von 10 Minuten). Es vermeidet organische Lösungsmittel, verwendet in herkömmlichen Verfähren und verbraucht relativ günstige Reagenzien.
Während das Polyelhylenimin eine nützliche Funktion zum Einfangen von Nukleinsäuren in einer Probe bietet, können die Nukleinsäuren nicht verwendet weiden, wenn sie mit Polyethylenimin komplexiert sind. So wird das Präzipitat von Nukleinsäuren und Polyethylenimin mit einer starken Base in Verbindung gebracht, um die Nukleinsäuren freizusetzen. Um die freigesetzten Nukleinsäuren in Lösung zu halten, werden sie mit einer ausgewählten Klasse von Tensiden, nämlich anionische Phosphatestern, bei einem hohen pH kontaktiert. Im allgemeinen muß der pH dann gesenkt werden, so daß die Nukleinsäuren in irgendeiner Art und Weise verwende weiden können. Das Tensid hält die Nukleinsäuren in Losung, selbst bei erniedrigtem pH.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 veranschaulicht einige der in Beispiel 1 unten erhaltenen Daten in Form eines Balkendiagramms.
Fig. 2 veranschaulicht die in Beispiel 2 unten erhalten Daten in Form eines
Fig. 3 veranschaulicht die in Beispiel 3 unten erhaltenen Daten in Form eines
Fig. 4 veranschaulicht die in Beispiel 5 unten erhaltenen Daten in Form eins Balkendiagramms.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung ist insbesondere zur Extraktion und Detektion von einer oder mehreren zu Zielnukleinsäuren geeignet, vorhanden in einer Probe jeglichen Typs gesammelt von Pflanzen, Tieren, Menschen oder der Umgebung. Die so erhaltenen Nukleinsäuren können weiterhin detektiert werden, indem sie herkömmlichen Hybridisierungstests unterworfen werden, wobei diese Verfahren im Stand der Technik wohl bekamt sind (z.B. US-A-4,994,373, unter Bezugnahme auf die Hybridisierungstechnologie hierin aufgenommen).
Jedoch wird um der Kürze Willen die verbleibende Diskussion auf bevorzugte Ausführungsformen gerichtet sein, wobei die Nukleinsäuren Amplifikationsverfahren, insbesondere PCR, unterworfen wurden. Jedoch soll der Umfang dieser Erfindung nicht darauf beschränkt sein, da andere Amplifikationstechniken (wie LCR) auch verwendet werden können.
Die allgemeinen Prinzipien und Bedingungen zur Amplifikalion und Detektion von Nukleinsaüren, unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion, sind relativ gut bekannt die Details derselben werden in verschiedenen Referenzen zur Verfügung gestellt, einschließlich US-A-4,683,195 (Mullis et al), US-A-4,683,202 (Mullis), US-A-4,965,188 (Mullis et al) und WO-A-91/12342. Die vermerkten US-Patente weiden hierin als Referenz aufgenommen. Im Hinblick auf die Lehre im Stand der Technik und der spezifischen hierin zur Verfügung gestellten Lehre, sollte ein Fachmann keine Schwierigkeiten bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung durch Kombinieren des Probenaufarbeitungsverfahrens dieser Erfindung mit Polymerasekettenreationsverfahren haben.
Andere Amplifikationsverfahren, die in der Praxis dieser Erfindung verwendet werden können, beinhalten Ligasekettenreaktion, wie z. B. in EP-A-0 320 308 (veröffentlicht im Dezember 1987) und EP-A-0 439 182 (veröffentlicht im Januar 1990) beschrieben ist.
Testproben können zelluläre oder virale Materialen, Haar, Körperflüssigkeiten oder andere Materialien, die Nukleinsäuren enthalten, umfassen. Die Zielnukleinsäure kann aus jeder geeigneten Quelle aus Mensch, Tier, Zellkultur, Mikroben, Viren, Pflanzen oder Umwelt extrahiert werden
Bakterien, die detektiert werden können, umfassen, sind aber nicht darauf limitiert Bakterien, die in Blut gefunden werden, Salmonella spp, Streptococcus spp, Neisseria ssp., Mycobacterium spp. (wie Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium avium-Komplex), Mycoplasma spp. (wie Mycoplasma pneumoniae), Legionella pneumophila, Borrelia burgdorferei, Pneumocystis carinii, Clostridium difficile, Campylobacter spp., Yersinia spp., Shigella spp. und Listeria monocytogenes. Viren, die detektierbar sind, um fassen, sind aber nicht darauf limitiert, Herpes simplex Viren, Epstein Barr Virus, Cytomegalovirus, humane Papilomaviren, Influenzaviren, Respiratory Syncytial Virus, Hepatitisviren und Retroviren (wie HTLV-I HTLV-II, HIV1 und HIV2). Protozoische Parasiten und Pilze (einschließlich Hefen und Schimmel) sind auch detektierbar. Andere detektierbare Spezies würden für den Fachmann sofort offensichtlich wenden. Die Erfindung ist insbesondere nützlich zur Detektion des Vorhandenseins von Nukleinsäuren, assoziiert mit verschiedenen Bakterien oder Viren.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Erfindung zur Isolierung, Amplifikation und Detektion von Nukleinsäuren in Verbindung mit HIV1, HIV2, proviralem HIV1, proviralem HIV2, Cytomegalovirus, human Papillomavirus, Mycobacterium spp., Hepatitisviren oder humangenetischen Krankheiten nützlich.
Vor Kontaktieren mit Polyethylenimin können die Nukleinsäuren aus der Probe in jeder geeigneten Art und Weise exrtahiert werden. Verschieden Lyseverfahren sind im Stand der Technik bekannt, einschließlich in denen, beschrieben bei Laute et al in The Lancet, pp. 538-540 (3. September 1988), Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp. 280-281 (1982), Gross-Belland et al in Eur. J. Biochem., 36, 32 (1973) und US-A-4,965,188 (oben erwähnt). Extraktion von DNA aus Gesamtblut oder Komponente desselben sind z. B. in EP A-0 393 744 (veröffentlicht am 24. Oktober 1990) und US-A 5,231,015 (Cummins et al) beschrieben, wobei das Cummins et al-Patent hierin als Referenz aufgenommen wird.
Während das jeweilige Lyseverfahren für die Praxis dieser Erfindung nicht kritisch ist, beinhaltet ein bevorzugtes Lyseverfahren das Erhitzen der Probe in Gegenwatt eines geeignete nicht ionischen Tensids, von denen eine Anzahl im Stand der Technik wohl bekannt ist. Ein charakteristisches Lyseverfahren ist im Beispiel 5 unten beschrieben.
Das Lysat wird dann mit Polyethylenimin gemischt, um mindestens 0,005 Gewichtsprozent Endkonzentration zur Verfügung zu stellen Polyethylenimin kann aus einer Anzahl kommerzieller Quellen bezogen weiden. Diese Menge ist im Allgemeinen ausreichend, um ein wasserunlösliches Präzipitat mit den gesamten Nukleinsäuren zu bilden, die in dem Lysat vorhanden sind, wobei die Nukleinsäuren aus dem Lysat präzipitiert werden. Natürlich würde ein Fachmann wissen, wie die Menge von Polyethylen- imin einzustellen ist, um sich jeder Menge von Nukleinsäuren anzupassen. Bevorzugt ist die Endkonzentration von Polyethylenimin in der Lösung von ungefähr 0,01 bis ungefähr 1 Gewichtsprozent. Das Durchmischen kann in jeder geeigneten Form für bis zu 30 Minuten und jeder geeigneten Temperatur durchgeführt werden (im Allgemeinen von 15 bis 35ºC).
Das Präzipitat kann von dem Lysat, wenn erwünscht, bevor es mit einer starken Base durchgemischt wird, entfernt um Inhibitoren oder Störsubstanzen oder zelluläre Trümmer zu entfernen oder die Nukleinsäuren zu konzentrieren. Zum Beispiel kann das Lysat, das das Präzipitat enthält, zentrifugiert werden und der Überstand verworfen werden.
Die eingefangenen Nukleinsäuren werden vom dem wasserunlöslichen Präzipitat durch Kontaktierung des Präzipitats mit einer starken Base freigesetzt (oder dekomplexiert). Mit einer starken Base ist eine Base gemeint die in der Lage ist, einen Lösungs-pH auf mindestens 10 (bevorzugt mindestens 11) ansteigen zu lassen. Solche umfassen, sind aber nicht darauf limitiert, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Lithiumhydroxid, Ammoniumhydroxid und andere organische oder inorganische Basen, die für einen Fachmann leicht offensichtlich werden würden. Die Menge der verwendeten starken Base würde leicht für einen Fachmann ersichtlich sein, in Abhängigkeit von der Stärke der Base und dem Volumen der Lösung. In der Praxis dieser Erfindung ist Natriumhydroxid bevorzugt.
Das Durchmischen mit der starken Base kann unter Verwendung jedes geeigneten Mischmittels für eine geeignete Zeit (im allgemeinen mindestens 1 Minute) und bei einer geeigneten Temperatur (im allgemeinen von ungefähr 15 bis ungefähr 35ºC) durchgeführt werden, was für den Fachmann leicht ersichtlich sein würde. Das erhaltene Gemisch hat im allgemeinen bei einen pH größer als oder gleich 11.
Eines oder mehrere Tenside einer spezifischen Klasse von Verbindungen werden verwende, um die Nukleinsäuren in Lösung zu halten. Dieses Tensid kann gleichzeitig mit den Präzipitat vermischt werden, während die starke Base zugefügt wird, aber bevorzugt wird das Tensid zugefügt, nachdem die starke Base Zeit hatte, die Freisetzung von Nukleinsäuren zu bewirten.
Die geeigneten Tenside sind wasserlösliche, anionische, nicht aromatische Phosphatester. Solche Stoffe können von verschiedenen kommerziellen Quellen bezogen den, einschließlich DuPont unter dem Markennamen ZONYLTMFSP und Witco Corp. unter dem Markennamen EMPHOSTM. Die Materialien, zur Verfügung stehend als ZONYLTMFSP und EMPHOSTMPS413 anionische Tenside sind kennzeichnend, wobei das Erstere bevorzugt wird.
Noch genauer sind die verwendeten Tenside nicht aromatische, fluorierte Phosphatester oder nichtaromatische, nichtfluorierte oxylalkylierte Alkylphosphatester (einschließlich Mono- und Diester) und entsprechende Salze.
Im allgemeinen haben nichtaromatische fluorierte Phosphatester mindestens eine perfluoroaliphatische Gruppe (das ist eine CnF2n+1 Gruppe) und bevorzugt sind die meisten aliphatischen Gruppen in dem Moleküle perfluorniert wie bei ZONYLTMFSP anionischen Tensid. Eine allgemeinere Struktur von einigen dieser Verbindungen ist
[(RfQa)nZ]mM&spplus;(3m-mn)
wobei Rf ein fluoroaliphatisches Radikal mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen ist, Q ist eine multivalente Verbindungsgruppe wie Alken, Sulfonamidoalken, Carbonamidoalken und äquivalente Kohlenwasserstoffgruppen, mit bis zu 10 Kohlenstoff- und Heteroatomen in der Kette, Z ist Phosphat, M&spplus; ist ein Alkalimetall (wie Natrium oder Kalium) oder Ammoniumkation, m ist 1 oder 2 und a ist 0 oder 1. M kann andere monovalente Kationen sein, was für den Fachmann leicht ersichtlich sein würde.
Die Ester können in From eines Alkalimetall-, Ammonium- oder Alkylammoniumsalzes verwendet werden.
Ein bevorzugter anionischer fluorierter Phosphatester, verwendbar in dieser Erfindung, ZonylTMFSP anionisches Tensid, das die Struktur hat:
[F(CF&sub2;-CF&sub2;)&sub3;&submin;&sub8;CH&sub2;CH&sub2;]1,2-OP(O)(OM)2,1,
wobei M ein Kation ist, wie oben definiert.
Die Endkonzentration von anionischem perfluoriertem Phosphatester, verwendet an dieser Stelle ist, in der Lösung im allgemeinen mindestens ungefähr 0,05 Gewichtsprozent, wobei von ungefähr 0,1 bis ungefähr 1,5 Gewichtsprozent bevorzugt werden. Die Menge kann mit einem gegebenen Tensid und der Menge von Polyethylenimin und Nukleinsäuren, die in der daraus resultierenden Lösung vorhanden sind, variieren. Einige Tenside können am besten bei Konzentrationen arbeiten, bei denen andere Tenside unwirksam sind. Es wurde herausgefunden, daß das Tensid die Nukleinsäuren davor bewahrt, mit den Polyethylenimin erneut zu komplexieren und sie dadurch für weitere Behandlung bei abgesenktem pH zur Verfügung hält. Die Menge von in dieser Weise freigesetzten und gelösten Nukleinsäuren wird natürlich von der Konzentration der Nukleinsäuren und des vorhandenen Polyethylenimins, der Menge an verwendetem Tensid und der Zeit und Temperatur beim Durchmischen abhängen. Wird vermutet, daß die Zielnukleinsäure in einer sehr geringen Menge vorhanden ist, würde ein Fachmann diese Tatsache berücksichtigen, um verschiedene Bedingungen zum Durchmischen und Mengen an Reagenzien zu wählen.
Das Durchmischen der freigesetzten Nukleinsäuern und dem Tensid kann für eine geeignete Zeit (im allgemeinen mindestens 1 Minute) und bei einer geeigneten Temperatur (im allgemeinen von ungefähr 15 bis ungefähr 35ºC) durchgeführt werden, was für einen Fachmann leicht ersichtlich sein würde.
Die erhaltene Lösung enthaltend freigesetzte Nukleinsäuren, hat einen hohen pH, so daß ihr pH im allgemeinen für die weitere Behandlung wie wirksame Amplifikation oder Hybridisierungstests angepaßt wird. Die Anpassung des pHs wird typischerweise durch Mischen der Lösung mit einer geeigneten Menge eines geeigneten Puffeis wie Tris(hydroxmethyl)aminomethanydrochlorid und anderen erreicht, was für einen Fachmann leicht ersichtlich sein würde. Der pH des Endgemisches ist im allgemeinen im Bereich von ungefähr 6 bis ungefähr 9.
Dieser Schritt kann sofort durchgeführt werden oder er kann bis zu einem späteren Zeitpunkt verzögert werden, wobei die freigesetzten Nukleinsäuren hohem gelagert werden.
Die beschriebenen Verfahren dieser Erfindung zum Einfangen und Freisetzen von Nukleinsäuren dieser Erfindung werden typischerweise innerhalb von ungefähr 15 Minuten und bevorzugt innerhalb von ungefähr 10 Minuten durchgeführt.
Das hierin durch Definieren von Mengen und Zeiten (es sei denn, es ist anders vermerkt) verwendete modifizierenden Wort "ungefähr", bezieht sich auf eine Varianz von ±10% der angegebenen Werte. Beim Bestimmen des pHs bezieh sich "ungefähr" auf ±0,5 pH-Einheit.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf die Amplifikation oder Detektion von einer oder mehreren spezifischen Nukleinsäuresequenzen gerichtet, vorhanden in einer oder mehreren Zielnukleinsäuren, die unter Verwendung des oben beschriebenen Vefahrens eingefangen und freigesetzt wurden. Darüber hinaus kann eine Vielzahl von Zielnukleinsäuren gleichzeitig unter Verwendung eines korrespondierenden Sets von Primern und Detektionsmitteln für jede spezifische Nukleinsäure amplifiziert und detektiert werden Multiple Sequenzen in derselben Nukleinsäure können auch amplifiziert und detektiert werden.
Ein "PCR-Reagenz" bezieht sich auf jedes der Reagenzien, die für die PCR als wesentlich erachtet werden, nämlich ein Set von Primern für jede Zielnukleinsäure, eine DNA-Polymerase, einen DNA- Polymeasekofaktor und zwei oder mehrere Deoxyribonucleosid-5'-Triphosphate (dNTP's).
Wie hierin unter Bezugnahme auf Primer oder Sonden verwendet bezieht sich der Begriff "Oligonukleotid" auf ein Molekül, umfassend vier oder mehr Deoxyribonukleotide oder Ribonukleotide und bevorzugt mehr als 10. Ihre genaue Größe ist nicht entscheidend, aber hängt von vielen Faktoren einschließlich der endgültigen Verwendung oder Funktion des Oligonukleotids ab. Das Oligonukleotid kann durch jedes im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden.
Der Begriff "Primer" bezieht sich auf ein Oligonukleotid, ob natürlich vorkommend oder synthetisch hergestellt, welches in der Lage ist, als ein Startpunkt der Synthese zu dienen, wenn es unter Bedingungen plaziert wird, unter denen die Synthese von einem Primerverlägerungsprodukt, komplementär zu einem Nukleinsäurestrang (das ist die Mairitze) veranlaßt wird. Solche Bedingungen umfassen das Vorhandensein von Nukleotiden (wie die vier Standarddeoxyribonukleosid-5'-Triphosphate), einer DNA-Polymerase und einem DNA-Polymerasekofaktor und geeigneter Temperatur und pH. Normalerweise sind solche Bedingungen im Stand der Technik als "hochstringente" Bedingungen bekannt, so daß nichtspezifische Amplifikalion minimiert wird. Der Primer muß lang genug sein, um die Synthese von Verlängerungsprodukten bei Anwesenheit einer DNA-Polymerase zu initiieren. Die genaue Größe von jedem Primer wird in Abhängigkeit von der in Erwägung gezogenen Verwendung, der Komplexität der Zielsequens, Reaktionstemperatur der Quelle der Primer variieren. Im allgemeinen haben die in dieser Erfindung verwendeten Primer von 10 bis 60 Nukleotide.
Hierfür verwendbare können von einer Reihe von Quellen erhalten weiden oder unter Verwendung bekannter Techniken und Ausrüstung, einschließlich z. B. eines ABI DNA Synthesizer (zu Beziehen von Applied Biosystems) oder einem Biosearch 8600 Serie oder 8800 Serie Synthesizer (zu Beziehen von Millingen- Biosearch, Inc.) und bekannte Verfahren für ihre Verwendung (z. B. wie beschrieben in US-A-4,965,188), hergestellt weiden. Natürlich vorkommende Primer, isoliert aus biologischen Quellen, sind auch verwendbar (wie Restriktionsendonukleaseverdaus). Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Primer" auch auf ein Gemisch von Primern. Somit kann jedes Set von Primern für eine gegebene Zielnukleinsäure zwei oder mehr Primer für jede entgegengesetzen Zielstrang umfassen.
Ein oder beide Primer könne mit derselben oder verschiedenen Markierung zur Detektion oder Einfangen von amplifizierten Produkten markiert werden. Verfahren zum Anbringen von Markierungen und Herstellen von Primern ist im Start der Technik gut bekannt z. B. wie bei Agrawal et al, Nucleic Acid Res., 14, pp. 62275 (1986), US-A-4,914,210 (Levenson et al) bezogen auf Biotinmarkierungen, US-A-4,962,029 (Levenson et al) bezogen auf Enzymmarkierungen und die hierin erwähnten Referenzen beschrieben Nützliche Markierungen beinhalten auch Radioisotope, elektronendichte Reagenzien, Chromogene, Flurogene, phosphoreszierende Komponenten, Ferritin und andere magnetische Partikel (s. US-A-4,795,698 von Owen et al und US- A-4,920,061 von Poynton et al), chemilumineszente Komponenten (wie Luminol) und andere spezifisch bindende Spezies (Avidin, Streptavidin, Biotin, Zucker oder Lektine). Bevorzugte Markierungen sind Enzyme, Radioisotope und spezifisch bindende Spezies (wie Biotin). Verwendbare Enzyme umfassen Glukoseoxidase, Peroxidasen, Urikase, alkalische Phosphate und andere im Stand der Technik bekannte und können an Oligonukleotide unter Verwendung bekannter Verfähren angeheftet werden. Reagenzien, um ein colorimetrisches oder chemilumineszentes Signal mit solchen Enzymen zur Verfügung zu stellen, sind gut bekannt.
Im Falle, daß die Markierung ein Enzym wie eine Peroxidase ist, können an einem bestimmten Punkt des Tests Wasserstoffperoxid und geeignete farbstoffbildende Zusammensetzungen zugefügt werden, tun einen detektierbaren Farbstoff zur Verfügung zu stellen. Zum Beispiel umfassen verwendbare Reagenzien, die einen Farbstoff zur Verfügung stellen, Tetramethylbenzidin und Derivate desselben und Leukofarbstoffe wie wasserunlösliche Triarylimidazolleukofarbstoffe (wie beschrieben in US-A-4,089,747 von Bruschi) oder andere Verbindungen, die reagieren, um einen Farbstoff bei Anwesenheit von Peroxidase und Wasserstoffperoxid zur Verfügung zu stellen Insbesonders nützliche Verbindungen, die einen Farbstoff zur Verfügung stellen, sind in EP-A-0 308 236 (publiziert am 22. März 1989) beschrieben Chemilumineszente Signale als Antwort auf eine Peroxidasemarkierung können auch unter Verwendung der entsprechenden Reagenzien erzeugt werden.
Sind einer oder beide Primer biotinyliert kann die amplifizierte Nukleinsäure unter Verwendung detektierbar markierten Avidins oder eines Äquivalents desselben (wie Steptavidin) detektiert weiden. Zum Beispiel kann Avidin mit einem Enzym konjugiert weiden oder ein Radioisotop unter Verwendung bekannter Technologie tragen. Das Bit auf dem ampilfizierten Produkt komplexiert mit dem Avidin und geeignete Detektionstechniken, um ein radioaktives, colorimetrisches oder chemiliumineszentes Signal zu detektieren werden verwendet.
Wie hierin verwendet, ist eine Einfang-"Sonde" ein Oligonukleotid, das im wesentlichen komplementär zu einer Nukleinsäuresequenz von einem oder meinen Strängen der Zielnukleinsäure ist und das vewendet wird, um die amplifizierte Nukleinsäure unlöslich zu machen. Das Sondenoligonukleotid ist im allgemeinen an ein geeignetes wasserunlösliches Substrat wie ein Polymer oder Glaskugeln, Mikrotiterplattenwell, dünner Polymer- oder Zellulosefilm oder andere Materialien, leicht für den Fachmann ersichtlich, gebunden. Das Oligonukleotid ist im allgemeinen von ungefähr 12 bis ungefähr 40 Nukleotide lang, obwohl die Länge nicht entscheidend ist.
Eine DNA-Polymemse ist ein Enzym, das die Deoxynukleosidmonphosphatmoleküle an das 3'- Hydroxyende des Primers in einem Komplex von Primer und Template anfügt, wobei diese Addition in einer Matritzen-abhängigen Art und Weise geschieht (das bedeutet, in Abhängigkeit von den spezifischen Nukleotiden der Matritze). Viele verwendbare DNA-Polymerasen sind im Stand der Technik bekannt. Bevorzugt ist die Polymerase "thermostabil", was bedeutet, daß sie gegenüber Hitze stabil ist, insbesondere bei hohen Temperatu ren, die zur Denaturierung von DNA Strängen verwendet werden. Insbesondere werden die thermostabilen DNA-Polymerasen durch die hohn Temperaturren, die in der hier beschriebenen PCR verwendet werden, im wesentlichen nicht inaktiviert.
Eine Anzahl von thermostabilen DNA-Polymerasen sind im Stand der Technik dargestellt worden, einschließlich solcher, genannt im Detail in US-A-4,965,188 (oben erwähnt) und US-A-4,889,818 (Gelfand et al), die hierin durch Referenz aufgenommen werden Insbesonders nützliche Polymerasen sind solche, gewonnen von verschiedenen Thermus-Bakterienspezies, wie Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus fliformis oder Thermus flavus. Andere verwende thermostabile Polymerasen sind von einer Rehe von anderen mikrobien Quellen gewonnen worden, einschließlich Thermococcus literalis, Pyrococcus furiosus, Thermotoga sp. und solche wie in WO-A-89/06691 (veröffentlicht am 27. Juli 1989) beschrieben worden sind. Einige nützliche Polymerasen stehen kommerziell zur Verfügung. Eine Anzahl von Techniken zur Isolierung natürlich vorkommender Polymerasen von Organismen und zur Produktion genetisch veränderter Enzyme unter Verwendung rekombinanter Techniken, wie in diesem Abschnitt erwähnten Stand der Technik, ist bekannt .
Ein DNA-Polymerasekofaktor bezieht sich auf eine nichtproteinöse Verbindung, von der das Enzym für seine Aktivität abhängig ist. Eine Anzahl von Materialien, die als Kofaktoren bekannt sind, beinhalten Mangan- und. Magnesiumsalze. Verwendbare Kofaktoren umfassen, sind aber nicht darauf begrenzt, Mangan- und Magnesiumchloride, Sulfate, Acetate und Fettsäuresalze (113. Salze der Buttersäure, Capronsäure, Caprylsäue, Caprinsäure und Laurinsäure). Die kleineren Salze, das sind Chloride, Sulfate und Acetate, sind bevorzugt.
Für PCR werden auch zwei oder mehre Desoxyribonucleosid-5'-Triphosphate benötigt, wie dATP, dCTP, dGTP, dUTP oder dTTP. Im allgemeinen weiden dATP, dCTP, dGTP und dTTP zusammen in der PCR verwendet. Analoga wie dTTP und 7 Deaza-dGTP sind auch verwendbar.
Auch verwendbar in der Erfindung ist ein Antikörper, spezifisch für die DNA Polymerase, wobei der Antikörper die enzymatische Aktivität bei Temperaturen unter ungefähr 50ºC inhibiert, aber dieser Antikörper bei höheren Temperaturen deaktiviert wird. Stellvertretende monoklonale Antikörper, die diese Eigenschaften haben, sind in US-A 5,338,671 (Scalice et al) ben tut wen und werden hierin durch Referenz aufgenommen. Antikörperfragmente können anstelle des ganzen Moleküls verwendet werden wen sie äquivalente Eigenschaften aufweisen.
Die hierin beschriebenen PCR-Reagenzien werde zur Verfügung gestellt und für die PCR in geeigneten Konzentrationen verwendet, um die Amplifikation der Zielnukleinsäure bereitzustellen. Die minimalen Mengen der DNA Polymerase sind im allgemeinen mindestens ungefähr 1 Unit/100 ul der Lösung, wobei von ungefähr 4 bis ungefähr 25 Units/100ul bevorzugt werden. Eine "Unit" ist hierin definiert als die Menge von Enzymaktivität, notwendig, tun 10 nMol der gesamten Nukleotide (dNTP's) in eine sich aufbauende Nukleinsäurekette in 30 Minuten bei 74ºC einzubauen. Die Konzentration jedes Primers ist mindestens ungefähr 0,075 umolar, wobei von ungefähr 0,2 bis ungefähr 1 umolar bevorzugt werden. In den meisten Fälle sind alle Primer in ungefähr der gleichen Menge vorhanden (mit einer Variation von jeweils 10%). In anderen Fällen jedoch können die Mengen der einzelnen Primer verändert werden, um die wirksamste Koamplifikation von multiplen Mairitzen zu erreichen. Der Kofaktor ist im allgemeinen in einer Menge von ungefähr 1 bis ungefähr 15 mmolar vorhanden und jedes dNTP ist im allgemeinen von ungefähr 0,1 bis ungefähr 3,5 mmolar in dem Reaktionsgemisch vorhanden. Wie in diesem Abschnitt verwendet, bezieht sich der modifizierende "ungefähr" auf eine Varianz von ±10% des angegebenen Werts.
Die PCR Reagenzien können einzeln zugegeben weiden oder in eine gepufferte Lösung mit einem pH im Bereich von ungefähr 7 bis ungefähr 9, verwendend jeden geeigneten Puffer.
Da die zu amplifizierende und detektierende Zielnuldeinsäure im allgemeinen in Doppelstrangform vorliegt, müssen die zwei Stränge getrennt werden (das bedeutet denaturiert), bevor das Anlagern der Primer stattfinden kam. Dies kann während des Extraktionsverfahrens stattfinden, aber bevorzugt geschieht es in einem separaten Schütt danach. Das Erhitzen auf eine geeignete Temperatur (hierin bezeichnet als "erste Temperatur" oder T&sub1;) ist ein bevorzugtes Mittel zur Denaturierung. Im allgemeinen befindet sich diese erste Temperatur im Bereich von ungefähr 85 bis ungefähr 100ºC für eine geeignete Zeit z. B. von 1 bis ungefähr 240 Sekunden (bevorzugt 1 bis ungefähr 40 Sekunde). Dieser anfängliche Denaturierugsschritt kann auch in den ersten Amplifikanszyklus hineingenommen weiden. In solchen Fälle kann die Denaturierung in dem ersten Zyklus länger sein (z. B. bis zu 240 Sekunden), wobei spätere Zyklen viel kürzere Denturierungsschritte haben können (z. B. bis zu 30 Sekunden).
An die denaturierten Stränge werden die entsprechenden Primer durch Abkühlen des Reaktionsgemisches auf eine zweite Temperatur, T&sub2; gebunden, die im allgemeinen innerhalb des Bereichs von ungefähr 55 bis ungefähr 75ºC liegt. Es ist erwünscht, daß die Abkühlung so schnell wie möglich stattfindet, aber mit der momentan bekannten Ausrüstung geschieht es in der Regel über einen Zeitbereich von ungefähr 5 bis ungefähr 40 Sekunden und besonders bevorzugt von ungefähr 5 bis ungefähr 20 Sekunden.
Wenn die denaturierenden Stränge abgekühlt sind, wird das Reaktionsgemisch, enthaltend die PCR- Reagenzien, bei einer dritten Temperatur, T&sub3;, im allgemeinen für 1 bis zu ungefähr 120 Sekunden und bevorzugt für 1 bis ungefähr 80 Sekunden inkubiert, um die Bildung von Primerextensionsprodukten zu bewirken. Im allgemeinen liegt die dritte Temperatur im Bereich von ungefähr 55 bis ungefähr 75ºC. Bevorzugt liegt sie im Bereich von ungefähr 62 bis ungefähr 70ºC.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die zweite und die dritte Temperatur gleich und liegen innerhalb des Bereichs von ungefähr 62 bis ungefähr 70ºC. Somit werden das Anlagern der Primer und die Primerextension bevorzugt im selben Schritt ausgeführt.
Somit umfaßt ein Amplifikationszyklus die Denaturierung, das Anbinden (oder Annealing) der Primer und die Primerextensionsschritte, wie oben beschrieben. Im allgemeinen werden mindestens 15 solcher Amplifikationszyklen in der Praxis dieser Erfindung durchgeführt, mit der maximalen Anzahl von Zyklen, die innerhalb des Ermessens der einzelnen Verwender liegt. In den meisten Fällen weiden 15 bis 50 Amplifikationszyklen in dem Verfähren verwendet, wobei 15 bis 40 Zyklen bevorzugt werden. Jeder Amplifikationszyklus dauert im allgemeinen von ungefähr 20 bis ungefähr 360 Sekunden, wobei eine Zykluszeit von ungefähr 30 bis ungefähr 120 Sekunden bevorzugt wird und von ungefähr 30 bis ungefähr 90 Sekunden besonders bevorzugt ist. Jedoch können längere oder kürzere Zykluszeiten verwertet werden, wenn erwünscht.
Wenn unter Bezugnahme auf die Zeit für einen gegebenen Schritt in dem Amplifikationsverfahren der Begriff "ungefähr" verwende wird, bezieht er sich auf ±10% des Zeitlimits. Wird ferner unter Bezugnahme auf Temperaturen der Begriff "ungefährt" verwendet, bezieht er sich auf ±5ºC.
Das Amplifikationsverfahren dieser Erfindung wird bevorzugt in eine kontinuierlichen, automatisieren Weise durchgeführt, so daß das Reaktionsgemisch in einer kontrollierten Weise für eine erwünschte Anzahl dem Temperaturzyklus unterworfen wird. Eine Reihe von Geräten ist zu diesen Zweck entwickelt worden, wie ein Fachmann weiß. Bevorzugt ist das verwendete Gerät auch für jeden Typ des gewünschten Amplifikationszyklus programmierbar.
Ein solches Gerät für diesen Zweck ist im Detail in US-A-4,965,188 und EP-A-0236,069 beschrieb. Im allgemeinen beinhaltet dieses Instrument ein wärmeleitendes Gefäß zur Aufnahme einer Anzahl von Reaktionsgefäßen, enthaltend das Reaktionsgemisch, ein Mittel zum Erhitzen, Abkühlen und Erhalten der Temperatur und ein Computermittel, um Signale zu erzeugen, die die Amplifikationssequenz, Änderungen Temperatur und Zeit kontrolliert.
EP A-0 402 994 stellt Details für nützliche chemikalische Testpackungen zur Verfügung, die unter Verwendung des in US-A-5,089,233 (Devaney, Jr. et al) beschriebenen Geräts verarbeitet werden können, hierin durch Referenz aufgenommen. Ebenfalls sind darin Mittel zum Erhitzen und Abkühlen der Testpackung bei wiederholenden Intervallen (das bedeutet durch Zyklen) beschrieben, geeignet für das Verfahren der vorliegenden Erfindung. Weitere als nützlich erachtete Details der PCR Dur können aus der beträchtlichen Literar in diesem Gebiet bezogen weiden und wären einem Fachmann leicht bekannt.
Abgesehen von den oben beschriebenen chemische Testpackungen kann das Verführen in anderen Behältern durchgeführt werden, wie diese detaillierter in US-A-4,902,624 (Columbus et al), US-A-5,173,260 (Zander et al) und US-A-5,229,297 (Schniplesky et al) beschrieben werden, wobei alle hierin durch Referenz aufgenommen werden und durch jeden geeigneten Behälter, der leicht für einen Fachmann ersichtlich ist. Solche Testpackungen sind auch bekannt als in sich abgeschlossene Testvorrichtungen, die getrennte Kompartimente für verschiedene Reagenzien haben, die im Verfähren nach dieser Erfindung verwendet werden. Diese Kompartimente sind passenderweise miteinander verbunden, so daß Reagenzien und Testlösungen mit dem aufgebrachten Reagenz für eine geeignete Zeit in Kontakt gebracht werden können, ohne die Vorrichtung zu öffnen.
Die Detektion von amplifizierten Produkten kann unter Verwendung jedes bekannten Verfahrens durchgeführt werde, beinhaltend Southern Blot Techniken wie in US-A-4,965,188 (oben erwähnt) beschrieben oder durch Verwendung von markierten Sonden oder Primern, wie im Stand der Technik bekannt.
Alternativ zu den oben beschriebenen Ausführungsformen können die amplifizierten Produkte unter Verwendung eines markierten Oligonukleotids detektiert werden, das komplementär zu einem der Primerextensionsprodukte ist.
In dem heterogen Detektionssystem dieser Erfindung wird das amplifizierte Produkt auf irgend ein wasserunlösliches Substrat aufgebracht und die anderen Materialien in den Reaktionsgemisch in einer geeigneten Weise entfernt, wie durch Filtration, Zentrifugation, Waschen oder andere Trennungstechniken.
Die aufgebrachten Einfangssonden können an wasserunlösliche Träger gebunden werden, verwendend bekannte Bindungstechniken (einschließlich Absorption und kovalente Reaktionen). Eine solcher Techniken ist in EP A-0 439 222 beschrieben (veröffentlicht am 18. September 1991). Andere Techniken sind z. B. in US-A-4,713,326 (Dattagupta et al), US-A4914,210 (Levenson et al) und EP-B-0 070 687 (veröffentlicht am 26. Januar 1983) beschrieben. Verwendbare Trennungsmittel beinhalten Filtration durch Membranen wie Polyamid-Mikroporenmembranen, kommerziell erwerbbar von Pall Corporation.
Jedoch kann jedes verwendbare Trägermaterial eingesetzt werden, um die Einfangsonde und eventuelle Hybridisierungsprodukte zu verankern, einschließlich Mikmtiterplatten, Teshröhrchen, Bechergläser, magnetische oder polymere Partikel, Metalle, Keramiken und Glaswolle, um nur einige zu nennen. Besonders nützliche Materialien sind magnetische oder polymere Partikel, die reaktive Gruppen tagen, verwendbar zur kovaleten Bindung der Einfangsonde. Solche Partikel sind im allgemeinen von ungefähr 0,001 bis ungefähr 10 um groß. Weitete Details über Beispiele von solchen Materialien sind in US-A-497,772 (Sutton et al), US-A- 5,147,777 (Sutton et al), US-A 5,155,166 (Danielson et al) und US-A-4,795,698 (Owen et al) zur Verfügung gestellt die alle hierin durch Referenz aufgenommen wenden.
Die Einfangsonde kann auf einen flachen Träger fixiert werden, wie einen polymeren Film, Membranen, Filterpier oder harzbeschichtetes oder unbeschichtetes Papier. Die auf polymere Partikel fixierte Einfangsonde kann auf solchen flache Trägem auch in geeigneter Weise imobilisiert werden, wie z. B. durch Trockenablagerungen oder durch Hitzefusion oder mit Klebstoffen befestigt werden. Die Einfangsonde kann z. B. auf einen flachen Träger in der in sich selbst abgeschlossenen Testvorrichtung dieser Erfindung fixiert weiden Andere Details über solche Materialien werden in EP A-0 408 738 (veröffentlicht am 23. Januar 1991), WO 92/1669 (veröffentlicht am 1. Oktober 1992) und US-A 5,173,260 (Sutton et al) zur Verfügung gestellt.
Die Eingfangsonde können auf einem geeigneten Träger in jeder Konfiguration, z. B. Reihen von runden Ablagerungen oder Streifen, angeordnet werden.
Die vorliegende Erfindung kann auch dazu verwendet werden, was als "homogene" Amplifikationsverfahren bekannt ist, in denen Zielnukleinsäuren detektiert werden, ohne die Notwendigkeit von Einfangreagenzien. Die Details solcher Tests sind im Stand der Technik bekannt, wie EP A-0 487 218 (veröffentlicht am 27. Mai 1992) und EP-A-0 512 334 (veröffentlicht am 11. November 1992).
Die Zusammensetzung der Amplilikationsreaktion kann als eine individuell verpackte Komponente von einem Testkit, verwendbar für verschiedene Amplifikationstest, enthalten sein. Der Kit kann andere Reagenzien, Lösungen, Ausrüstungen und Anweisungen enthalten, verwendbar in den Verfahren dieser Erfindung beinhaltend Einfangreagenzien, imobilisiert auf einem löslichen Träger, Waschlösungen, Lyselösungen, Detektionsreagenzien und andere Materialien, wie für Fachlee leicht offensichtlich ist. Zusätzlich kann der Testkit separat verpacktes Polyethylenimin wie oben beschrieben enthalten, ein oder mehrere anionische phatestertenside, Puffer, starke Basen und andere Reagenzien, die entweder für Amplifikation oder Probenaufarbeitung oder beides benötigt werden. Der Testkit kann auch ein Testverfahren beinhalten, end ein oder mehrere andere Kitkomponenten. Dieses Testverfahren ist bevorzugt "in sich abgeschlossen", wie der Begriff im Stand der Technik verstanden wird. Andere Testkits können zusammengestellt weiden, die verwendbar für Hybridisierungstests sind, z. B. enthaltend Detektionseinfangsonden für die Zielnuldeinsäure.
Die folgenden Beispiele sind aufgenommen worden, um die Praxis dieser Erfindung darzustellen und sollen in keinster Weise limitierend sein. Alle Prozentangaben sind Gewichtsprozent, es sei denn, es ist anderweitig erwähnt.

Material und Methoden für Beispiele:

Rekombinante DNA Polymerase von Thermus aquticus wurde unter Verwendung herkömmlicher Verfähren hergestellt.
Die folgenden Primer und Sonden wurden unter Verwendung bekannten Startmaterials und Verfahren hergestellt, verwendend einen BIOSEARCHTM Modell 8700 DNA Synthesizer und Standardphosphoramiditchemie, und hat die folgende Sequenzen, komplementär zu der Haupthüllproteinregion der humanen cytomegaloviralen (hCMV)-DNA sind:
SEQ ID: NO: 1
5'-X-CATTCCCACT GACTTTCTGA CGCACGT-3'
SEQ ID: NO: 2
5'-X-TGAGG TCGTG GAACT TGATG GCGT-3'
SEQ ID: NO: 3
5'-GGTCATCGCC GTAGTAGATG CGTAAGGCCT-Y-3'
In den ersten beiden Sequenzen der Primer stellt X eine Biotinkomponente dar, gebunden an die Sequenz durch zwei Tetraethylenglycolabstandhaltereinheiten verwendend die Lehre von US-A-4,914,210 (Levenson et al), hierin durch Referenz aufgenommen. Alle Reinigungen wurden unter Verwendung einer Nukleinsäurereinigungssäule durchgeführt, gefolgt durch Umkehrphasen HPLC-Techniken.
Die dritte Sequenz wurde als eine Einfangsonde verwendet, wobei Y zwei Tetraethylenglykolabstandshalter enthält, verbunden durch eine Phosphatverbindung und eine 3-Amino-1,2-Propandiolkomponente, hergestellt unter Verwendung der Verfahren von Levenson aal des oben erwähnten Patents.
Desoxyribonukleotide (cNTP's) und Kalbsthymus-DNA wurden von Sigma Chemical Co. bezogen.
Der monoklonale Antikörper, spezifisch gegen die beschriebene DNA-Polymerase, wurde wie in US- A-5338,671 (oben erwähnt) beschrieben hergestellt. Im allgemeinen wurde er von den Immunzellen von DNA-Polymerase-immunierten Mäusen unter Verwendung herkömmlicher Verfahren hergestellt, wie diese von Milstein et al, Nature 256, pp. 495-497,1975 beschrieben wurden und Hybridomazellinien (entweder HB 11126 oder 11127 von ATCC), wobei antikörpersekretierende Zelle von dem Wirtstier aus Lymphoidgewebe (wie der Milz) isoliert wurden uni mit SP2/0-Agl4 Myelomazellen aus Maus in Gegenwart von Polyethylenglykol fusioniert wurden, wurden in selektivem Medium verdünnt und in Multiwellgewebekulturschalen ausplattiert. Ungefähr 7 bis 14 Tage später wurden die Hybridomazellen, enthaltend die Antikörper, geerntet unter Verwendung herkömmlicher Techniken gereinigt.
Eine Streptavidinperoxidasekonjugatlösung umfaßte ein kommerziell zur Verfügung stehendes (Zymed Labolatories, Inc.) Konjugat von Streptavidin und Meerrettichperoxidase (126 ul/l), 4'-Hydroxyacetanilid (10 mmolar), Kasein (0,5%) und Merthiolat (0,5%).
Eine Waschlösung (pH 7,4) enthielt Natriumphosphat, einbasisches 1-Hydrat (25 mmolar), Natriumchlorid (373 mmolar), das Natriumsalz der Ethylendinitrilotetraessigsäure (2,5 mmolar), das Natriumsalz der Ethylmercuri-thiosalicylsäure (25 umolar) und Decylnatriumsulfat (38 mmolar).
Die farbstoffbereitstellende Zusammensetzung (pH 6,8) enthielt 4,5 Bis(4-dimethylaminophenyl)-2-(4- hydroxy-3-methoxyphenyl) Imidazol-Leukofarbstoff (250 umolar), Poly(vinylpyrrolidon) (112 mmolar), Wasserstoffperoxid (0,03%), Diethylentriminpentaessigsäure (100 umolar), 3'-Chloro-4'-Hydroxyacetanilid (5 mmolar) und Natriumphosphat einbasisch, 1-Hydrat (10 mmolar).
Die wäßrige Farbstoffsignalstoplösung enthielt 0,1% Natriumazid.
Das Reagenz der Einfangsonde wurde durch Anbinden des oben ausgewiesenen Oligonukleotids der SEQ ID NO: 3 an Partikel aus Poly[styren-co-3-(p-vinylbenzylthio)-Propionsäure] (Gewichtsverhältnis 95 : 5, 1 um Durchschnittsdurchmesser) in folgender Weise hergestellt. Eine Suspension der Partikel in Wasser wurde zweimal mit 2(N-Morpholino)-ethansulfonsäurepuffer (0,1 molar pH 6) gewaschen und auf ungefähr 10% feste Bestandteile suspendiert. Eine Probe (3,3 ml) der gewaschenen Partikel, verdünnt auf 3,33% feste Bestandteile in dem Puffer (0,1 molar), wurde mit 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (2,1 ml von 84 mg/ml Wasser) und der entsprechenden Sonde (22 ul von 44,44 OD/ml nanoreinen Wassers) gemischt. Die entstandene Suspension wurde auf 50ºC im Wasserbad für ungefähr 2 Stunden bei mittlerer Durchmischung erhitzt und zentrifugiert. Die Partikel wurden dreimal mit Tris(hydroxymethyl)aminomethanpuffern (0,01 molar, pH 8) gewaschen, enthaltend das Natriumsalz der Ethylendinitrilotetraessigsäure (0,001 molar) und hierin auf 4% feste Bestandteile resuspendiert.
Eine PCR Reaktionsgemisch umfaßte:
Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid-Puffer (10 mmolar), Natriumchlorid (50 mmolar), Magnesiumchlorid (10 mmolar), Gelatine (100 ug/ml), dATP, dCTP, dGTP und dTTP (jeweils 1 mmolar), Glycerin (9,5%), Primer (0,4 umolar von jedem), DNA-Polymerase wie oben ausgewiesen (16 units/100 ul) und einen monoklonale Antikörper, spezifisch gegen die oben ausgewiesene DNA Polymerase (molares Verhältnis 50 : 1 zur DNA Polymemse).
SURECELLTM Testvorrichtungen sind von Eastman Kodak Company (Clinical Diagnosfies Division) zu beziehen und enthalten drei Testwells, jedes mit einer befestigten LOPRODYNETM Mikroporenmembran (Pall Corp., 5 umeter durchschnittliche Porengröße). Das Reagenz der Einfangsonde winde verteilt und auf den Membranen in den Testwells der Testvorrichtungen getrocknet.
DEQUESTTM 2006 anionisches Ami-tri(methylenphosphorsäure)-pentanatriumsalztensid wurde von Monsato Co. bezogen.
ZONYLTM FSP anionisches fluoriniertes Phosphatestertensid winde von duPont erhalten.
MONAWETTM B-174 anionisches Natriumdiocylphosphosphosuccinattensid wurde von Mona Industries erhalten.
RHODAFACTM L0529 anionisches partielles Natriumsalz von einem aromatischen Alkylenoxidphosphatestertensid wurde von Rhone Poulenc erhalten.
EMPHOSTM CS413 anionisches oxyalkyliertes Alkylphosphatestertensid und EMPHOSTM CS141 anionischer polyoxylalkylierter Alkylarylphosphaytster wurden von Witco Chemical Co. erhalten.
Polyethylenimin wurde von Bethesda Research Laboratories (auch erwerbbar von BASF Corp.) erhalten.
Andere Reagenzien und Materialien wurden entweder aus kommerziellen Quellen bezogen oder unter Verwendung leicht zur Verfügung stehender Startmaterialien und herkömmlicher Verfahren hergestellt.

Beispiel 1

Einfangen und Freisetzen DNA

Dieses Beispiel erläutert die Praxis von der vorliegenden Erfindung zum Einfangen. Einen und Freisetzen einer Nukleinsäure und Verwendung von Polyethylenimin und einem anionischen fluorinierten Phosphatesrertensids.
Eine Probe (5 ul) von einer 1 : 10-Verdünung von 10% 10% Polyethylenimin in destilliertem Wasser wurde mit einer Lösung (95 ul) von Kalbsthymus-DNA (0,5 ug/ul) durch Vortexen gemischt. Das erhaltene Gemisch wurde dann bei 14.000 rpm für 5 Minuten zentrifugiert ein Pellet des sich ergebenden Präzipitats von DNA und Polyethyleniminkomplex zu bilden.
Der Überstand wurde verworfen und Natriumhydroxid (75 ul, 50 mmolar) wurde in das Gefäß hinzugegeben, das das Pellet enthält, und anschließend durch Vortexen vermengt. Der sich ergebende pH war ungefähr 11.
Eine Lösung (10 ul bei 0,5%, 0,25% oder 0,125% Endkonzentration) eines anionischen Tensids (s. Tabelle I) wurde zu dem Gemisch mit hohem pH dazugegeben und duch Vortexen vermengt. Die entstehende Lösung wurde dann auf einen pH von ungefähr 8 durch Zufügen von 15 ul Tris(hydroxmethyl)aminomethanhydrochlorid-puffer (1 molar) neutralisiert.
Das Freisetzen der Nukleinsäuren wurde unter Verwendung herkömmlicher Gelelektorphoresen bestätigt. Ein Aliquot (5 ul) der erhaltenen Lösung enthalten Nukleinsäuren, Polyethylenimin und Tensid wurde mit einem herkömmlichen Probenfarbstoffpuffer in einem Mikrozentrifugationsgefäß gemischt. Eine Probe (4 ul) wurde dann auf ein 0,5%iges herkömmliches Agarosegel, vorgefärbt mit Ethidiumbromid, geladen und die Elektrophorese bei 120 Volt für 30 Minuten durchgeführt Gelbanden wurden unter ultraviolettem Licht sichtbar gemacht. Das Vorhandensein von einer genomischen DNA-Bade, die in einer ähnlichen Weise wandert wie der herkömmliche Lambda DNA-Marker, legte nahe, daß die Nukleinsäuren von dem Polyethylenimin freigesetzt worden waren.
Um zu bestimmen, ob ein Aspekt des vorangegangen Verfahrens zur Probenpräparation die Amplifkation durch PCR inhibieren würde, wurde humane cytomegalovirale (hCMV) DNA zu jeder neutralisierten Probe zugegeben, so präpariert dem PCR Protokoll unterworfen, wie unten dargestellt.
Noch spezifischer wurde ein Aliquot (20 ul) von jeder neutralisierten Probe, enthaltend das anionische Tensid und die freigesetzte Kalbsthymus-DNA, mit einer Lösung (10 ul) der hCMV Zielnukleinsäure von der Haupthüllproteinregion des hCMV Genoms (1 : 10-Verdünnung von einer Vorratslösung, enthaltend 1-5 · 10&sup5; Kopien/ul) vermischt. Ein zweites Aliquot (20 ul) von jeder Probe wurde mit einer 1 : 100 Verdünnung von der Zielnukleinsäure vermischt.
Zu jedem sich ergebenden Gemisch (30 ul) wurde das PCR Amplifikatiosnreaktionsgemisch (70 ul), wie oben ausgewiesen, zugefügt und die Amplifikation für 40 Zyklen unter Verwendung des folgenden Protokolls durchgeführt.
1) Denaturierung bei 95ºC für 30 Sekunden (210 Sekunden für den ersten Zyklus), und
2) Anlagern der Primer und Primerextension bei 64ºC für 30 Sekunden.
Nach der Amplifikation wurden zwei Verfähren zum Detektieren des Vorhandenseins von amplifizierter hCMV-DNA verwendet.
a) Gelelektorphorese: ein Aliquot (10 ul) von jeder amplifizierten Produktlösung wurde zu 4 ul eines herkömmlichen Probenfarbstoffes zugefügt. Das erhaltene Gemisch (10 ul) wurde auf ein 2,5%iges Agarosegel geladen, das mit Ethidiumbromid vorgefärbt worden war. Die Elektrophorese winde für 1,5 Stunden bei 120 Volt durchgeführt. Gelbanden wurden unter ultraviolettem Licht sicht sieht gemacht.
b) Farbstoffsignal im SURECELLTM Testverfahren: eine Pinie (95 ul) einer 1 : 20-Verdünung von jeder amplifizierten Piuduktprobe wurde auf 95ºC für 5 Minuten erhitzt, um die Amplifikationsprodukte zu denaturieren und mit dem Fängerreagenz zu kontaktieren, das auf die Membranen der SURECELLTM Testvorrichtung-Testwells, getrocknet worden war. Die Vorrichtungen wurden dann bei 50ºC für 5 Minuten inkubiert und bei Raumtemperatur mit der oben beschriebenen Waschlösung gewaschen, um ungebundenes Material zu entfernen.
Eine Lösung (100 ul) einer streptavidinkonjugierten Merrettichperoxidase (131 ng/ml) wurde zu jedem Testwell zugefügt, gefolgt von einer zweiminütige Inkubation bei Raumtemperatur. Ein weiteres Waschen wurde durchgeführt, gefolgt vom Hinzufügen der oben beschriebenen Leucofarbstofflösung (100 ul) und einer zusätzlichen zweiminütigen Inkubation bei. Die Fadstoffentwicklung wurde durch Hinzufügen der Natriumazidlösungen gestoppt.
Tabelle I unten zeigt die Ergebnisse der Gelelektrophoresewerteskala und der Farbstoffwerteskala für verschiedene Proben, verwendend verschiedene Mengen mehrerer anionischer Tenside. Es ist offensichtlich, daß ZONYL FSPTM anionisches Tensid die stärksten Signale liefert und die PCR der Zielnukleinsäure nicht inhibiert. Die Farbstoffwerteskala wurden auf einen Dichtegradienten von 0 bis 10 (höchste Dichte) abgestuft. Die elektrophoretischen Werte der Gelskala waren negativ (-), leicht positiv (w+), deutlich positiv (+) und sehr positiv (++).
Es wurden auch verschiedene Amplifikationen durchgeführt, wobei die Verwendung von Polyethylenimin oder dem Tensid unterlassen wurde. Die Ergebnisse dieser Tests sind die letzten vier Linien der Tabelle I. Die letzten zwei Linien zeigen die Ergebnisse, wo kein Tensid oder Polyethylenimin verwende wurde. Während die Signale hoch waren, muß verstanden weiden, daß diese Daten von "sauberen" Proben stammen, die keine Störsubstanzen oder Inhibitoren enthalten. In klinischen Proben würden Inhibitoren oder Störsubstanzen wahrscheinlich solche Signale reduzieren oder die Amplifikation insgesamt verhindern. Es ist deshalb die Absicht dieser Erfindung ein Mittel zur Trennung von Zielnukleinsäuren von solchen ungünstigen Materialien zur Verfügung zu stellen und die Ergebnisse in Tabelle I zeigen, daß die Verwendung von Polyethylenimin und einem fluoriniertem Tensid entsprechend dieser Erfindung diesen Zwack erfüllt.
Fig. 1 veranschaulicht die Farbstoffauswertungsdaten in Form eines Balkendiagramms für die verschiedenen Level von zwei bevorzugten Tensid, EMPHOSTM CS413 und ZONYLTM FSP anionische Tenside. Die hCMV DNA Level waren 1 : 10 (Level 1) und 1 : 100 (Level 2). Die Kontrolldaten wurden in Abwesenheit von beiden Tenside erhalten. Tabelle 1
*: Kein Einfangen der Kalbsthymus-DNA mit Polyethylenimin.

Beispiel 2

Probenpräparation und Amplifikation von humaner cytomegaloviraler DNA

Dieses Beispiel zeigt die Praxis der vorliegenden Erfindung um hCMV-DNA zur Amplifikalion unter Anwesenheit von Hintergrund-DNA, d. h. Kalbsthymus-DNA, einzufangen und freizusetzen.
Proben (10ul) von hCMV-Vabindunngen wurden mit Kalbsthymus DNA (95 ul 0,5 ug/ul) gemischt, gefolgt durch Mischen mit einer 1 : 10-Verdünnung von Polyethylenimin (10%), um ein Präzipitat von Polyethylenimin und den Nukleinsäuren zu bilden.
Dieses Präzipitat wurde von der Lösung durch Zentrifugation bei 14.000 mm für fünf Minuten getrennt. Der Überstand wurde verworfen und dem Pellet wurde durch Mischen Natriumhydroxid (75 ul, 50 mmolar)zugefügt.
Eine Lösung (10ul) von ZONYLTM FSP anionischem Tensid (1,5% 1,0%, 0,5%, 0,25% oder 0,125% Endkonzentration) wurde dann zu dem Gemisch mit hohem pH durch Mischen zugefügt. Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid (15 ul, 1 molar, pH 7,5) wurde dann zum Neutralisieren der Lösung zur Amplifikation zugefügt.
Ein Aliquot (20 ul) von jeder Probe, wie oben beschrieben behandelt, wurde dem PCR- Reagenzgemisch (80 ul) zugefügt, enthaltend die hCMV-Primer wie obenangegeben, und 40 Zyklen der PCR wurden unter Verwendung des in Beispiel 1 oben beschriebenen Protokolls durchgeführt.
Die Detektion von amplifizierten Produkten wurde unter Verwendung sowohl der Gelelektorphorese als auch der Farbstoffsignalerzeugung wie oben in Beispiel 1 beschrieben, ereicht. Tabelle II unten zeigt die Ergebnisse für zwei Wiederholungen von jeder Probe und Fig. 2 zeigt die Farbstoffauswertungsdaten in einem Balkendiagramm.
Die PCR wurde für alle Level von Ziel-hCMV-DNA inhibiert wen 1,5% Tensid (Endkonzetration) verwendet wurden. Darüber hinaus waren die geringen Mengen von 0,125% und 025% nicht verwendbar, da ein hoher Hintergrund beobachtet wurde. Optimale Ergebnisse wunden unter Verwendung von 0,5% oder 1,0% Tensid adelt und die niedrigere Menge war bei den niedrigeren Konzentrationen von Zielnukleinsäure nützlicher. Es wurde in Kontrolltest, wo kein Tensid verwendet wurde, keine PCR beobachtet. Ein Signal wurde erhalten, wenn kein Polyethylenimin oder Tensid verwendet wurden, aber diese Daten wurden mit "sauberen" Proben gewonnen, die keine Störsubstanzen oder Inhibitoren enthalten, welche typischerweise in klinisch Proben vorhanden sind.
In Fig. 2 sind die Farbstoffwerte bei verschiedenen Zielnukleinsäurelevels für das bevorzugte Tensid, ZONYLTM FSP anionisches Tensid, dargestellt Kein Polyethylenimin oder Tensid wurde in dem Kontrolltest verwendet. Die hCMV-Konzentraionslevel, angegeben in Fig. 2 und Tabelle II unten, waren wie folgt:
Level 1: 1 : 10 Verdünnung der Stammlösung
Level 2: 1 : 100 Verdünung der Stammlösung
Level 3: 1 : 1000 Verdünung der Stammlösung
Level 4: 1 : 10.000 Verdünung der Stammlösung
Level 5: 1 : 100.000 Verdünung der Stammlösung
Level 6: 1 : 1.000.000 Verdünung der Stammlösung
Level 7: keine hCMV-DNA Tabelle II

Beispiel 3

Einfangen und Freisetzen von Ziel-hCMV-DNA und Amplifikation in Abwesenheit von Hintergrund DNA

Dieses Beispiel wurde genauso wie in Beispiel 2 beschrieben ausgeführt, mit dem Unterschied, daß die hCMV-DNA-Verdünnungsproben mit einer Pufferlösung (95 ul) enthaltend Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid (10 mmolar, pH 8) und TWEENTM 20 nichtionisches Tensid (0,5%) anstelle der Kalbstymus-DNA-Lösung vermischt worden waren.
Amplifikation und Detektion von der eingefangenen und freigesetzten Ziel-hCMV-DNA wurde wie oben beschrieben duchgeführt. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 und in Tabelle III unten gezeigt. Die darin angegebenen Zielnukleinsäurelevel sind dieselben wie in Beispiel 2 oben beschrieben.
Die Ergebnisse geben zu erkennen, daß die Verwendung von 1,5% Tensid die PCR inhibiert, ebenso wie die Abwesenheit von Tensid. In den meisten Tests war ein Hintergrundlevel zu beobachten, aber das Level war im allgemeinen akzeptabel. Tabelle III

Beispiel 4

Einfangen, Freisetzen und Amplifikation von hCMV-DNA bei Anwesenheit von verschiedenen Mengen von Hintergrund-DNA

Dieses Beispiel verdeutlicht die Prwds dieser Erfindung in der Anwesenheit von verschiedenen Menge von Hintergrund-Kalbsthysmus-DNA in den untersuchen Proben. Die Verfahren wurden exakt so durchgeführt wie in Beispiel 2 oben beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Zielnukleinsäuerverdünnungen mit 95 ul einer Lösung, enthaltend verschiedene Mengen von Kalbsthymus-DNA (55 ug 25 ug 10 ug oder 5 ug Endmengen) vermischt worden waren.
Amplifikation und Detektion wurden wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt (mit der Ausnahme, daß elektrophoretische Gele nicht verwendet wurden). Die Ergebnisse der Farbstoffauswertung sind in Tabelle IV unten dargestellt. Die Ergebnisse deuten an, daß 0,5% Endkonzentration des Tensid ausreichend war, um die Nukleinsäuren gelöst zuhalten, so daß eine optimale Amplifikalion für die gesamte Breite der in den Proben vorhandenen Hintergrund DNA durchgeführt werden konnte. Ergebnisse nach Verwenden niedriger Mengen von Tensid lassen einen hohen Hintergrund erkennen, aber die Bedingungen können angepaßt werden oder ein anderes Tensid wird verwendet, um diesen Effekt zu minimieren. Tabelle IV

Beispiel 5

Einfangen und Freisetzen von Ziel-hCMV-DNA in Patientenproben und Amplifikation

Dieses Beispiel zeigt die Praxis der vorliegenden Erfindung verwendend 9 hCMV-kulturpositive und 3 hCMV kulturnegative Urinproben, erhalten von einem Krankenzentrum. Es vergleicht auch die vorliegende Erfindung mit einem herkömmlich verwenden Verfahren zur Probenpräparation, was das Erhitzen der Probe auf 100ºC für 10 Minuten in Anwesenheit von einem nicht-ionischen Tensid umfaßt.
Zwei Aliquots (jeweils 150 ul) von jeder Urinprobe wurden mit einer Pufferlösung (150 ul), enthaltend TWEENTM 20 nicht-ionisches Tensid (0,5%) in Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochloridpuffer (10 mmolar, pH 8), gemischt.
Die Gemische wurden jeweils für 10 Minuten gekocht. Zu einem Set von Proben wurde eine 1 : 10- Verdünnung einer 10%igen Polyethyleniminlösung zugefügt und durchmischt, um ein Präzipitat von Nukleinsäuren und Polyelhylenimin zu bilden. Die erhaltenen Suspension wurden bei 14.000 rpm für fünf Minuten zentrifugiert. Die Überstände wurden verworfen und Natriumhydroxid (75 ul, 50 mmolar) winde zu jedem Pellt hinzuzugefügt und anschließend durchmischt. Eine Lösung (10 ul) von ZONYLTM FSP anionischem Tensid (0,5% Endkonzentration) wurde zu den Suspensionen mit hohem pH hinzugefügt, und anschließend gevortext. Um die Suspensionen zu neutralisieren, wurde Tris(hydroxymethyl)aminomethan (15 ul, 1 molar, ph 7,5) zugefügt.
Das zweite Set von Proben erfuhr keine weitere Behandlung.
Ein Aliquot (20 ul) von jeder Lösung (für beide behandelter Proben) wurde zu dem PCR- Reaktionsgemisch (80 ul) wie oben beschrieben zugefügt enthaltend die erwähnten hCMV-DNA-Primer. PCR wurde für 40 Zyklen wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt und alle amplifizierten Produkte wurde durch Erzeugen eines Farbstoffsignals (Wert) wie oben beschrieben erzeugt.
Fig. 4 und Tabelle V unten zeigen die Ergebnisse von beiden Verfahren, verglichen mit Kulturergebnissen. Es ist offensichtlich, daß in diesem Beispiel die Erfindung eine Sensitivität von 89% (8 von 9 positiven Kulturen) und eine Spezifität von 100% (3 von 3 negativen Kulturpoben) zeigt, wenn sie mit Kulturergebnissen verglichen wird. Das Verlern zur Kontrollprobenpräparation (Eihitzen mit nicht-ionischem Tensid) zeigt eine Sensitivität von 33% (3 von 9 positive Kulturproben) und eine Spezifität von 100% (3 von 3 negativen Kulturproben), wenn sie mit den Kulturergebnissen verglichen wird. Tabelle V: Urinproben
Dieses Beispiel zeigt den Vorteil der Entfernung von Inhibitoren aus Zielnukleinsäuren, die in klinischen Proben vorhanden sein können. Andere im Stand der Technik verwendete Verfahren können die selben Ergebnisse erzielen, aber in eher mühsameren, zeitraubenden und nicht und nicht umweltschonenden Art.
Die Erfindung ist im Detail unter Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen derselben beschrieben worden, es soll aber verstanden werden, daß Variationen und Modifikationen innerhalb des Geistes und unter den Schutzumfang der Erfindung fallen.

Sequenzprotokoll

(1) ALLGEMEINE ANGABEN

(i) ANMELDER
(A) NAME: Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc.
(B) STRASSE: 100 Indigo Creek Drive
(C) ORT: Rochester
(D) STAAT: New York
(E) LAND: USA
(E) POSTLEITZAHL: 14650-0880
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG:
Verfahren zum Einfangen und selektivem Freisetzen von Nukleinsäuren Verwendung von Polyethylenimin und einem anionischen Phosphatertrotensid und Amplifikation derselben.
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 3
(iv) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
(A) DATENTRÄGER Diskette
(B) COMPUTER. IBM-PC kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, Version 1.3 (EPO)

(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 1:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(a) LÄNGE: 27 Basenpaare
(b) ART: Nukleinsäure
(c) STRAGFORM: Einzelstrang
(d) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: andere Nukleinsäure
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 1:
CATTCCCACT GACTTTCTGA CGCACGT

(2) ANGABEN ZUR SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZKENNZEICHEN:
(A) LÄNGE: 24 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: andere Nukleinsäure
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG. SEQ ID NO: 2:
TGAGGTCGTG GAACTTGATG GCGT

(2) ANGABEN ZUR SEQ ID NO: 3:

c) SEQUENZKENNZEICHEN
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: andere Nukleinsäure
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 3:
GGTCATCGCC GTAGTAGATG CGTAAGGCCT

Claims

1. Verfahren, um eine Nukleinsäure aus einem Lysat zur Verfügung zu stellen, die Schritte umfassend:

A) Kontaktierung eines Lysats, das vermutlich Nukleinsäure enthält, mit Polyethylenimin in einer ausreichenden Menge, um ein wasserunlösliches Präzipitat des Polyethylenimins mit allen im Lysat vorhandenen Nukleinsäuren zu bilden,

B) Abtrennung des wasserunlöslichen Präzipitats vom Lysat,

C) Kontaktierung des abgetrennten wasserunlöslichen Präzipitats mit einer starken Base, um die Nukleinsäuren vom Polyethylenimin zu lösen, und

D) gleichzeitig mit oder anschließend an Schritt C, Kontaktierung der Nukleinsäuren mit einem anionischen Phosphatestertensid, um die freigesetzten Nukleinsäuren in Lösung zu halten.

2. Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend den Schritt E, in dem der pH der Lösung, die die freigesetzten Nukleinsäuren enthält, auf von ungefähr 6 bis ungefähr 9 eingestellt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die starke Base Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Lithiumhydroxid oder Ammoniumhydroxid ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das in Schritt A verwendete Polyethylenimin in einer Menge von ungefähr 0,005 bis ungefähr 1 Gew.-% eingesetzt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Lysat durch Erhitzen einer Untersuchungsprobe in einer Lösung, die ein nicht-ionisches Tensid enthält, erhalten wird.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das in Schritt D verwendete anionische Phosphatestertensid in einer Menge von ungefähr 0,05 bis ungefähr 1,5 Gew.-% eingesetzt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das anionische Phosphatestertensid ein nicht-aromatischer, fluorierter Phosphatester oder ein nichtaromatischer, nicht-fluorierter, oxyalkylierter Alkylphosphatester ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das anionische Phosphatestertensid die Struktur

[F(CF&sub2;-CF&sub2;)&sub3;&submin;&sub8;CH&sub2;CH&sub2;]1,2-OP(O)(OM)2,1

besitzt, wobei M ein Alkalimetall- oder Ammoniumkation ist.

9. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es innerhalb von ungefähr 15 Minuten durchgeführt wird.

10. Verfahren zur Amplifikation und Detektion einer Zielnukleinsäure, umfassend:

I) Bereitstellen einer Zielnukleinsäure aus einem Lysat unter Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 2,

II) Amplifikation einer Zielnukleinsäure aus den freigesetzten Nukleinsäuren, und

III) Detektion der amplifizierten Zielnukleinsäure.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikation eine Polymerasekettenreaktion, katalysiert durch eine thermostabile DNA- Polymerase, ist und mindestens einen markierten Primer benutzt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der markierte Primer mit Biotin markiert ist und die erhaltene, amplifizierte, biotinylierte Zielnukleinsäure durch ihre Reaktion mit einem Konjugat aus Avidin und einem Enzym detektiert wird.

13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet:

daß die starke Base Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Lithiumhydroxid oder Ammoniumhydroxid ist,

daß das Polyethylenimin in Schritt A in einer Menge von ungefähr 0,005 bis ungefähr I Gew.-% eingesetzt wird, und

daß das anionische Phosphatestertensid in Schritt D in einer Menge von ungefähr 0,05 bis ungefähr 1,5 Gew.-% eingesetzt wird, und ein nicht-armomatischer, fluorierter Phosphatester oder ein nicht-aromatischer, nicht-fluorierter oxyalkylierter Alkylphosphatester ist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die starke Base Natriumhydroxid ist, das Polyethylenimin in Schritt A in einer Menge von ungefähr 0,01 bis ungefähr 1 Gew.-% eingesetzt wird, und das anionische Phosphatestertensid in Schritt D im Anschluß an Schritt C in einer Menge von ungefähr 0,1 bis ungefähr 1,5 Gew. -% eingesetzt wird und die Struktur hat:

[F(CF&sub2;-CF&sub2;)&sub3;&submin;&sub8;CH&sub2;CH&sub2;]1,2-OP(O)(OM)2,1

wobei M ein Alkalimetall- oder Ammoniumkation ist.

15. Verfahren nach Anspruch 10 zur Amplifikation und Detektion der Zielnukleinsäure, die assoziiert ist mit HIV1, HIV2, proviralem HIV1, proviralem HIV2, Cytomegalovirus, Mycobakterium spp., humanem Papillomavirus, Hepatitisviren oder einer humangenetischen Krankheit unter Verwendung spezifischer Primer an und hybridisierbar mit dem Strang der Zielnukleinsäure.

16. Testkit zur Amplifikation einer Zielnukleinsäure, welche einzeln verpackt, umfaßt:

a) eine Amplifikationsreaktionsmischung, umfassend ein oder mehrere Amplifikationsreagentien,

b) Polyethylenimin, und

c) ein anionisches Phosphatestertensid.

17. Testkit nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Amplifikationsreaktionsmischung ein Set von Primern, von denen mindestens einer markiert ist, eine Vielzahl von dNTP's und eine thermostabile DNA-Polymerase umfaßt.

18. Testkit nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das anionische perfluorierte Phosphatestertensid ein nicht-aromatischer, fluorierter Phosphatester oder ein nicht-aromatischer, nicht-fluorierter oxyalkylierter Alkylphosphatester ist.

19. Testkit nach Anspruch 16, weiterhin umfassend eine Testvorrichtung, enthaltend eine oder mehrere andere Kitkomponenten.

20. Verfahren zur Detektion einer Zielnukleinsäure umfassend:

I) Bereitstellen einer Zielnukleinsäure aus einem Lysat unter Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 2.