DE69533771T2 - Verfahren zum Einfangen und selektivem Freisetzen von Nukleinsäuren unter Verwendung eines schwach basischen Polymers und Amplifikation dieser Nukleinsäuren - Google Patents

Verfahren zum Einfangen und selektivem Freisetzen von Nukleinsäuren unter Verwendung eines schwach basischen Polymers und Amplifikation dieser Nukleinsäuren Download PDF

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Description

  • Bereich der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Präparation einer Probe durch Fangen und selektive Freisetzung von Nukleinsäuren zum Nachweis. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zum Fangen und Freisetzen von Nukleinsäuren für die anschließende Behandlung, wie z. B. Amplifikation. Sie betrifft auch ein Test-Kit zur Verwendung in dem Verfahren.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Die Technologie zum Nachweis kleiner Mengen von Nukleinsäuren hat sich über die letzten zwei Jahrzehnte hinweg schnell entwickelt, einschließlich der Entwicklung von hoch fortschrittlichen Amplifikationstechniken, wie z. B. Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Die Forscher haben leicht den Wert von solcher Technologie erkannt, um Nukleinsäure nachzuweisen, die für Erkrankungen und genetische Merkmale in menschlichen oder tierischen Testproben Indikativ sind. Die Verwendung von Sonden und Primern in solcher Technologie basiert auf dem Konzept der Komplementärität, gemeint ist, die Bindung von zwei Strängen einer Nukleinsäure durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen komplementären Nukleotiden (auch als Nukleotidpaare bekannt).
  • PCR ist ein signifikanter Fortschritt im Stand der Technik, um den Nachweis von sehr kleinen Konzentrationen einer Zielnukleinsäure zu ermöglichen. Die Details von PCR sind z. B. in US-A-4,683,195 (Mullis et al), US-A-4,683,202 (Mullis) und US-A-4,965,188 (Mullis et al) beschrieben, obwohl es ein sich schnell erweiterndes Volumen von Literatur in diesem Gebiet gibt.
  • Um eine Zielnukleinsäure effektiv zu amplifizieren und nachzuweisen ist es gewöhnlicherweise erforderlich, diese Nukleinsäure aus zellulären und anderen Probenverunreinigungen zu isolieren. Verschiedene Lyseverfahren sind bekannt, einschließlich Frieren, Behandlung mit verdauenden Enzymen, wie z. B. Proteasen (z. B. Proteinase K), Kochen, und die Verwendung von verschiedenen Detergentien (siehe z. B. U. S. S. N. 178,202, angemeldet am 06. April 1988 durch Higuchi und EP-A-0 428 197, veröffentlicht am 22. Mai 1991), Lösungsmittel-Ausfällungen und Erhitzungsprotokolle.
  • Sobald die Nukleinsäuren aus den Zellen oder Viruspartikeln extrahiert sind, besteht jedoch ein Bedarf, um sie von anderen Materialien in dem Lysat auf einfache und kosteneffektive Weise abzutrennen. Ein Material, von dem bekannt ist, daß es sich mit Nukleinsäuren komplexiert, ist Polyethylenimin und verschiedene chemische Derivate. Es wurde dazu verwendet, um Nukleinsäuren als Kontaminanten in Verfahren zur Isolierung von Enzymen auszufällen, und in Affinitätssäulen zum Fangen von Nukleinsäuren.
  • Kürzlich haben unsere Kollegen Polyethylenimin in Kombination mit einem anionischen Phosphatester-oberflächenakiven Mittel verwendet, um Nukleinsäuren zu fangen und selektiv zu isolieren. Während diese Technik mit einigem Erfolg verwendet wurde, erforderte sie die Verwendung von zwei getrennten Reagenzien in verschiedenen Schritten in sorgfältig kontrollierten Mengen. Gemeint ist, die Menge von Phosphatester-oberflächenaktivem Mittel, die verwendet wird, hängt von der Menge von Polyethylenimin ab, die in dem Präzipitat mit den Nukleinsäuren vorhanden ist. Eine Verbesserung wurde gesucht, um die Zahl von Schritten und Reagenzien zu verringern, die zum Fangen und der Isolierung von Nukleinsäuren benötigt werden.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die oben angegebenen Probleme werden durch ein Verfahren zum zur Verfügung stellen einer Nukleinsäure aus einem Lysat überwunden, das die Schritte umfaßt von:
    • A) bei einem pH von weniger als 7, in Kontakt bringen eines Lysats, von dem vermutet wird, das es eine Nukleinsäure enthält, mit einem wasserlöslichen, schwach basischen Polymer in einer ausreichenden Menge, um ein wasser-unlösliches Präzipitat des schwach basischen Polymers mit allen Nukleinsäuren, die in dem Lysat vorhanden sind, zu bilden,
    • B) Abtrennen des wasser-unlöslichen Präzipitats vom Lysat, und
    • C) In Kontakt bringen des Präzipitats mit einer Base, um den pH der Lösung auf über 7 zu erhöhen, und dabei Freisetzen der Nukleinsäuren von dem schwach basischen Polymer, wobei das schwach basische Polymer sich wiederkehrende Einheiten umfaßt, erhalten durch Additionspolymerisation von einem oder mehren ethylenisch ungesättigten, polymerisierbaren Monomeren, die eine Amingruppe aufweisen, die bei saurem pH protoniert werden kann.
  • Diese Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Amplifikation und dem Nachweis einer Zielnukleinsäure zur Verfügung, umfassend:
    • I) Zur Verfügung stellen einer Zielnukleinsäure unter der Verwendung von der Schritte von:
    • A) Bei einem pH von weniger als 7 in Kontakt bringen eines Lysats, von dem vermutet wird, daß es eine Zielnukleinsäure enthält, mit einem wasser löslichen leicht basischem Polymer in einer Menge, die ausreichend ist, um ein wasser unlösliches Präzipitat des schwach basischen Polymers mit allen Nukleinsäuren zu bilden, die in dem Lysat vorhanden sind, einschließlich der Zielnukleinsäure,
    • B) Abtrennen des wasser unlöslichen Präzipitats in dem Lysat, und
    • C) in Kontakt bringen des Präzipitats mit einer Base, die den pH der Lösung auf höher als 7 anhebt und dadurch Freisetzen der Nukleinsäuren, einschließlich der Zielnukleinsäure, von dem leicht basischen Polymer, wobei das leicht basische Polymer sich wiederholende Einheiten umfaßt, die durch die Additionspolymerisation von einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren abgeleitet sind, die eine Amingruppe aufweisen, die bei saurem pH protoniert werden kann,
    • II) Amplifizieren der Zielnukleinsäure, die unter den freigesetzten Nukleinsäuren vorhanden ist, und
    • III) Nachweisen der amplifizierten Zielnukleinsäure.
  • Ein Test-Kit zur Amplifikation einer Zielnukleinsäure umfaßt, getrennt verpackt;
    • a) ein Amplifikations-Reaktionsgemisch, umfassend eines oder mehrere Amplifikationsreagenzien, und
    • b) ein schwach basisches Polymer, umfassend sich wiederholende Einheiten abgeleitet durch Additionspolymerisation von einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren, die eine Amingruppe aufweisen, die bei saurem pH protoniert werden kann.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein schnelles, einfaches und effektives Verfahren zur selektiven Isolierung und zum zur Verfügung stellen von Nukleinsäuren für die weitere Behandlung, wie z. B. Hybridisierungstest oder Amplifikationsverfahren, zur Verfügung. Diese Erfindung überwindet das oben angegebene Problem im Hinblick auf herkömmliche Isolierungsmittel, einschließlich der Verwendung von Polyethylenimin. Zusätzlich werden die durch die Verwendung von Polyethylenimin, kombiniert mit einem fluorinierten Phosphatoberflächenaktiven Mittel präsentierten Probleme auch vermieden, da das oberflächenaktive Mittel nicht erforderlich ist. Das Probenpräparationsverfahren dieser Erfindung ist nicht aufwendig und erfordert ein Minimum an Schritten, wodurch es leichter automatisierbar ist. Es kann gewöhnlicherweise innerhalb von 15 Minuten (bevorzugterweise innerhalb von 10 Minuten) durchgeführt werden.
  • Diese Vorteile werden durch die Verwendung eines "schwach basischen" Polymers anstelle des Polyethylenimins zur Verfügung gestellt, das bei saurem pH kationisch und wasserlöslich ist, jedoch bei einem basischen pH deprotoniert, der signifikant oberhalb des pKa des Polymers ist. Mit "schwach basisch" ist gemeint, daß der Polymer-pKa weniger als 7 ist und wahrscheinlicher weniger als 6,5. Daher kann das Polymer bei niedrigem pH verwendet werden, um Nukleinsäuren auf Grund der ionischen Interaktion des kationischen Polymers und des anionischen Phosphatrückgrats von Nukleinsäuren auszufällen.
  • Nach Entfernen von nicht komplexierten Materialien und nach einer pH-Einstellung auf basische Bedingungen werden die Nukleinsäuren von dem schwach basischen Polymer des Präzipitats freigesetzt (oder dekomplexiert) und für die weitere Behandlung, wie z. B. Amplifikation, erhältlich. Die Amplifikationsverfahren können unter basischen Bedingungen durchgeführt werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnung
  • 1 zeigt Daten, die in Beispiel 3 unten erhalten wurden, in einer Balken-graphischen Form.
  • 2 zeigt Daten, die in Beispiel 4 unten erhalten wurden, in einer Balken-graphischen Form.
  • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung ist insbesondere für die Extraktion und den Nachweis von einer oder mehreren Zielnukleinsäuren geeignet, die in einer Probe dieses Typs vorhanden sind, die von Tieren, Menschen, Umwelt oder mikrobiellen Proben gesammelt wurde. Die so erhaltenen Nukleinsäuren können weiter behandelt werden, durch Unterziehen Dieser von herkömmlichen Hybridisierungstests, deren Verfahren im Stand der Technik gut bekannt sind (z. B., US-A-4,994,373).
  • Jedoch wird aus Gründen der Kürze die verbleibende Diskussion auf bevorzugte Ausführungsformen gerichtet werden, wobei die Nukleinsäuren Amplifikationsverfahren, insbesondere PCR, unterzogen werden. Jedoch ist der Bereich dieser Erfindung nicht gedacht, so eingeschränkt zu sein, da andere Amplifikationstechniken (wie z. B. LCR) auch verwendet werden könne.
  • Die allgemeinen Prinzipien und Bedingungen für die Amplifikation für den Nachweis von Nukleinsäuren unter der Verwendung von Polymerase-Kettenreaktion sind recht gut bekannt, wobei die Details davon in zahlreichen Referenzen einschließlich US-A-4,683,195 (Mullis et al.), US-A-4,683,202 (Mullis), US-A-4,965,188 (Mullis et al.) und WO-A-91/12342 zur Verfügung gestellt werden. Im Hinblick auf die Lehre im Stand der Technik und die hier spezifisch zur Verfügung gestellte Lehre sollte ein Arbeiter im Stand der Technik keine Schwierigkeit bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung durch Kombinieren der präparativen Methode dieser Erfindung mit Polymerase-Kettenreaktionsverfahren oder mit irgend einem anderen Amplifikationsverfahren, das im Stand der Technik bekannt ist, haben.
  • Andere Amplifikationsverfahren, die in der Durchführung dieser Erfindung verwendet werden können, schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, Ligase-Kettenreaktion, wie beschrieben, z. B. in EP-A-0 320 308 (veröffentlicht Dezember 1987) und EP-A-0 439 182 (veröffentlicht Januar 1990).
  • Testproben können zelluläres oder virales Material, Haar, Körperflüssigkeiten oder andere Materialien einschließen, die genetische DNA oder RNA, oder DNA oder RNA von infektiö sen Mitteln, die nachgewiesen werden können, enthalten. Die Zielnakleinsäure kann aus jeder geeigneten menschlichen, tierischen, mikrobiellen, viralen oder pflanzlichen Quelle extrahiert werden. Zusätzlich können Zielnukleinsäuren aus onkogenen Zellen isoliert werden.
  • Bakterien, die nachgewiesen werden können schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, Bakterien, die im Blut gefunden werden, Salmonella spp., Streptococcus spp., Chlamydia spp., Neisseria spp., Mycobacterium spp. (wie z. B. Mycobacterium tuberculosis und Mycobacterium avium-Komplex), Mycoplasma spp. (wie z. B. Mycoplasma, Haemophilus influenzae und Mycoplasma pneumoniae), Legionella pneumophila, Borrelia burgdorferi, Pneumocystis carinii, Clostridium difficile, Campylobacter spp., Yersinia spp., Shigella spp. und Listeria spp.. Viren, die nachweisbar sind schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, Herpes-Simplex-Virus, Epstein-Barr-Virus, Cytomegalovirus, menschlicher Papilloma-Virus, Influenzaviren, respiratoische syncytiale Viren, Hepatitisviren und Retroviren (wie z. B. HTLV-I, HTLV-II, HIV1 und HIV2). Protozoische Parasiten und Pilze (einschließlich Hefen und Schleimpilze) sind auch nachweisbar. Andere nachweisbare Spezies wären dem Fachmann im Stand der Technik leicht erkennbar. Die Erfindung ist besonders brauchbar für den Nachweis der Nukleinsäuren, die mit verschiedenen Bakterien oder Viren assoziiert sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Erfindung brauchbar für die Isolierung, Amplifikation und den Nachweis von Nukleinsäuren, die in einer Probe jedes Typs, gesammelt von HIV1, HIV2, proviralem HIV1, proviralem HIV2, Cytomegalovirus, menschlichen Papilloma-Virus, mycobakteriellen Spezies, Hepatitisvirus vorhanden sind oder mit genetischen Erkrankungen assoziiert sind.
  • Vor dem Kontakt mit dem hier definierten schwach basischen Polymer können die Nukleinsäuren auf jede bekannte Weise aus der Probe extrahiert werden. Verschiedene Lyseverfahren sind im Stand der Technik bekannt, einschließlich denjenigen beschrieben durch Laure et al. in The Lancet, pp. 538–540 (03. September 1988), Maniatis et all, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp. 280–281 (1982), Gross-Belland et al in Eur. J. Biochem., 36, 32, (1973) und US-A-4,965,188 (oben angegeben). Die Extraktion von DNA aus Gesamtblut oder Komponenten davon ist darin beschrieben, z. B. in EP-A-0 393 744 (veröffentlich 24. Oktober 1990), US-A-5,231,015 (Cummings et al) US-A-5,334,499 (Burdick et al). Das Lyseverfahren kann von dem Typ der verwendeten Probe, die als die Quelle an Nukleinsäuren verwendet wird, abhängig sein.
  • Während das besondere Lyseverfahren für die Durchführung dieser Erfindung nicht kritisch ist schließt ein bevorzugtes Lyseverfahren ein Erhitzen der Probe in Anwesenheit eines geeigneten ionischen oberflächenaktiven Mittels ein, von denen eine Zahl im Stand der Technik gut bekannt sind.
  • Das Lysat wird dann, bei einem pH von weniger als 7 (bevorzugterweise weniger als 5) mit einem schwach basischen Polymer (unten definiert) in einer Menge gemischt, die ausreichend ist, um mit allen Nukleinsäuren, die in dem Lysat vorhanden sind, zu komplexieren, wodurch ein wasserlösliches Präzipitat gebildet wird. Dieses Polymer ist wasserlöslich bei saurem pH. Im allgemeinen ist die Menge von vorhandenen Polymeren mindestens ungefähr 0,01 Gewichtsprozent, wobei von ungefähr 0,05 bis ungefähr 0,5 Gewichtsprozent bevorzugt sind. Natürlich würde ein Fachmann im Stand der Technik wissen, wie die Mengen von Polymer anzupassen sind, um jede Menge von Nukleinsäuren zu handhaben. Das Mischen kann auf jede geeignete Weise für bis zu 30 Minuten (im allgemeinen weniger als 5 Minuten) und bei jeder geeigneten Temperatur (allgemein von 15 bis 35°C) durchgeführt werden.
  • Das schwach basische Polymer kann in seiner wasserlöslichen freien Form verwendet werden oder an ein wasserunlösliches Substrat angebracht sein, wie z. B. in einer Affinitätssäule oder an Polymere, Glas oder andere anorganische Partikel angebracht sein. Dazu können die Polymere unter der Verwendung von herkömmlichen Mitteln (z. B. Absorption, kovalente Bindungen oder spezifische Bindungsreaktionen) an ein geeignetes Substrat, einschließlich Glas, Polymer oder magnetischen Partikeln, Filtern oder Filmen angebracht sein. Wo das schwach basische Polymer sogar bei basischem pH wasserunlöslich ist, kann es durch Filtration, Zentrifugation oder andere herkömmliche Mittel entfernt werden, nachdem die Nukleinsäuren freigesetzt wurden.
  • Während sie an das schwach basische Polymer gebunden sind, sind die Nukleinsäuren jedoch nicht brauchbar. Es ist dann erforderlich, das wasserunlösliche Präzipitat von dem Rest der Probe abzutrennen, die möglicherweise beträchtliche Zellrückstände und überschüssiges Polymer enthalten kann. Diese Abtrennung kann unter der Verwendung jedes einer Vielzahl von herkömmlichen Verfahren erreicht werden, einschließlich Zentrifugation oder Filtration, wonach die Flüssigkeit abgegossen wird. Zentrifugation ist bei der Durchführung der Erfindung bevorzugt.
  • Nach dem Abtrennschritt können die Nukleinsäuren aus dem schwach basischen Polymer dekomplexiert oder freigesetzt werden, durch in Kontakt bringen des Präzipitats mit einer Base, mit oder ohne Erhitzen. Starke Basen können ohne Hitze verwendet werden, und diese schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Lithiumhydroxid, Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, ein tertiäres Amin (wie z. B. Triethylamin, Diisopropylethylamin und Lutidin), Trizin, Bizin oder jede andere organische oder anorganische Base, die dem Fachmann leicht ersichtlich wäre. Brauchbare schwächere Basen können basische Puffer, wie z. B. Tris(Hydroxymethyl)aminomethan (oder Säureadditionssalz davon), N,N-Bis(2-Hydroxyethyl)glycin, N-Tris(Hydroxymethyl)methylglycin und andere gut im Stand der Technik bekannte einschließen. Das Erhitzen kann erforderlich sein, wenn schwächere Basen verwendet werden.
  • Solch ein Erhitzen kann für bis zu 15 Minuten (im allgemeinen weniger als 5 Minuten) bei einer Temperatur durchgeführt werden, die mindestens ungefähr 50°C ist und bevorzugterweise von ungefähr 90 bis ungefähr 125°C unter geeignetem Druck ist. Wie in diesem Absatz verwendet, betrifft "ungefähr" ±5°C.
  • In bevorzugten Ausführungsformen können schwächere Basen mit Erhitzen verwendet werden, um die Nukleinsäuren aus dem Präzipitat freizusetzen. Dies stellt eine Lösung zur Verfügung, die Nukleinsäuren enthält, die für die Amplifikation ohne weitere Behandlung bereit sind. Solche schwächeren Basen können Puffer, wie z. B. Tris(Hydroxymethyl)aminomethanchlorid sein.
  • In einigen Ausführungsformen sind die Polymere, die in solchen Ausführungsformen verwendet werden, diejenigen (definiert unten) die sogar bei basischem pH wasserunlöslich sind. Solche Polymere können aus dem System nach Freisetzung der Nukleinsäure und vor der Amplifikation entfernt werden, falls gewünscht.
  • Die sich ergebende Lösung, die die freigesetzten Nukleinsäuren enthält, weist einen basischen pH auf. In einigen Fällen kann die Nukleinsäure weiter ohne jegliche Einstellung im pH behandelt werden. In anderen Ausführungsformen, wo eine starke Base verwendet wird, kann der pH der Lösung eingestellt werden (im allgemeinen abwärts) von ungefähr 6 bis ungefähr 9 (bevorzugterweise von ungefähr 7,5 bis 9) unter der Verwendung von jeder geeigneten Säu re oder einem Puffer, wie z. B. Tris(Hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid, N,N-Bis(2-Hydroxyethyl)glycin, N-Tris(Hydroxymethyl)methylglycin und anderen, die dem Fachmann im Stand der Technik leicht ersichtlich wären. Die Menge von solchen Materialien, die erforderlich ist, um den gewünschten pH zu erreichen, wäre dem Fachmann im Stand der Technik leicht ersichtlich. Bei basischem pH kann das Polymer, das zum Fangen der Nukleinsäure verwendet wurde entweder wasserlöslich oder wasserunlöslich sein, und Monomere, die zum zur Verfügung stellen solcher Eigenschaften erforderlich sind, werden unten beschrieben. Die beschriebenen Verfahren von Fangen und Freisetzen von Nukleinsäuren dieser Erfindung werden typischerweise innerhalb von ungefähr 20 Minuten und bevorzugterweise von innerhalb ungefähr 10 Minuten durchgeführt.
  • Wie hier verwendet, wenn nicht anders angegeben, betrifft der modifizierende Begriff "ungefähr" eine Varianz von ±10% der angegebenen Werte. Wenn mit pH Werten verwendet, betrifft "ungefähr" ±0,5 pH Einheiten.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Amplifikation den Nachweis eine Zielnukleinsäure:
    • I) Lysieren von Zellen oder Viruspartikeln, um eine Zielnukleinsäure freizusetzen,
    • II) Unterziehen der Zielnukleinsäuren den Schritten von:
    • A) bei einem pH von weniger als 7, in Kontakt bringen der Zielnukleinsäure mit einem wasserlöslichen, schwach basischen Polymer in einer Menge, die ausreichend ist, um ein wasserunlösliches Präzipitat des schwach basischen Polymers mit allen Nukleinsäuren zu bilden, die in dem Lysat vorhanden sind, einschließlich der Zielnukleinsäure,
    • B) Abtrennen des wasserunlöslichen Präzipitats von dem Lysat, und
    • C) in Kontakt bringen des Präzipitats mit einer Base, um den Lösungs-pH auf größer als 7 anzuheben, und dadurch Freisetzen der Nukleinsäuren, einschließlich der Zielnukleinsäure, von dem schwach basischen Polymer, wobei das schwach basische Polymer sich wiederholende Einheiten aufweist, die durch Additionspolymerisation von einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren, die eine Amingruppe aufweisen, die bei saurem pH protoniert werden kann, abgeleitet sind,
    • III) ohne weitere Einstellung des pH's, Amplifizieren der freigesetzten Zielnukleinsäure, und IV) Nachweisen der amplifizierten Zielnukleinsäure.
  • In dem voranstehenden Verfahren ist es noch weiter bevorzugt, daß das schwach basische Polymer bei basischem pH wasserunlöslich ist und daß das Verfahren weiterhin den Schritt von Entfernen des wasserunlöslichen Polymers nach Freisetzung der Zielnukleinsäure, jedoch vor deren Amplifikation, umfaßt.
  • Das bei der Durchführung dieser Erfindung verwendete schwach basische Polymer wird aus einem oder mehreren ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomeren hergestellt, von denen mindestens eines eine Amingruppe aufweist, die bei saurem pH protoniert werden kann. Daher ist das Polymer bei saurem pH protoniert, um das Säureadditionssalz des Amins zu bilden. Bei basischem pH existiert das Polymer als eine freie Base.
  • Besondere "schwach basische Gruppen", die ein Teil von in dieser Erfindung brauchbaren polymerisierbaren Monomeren sind schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, zyklische Amingruppen oder primäre, sekundäre oder tertiäre Aminoalkylgruppen, die bei saurem pH protoniert werden können. Brauchbare zyklische Amingruppen schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, Imidazolyl, Isoxazolyl, Pyridyl, Piperidyl, Piperazinyl, Pyrazolyl, Triazolyl, Tetrazolyl, Oxadiazolyl, Pyridazinyl, Pyrimidyl, Pyrazinyl, Chinolinyl und Chinazolinyl. Die bevorzugten Gruppen sind zyklische Gruppen, die aromatisch sind und die Imidazolylgruppe ist am meisten bevorzugt. Brauchbare Aminoalkyl- oder zyklische Amingruppen werden an Vinylgruppen der Monomere unter der Verwendung von bequemen Verbindungsgruppen, einschließlich Alkylen-, Amido- oder Estergruppen gebunden und vielfache Alkylengruppen könne gemeinsam mit Imino-, Oxy-, Amid-, Caronyl- oder Estergruppen verbunden werden.
  • Im allgemeinen brauchbare Polymere zum Fangen von Nukleinsäuren sind aus sich wiederholenden Einheiten abgeleitet durch die Additionspolymere von:
    • a) von ungefähr 15 bis 100 Gewichtsprozent eines wasserlöslichen schwach basischen ethylenisch ungesättigtem polymerisierbaren Monomers, das mindestens eine Gruppe aufweist, die bei saurem pH protoniert werden kann und die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminoalkyl, Imidazolyl, Isoxazolyl, Pyridyl, Piperidyl, Piperazinyl, Pyrazolyl, Triazolyl, Tetrazolyl, Oxadiazolyl, Pyridazinyl, Pyrimidyl, Pyrazinyl, Chinolinyl und Chinazolinyl,
    • b) von 0 bis ungefähr 35 Gewichtsprozent eines nicht ionischen hydrophilen ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomers, und
    • c) von 0 bis ungefähr 85 Gewichtsprozent eines nicht ionischen hydrophoben ethylenisch ungesättigten polymerisierbaren Monomers zusammengesetzt.
  • Bevorzugterweise umfaßt das schwach basische Polymer sich wiederholende Einheiten von ungefähr 20 bis ungefähr 100 Gewichtsprozent von a), von 0 bis ungefähr 25 Gewichtsprozent b) und von 0 bis ungefähr 80 Gewichtsprozent c).
  • Eine spezifische Klasse von Monomeren, die in a) oben brauchbar sind, sind diejenigen, die durch die Struktur (I) dargestellt werden:
    Figure 00110001
    worin R3 Wasserstoff oder Methyl ist und X ist Oxy oder Imino. Zusätzlich ist R4 eine divalente Kohlenwasserstoff-Verbindungsgruppe, die von 1 bis 8 Kohlenstoff und Heteroatome in der Kette aufweist und eine oder mehrere Alkylengruppen (wie z. B. Methylen, Ethylen, N-Propylen, Isopropylen und n-Pentylen) umfaßt, unter der Voraussetzung, das wenn es mehr als eine Alkylengruppe gibt, sie in R4 mit einer oder mehrere Carbonyl-, Oxy-, Imino-, Ester- oder Aminogruppen in jeder nacharbeitbaren Kombination zusammen verbunden sind. Mit "nacharbeitbare Kombination" ist gemeint, daß diese Gruppen mit den Alkylengruppen in jeder chemisch möglichen Konfiguration kombiniert werden können und in Kombination (mit einander verbunden) in chemisch möglichen Wegen (wie z. B. Oxycarbonyl, Carbonamido und andere dem Fachmann im Stand der Technik leicht ersichtliche) verwendet werden könne. Es soll auch verstanden werden, daß R4 mit einer Carbonyl-, Oxy-, Imino-, Ester- oder Amidogruppe beendet werden kann (oder an R5 gebunden werden kann).
  • R5 ist eine zyklische Amin- oder primäre, sekundäre oder tertiäre Aminoalkylgruppe, wie oben definiert, die bei saurem pH protoniert werden kann.
  • Beispiele von brauchbaren Typ a) Monomeren schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, 1-Vinylimidazol, 2-Methyl-1-vinylimidazol, 2-Vinylpyridin, 1-Hydroxy-6-vinyl-1H-benzotriazol, 2-Aminoethylmethacrylathydrochlorid, 2-Aminoethylacrylathydrochlorid, N-(3-Aminopropyl)methacrylamid, 2-Vinylchinolin, N-(3-Imidazolylpropyl)methacrylamid, N-(2-Imidazolylethyl)methacrylamid, N-(3-Imidazolylpropyl)acrylamid, N-(1,1-Dimethyl-3-N-imidazolylpropyl)acrylamid, N-(Imidazolylmethyl)acrylamid, 1-Vinylpyrrolidinon, 3-(N,N-Dimethylamino)propylmethacrylat und Säureadditionssalze der angegebenen freien Basen.
  • Eine Klasse von neuen Monomeren von Typ a) diese Erfindung kann dazu verwendet werden, um entweder Homopolymere oder Copolymer herzustellen. Diese Monomere werden durch die Struktur (II) definiert:
    Figure 00120001
    worin R Wasserstoff oder Methyl ist. Bevorzugterweise ist R Methyl. Zusätzlich ist R1 verzweigtes oder lineares Alkylen von 1 bis 3 Kohlenstoffatomen (wie z. B. Methylen, Ethylen, Trimethylen oder Propylen). Bevorzugterweise ist R1 Alkylen von 2 oder 3 Kohlenstoffatomen. Weiter bevorzugt ist R1 Trimethylen.
  • Besonders brauchbare Monomere, die Struktur (II) aufweisen, schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, N-(3-Imidazolylpropyl)methacrylamid, N-(2-Imidazolylethyl)methacrylamid, N-(3-Imidazolylpropyl)acrylamid, N-(1,1-Dimethyl-3-N-imidazolylpropyl)acrylamid, N-(Imidazolylmethyl)acrylamid und deren Säureadditionssalze. Von den hier beschriebenen neuen Monomeren ist die erste Verbindung die am meisten bevorzugte.
  • Bevorzugte Typ a) Monomere schließen 1-Vinylimidazol und N-2-Methyl-1-vinylimidazol ein.
  • Wenn die Monomere von Typ a) eine niedrige oder keine Wasserlöslichkeit aufweisen, können Sie auch in der Form Ihrer Säureadditionssalze polymerisiert werden (wie z. B. das Hydrochlorid oder Hydrobromid).
  • Monomere, die als Typ b) Monomere angegeben werden, sind diejenigen, die hier als "hydrophil" definiert sind, was diejenigen bedeutet, die, wenn homopolymerisiert, Homopolymere zur Verfügung stellen, die bei pH 7 oder darüber wasserlöslich sind. Im allgemeinen weisen solche Monomere hydrophile Gruppen, wie z. B. Hydroxy-, Amin- (primär, sekundär, tertiär und zyklisch), Amid-, Sulfonamid- und Polyethylenoxy-Gruppen auf, jedoch ist es nicht erforderlich, daß diese solche Gruppen umfassen, wenn der angegebene Homopolymer-Wasserlöslichkeits-Parameter erfüllt wird.
  • Repräsentative Monomere von Typ b) schließen ein, aber sind nicht begrenzt auf Acrylamid, 2-Hydroxyethylacrylat, 2,3-Dihydroxypropylacrylat, 2,3-Dihydroxypropylmethacrylat, Poly(ethylenoxy)ethylmethacrylat (das von 2 bis 10 Ethylenoxygruppen aufweist) und N,N-Dimethylacrylmid. Ein bevorzugtes Monomer ist Acrylamid.
  • Monomere, angegeben als Typ c) Monomere sind diejenigen, die hier als "hydrophob" definiert sind, was diejenigen bedeutet, die, wenn homopolymerisiert, Homopolymere zur Verfügung stellen, die bei pH 7 oder darüber wasserunlöslich sind, unabhängig vom Typ der abzweigenden Gruppen, die sie besitzen können.
  • Repräsentative Monomere von Typ c) schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, Methacrylamid, 2-Hydroxyethylmethacrylat, N-t-Butylmethacrylamid, Ethylacrylat, Methylacrylat, Butylacrylat, Methylmethacrylat, Styrol, Vinyltoluol und andere Vinylaromatika und andere, die dem Fachmann leicht ersichtlich wären. Ein bevorzugtes Monomer ist 2-Hydroxyethylmethacrylat.
  • Die Monomere von Typ a), b) und c) die nicht neu sind, sind im allgemeinen leicht von kommerziellen Quellen erhältlich oder werden unter der Verwendung von herkömmlichen Verfahren und Ausgangsmaterialien hergestellt.
  • Die neuen Monomere der Struktur (II) können im allgemeinen durch Kondensation eines 1-(Aminoalkyl)imidazols mit einem (Meth)acryloylchlorid unter der Verwendung von geeigneten Bedingungen, die dem Fachmann leicht ersichtlich wären, hergestellt werden. Eine repräsentative Herstellung eines bevorzugten Monomers ist unten vor den Beispielen zur Verfügung gestellt.
  • Die hier beschriebenen Homopolymere und Copolymere können unter der Verwendung von herkömmlichen Lösungspolymerisationstechniken präpariert werden, die alle gut im Stand der Technik bekannt sind, obwohl es bestimmte bevorzugte Bedingungen gibt, die in den präparatorischen Verfahren verdeutlicht werden, die unten vor den Beispielen zur Verfügung gestellt werden. Das Verhältnis der verschiedenen Monomere kann auch eingestellt werden, wie ein Fachmann wissen würde, um Polymere zur Verfügung zustellen, die entweder wasserlöslich oder wasserunlöslich bei basischem pH sind, so lange wie solche Polymere bei saurem pH wasserlöslich verbleiben.
  • Lösungspolymerisation schließt im allgemeinen das Lösen der Monomere in einem geeigneten Lösungsmittel (einschließlich Wasser oder verschiedenen Wasser-mischbaren organischen Lösungsmitteln) und Polymerisieren in der Anwesenheit eines geeigneten freien Radikal-Initiators ein. Das sich ergebende Polymer ist wasserlöslich bei saurem pH, so wird es unter der Verwendung eines Lösungsmittels, wie z. B. Aceton ausgefällt, gereinigt und in Wasser zur weiteren Verwendung wieder gelöst.
  • Besonders brauchbare Polymere wie hier beschrieben schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf Poly[N-(3-imidazolylpropyl)methacrylamidhydrochlorid-co-acrylamid], Poly[N-(3-imidazolylpropyl)methacrylamidhydrochlorid-co-2-hydrocyethylmethacrylat], Poly(1-vinylimidazol), Poly(2-aminoethylmethacrylathydrochlorid-co-2-hydroxyethylmethacrylat), Poly(1-vinylimidazolhydrochlorid-co-2-hydroxyethylmthacrylat), Poly[N-1,1-dimethyl-3-imidazolylpropyl)acrylamid], Poly(N-2-methyl-1-vinylimidazol) und Säureadditionssalze der freien Basepolymere.
  • In bevorzugten Ausführungsformen sind die verwendeten Polymere bei basischen pH wasserunlöslich. Solche Polymere werden unter der Verwendung von Typ a) Monomeren sowie Typ c) Monomeren, jedoch mit begrenzten Mengen (weniger als 15 Gewichtsprozent) an Typ b) Monomeren hergestellt, um eine Lösung des Polymers bei basischen pH zu verhindern. Repräsentative Polymere dieses Typs schließen ein, sind nicht begrenzt auf, Poly[N-(3-imidazolypropyl)-metacrylamidhydrochlorid-co-2-hydroxyethylmethacrylat], Poly(1-vinylimidazol), Poly(2-aminoethylmethacrylathydrochlorid-co-2-hydroxyethylmethacrylat) und Poly(1-vinylimidazolhydrochlorid-co-2-hydroxyethylmethacrylat).
  • Die vorliegende Erfindung ist auch auf die Amplifikation und den Nachweis von einer oder mehreren spezifischen Nukleinsäuresequenzen gerichtet, die in einer oder mehrerer Zielnukleinsäuren vorhanden sind, die wie oben angegeben freigesetzt werden. Darüber hinaus kann eine Vielzahl von Zielnukleinsäuren gleichzeitig amplifiziert und nachgewiesen werden, durch Verwendung eines entsprechenden Sets von Primern und Nachweismitteln für jede spezifische Nukleinsäure. Multiple Sequenzen in derselben Nukleinsäure können auch amplifiziert und nachgewiesen werden.
  • Ein "PCR Reagenz" betrifft jedes der Reagenzien, die im allgemeinen als in der PCR brauchbar betrachtet werden, nämlich ein Set von Primern für jede Zielnukleinsäure, eine DNA Polymerase, einen DNA Polymerase-Kofaktor und zwei oder mehr Desoxyribnukleosid-5'-Triphosphate (dNTP's).
  • Wie hier verwendet im Bezug auf Primer oder Sonden betrifft der Ausdruck "Oligonucleotide" ein Molekül, das aus 4 oder mehr Desoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden zusammengesetzt ist und bevorzugterweise mehr als 10. Seine genaue Größe ist nicht wichtig, sondern hängt von vielen Faktoren ab, einschließlich der ultimativen Verwendung oder Funktion des Oligonukleotids. Das Oligonukleotid kann durch jedes bekannte Verfahren abgeleitet werden.
  • Der Ausdruck "Primer" betrifft ein Oligonukleotid, ob natürlich auftretend oder synthetisch hergestellt, das in der Lage ist, als Punkt der Initiation von Synthese zu wirken, wenn unter Bedingungen plaziert, bei denen eine Synthese eines Primer-Verlängerungsprodukts komplementär zu einem Nukleinsäurestrang (gemeint ist Templat) induziert wird. Solche Bedingungen schließen die Anwesenheit von Nukleotiden (wie z. B. die 4 Standard Desoxyribonukleosid-5'-Triphosphate), eine Polymerase und einen Polymerase Kofaktor und geeigneter Temperatur und pH ein. Normalerweise sind solche Bedingungen das was im Stand der Technik als Bedingungen "hoher Stringenz" bekannt ist, so daß die nicht spezifische Amplifikation minimiert wird. Der Primer muß lang genug sein, um die Synthese von Verlängerungsprodukten in der Anwesenheit der DNA Polymerase zu initiieren. Die genaue Größe des Primers wird in Abhängigkeit von der vorgesehenen Verwendung an der Komplexität der Zielsequenz, der Reaktionstemperatur und der Quelle der Primer abhängig sein. Im allgemeinen werden die in dieser Erfindung verwendeten Primer von 10 bis 60 Nukleotide aufweisen.
  • Hier brauchbare Primer können auch von einer Zahl von Quellen erhalten werden oder unter der Verwendung von bekannten Techniken und Ausrüstung präpariert werden, einschließlich z. B., einem ABI DNA Synthesizer (erhältlich von Applied Biosystems) oder einem Biosearch 8600 Series oder 8800 Series Synthesizer (erhältlich von Milligen-Biosearch, Inc.) und bekannte Verfahren zu deren Verwendung (z. B. wie beschrieben in US-A-4,965,188). Natürlich auftretende Primer, die aus biologischen Quellen isoliert wurden sind auch brauchbar (so wie z. B. Restriktionsendonukleaseverdaue). Wie hier verwendet betrifft der Ausdruck "Primer" auch ein Gemisch von Primern. Daher kann jedes Set von Primern für eine angegebene Zielnukleinsäure 2 oder mehr Primer für jeden gegenüberliegenden Zielstrang einschließen.
  • Einer oder beide Primer können mit demselben oder unterschiedlichen Marker zum Nachweis oder Fangen des amplifizierten Produkts markiert sein. Verfahren zum Anbringen von Markern und Herstellung von Primern sind gut im Stand er Technik bekannt, z. B., wie beschrieben durch Agrawal et al., Nucleic Acid Res., 14, pp. 6227-45 (1986), US-A-4,914,210 (Levenson et al.), im Hinblick auf Biotinmarker, US-A-4,962,029 (Levenson et al.) im Hinblick auf Enzymmarker und die hier angegebenen Referenzen. Brauchbare Marker schließen auch Radioisotope, elektronendichte Reagenzien, Chromogene, Fluorogene, phosphoreszente Gruppen, Ferritin und andere magnetische Partikel (siehe US-A-4,795,698 von Owen et al. und US-A-4,920,061 von Poynton et al.), chemilumineszente Gruppen (wie z. B. Luminol) und andere spezifische Bindungsspezies (Avidin, Steptaviddin, Biotin, Zucker oder Lektine) ein. Bevorzugte Marker sind Enzyme, Radioisotope und spezifisch bindende Spezies (wie z. B. Biotin). Brauchbare Enzyme schließen ein Glukoseoxidase, Peroxidase, Uricase, alkalische Phosphatase und andere die im Stand der Technik bekannt sind und an Oligonucleotide unter der Verwendung von bekannten Verfahren angebracht werden können. Reagenzien, um ein kolorimetrisches oder chemilumineszentes Signal mit solchen Enzymen zur Verfügung zu stellen, sind gut bekannt.
  • Wenn der Marker ein Enzym, wie z. B.: eine Peroxidase ist, werden an einem Punkt in dem Test Wasserstoffperoxid und geeigneter Farb-bildende Zusammensetzungen hinzugefügt, um einen Nachweisbaren Farbstoff zur Verfügung zustellen. Z. B. schließen brauchbare Farbe zur Verfügung stellende Reagenzien Tetramethylbenzidin und Derivate davon ein und Leukofarbstoffe, wie z. B. wasserunlösliche Triarylimidazol-Leukofarbstoffe (wie beschrieben in US-A-4,089,747 von Bruschi) oder andere Verbindungen, die reagieren, um einen Farbstoff in der Anwesenheit von Peroxidase und Wasserstoffperoxid zur Verfügung zu stellen. Besonders brauchbare Farbstoff zur Verfügung stellende Zusammensetzungen sind in EP-A-0 308 236 (veröffentlicht 22. März 1989) beschrieben. Chemilumineszente Signale in Antwort auf einen Peroxidasemarker können auch unter der Verwendung der geeigneten Reagenzien erzeugt werden.
  • Wenn einer oder beide Primer biotinyliert sind, kann die amplifizierte Nukleinsäure unter der Verwendung von nachweisbar markiertem Avidin oder einem Äquivalent davon (z. B. Streptavidin) nachgewiesen werden. Z. B. kann Avidin mit einem Enzym konjugiert werden oder ein Radioisotop aufweisen, unter der Verwendung von bekannter Technologie. Biotin des amplifizierten Produkts komplexiert mit dem Avidin, und geeignete Nachweistechniken, um ein radioaktives, kolorimetrisches oder chemilumineszentes Signal nachzuweisen, werden verwendet.
  • Hier verwendet ist eine Fang "Sonde" ein Oligonukleotid, das im wesentlichen komplementär zu einer Nukleinsäuresequenz von einem oder mehrerer Stränge der Zielnukleinsäure ist und die dazu verwendet wird, um die amplifizierte Nukleinsäure unlöslich zu machen. Das Sonden-Oligonukleotid ist im allgemeinen an eine geeignete wasserunlösliche Substanz, wie z. B. Polymer oder Glasperlen, Mikrotiterplatten-Well, dünnen Polymer- oder Cellulosefilm der andere Materialien, die dem Fachmann leicht ersichtlich sind, angebracht. Das Oligonukleotid weist im allgemeinen eine Länge von ungefähr 12 bis ungefähr 40 Nukleotiden auf, obwohl die Länge nicht wichtig ist.
  • Eine DNA Polymerase ist ein Enzym, die Desoxionukleosidmonophosphat Moleküle an das 3'-Hydroxyende des Primers in einem Komplex von Primer und Templat hinzufügen wird, jedoch ist die Hinzufügung auf Templat abhängige Weise (gemeint ist, abhängig von den spezifischen Nukleotiden in dem Templat). Viele brauchbare DNA Polymerasen sind dem Stand der Technik bekannt. Bevorzugter Weise ist die Polymerase "thermostabil", was bedeutet, daß sie gegenüber Hitze stabil ist, insbesondere den hohen Temperaturen, die für die Renaturierung von DNA Strängen verwendet werden. Genauer gesagt werden die thermostabilen DNA Polymerasen nicht wesentlich inaktiviert durch die hohen Temperaturen, die im PCR verwendet werden, wie hierin beschrieben.
  • Eine Zahl von thermostabilen DNA Polymerasen wurden im Stand der Technik berichtet, einschließlich denjenigen, die genau in US-A-4,965,188 (oben angegeben) und US-A-4,889,818 (Gelfand et al.) erwähnt sind. Besonders brauchbare Polymerasen sind diejenigen, die von verschiedenen Thermus bakteriellen Spezies erhalten werden, wie z. B. Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus filiformis oder Thermus flavus. Andere brauchbare thermostabile Polymerasen werden aus einer Vielzahl von anderen mikrobiellen Quellen einschließlich Thermococcus literalis, Pyrococcus furiosus, Thermotoga sp. und denjenigen beschrieben in WO-A-89/06697 (veröffentlicht 27. Juli 1989) erhalten. Einige brauchbare Polymerasen sind käuflich erhältlich. Eine Zahl von Techniken sind zur Isolierung von natürlich auftretenden Polymerasen aus Organismen bekannt, und zur Herstellung von gentechnischen Enzymen unter der Verwendung von rekombinanten Techniken, wie in dem Stand der Technik angegeben, der in diesem Absatz zitiert wird.
  • Ein DNA Polymerase-Kofaktor betrifft eine nicht-Proteinverbindung, von dem das Enzym für seine Aktivität abhängig ist. Eine Zahl von solchen Materialien sind bekannte Kofaktoren, einschließlich Mangan- und Magnesiumsalzen. Brauchbare Kofaktoren schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf, Mangan- und Magnesiumchloride, Sulfate, Acetate, Fettsäuresalze (z. B. Butter-, Caproin-, Capryl-, Caprin- und Laurylsäuresalze). Die kleineren Salze, gemeint sind Chloride, Sulfate und Acetate, sind bevorzugt.
  • Auch für die PCR erforderlich sind zwei oder mehr Desoxyribonukleotide-5'-triphosphate, wie z. B. dATP, dCTP, dGTP, dUTP oder dTTP. Gewöhnlicherweise werden dATP, dCTP, dGTP und dTTP alle in der PCR verwendet. Analoga, wie z. B. dITP und 7-Deaza-dGTP sind auch brauchbar.
  • Auch bei der Durchführung der Erfindung brauchbar ist ein Antikörper, der spezifisch gegen die DNA Polymerase ist, wobei der Antikörper ihre enzymatische Aktivität bei Temperaturen von unterhalb ungefähr 50°C eliminiert, jedoch der Antikörper bei höheren Temperaturen deaktiviert wird. Repräsentative monoklonale Antikörper, die diese Eigenschaften aufweisen, sind in US-A-5,338,671 (angemeldet 07. Oktober 1992 durch Scalice et al.) geschrieben. Antikörperfragmente können anstelle des gesamten Moleküls verwendet werden, wenn sie äquivalente Eigenschaften aufweisen.
  • Die hier beschriebenen PCT Reagenzien werden zur Verfügung gestellt und in der PCR in geeigneten Konzentrationen um eine Amplifikation der Zielnukleinsäure zur Verfügung zustellen. Die minimalen Mengen von DNA Polymerase ist im allgemeinen mindestens ungefähr 1 Einheit/100 μl Lösung, wobei von ungefähr 4 bis ungefähr 25 Einheiten/100 μl bevorzugt sind. Eine "Einheit" ist hier definiert als die Menge von Enzymaktivität, die erforderlich ist, um 10 nmol von Gesamtnukleotiden (dNTP's) in eine sich verlängerte Nukleinsäurekette in 30 Minuten bei 74°C zu inkorporieren. Die Konzentration von jedem Primer ist mindestens ungefähr 0,075 μmolar, wobei von ungefähr 0,2 bis ungefähr 1 μmolar bevorzugt sind. Alle Primer sind ungefähr in derselben Menge vorhanden (innerhalb einer Variation von 10% jedes). Der Kofaktor ist im allgemeinen in einer Menge von ungefähr 1 bis ungefähr 15 mmolar vorhanden und jedes dNTP ist im allgemeinen bei von ungefähr 0,1 bis ungefähr 3,5 mmolar in dem Reaktionsgemisch vorhanden. Wie in diesem Absatz verwendet, betrifft der Modifikator "ungefähr" eine Varianz von ±10% des angegebenen Wertes.
  • Die PCR Reagenzien können einzeln zugeführt werden oder in einer gepufferten Lösung, die ein pH im Bereich von ungefähr 7 bis ungefähr 9 unter der Verwendung von jedem geeigneten Puffer aufweist.
  • Da die zu amplifizierende nachzuweisende Zielnukleinsäure im allgemeinen in doppelsträngiger Form vorliegt, müssen die zwei Stränge getrennt werden (gemeint ist denaturiert) bevor ein Primen statt finden kann. Dies kann während des Extraktionsprozesses stattfinden, jedoch findet dies bevorzugterweise in ein einem getrennten Schritt danach statt. Erhitzen auf eine geeignete Temperatur (angegeben als "erste Temperatur" oder T1) ist ein bevorzugtes Mittel zur Denaturierung. Im allgemeinen ist diese erste Temperatur im Bereich von ungefähr 85 bis ungefähr 100°C für eine geeignete Zeit, z. B. von 1 bis ungefähr 240 Sekunden (bevorzugterweise 1 bis ungefähr 40 Sekunden). Dieser anfängliche Denaturierungsschritt kann auch im ersten Amplifikationszyklus eingeschlossen sein. In solchen Fällen kann die Denaturierung länger im ersten Zyklus (z. B. bis zu 240 Sekunden) sein, wohin gegen später die Zyklen sehr viel kürzere Denaturierungsschritte aufweisen können (z. B. bis zu 30 Sekunden).
  • Die denaturierten Stränge werden dann mit dem geeigneten Sets von Primern durch abkühlen des Reaktionsgemischs zur zweiten Temperatur T2, geprimt, die im allgemeinen innerhalb des Bereichs von ungefähr 55 bis ungefähr 70°C liegt. Es ist wünschenswert, daß ein Abkühlen so schnell wie möglich durchgeführt wird, jedoch dauert dies im allgemeinen mit augenblicklich bekannter Ausrüstung über eine Zeitdauer von ungefähr 5 bis ungefähr 40 Sekunden und weiter bevorzugt von ungefähr 5 bis ungefähr 20 Sekunden.
  • Sobald die denaturierten Stränge abgekühlt sind, wird das Reaktionsgemisch, das die PCR Reagenzien enthält, bei einer dritten Temperatur, T3, inkubiert, im allgemeinen für von 1 bis ungefähr 120 Sekunden und bevorzugterweise von 1 bis ungefähr 80 Sekunden, um die Bildung von Primer-Verlängerungsprodukten zu bewirken. Im allgemeinen liegt die dritte Temperatur im Bereich von ungefähr 55 bis ungefähr 70°C. Bevorzugterweise liegt sie im Bereich von ungefähr 62 bis ungefähr 70°C.
  • In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform sind die zweiten und dritten Temperaturen dieselben und liegen innerhalb des Bereichs von ungefähr 62 bis ungefähr 70°C. Daher werden das Primen und die Primer-Verlängerung bevorzugterweise in demselben Schritt durchgeführt.
  • Daher umfaßt ein Amplifikationszyklus die Denaturierung, das Primen (oder Annealing) und die Primer-Verlängerungsschritte wie oben beschrieben. Im allgemeinen werden mindestens 15 solcher Amplifikationszyklen bei der Durchführung dieser Erfindung durchgeführt, wobei die maximale Zahl von Zyklen innerhalb der Entscheidung des bestimmten Verwenders liegt. In den meisten Fällen werden 15 bis 50 Amplifikationszyklen in dem Verfahren verwendet, wobei 15 bis 40 Zyklen bevorzugt sind. Jeder Amplifikationszyklus beträgt im allgemeinen von ungefähr 20 bis ungefähr 360 Sekunden, wobei eine Zykluszeit von ungefähr 30 bis 120 Sekunden bevorzugt ist und von ungefähr 30 bis ungefähr 90 Sekunden weiter bevorzugt ist. Jedoch könne längere oder kürzere Zykluszeiten verwendet werden, falls gewünscht.
  • Wenn im Bezug auf die Zeit für einen gegebenen Schritt im Bezug auf das Amplifikationsverfahren verwendet, detrifft der Ausdruck "ungefähr" ±10% dieser Zeitgrenze. Darüber hinaus, wenn im Bezug auf Temperaturen verwendet, betrifft der Ausdruck "ungefähr" ±5°C.
  • Das Amplifikationsverfahren dieser Erfindung wird bevorzugterweise auf eine kontinuierliche automatisierte Weise durchgeführt, so daß das Reaktionsgemisch auf eine kontrollierte Weise für eine gewünschte Zahl von Zeiten zyklisiert wird. Eine Zahl von Instrumenten wurden für diesen Zweck entwickelt, wie der Fachmann wissen würde. Bevorzugterweise werden diese verwendeten Instrumente auch programmierbar sein, für sowohl primäre und sekundäre Amplifikationszyklen.
  • Ein solches Instrument für diesen Zweck ist in einigem Detail in US-A-4,965,188 und EP-A-0 236,069 beschrieben. Im allgemeinen enthält dieses Instrument einen Hitze leitenden Behälter zum Halten einer Zahl von Reaktionsröhrchen, die Reaktionsgemisch enthalten, ein Mittel zur Erwärmung, Abkühlung und Temperaturaufrechterhaltung und ein Computermittel, um Signale zu erzeugen, um die Amplifikationssequenz, die Veränderungen in der Temperatur und den Zeitablauf zu kontrollieren.
  • EP-A-0 402 994 stellt Details von brauchbaren chemischen Testpacks zur Verfügung, die unter der Verwendung des in US-A-5,089,233 (Devaney, Jr. et al.) beschriebenen Instruments verarbeitet werden. Auch darin beschrieben sind Mittel zum erhitzen und abkühlen des Testpacks in wiederholten Intervallen (gemeint ist durch Zyklen) die für das Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Weitere Details im Hinblick auf brauchbare PCR Verarbeitungsausrüstung können aus der beträchtlichen Literatur in dem Bereich erhalten werden und wären dem Fachmann im Stand der Technik leicht bekannt.
  • Neben den oben beschriebenen chemischen Testpacks kann das Verfahren in anderen Behältern, wie z. B. denjenigen, die in einigem Detail in US-A-4,902,624 (Columbus et al), US-A-5,173,260 (Zander et al.) und US-A-5,229,297 (Schnipelsky et al.) beschriebenen und anderen geeigneten Behältern durchgeführt werden, was dem Fachmann im Stand der Technik leicht ersichtlich ist. Solche Testpacks sind auch als selbst-enthaltende Testvorrichtungen bekannt, die getrennte Kompartimente für in dem Verfahren dieser Erfindung verwendete verschiedene Reagenzien aufweisen. Die Abteilungen sind geeignet miteinander verbunden, so daß Reagenzien und Testlösungen zu geeigneten Zeiten mit dem Fang-Reagenz in Kontakt gebracht werden können, ohne die Vorrichtung zu öffnen.
  • Der Nachweis von amplifizierten Produkten kann unter der Verwendung jedes bekannten Verfahrens erreicht werden, einschließlich Southern blotting Techniken, wie beschrieben in US-A-4,965,188 (oben angegeben) oder durch die Verwendung von markierten Sonden oder Primern, wie es im Stand der Technik bekannt ist.
  • Alternativ zu den oben beschriebenen Ausführungsformen können die amplifizierten Produkte unter der Verwendung eines markierten Oligonukleotids nachgewiesen werden, das zu einem der Primer-Verlängerungsprokukte komplementär ist.
  • In den heterogenen Nachweissystemen dieser Erfindung werden die amplifizierten Produkte auf einem wasserunlöslichen Substrat einer Art gefangen und die anderen Materialien des Reaktionsgemischs werden auf eine geeignete Weise entfernt, wie z. B. durch Filtration, Zentrifugation, Waschen oder andere Abtrenntechnik.
  • Fangsonden können unter der Verwendung von bekannten Anbringungstechniken (einschließlich Absorption und kovalenten Reaktionen) auf wasserunlöslichen Trägern angebracht werden. Eine solche Technik ist beschrieben in EP-A-0 439 222 (veröffentlicht am 18. September 1991). Andere Techniken sind zum Beispiel in US-A-4,713,326 (Dattagupta et al.), US-A-4,914,210 (Levenson et al.) und EP-B-0 070 687 (veröffentlicht am 26. Januar 1983) beschrieben. Brauchbare Abtrennmittel schließen Filtration durch Membranen, wie zum Beispiel Polyamid-mikroporöse Membranen, käuflich erhältlich von Pall Corporation, ein.
  • Jedoch kann jeder brauchbare feste Träger dazu verwendet werden, um die Fangsonde zu verankern und ein eventuelles Hybridisierungsprodukt, einschließlich Mikrotiterplatten, Teströhrchen, Bechergläser, magnetischen oder Polymerpartikeln, Metallen, Keramiken und Glaswolle, um ein paar zu nennen. Insbesondere brauchbare Materialien sind magnetische oder Polymerpartikel, die reaktive Gruppen aufweisen, die für die kovalente Anbringung der Fangsonde geeignet sind. Solche Partikel weisen im allgemeinen von 0,001 bis ungefähr 10 μm auf. Weitere Details über Beispiele von solchen Materialien werden in US-A-4,997,772 (Sutton et al.), US-A-5,147,777 (Sutton et al.), US-A-5,155,166 (Danielson et al.) und US-A-4,795,698 (Owen et al.) zur Verfügung gestellt.
  • Die Fangsonde kann auf einen flachen Träger, wie zum Beispiel einem Polymerfilm, Membranen, Filterpapieren oder Harz-beschichteten oder unbeschichteten Papier aufgebracht werden. Auf Polymerpartikel aufgebrachte Fangsonde kann auch auf solchen flachen Trägern auf eine geeignete Weise immobilisiert werden, zum Beispiel als getrocknete Ablagerungen oder durch Hitzefusion oder mit Klebstoffen angeheftet. Die Fangsonde kann zum Beispiel auf einen flachen Träger in der selbst-enthaltenden Testvorrichtung dieser Erfindung aufgebracht werden. Andere Details von solchen Materialien werden in EP-A-0 408 738 (veröffentlicht am 23. Januar 1992), WO 92/16659 (veröffentlicht am 1. Oktober 1992) und US-A-5,173,260 (Sutton et al.) zur Verfügung gestellt. Die Fangsonden können auf einem geeigneten Träger in jeder Anordnung, zum Beispiel Reihen von runden Aufbringungen oder Streifen angeordnet werden.
  • Die vorliegende Erfindung kann auch darin verwendet werden, was als "homogene" Amplifikationsverfahren bekannt ist, wobei Zielnukleinsäuren ohne den Bedarf von Fangreagenzien nachgewiesen werden. Die Einzelheiten von solchen Tests sind im Stand der Technik bekannt, wie zum Beispiel in EP-A-0 487 218 (veröffentlicht am 27. Mai 1992) und EP-A-0 512 334 (veröffentlicht am 11. November 1992).
  • Die Amplifikations-Reaktionszusammensetzung kann als eine einzelne kompakte Komponente eines Testkits enthalten sein, das für verschiedene Amplifikationstests brauchbar ist. Das Kit kann andere Reagenzien, Lösungen, Ausrüstung und andere Anweisungen einschließen, die in dem Verfahren dieser Erfindung brauchbar sind, einschließlich Fangreagenzien, immobilisiert auf einem wasserunlöslichen Substrat, Waschlösungen, lysierende Lösungen, Nachweisreagenzien und andere Materialien, die den Fachmann leicht ersichtlich sind. Zusätzlich kann das Testkit ein getrennt verpacktes schwach basisches Polymer, wie oben beschrieben, Puffer, schwache oder starke Basen und andere Reagenzien einschließen, die für jede oder beide Amplifikations- und Specimen-Probenpräparation erforderlich sind. Das Testkit kann auch eine Testvorrichtung einschließen, die eine oder mehrere andere Kitkomponenten enthält. Die Testvorrichtung ist bevorzugterweise "selbst-enthaltend", sowie dieser Ausdruck im Stand der Technik verstanden wird. Andere Kits können das hier beschriebene schwach basische Polymer und ein oder mehrere Reagenzien (wie zum Beispiel Nachweis oder Fangsonden), die in Hybridisierungstests verwendet werden, enthalten.
  • Die folgenden Beispiele sind enthalten, um die Durchführung dieser Erfindung zu verdeutlichen und sind nicht gedacht, auf irgendeine Art und Weise begrenzend zu sein. Alle Prozentwerte sind pro Gewicht, wenn nicht anders angegeben.
  • Materialien und Verfahren für Beispiele:
  • Herstellung von N-(3-Imidazolylpropyl)metacrylamid
  • Dieses Verfahren zeigt die Herstellung eines neuen Monomers der Struktur (I), wie oben angegeben, jedoch ist die Herstellung repräsentativ dafür, wie andere Monomere innerhalb des Bereichs dieser Erfindung leicht hergestellt werden könnten.
  • Ein Lösungsmittelgemisch wurde durch Mischen von Wasser (100 ml), enthaltend Natriumhydroxid (12,8 g, 0,32 Mol) und Dichlormethan (200 ml), enthaltend 1-(3-Aminopropyl)imidazol (37,5 g, 0,3 Mol) hergestellt und in einem Eisbad gekühlt. Zu diesem abgekühlten Gemisch wurde gleichzeitig Methacryloylchlorid (34,8 g, 0,3 Mol) in Dichlormethan (100 ml) mit kräftigem Rühren unter einer Stickstoffatmosphäre hinzugefügt. Es entwickelte sich Hitze, wobei die Temperatur des Gemisches auf ungefähr 60°C anstieg, und das Gemisch wurde für weitere 10 Minuten kräftig gerührt, und dann wurde der organischen Phase ermöglicht, sich abzutrennen. Die wäßrige Phase wurde zweimal mit Dichlormethan (100 ml, jedesmal) extrahiert. Die kombinierten organischen Lösungen (die organische Lösungsmittelphase und die Extrakte) wurden mit gesättigtem Natriumchlorid (100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel wurde entfernt. Der Rest wurde in Chloroform (50 ml) gelöst, gefolgt von der Hinzugabe von Ethylether (50 ml) bis zu einer Wolkenbildung.
  • Das sich ergebende Reaktionsprodukt kristallisierte bei ungefähr 0°C und wurde abfiltriert, um einen weißen Feststoff zu ergeben, der einen Schmelzpunkt von 45–46°C aufweist. Die Ausbeute war 70%.
  • Die analytischen Daten schlossen ein: m/e (M-193), 1H NMR (DMSO d6) 1,8 (m, 2H, C-CH2 C, CH3), 3.02 (m, 2H, N-CH2), 3,95 (t, 2H, im-CH2), 5,25 und 5,6 (AB, 2H, Vinyl-CH2), 6,82 und 7,15 (AB, 2H, 4,5 H von im), 7,6 (s, 1H, 2-H von im), 7,95 (m, 1H, NH).
  • Präparation von Homopol
  • Ein bevorzugtes Homopolymer, hergestellt aus einem hier beschriebenen neuen Monomer wurde durch Hinzufügen von 2,2'-Azobis(2-methylpropionitril) (300 mg) zu einer Lösung von N-(3-Imidazolylpropyl)methacrylamid (12,5 g, 0,065 Mol) in Wasser (90 ml) und Iso propanol (10 ml) hergestellt, und dabei unter einer Stickstoffatmosphäre gehalten. Die sich ergebende Lösung wurde erhitzt, während sie gerührt wurde, auf 65–70°C in einem Wasserbad für 3 Stunden. Nach ungefähr 1,5 Stunden dieser Zeit wurde das konzentriert HCl (3 ml) hinzugefügt und das Rühren wurde unter Stickstoff für den Rest der Zeit fortgeführt. Die Lösung wurde dann auf einem Rotationsevaporator auf ungefähr 25 ml konzentriert und das sich ergebende Polymerprodukt wurde in Aceton ausgefällt (über 4 Liter), filtriert und in deionisiertem Wasser (80 ml) gelöst. Die Lösung enthielt 12% Feststoff.
  • Herstellung von erstem Copolymer
  • Poly[N-(3-Imidazolylpropyl)methacrylamidhydrochlorid-co-acrylamid] (90 : 10 Gewichtsverhältnis) wurde durch Hinzufügen von 2,2'-Azobis(2-methylpropionitril) (400 mg) zu einer Lösung von N-(3-Imidazolylpropyl)methacrylamid (18 g, 0,09 Mol) und Acrylamid (2 g, 0,028 Mol) in deionisiertem Wasser (120 ml) und Isopropanol (15 ml) hinzugefügt, und dabei unter einer Stickstoffatmosphäre gehalten. Die Lösung wurde mit Rühren am 65–70°C für 4 Stunden erhitzt, gefolgt von Hinzugabe von verdünnter HCl, um den pH auf ungefähr 2 abzusenken. Rühren und Erhitzen wurden für eine weitere Stunde fortgeführt und der Lösung wurde es dann ermöglicht, über Nacht Raumtemperatur zu erreichen.
  • Die Lösung wurde auf ungefähr 75 ml unter der Verwendung eines Rotationsevaporators konzentriert und das sich ergebende Polymer wurde in Aceton ausgefällt (ungefähr 4 Liter), filtriert und in deionisiertem Wasser (150 ml) gelöst. Die weitere Konzentration auf ungefähr 125 ml wurde durchgeführt, um restliches Aceton zu entfernen. Das Polymer war bei 15,5% Feststoffen vorhanden.
  • Herstellung des zweiten Copol
  • Poly[2-Aminoethylmethacrylathydrochlorid-co-2-hydroxyethylmethacrylat] (20 : 80 Gewichtsverhältnis) wurde durch hinzufügen von 2,2'-Azobis(2-methylpropionitril) (400 mg) zu einer Lösung von 2-Aminoethylmethacrylathydrochlorid (4 g, 0,02 Mol) und 2-Hydroxyethylmethacrylat (16 g, 0,12 Mol) in deionisiertem Wasser (180 ml) und Ethanol (20 ml) hergestellt und dabei unter einer Stickstoffatmosphäre gehalten. Die Lösung wurde auf 65–70°C mit Rühren für 4 Stunden erhitzt. Rühren und Erhitzen wurden für eine weitere Stunde fortgeführt, und der Lösung wurde es dann erlaubt, über Nacht Raumtemperatur zu erreichen.
  • Das sich ergebende Polymer wurde in Azeton (ungefähr 4 Liter) ausgefällt, filtriert und in deionisiertem Wasser (150 ml) gelöst. Eine weitere Konzentration auf ungefähr 125 ml wurde durchgeführt, um restliches Azeton zu entfernen. Das Polymer war bei 5.6% Feststoff vorhanden.
  • Herstellung des dritten Copolymers
  • Poly[1-Vinylimidazol-co-2-hydroxyethylmethacrylat] (50 : 50 Gewichtsverhältnis) wurde durch hinzufügen von 2,2'-Azobis(2-methylpropionitril) (350 mg) zu einer Lösung von 1-Vinylimidazol (10 g, 0,1 Mol) und 2-Hydroxyethylmethacrylat (10 g, 0077 Mol) in N,N-Dimethylformamid (160 ml) hergestellt und dabei unter einer Stickstoffatmosphäre gehalten. Die Lösung wurde mit Rühren für 7 Stunden auf 65–70°C erhitzt.
  • After Absetzen bei Raumtemperatur über Nacht, wurde das Polymer in Azeton (ungefähr 4 Liter) ausgefällt, filtriert und in deionisiertem Wasser (200 ml) gelöst, das konzentrierte HCl (8,5 ml) enthielt. Eine weitere Konzentration wurde durchgeführt, um restliches Azeton zu entfernen. Das Polymer war bei 12.4% Feststoff vorhanden.
  • Herstellung des vierten Copolymers
  • Poly(1-Vinylimidazol-co-2-hydroxyethylmethacrylat) (25 : 75 Gewichtsverhältnis) wurde auf eine Weise ähnlich wie das "Dritte Copolymer" hergestellt. Die sich ergebende Lösung enthielt 13.7% Feststoffe.
  • Rekombinante DNA Polymerase von Thermus aquaticus wurde unter der Verwendung herkömmlicher Verfahren hergestellt und wies eine Aktivität von ungefähr 250,000 Einheiten/mg Protein auf.
  • Die folgenden Primer und Sonden wurden unter der Verwendung von Ausgangsmaterialien und Verfahren unter der Verwendung eines Applied Biosystems Model 380B DNA Synthesisers und Standard-Phosphoramiditchemie und dem ABI 1 μmolarem Maßstab, schneller Zyklus-Protokoll, hergestellt. Nukleosid-3'-phosphoramidite und Nukleosid-derivatisierte kontrollierte Poren Glasträger wurden von Applied Biosystems erhalten.
  • Zu der Hauptcapsid Proteinregion der menschlichen Cytomegalovirus DNA komplementäre Primer und Sonden waren wie folgt:
  • Figure 00270001
  • Zu der 65 kD Antigenregion der Mycobacterium tuberculosis DNA komplementäre Primer und Sonden waren wie folgt:
  • Figure 00270002
  • Zu der gag Region von HIV1 proviraler DNA komplementäre Primer und Sonden waren wie folgt:
  • Figure 00270003
  • In den Primersequenzen stellt X eine Biotinphosphoramiditgruppe dar (von DuPont), die über zwei Tetraethylenglycol-Abstandseinheiten an die Sequenz angebracht wurde, unter der Verwendung der Lehre von US-A-4,914,210 (Levensonet al.). Alle Reinigungen wurden unter der Verwendung einer Nukleinsäure-Reinigungssäule durchgeführt, gefolgt von Umkehrphase HPLC-Techniken.
  • In den Fangsonden-Sequenzen enthält Y zwei Tetraethylenglycol-Abstandsarme, die durch einen Phosphat-Brücke verbunden sind und eine 3-Amino-1,2-propandiol-Gruppe, die unter der Verwendung der Verfahren des Levison et al.-Patents, wie oben angegeben, präpariert wurden.
  • HIVI Ziel provirale DNA mit niedriger Kopienzahl wurde aus der 8E5/LAV Zelllinie extrahiert (enthält eine einzelne integrierte Kopie des HIV1-Genoms), unter der Verwendung herkömmlicher Verfahren. Im Anschluß an die Zellyse und Proteinverdau wurde die Nukleinsäure durch Phenol/Chloroformextraktion gereinigt: tris-gesättigtes Phenol (57 μl) wurde zur Zelldispension hinzugefügt und die Phenol/Lysatlösungen wurden gemischt und durch Zentrifugation abgetrennt. Die wäßrige Phase wurde dann in ein frisches 2 ml Röhrchen überführt. Dieses Verfahren wurde unter der Verwendung von Chloroformisoamyl-Alkohol wiederholt. Die wäßrige Lage wurde auf 0,3 Molar mit Natriumacetat gebracht. Die Nukleinsäuren wurden durch Hinzufügen von 95% kaltem Ethanol und Lagern bei –70°C für eine Stunde ausgefällt. Die Konzentration von HIVI proviraler DNA wurde dann bei A260 bestimmt und serielle Verdünnungen von verschiedenen Kopienzahlen wurden in "TE"-Puffer gemacht [tris(Hydroxymethyl)aminomethan 1 (mMolar) und (Ethylendinitrilo)tetraessigsäure (0,1 mMolar)] für die Verwendung in den Experimenten. Probe (5–10 μl) wurde zum Fangen zur DNA-Lösung hinzugefügt.
  • Der Kontroll-hCMV-Stamm AD169 (ATCC VR538) wurde in MRC-5 (ATCC CCL171) Zellen vermehrt, bis ein charakteristischer zytopathischer Effekt in > 90% der Monolage ersichtlich war. Zellkulturflüssigkeit wurde geerntet, 20% finales Volumen fötales Rinderserum wurden hinzugefügt und die Zellen wurden pelletiert. Der Überstand, der freies Virus enthielt, wurde bei –80°C gefroren. Für Kontroll-DNA-Amplifikationen wurden 1 : 10 serielle Verdünnungen der Vorratspräparation in Pufferlösung hergestellt [tris(hydroxymethyl)aminomethan (10 mMolar, pH 8) und TWEENTM 20 nicht-ionisches Oberflächen-aktives Mittel (0,5%)]. Die seriellen Verdünnungen wurden dann für 5 Minuten gekocht um die viralen Partikel zu lysieren und Aliquots dieser Proben wurden zu dem PCR-Reaktionsgemisch hinzugefügt.
  • Mycobakterium tuberculosis DNA wurde durch Verdünnen von kultivierten M. Tuberculosis, einem avirulenten Stamm H37Ra (ATCC 25177) auf die selbe Trübung, wie ein MacFarland #1 Standard erhalten. Diese entspricht ungefähr 3 × 108 Kolonie bildende Einheiten/ml (cfu). Für DNA Amplifikationen wurde 1 : 10 serielle Verdünnungen dieser Vorratspräparation in die oben genannte Pufferlösung hergestellt die seriellen Verdünnungen wurden dann für 30 Minuten gekocht, um die Bakterien zu lysieren. Ein Spiegel von Zielnukleinsäure, der 1,8 × 104 cfu entsprach wurde in jedem 300 μl Reaktionsgemisch verwendet.
  • Klinische Proben für Beispiel 3 wurden von Dr. Gregory J. Buffone am Baylor College of Medicine, Texas Children's Hospital (Houston, Texas) erhalten. Diese Proben wurden vorher als entweder hCMV DNA "Kultur positiv" oder "Kultur negativ" bestimmt. Kultur positive Proben wurden weiterhin durch die Länge der Zeit bewertet, die für Kultur positive Ergebnisse erforderlich war, visuell beobachtbar zusein (von Proben, die zu früheren Zeiten positiv sind wird im allgemeinen angenommen, daß sie mehr kultivierbares Virus enthalten).
  • Desoxyribonukleotide (dNTP's), Tris(hydroxymethyl)aminomethan-Puffer und lyophilisierte Kalbsthymus DNA wurden von Sigma Chmical Co. erhalten.
  • ZONYLTM FSP anionisches fluoriniertes Phosphatester oberflächenaktives Mittel wurde von DuPont erhalten.
  • TWEENTM 20 nichtionisches oberflächenaktives Mittel wurde von ICI Americas, Inc. erhalten.
  • Der für die angegebene DNA Polymerase spezifische monoklonale Antikörper wurde hergestellt, wie beschrieben in US-A-5,338,671 (oben angegeben).
  • Eine Streptavidin-Peroxidase Konjugatlösung umfaßte ein käuflich erhältliches (Zymed Lavoratories, Inc.) Konjugat von Streptavidin und Meerrettich Peroxidase (131 ng/ml), Casein (0,5%), 4'-Hydroxyacetanilid (10 mmolar) und Merthiolat (0,5%) in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (25 mmolar Natriumphosphat und 75 mmolar Natriumchlorid). Die finale Konjungat-Konzentration war 312 ng/ml.
  • Eine Waschlösung (pH 7,4) enthielt Natriumphosphat, monobasisches 1-Hydrat (25 mmolar), Natriumchlorid (373 mmolar), (Ethylendinitrilo)tetraessigsäuredinatriumsalz (2,5 mmolar), Ethylquecksilberthiosalizylsäurenatriumsalz (25 μmolar) und Decylnatriumsulfat (38 mmolar).
  • Die Farbstoff zur Verfügung stellende Zusammensetzung (pH 6,8) enthielt 4,5-Bis(4-Dimethylaminophenyl)-2-(4-hydrocy-3-methoxyphenyl)Imidazol Leukofarbstoff (250 μmolar), Poly(vinylpyrrolidon) (112 mmolar), Wasserstoffperoxid (0,03%), Diethylentriaminpentaessigsäure (100 μmolar), 3'-Chlor-4'-hydroxyacetanilid (5 mmolar) und Natriumphosphat, monobasisch, 1-Hydrat (10 mmolar).
  • Die wäßrige Farbsignal-Stopplösung enthielt Natriumazid (0,1%).
  • Die Fangreagenzien wurden durch Anbringen von SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 6 oder SEQ ID NO. 9 Oligonukleotiden wie oben angegeben an Partikel aus Poly[Styrol-co-3-(p-vinylbenzylthio)propionsäure] (95 : 5 Gewichtsverhältnis, 1 μm durchschnittlichen Durchmesser) auf die folgende Weise hergestellt. Eine Suspension der Partikel in Wasser wurde zweimal mit 2-(N-Morpholino)enthansulfonsäurepuffer (0,1 molar, pH 6) gewaschen und auf ungefähr 10% Feststoff suspendiert. Eine Probe (3,3 ml) der gewaschenen Partikel, verdünnt auf 3,33% Feststoffe in dem Puffer (0,1 molar) wurden mit 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (2,1 ml von 84 mg/ml Wasser) und der geeigneten Probe (22 μl von 44,44 OD/ml nanoreinem Wasser) gemischt. Die erhaltene Lösung wurde bei 50°C in einem Wasserbad für ungefähr 2 Stunden mit dazwischen liegendem Mischen erhitzt und zentrifugiert. Die Partikel wurden 3 mal mit Tris(hydroxymethyl)aminomethanpuffer (0,01 molar, pH8), enthaltend (Ethylendinitrilo)tetraessigsäuredinatriumsalz (0,001 molar) und darin auf 4% Feststoffe resuspendiert.
  • Ein PCR Reaktionsgemisch (100 ml) schloß Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochloridpuffer (10 mmolar, pH 8), Kaliumchlorid (50 mmolar), Magnesiumchlorid (10 mmolar), Gelatine (0,01%) dATP, dCTP, dGTP und dTTP (jeweils 1,5 mmolar in Beispielen 2 und 3 und jeweils 1,0 mmolar in Beispiel 4), Glyzerin (9,5%), Primer (jeweils 0,4 μmolar wenn nicht anders angegeben), DNA Polymerase wie oben angegeben (16 Einheiten/100 u1) und einen monoklonalen Antikörper, der für die oben angegebene DNA Polymerase spezifisch ist (50 : 1 Molverhältnis zu DNA Polymerase, nur in Beispielen 2 und 4).
  • Die Amplifikation durch PCR wurde in Beispiel 2 unten unter der Verwendung von Einwegchemischen-Testpacks oder Vorrichtungen durchgeführt, die Kammern für einzelne Reagenzien und Lösungen enthielten. Diese Kammern und die Vorrichtung wurden aus einer Lage von Polyester (0,01 cm Dicke) gebildet, das mit Polyethylen beschichtet war (SCOTCH PAKTM von 3 M Co), so umgestaltet, um eine runde Kammer von ungefähr 1,3 cm im Durchmesser zur Verfügung zu stellen. Eine Öffnung wurde zur Verfügung gestellt, um die Zuführung des PCR Reagenzgemisches zu ermöglichen, daß in eine Kammer durch Vakuum hineingezogen wurde. Die Öffnung wurde dann hitzeversiegelt. Nach der Amplifikation wurde eine Ecke der Kammer abgeschnitten und das Reaktionsgemisch, enthaltend Produkte, wurde in ein Mikrofugenröhrchen (0,5 ml) zur Lagerung bei 4°C transferiert, bis der Nachweis der Produkte durchgeführt wurde. Das PCR Protokoll wurde unter der Verwendung eines konventionellen automatisierten PCR Prozessors durchgeführt, der im Detail in US-A-5,089,233 beschrieben ist.
  • Die Amplifikation in den Beispielen 3 und 4 wurde in 0,2 ml MICROAMPTM Reaktionsröhrchen unter der Verwendung eines herkömmlichen Perkin Elmer GENEAMPTM PCR System 9600 Thermocyclers durchgeführt.
  • Die PCR Amplifikationsprotokolle sind unten in den jeweiligen Beispielen beschrieben.
  • SURECELLTM Testvorrichtungen wurden dazu verwendet, um die Amplifikationsprodukte nachzuweisen. Diese Vorrichtungen sind von Eastman Kodak Company (Clinical Diagnostics Division) erhältlich und enthalten drei Test Wells, jedes mit einer vormontierten LOPRODYNETM mikroporösen Membran (Pall Corp., 5 μm durchschnittliche Porengröße). Nach Verdünnung auf 0,25% wurde jedes Fangreagenz (1,2 μl) aufgetragen und getrocknet in definierten Regionen der Membranen in den Test Wells der Testvorrichtungen. Diese Testvorrichtungen sind genauer in US-A-4,948,561 (Hinckley et al) beschrieben.
  • Der Nachweis wurde auf die folgende Weise durchgeführt. Ein Teil (5 μl) des finalen Amplifikationsreaktionsgemisches wurde mit einer Pufferlösung [Tris(hydroxymethyl)aminomethan (10 mmolar, pH 8), Kaliumchlorid (50 mmolar), Magnesiumchlorid (10 mmolar) und Gelati ne (0,01%)] (95 μl) gemischt und bei 95°C für 5 Minuten inkubiert, um die Nukleinsäure zu denaturieren. Die sich ergebende Lösung wurde dann auf SURECELLTM Testvorrichtungen transferiert, so daß die amplifizierten Zielnukleinsäuren mit den Fangproben bei 50°C hybridisiert werden konnten.
  • Die Test Wells der Testvorrichtung wurden dann bei 55°C mit einer Pufferlösung [Natriumdihydrogenphosphat (10 mmolar), Natriumchlorid (150 mmolar), Natriumdezylsulfat (1%) und Ethylendiamintetraessigsäure (1 mmolar)] (250 μl, pH 7,4) gewaschen. Die Streptavidin-Peroxidase Konjugatlösung (50 μl) wurde zu jedem Test Well hinzugefügt und es ihr ermöglicht, bei Raumtemperatur durch die Membranen zu fließen. Nach 2 Minuten wurden die Test Wells ein zweites Mal gewaschen.
  • Die Farbe zur Verfügung stellende Zusammensetzung (100 μl) wurde dann zu jedem Test Well hinzugefügt, gefolgt von Inkubation bei Raumtemperatur für 2 Minuten. Die Farbstopplösung (100 μl) wurde dann zu jedem Test Well hinzugefügt, um eine Farbentwicklung zu stoppen und das sich ergebende Farbsignal wurde visuell auf einer Dichteskala von 0 bis 10 (höchste Dichte) eingestuft. Hintergrund-Ablesungen wurden von den Regionen auf den Membranen erhalten wo kein Fangreagenz aufgetragen wurde.
  • Gelelektrophorese wurde durch hinzufügen des Amplifikationsgemisches (6,75 μl) auf Agarosegele (2,5%) durchgeführt, die mit Ethidiumbromid (0,4 mg/ml finale Konzentration) vorgefärbt wurden. Die Gele wurden bei ungefähr 8 Volt/cm für ungefähr 1 Stunde unter der Verwendung eines Elektrophoresepuffers (600 ml), der Ethidiumbromid enthielt (0,4 mg/ml finale Konzentration) elektrophoriert. Der Puffer war ein Gemisch von Tris(hydroxymethyl)aminomethan, Borat und Ethylendiamintetraessigsäure. Die sich ergebenden Banden wurden mit herkömmlichen Molekulargewichtsmarkern verglichen und die Produktbanden Intensität wurde bewertet (115-mer für HIV1 und 383-mer für M. tuberculosis) auf einer 0 bis 5 Skala, wobei 0 kein nachweisbares Signal darstellte und 5 das höchste Signal darstellte.
  • Andere Reagenzien und Materialien wurden entweder aus kommerziellen Quellen erhalten oder unter der Verwendung von leicht erhältlichen Ausgangsmaterialien und herkömmliche Verfahren hergestellt.
  • Beispiel 1
  • Fangen und Freisetzung von DNA unter der Verwendung von schwach basischem Homopolymer
  • Dieses Beispiel verdeutlicht die Durchführung der vorliegenden Erfindung, eine Nukleinsäure unter der Verwendung von Poly(1-vinylimidazol) zu fangen und freizusetzen.
  • Verschiedene Volumen von Poly(1-vinylimidazol) [von einer 1 : 10 Verdünnung von 2,4% Vorratslösung (pH 2.3)] wurden mit Kalbsthymus DNA (100 μl, 0.5 μg/μl) gemischt und gevortext, um ein Präzipitat von Nukleinsäure und Polymer zu bilden. Dann wurde ein Zentrifugieren für 1 Minute durchgeführt. Eine zusätzlich Menge von Polymer (10 μl von der 2,4% Vorratslösung) wurde zu jedem Überstand hinzugefügt und die sich ergebenden Gemische wurden gevortext und zentrifugiert, um zu bestimmen, ob das erste Präzipitat quantitativ war. Tabelle I unten zeigt die Menge von verwendetem Polymer und den Typ von Präzipitat, der für jede Probe beobachtet wurde.
  • TABELLE I
    Figure 00330001
  • Es wurde beobachtet, daß ein Ausfallen unter sauren Bedingungen (pH 2,3) auftrat und daß 50 μl von der 1 : 10 Verdünnung von Polymer Vorratslösung dazu verwendet werden konnten, um 100 μl von der Kalbsthymus DNA Lösung (0,5 μg/μl) auf eine nahezu quantitative Weise auszufällen. Diese Beobachtung wurde auch unter der Verwendung von herkömmlichen gelelektrophoretischen Verfahren bestätigt.
  • Experimente wurden durchgeführt, um zu bestimmen, wie das Präzipitat gelöst werden kann, wodurch die Nukleinsäure für die spätere Verwendung freigesetzt wird. Tabelle II unten zeigt die verschiedenen Pellet versuchten Lösungs-Bedingungen und die sich ergebende Pelletgröße. Die am meisten brauchbare Technik war die Verwendung von Hitze in Kombination mit basischem pH (kein Pellet). Herkömmliche Gelelektrophorese zeigte klar, daß bei einem basischem pH das Polymer und Nukleinsäuren wurde als freie Materialien vorhanden waren. Daher waren die Nukleinsäuren für die spätere Verwendung, wie zum Beispiel in PCR, erhältlich.
  • Tabelle II
    Figure 00340001
  • Tabelle III unten zeigt den Effekt von pH auf die Bildung von einem Präzipitat zwischen dem Polymer (50 μl von 1 : 10 Verdünnung von Vorratslösung) und Kalbsthymus DNA (100 μl von 0,5 μg/μl Lösung). Saurer pH war klar für effektives Fangen der Nukleinsäure durch Bildung von einem Präzipitat (Pellet) erforderlich.
  • Tabelle III
    Figure 00350001
  • Beispiel 2
  • Fangen und Freisetzung von HIV1 proviraler DNA und Amplifikation von HIV1 DNA und genomischer Mycobacterium tuberculosis DNA
  • Dieses Beispiel zeigt die Durchführung von dieser Erfindung, um eine Zielnukleinsäure in der Anwesenheit von nicht-Zielnukleinsäuren zu fangen und freizusetzen, gefolgt von Amplifikation von der isolierten Zielnukleinsäure.
  • Sonden für die Experimente wurden durch Mischen von Kalbsthymus DNA (nicht Ziel-DNA, 250 μl, 0.5 μg/μl), mit oder ohne 100 Kopien von HIV1 proviraler DNA, mit Poly(1-vinylimidazol) (125 μl von 1 : 10 Verdünnung von 2,4% Lösung) hergestellt, gevortext, um Präzipitat zu bilden, und Zentrifugieren für 1 Minute, um das Präzipitat zu isolieren.
  • Das Präzipitat wurde in entweder einer Lösung Natriumhydroxid (187,5 μl, 50 mmolar) in Wasser (25 μl) oder wäßrigem Natriumhydroxid und ZONYLTM FSP anionischem fluoriniertem Phosphatester oberflächenaktiven Mittel (25 μl) resuspendiert, gefolgt von Erhitzen bei 100°C für 10 Minuten. Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid Puffer (37,5 μl, 0,5 molar) wurde dann zu jeder Lösung hinzugefügt, wobei die finale DNA Konzentration auf 0,5 μg/μl gebracht wurde. Das anionische oberflächenaktiven Mittel wurde zu einigen Präzipita ten hinzugefügt, um seinen Effekt auf die Freisetzung und Amplifikation von DNA zu bestimmen.
  • Zu jedem sich ergebenden Gemisch (60 oder 150 μl) wurde das PCR-Amplifikations-Reaktionsgemisch (240 oder 150 μl) wie oben angegeben hinzugefügt, um ein finales Reaktionsgemisch von 300 μl zu ergeben, und die Amplifikation wurde für 40 Zyklen unter der Verwendung von dem folgenden Protokoll durchgeführt:
    • 1) Denaturierung bei 95°C für 15 Sekunden (80 Sekunden für ersten Zyklus), und
    • 2) Primer Annealing und Primerverlängerung für 30 Sekunden bei 62°C für Ziel HIV1 provirale DNA.
  • M. tuberculosis DNA (100 Kopien) wurde ähnlich amplifiziert (Primerverlängerung bei 64°C in Schritt 2), mit der Ausnahme, daß sie direkt zu dem PCR Reaktionsgemisch hinzugefügt wurde. Sie wurde nicht dem schwach basischen Polymer ausgesetzt. Dies wurde durchgeführt, um zu zeigen, daß das Polymer die Amplifikation einer nicht-gefangenen Zielnukleinsäure nicht nachteilig beeinflussen würde.
  • Nach Amplifikation wurden zwei Verfahren verwendet, um die Anwesenheit von amplifizierter Ziel-DNA nachzuweisen:
    • (a) Gelelektrophorese: Ein Aliquot (12 μl) von jeder amplifizierten Produkt-Lösung wurde zu 4 μl von einer herkömmlichen Probe Laufmarker-Farbstoff hinzugefügt. Das sich ergebende Gemisch wurde auf ein 2,5% Agarosegel geladen, das mit Ethidiumbromid (0,4 mg/ml finale Konzentration) vorgefärbt war. Elektrophorese wurde für 1,5 Stunden bei 120 Volt durchgeführt. Gelbanden wurde unter ultraviolettem Licht sichtbar gemacht und wie oben beschrieben bewertet.
    • (b) Farbstoff Signal in den SURECELLTM Test Vorrichtungen wurde wie oben beschrieben erhalten.
  • Tabelle IV unten zeigt die Gelelektrophorese und die Farbstoff Farbwert-Ergebnisse für mehrere Sonden unter verschieden Bedingungen. Die Ergebnisse zeigen, daß HIV 1 provirale DNA Zielnukleinsäure erfolgreich nach Fangen und Freisetzung unter der Verwendung von dem schwach basischem Polymer amplifiziert wurde. Zusätzlich, wurde die M. tuberculosis DNA auch amplifiziert, was anzeigt, daß das Polymer in dem Reaktionsgemisch nicht die Amplifikation von einer exogen hinzugefügten Nukleinsäure inhibierte.
  • Farbstoffsignale und Gelelektrophorese-Ergebnisse bei den 30 μg und 75 μg Zielspiegeln waren mit denjenigen konsistent, die mit den selben Mengen von gekochter oder nicht gekochter Kalbsthymus DNA (Proben 17–20), oder nicht gekochter humaner Plazenta-DNA (Proben 21–23) erhalten wurden. Bei allen Siegeln von ZONYLTM FSP anionischem oberflächenaktivem Mittel, war die Amplifikation stark inhibiert und kein Signal wurde mit jeder Nachweistechnik beobachtet. Sonden 1 und 2 zeigten die am meisten effiziente Amplifikation für HIV 1 provirale DNA (24 und 60 Kopien pro jeweils 300 μl Reaktionsgemisch).
  • Tabelle IV
    Figure 00370001
  • Figure 00380001
  • Beispiel 3
  • Probenpräparation und Amplifikation von humaner Cytomegalovirus DNA
  • Dieses Beispiel zeigt die Durchführung der vorliegenden Erfindung unter der Verwendung von 9 hCMV "Kultur positiven" und 3 "Kultur negativen" Urinproben, die von einem Krankenhaus erhalten wurden. Es vergleicht auch die vorliegende Erfindung mit einem herkömmlich verwendeten Proben-präparatorischen Verfahren, gemeint ist, Erhitzen der Probe auf 100°C für 10 Minuten in Anwesenheit eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels.
  • Zwei Aliquots (jeder 150 μl) von jeder Urinprobe wurden mit einer Pufferlösung (150 μl) gemischt, die TWEENTM 20 nichtionisches oberflächenaktives Mittel (0,5%) und Kalbsthymus – DNA (10 μg) in Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid Puffer (10 mmolar, pH 8) enthielt.
  • Die Gemische wurden jedes für 10 Minuten auf 100°C erhitzt. Zu einem Set von Proben wurde ein schwach basisches Polymer, Poly(1-vinylimidazol) (125 μl, 1 : 10 Verdünnung von 2,4%), hinzugefügt, was ein Präzipitat von Polymer und Nukleinsäuren ergab. Die sich ergebenden Suspensionen wurden bei 14.000 U/min für 5 Minuten zentrifugiert. Die Überstände wurden abgegossen, und die Pellets wurden in Natriumhydroxid (83 μl, 50 mmolar) resuspendiert und auf 100°C für 10 Minuten für eine Freisetzung der Nukleinsäuren erhitzt. Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid (17 μl, 0,5 molar, pH 7) wurde dann für eine Neutralisierung der Lösung hinzugefügt.
  • Das zweite Set von auf 100°C erhielten keine weitere Behandlung.
  • Ein Aliquot (20 μl) von jeder Lösung (für beide Sets von behandelten Proben) wurde zu dem oben beschriebenen PCR Reagenzgemisch (80 μl) hinzugefügt, das die angegebenen hCMV Primer enthielt, und 40 Zyklen von PCR wurden unter der Verwendung von dem folgenden Protokoll durchgeführt:
    • 1) Denaturierung bei 94°C für 30 Sekunden, und
    • 2) Primer Annealing und Primerverlängerung für 30 Sekunden bei 64°C.
  • Der Nachweis von amplifizierten Produkten wurde unter der Verwendung von Farbstoff-Farbsignalerzeugung mit Fangsonden wie in Beispiel 2 oben beschrieben erreicht und mit den durch Bestimmung der Kultur erhaltenen Ergebnissen verglichen (nur klinische Proben).
  • 1 und Tabelle V unten zeigen die Ergebnisse von beiden Verfahren, verglichen mit Kulturergebnissen. Es ist ersichtlich, daß in diesem Beispiel, diese Erfindung eine Sensitivität von 89% (8 von 9 Kultur positiven Proben) zeigt, und eine Spezifität von 100% (3 von 3 Kultur negativen Proben) wenn verglichen mit Kulturergebnissen. Das Kontrollprobepräparatorische Verfahren (Erhitzen in Anwesenheit von einem nichtionischen oberflächenaktiven Mittel) zeigte eine Sensitivität von 33% (3 von 9 Kultur positiven Proben) und eine Spezifität von 100% (3 von 3 Kultur negativen Proben), wenn verglichen mit Kulturergebnissen.
  • Dieses Beispiel zeigt den Vorteil von Entfernen von Ziel-Nukleinsäuren aus Inhibitoren, die in klinischen Proben vorhanden sein können. Andere im Stand der Technik verwendete Verfahren erreichen dasselbe Ergebnis, jedoch auf eine kompliziertere, zeitaufwendige und Umwelt-gefährdende Weise.
  • TABELLE V
    Figure 00400001
  • Beispiel 4
  • Fangen und Freisetzung von Ziel-hCMV DNA und Amplifikation unter der Verwendung von verschiedenen Polymeren
  • Dieses Beispiel wurde ähnlich zu Beispiel 3 oben unter der Verwendung von verschiedenen schwach basischen Polymeren innerhalb des Bereichs von dieser Erfindung durchgeführt.
  • Verschiedene hCMV DNA Verdünnungen (10 μl) wurden durch Vortexen mit einer Pufferlösung (70 μl), enthaltend Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid-Puffer (10 mmolar, pH 8) und TWEENTM 20 nichtionischem oberflächenaktivem Mittel (0,5%) und mit Kalbsthymus DNA (20 μl, 0,5 μg/ μl) in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen gemischt. Verdünntes Polymer (100 μl, ungefähr 0,24% Feststoffe) wurde zu jedem Röhrchen hinzugefügt, und das sich ergebende Gemisch gevortext.
  • Polymer 1 war Poly[N-(3-imidazolylpropyl)methacrylamidhydrochlorid] (12% Feststoffe), Polymer 2 war Poly[N-vinylimidazol-co-2-hydroxyethylmethacrylat] (50 : 50 Gewichtsverhältnis, 5,3% Feststoffe), und Polymer 3 war Poly[N-(3-imidazolylpropyl)methacrylamidhydrochlorid-co-acrylamid] (90 : 10 Gewichtsprozent, 15,5% Feststoffe). Negative Kontrollen wurden ähnlich hergestellt und verarbeitet, die keine Zielnukleinsäure enthielten. Andere Kontrollen enthielten Zielnukleinsäuren, jedoch war destilliertes Wasser (100 μl) mit den Proben anstelle von Polymer gemischt.
  • Die sich ergebenden Gemische wurden für 30 Sekunden bei 14,000 U/min zentrifugiert, um jedes Präzipitat von dem Überstand abzutrennen, der verworfen wurde. Zu den sich ergebenden Pellets wurde der Puffer (100 μl, wie oben angegeben, enthaltend TWEENTM 20 nichtionisches oberflächenaktives Mittel, pH 10) hinzugegeben, gefolgt von Vortexen und Erhitzen auf 100°C für 5 Minuten.
  • Die Verdünnungsspiegel von Ziel hCMV DNA Vorratslösungen waren wie folgt:
    Spiegel 1: 1 : 500
    Spiegel 2: 1 : 5.000
    Spiegel 3: 1 : 50.000
    Spiegel 4: 1 : 500.000
  • Amplifikation und Nachweis von der gefangenen und freigesetzten Ziel hCMV DNA wurde ähnlich zu der in Beispiel 3 beschriebenen durchgeführt, unter der Verwendung von 40 Zyklen des Protokolls:
    • 1) Denaturierung bei 95°C für 30 Sekunden (180 Sekunden für ersten Zyklus), und
    • 2) Primer Annealing und Primerverlängerung für 30 Sekunden bei 68°C.
  • Die Ergebnisse sind in 2 und in Tabelle VI unten gezeigt. In 2 zeigen die ersten drei Sets von Balken die Farbstoff Farbwert-Werte, die durch die Erfindung für jedes von drei schwach basischem Polymeren von den hCMV DNA Spiegeln erhalten wurden, die gefangen und anschließend amplifiziert wurden. Das letzte Set von Balken zeigt die Ergebnisse, wenn kein Polymer verwendet wurde, um Nukleinsäuren zu isolieren. Die Farbwerte in Tabelle VI wurden wie in Beispiel 3 oben beschrieben bestimmt.
  • Die Ergebnisse zeigen, daß die drei schwach basischen Polymere effektiv Zielnukleinsäure für Amplifikation fangen und freisetzen, mit der Ausnahme des niedrigsten Zielnukleinsäurespiegels.
  • TABELLE VI
    Figure 00420001
  • Figure 00430001
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00440001
  • Figure 00450001
  • Figure 00460001
  • Figure 00470001
  • Figure 00480001

Claims (24)

  1. Verfahren, um eine Nukleinsäure aus einem Lysat zur Verfügung zu stellen, das die Schritte umfaßt: A) bei einem pH von weniger als 7, Kontaktieren eines Lysats, von dem vermutet wird, daß es eine Nukleinsäure enthält, mit einem wasserlöslichen, schwach-basischen Polymer in einer ausreichenden Menge, um ein wasserunlösliches Präzipitat des schwach-basischen Polymers mit allen Nukleinsäuren, die in dem Lysat vorhanden sind, zu bilden, B) Abtrennen des wasserunlöslichen Präzipitats vom Lysat, und C) Kontaktieren des Präzipitats mit einer Base, um den pH der Lösung auf über 7 zu erhöhen und dabei Freisetzen der Nukleinsäuren vom schwach-basischen Polymer, das schwach-basische Polymer umfaßt wiederkehrende Einheiten, erhalten durch Additionspolymerisation von einem oder mehren ethylenisch ungesättigten, polymerisierbaren Monomeren, die eine Amingruppe aufweisen, die bei saurem pH protoniert werden kann.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend den Schritt: D) Einstellen des pH der Lösung, die die freigesetzten Nukleinsäuren enthält, auf ungefähr 6 bis ungefähr 9.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Base Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Lithiumhydroxid, Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, ein tertiäres Amin oder Tris(hydroxymethyl)aminomethan ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das schwach-basische Polymer in Schritt A) in einer Menge von ungefähr 0,01 bis 0,5 Gewichtsprozent verwendet wird.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das schwach-basische Polymer wiederkehrenden Einheiten erfaßt und durch Additionspolymerisation von: a) ungefähr 15 bis 100 Gewichtsprozent eines wasserlöslichen, schwach-basischen ethylenisch ungesättigten, polymerisierbaren Monomers, das mindestens eine Gruppe aufweist, die bei saurem pH protoniert werden kann, und die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminoalkyl, Imidazolyl, Isoxazolyl, Pyridyl, Piperidyl, Piperazinyl, Pyrazolyl, Triazolyl, Tetrazolyl, Oxadiazolyl, Pyridazinyl, Pyrimidyl, Pyrazinyl, Chinolinyl und Chinazolinyl, b) 0 bis ungefähr 35 Gewichtsprozent eines nicht-ionischen, hydrophilen, ethylenisch ungesättigten, polymerisierbaren Monomers, und c) 0 bis ungefähr 85 Gewichtsprozent eines nicht-ionischen, hydrophoben, ethylenisch ungesättigten, polymerisierbaren Monomers erhalten wurde.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Schritt C) eine schwache Base verwendet wird, begleitet vom Erhitzen des wasserunlöslichen Präzipitats auf ungefähr 50 bis ungefähr 125°C.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine starke Base in Schritt C) verwendet wird, ohne das wasserunlösliche Präzipitat zu erhitzen.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend die Schritte: E) Amplifizieren einer Zielnukleinsäure, die sich unter den freigesetzten Nukleinsäuren befindet, und F) Detektieren der amplifizierten Zielnukleinsäure; zur Amplifikation und Detektion einer Zielnukleinsäure.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, weiterhin umfassend, nach Schritt C), den Schritt: D) Einstellen des pH der Lösung, die die freigesetzten Nukleinsäuren enthält, auf ungefähr 6 bis ungefähr 9.
  10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Amplifizieren mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion unter Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase und mindestens eines markierten Primers durchgeführt wird.
  11. Verfahren nach Anspruch 8 zur Amplifikation und Detektion einer Zielnukleinsäure, die in einer Probe jeglichen Typs vorhanden ist, gesammelt von HIV1, HIV2, proviralem HIV1, proviralem HIV2, Cytomegalovirus, Mycobacterium spp., humanem Papillomavirus, Hepatitisviren oder einer mit einer genetischen Krankheit assoziierten Nukleinsäure unter Verwendung von Primern, die spezifisch für und hybridisierbar mit den Strängen der Zielnukleinsäure sind.
  12. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das schwach-basische Polymer aus wiederkehrenden Einheiten besteht, erhalten durch Additionspolymerisation von: a) ungefähr 15 bis 100 Gewichtsprozent eines wasserlöslichen, schwach-basischen, ethylenisch ungesättigten, polymerisierbaren Monomers, das mindestens eine Gruppe aufweist, die bei saurem pH protoniert werden kann, und die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aminoalkyl, Imidazolyl, Isoxazolyl, Pyridyl, Piperidyl, Piperazinyl, Pyrazolyl, Triazolyl, Tetrazolyl, Oxadiazolyl, Pyridazinyl, Pyrimidyl, Pyrazinyl, Chinolinyl und Chinazolinyl b) 0 bis ungefähr 35 Gewichtsprozent eines nicht-ionischen, hydrophilen, ethylenisch ungesättigten, polymerisierbaren Monomers, und c) 0 bis ungefähr 85 Gewichtsprozent eines nicht-ionischen, hydrophoben, ethylenisch ungesättigten, polymerisierbaren Monomers.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das schwach-basische Polymer aus wiederkehrenden Einheiten aus ungefähr 20 bis ungefähr 100 Gewichtsprozent von (a) 0 bis ungefähr 25 Gewichtsprozent von (b) und 0 bis ungefähr 80 Gewichtsprozent von (c) besteht.
  14. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Monomer (a) die Formel (I) aufweist:
    Figure 00510001
    wobei R3 Wasserstoff oder Methyl ist, X Oxy oder Imino ist, R4 eine divalente Kohlenwasserstoffverbindungsgruppe ist, die von 1 bis 8 Kohlenstoffe oder Heteroatome in der Kette aufweist und ein oder mehrere Alkylengruppen umfaßt, vorausgesetzt, daß, wenn mehr als eine Alkylengruppe vorhanden ist, die in R4 mit einer oder mehreren Carbonyl-, Oxy-, Imino-, Ester- oder Aminogruppen in jeder funktionellen Kombination verbunden sind, und R4 mit einer Carbonyl-, Oxy-, Imino-, Ester- oder Amidogruppe terminiert sein kann, und R5 ein zyklisches Amin oder eine primäre, sekundäre oder tertiäre Aminoalkylgruppe ist, die bei saurem pH protoniert werden kann.
  15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Monomer (a) die Struktur (II) aufweist:
    Figure 00520001
    wobei R Wasserstoff oder Methyl ist und R1 Alkylen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 12, wobei: das Monomer (a) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus N-(3-Imidazolylpropyl)methacrylamid, 1-Vinylimidazol, 2-Methyl-1-vinylimidazol, 2-Vinylpyridin, 1-Hydroxy-6-vinyl-1H-benzotriazol, 2-Aminoethylmethacrylathydrochlorid, 2-Aminoethylacrylathydrochlorid, 1-Vinylpyrrolidinon, 3-(N,N-Dimethylamino)propylmethacrylat, 2-Aminoethylmethacrylat, N-(3-Aminopropyl)methacrylamidhydrochlorid, 2-Vinylchinolin, N-(2-Imidazolylethyl)methacrylamid, N-(3-Imidazolylpropyl)acrylamid, N-(Imidazolylmethyl)acrylamid, N-(1,1-Dimethyl-3-imidazolylpropyl)acrylamid und saure Additionssalze derselben, das Monomer (b) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Acrylamid, 2-Hydroxyethylacrylat, 2,3-Dihydroxypropylacrylat, 2,3-Dihydroxypropylmethacrylat, Poly(ethylenoxy)ethylmethacrylat (das 2 bis 10 Ethylenoxygruppen aufweist), und N,N-Dimethylacrylamid, und das Monomer (c) ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Methacrylamid, 2-Hydroxyethylmethacrylat, N-t-Butylmethacrylamid, Ethylacrylat, Methylmethacrylat, Styrol, Vinyltoluol, Methylacrylat und Butylacrylat.
  17. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das schwach-basische Polymer Poly[N-(3-imidazolylpropyl)methacrylamidhydrochlorid-co-acrylamid], Poly[N-(3-imidazolylpropyl)methacrylamidhydrochlorid-co-2-hydroxyethylmethacrylat], Poly(1-vinylimidazol), Poly(2-aminoethylmethacrylathydrochlorid-co-2-hydroxyethylmethacrylat), Poly(1-vinylimidazol-co-2-hydroxyethylmethacrylat), Poly[N-(1,1-dimethyl-3-imidazolylpropyl)acrylamid] oder Poly(N-2-methyl-1-vinylimidazol) ist.
  18. Testkit zur Amplifikation einer Zielnukleinsäure, der separat verpackt umfaßt: a) ein Amplifikationsreaktionsgemisch, umfassend ein oder mehrere Amplifikationsreagenzien, und b) ein schwach-basisches Polymer, umfassend wiederkehrende Einheiten, erhalten durch Additionspolymerisation von einem oder mehren ethylenisch ungesättigten, polymerisierbaren Monomeren, die eine Aminogruppe aufweisen, die bei saurem pH protoniert werden kann.
  19. Testkit nach Anspruch 18, wobei das schwach-basische Polymer aus wiederkehrenden Einheiten besteht, erhalten durch Additionspolymerisation von: a) ungefähr 15 bis 100 Gewichtsprozent eines wasserlöslichen, schwach-basischen, ethylenisch ungesättigten, polymerisierbaren Monomers, das mindestens eine Gruppe aufweist, die bei saurem pH protoniert werden kann, und die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Aminoalkyl, Imidazolyl, Isoxazolyl, Pyridyl, Piperidyl, Piperazinyl, Pyrazolyl, Triazolyl, Tetrazolyl, Oxadiazolyl, Pyridazinyl, Pyrimidyl, Pyrazinyl, Chinolinyl und Chinazolinyl, b) 0 bis ungefähr 35 Gewichtsprozent eines nicht-ionischen, hydrophilen, ethylenisch ungesättigten, polymerisierbaren Monomers, und c) 0 bis ungefähr 85 Gewichtsprozent eines nicht-ionischen, hydrophoben, ethylenisch ungesättigten, polymerisierbaren Monomers.
  20. Testkit nach Anspruch 18, wobei das Amplifikationsreaktionsgemisch ein Set von Primern, von denen mindestens einer markiert ist, eine Vielzahl von dNTP's und eine thermostabile DNA-Polymerase umfaßt.
  21. Testkit nach Anspruch 18, der eine Testvorrichtung umfaßt, die ein oder mehrere Kitkomponenten enthält.
  22. Testkit nach Anspruch 18, wobei das schwach-basische Polymer an ein festes Substrat gebunden ist.
  23. Verfahren nach Anspruch 8, weiterhin umfassend den Schritt von: I) Lysieren von Zellen oder Viruspartikeln vor Schritt A) und Durchführen des Schrittes: E) ohne weiteres Angleichen des pH.
  24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei das schwach-basische Polymer bei einem basischen pH wasserunlöslich ist und das Verfahren weiterhin den Schritt des Entfernens des wasserunlöslichen Polymers nach Freisetzen der Zielnukleinsäure von demselben und vor der Amplifikation derselben umfaßt.
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