DE4038293A1 - Nucleinsaeure-addukte, verfahren zu ihrer herstellung und ihrer verwendung zur in situ polymerase-kettenreaktion - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft neue Nucleinsäure-Addukte, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur in situ Polymerase- Kettenreaktion. Anwendungsgebiete sind u. a. die Gentechnik. die biochemische Analytik und die medizinische Diagnostik. Der Nachweis seltener Nucleinsäuresequenzen in zytologischen oder histologischen Präparaten erfolgt in situ bekanntermaßen mit Hilfe eines Methodenkomplexes, der unter dem Stichwort in situ Hybridisierung zusammengefaßt wird. Das Prinzip der in situ Hybridisierung besteht in der Hybridisierung zweier komplementärer Nucleinsäuresequenzen im mikroskopischen Präpa­ rat. Dabei ist der eine Komplementärstrang der gesuchte und nachzuweisende im Untersuchungsmaterial. Der andere Komplemen­ tärstrang wird als radioaktiv oder chemisch markierte Gensonde (oder Genprobe) dem Untersuchungsmaterial zugegeben und er­ laubt die Bindung der Markierung an den Komplementärstrang im Untersuchungsmaterial durch Hybridisierung (Renaturierung), falls ausreichende Basensequenz-Komplementarität zwischen der Nucleinsaure im Untersuchungsmaterial und der Gensonde vorhan­ den ist. Der Nachweis der Markierung erfolgt durch mikroskopi­ sche Auswertung eines geeigneten radiochemischen oder bioche­ mischen Detektionsverfahrens für die Markierung (W. J. G. Melchers et al: DNA detection Techniques for Routine Diagnosis of Infections: In: Techniques in Diagnostic Pathology Vol. I, Academic Press Ltd 1989, pp 151-172).

Die in situ Hybridisierung ist bisher insbesondere zum Nach­ weis von Chromosomenanomalien im Zellkern, zum Nachweis von Genexpressionen sowie zum Nachweis von Virusinfektionen in den Zellen und im Gewebe von medizinischen und biologischen Unter­ suchungsmaterialien eingesetzt worden. Als solche hat sie be­ reits außergewöhnliche Bedeutung für die medizinische Diagno­ stik und für die Forschung gewonnen, da sie als einzige Metho­ dik die Zuordnung genetischer Mutationen, die Zuordnung von Virusinfektionen und die Zuordnung spezieller Genexpressionen auf einzelne mikroskopisch sichtbare Zellen im natürlichen Ge­ webeverband erlaubt.

Ein Nachteil der in situ Hybridisierung ist ihre unbefriedi­ gende Sensitivität, die zu: Beispiel beim Nachweis des mensch­ lichen Virus HPV (Human Papillom Virus, ca. 8000 Basenpaare Doppelstrang-Desoxyribonucleinsäure) in medizinischen Biopsie- Materialien bei etwa 100 Virusgenom-Kopien pro Einzelzelle liegt. Die Art der Markierung der Gensonden (radioaktiv oder nichtradioaktiv) spielt für die Nachweissensitivität nur noch eine untergeordnete technische Rolle.

Die Erfindung wird gemäß der Ansprüche 1, 3 und 7 realisiert. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen ausgeführt. Es werden Nucleinsäure-Addukte hergestellt, die er­ findungsgemäß aus einem basischen, wasserlöslichen Polymer, das an Zellen in histologischen oder zytologischen Präparaten adsorbiert ist, und Nucleinsäuresequenzen bestehen. Die Nu­ cleinsäuresequenzen sind in den Zellen enthalten und wurden während einer Polymerase-Kettenreaktion oder einer reversen Transkriptase-Reaktion gebildet. Die erfindungsgemäßen Nu­ cleinsäure-Addukte sind amplifizierbar: sie gehen mit freien Bindungsvalenzen des intracellulär- und zirkumzellulär-adsor­ bierten basischen Polymers des Präparates Bindungen ein. Ein geeignetes wasserlösliches, basisches Polymer zur Addukt­ bildung mit den Nucleinsäuren in den Zellen ist Polyethylen­ imin oder DEAE-Dextran.

Die Vorbehandlung der histologischen und zytologischen Präpa­ rate erfolgt nach den bekannten Protokollen für eine in situ Hybridisierung bis zum Schritt Proteinase-Behandlung. Die so vorbehandelten Präparate werden mit einer wäßrigen Lösung des basischen Polymers inkubiert, die zu einer Vernetzung des Polymers mit dem Zellgerüst und zu einer Bindung vorhandener zellulärer Nucleinsäuren führt. Im Anschluß wird überschüssi­ ges Polymer gegebenenfalls abgespült, und Reaktionen zur Polymerisation der Nucleinsäuren werden gegebenenfalls direkt auf dem mikroskopischen Präparat durchgeführt, vorzugsweise eine Polymerase-Kettenreaktion oder/und eine reverse Trans­ kription. Die dabei gebildeten Nucleinsäuresequenzen werden an dem auf dem Zellgerüst haftenden basischen Polymer gebunden. Die bekannte Polymerase-Kettenreaktion wird in Reaktionsgefä­ ßen durchgeführt. Erfindungsgemäß erfolgt die Polymerase-Ket­ tenreaktion und andere Polymerisationsreaktionen direkt auf dem mikroskopischen Präparat, indem eine Kammer mit wasserun­ löslichem Klebstoff so über dem Präparat aufgeklebt wird, daß darin die für die Polymerase-Kettenreaktion üblichen Bestand­ teile im üblichen Volumen eingebracht werden. Die Inkubation des Präparats findet durch Einbringen in geeignete Thermosta­ ten in bekannter Weise statt.

Eine weitere erfindungsgemäße Variante zur Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion ist die Aufbringung der mikroskopi­ schen Präparate auf eine inerte, optisch klare Kunststoff-Fo­ lie. Folie-adsorbierte Präparate können durch Eintauchen klei­ ner Folie-Stückchen in Lösungen, darunter in Lösung des basi­ schen Polymers, und durch Einbringen der Folie-Stückchen in für die Polymerase-Kettenreaktion in bekannter Weise verwende­ te Reaktionsgefäße und Geräte technisch elegant behandelt wer­ den. Anschließend wird die Folie auf mikroskopische Objektträ­ ger aufgebracht und erlaubt eine in situ Hybridisierung und mikroskopische Auswertung in bekannter Weise. Als bevorzugt geeignetes Folienmaterial hat sich Nitrocellulose erwiesen. Zum Nachweis von zellulärer Desoxyribonucleinsäure ist es un­ erheblich, ob sie primär einsträngig oder doppelsträngig vor­ liegt. Zur Untersuchung von Ribonucleinsäure muß diese vor Be­ ginn der Polymerase-Kettenreaktion durch reverse Transkription in cDNA überführt werden.

Mit der Erfindung wird eine chemische Verbindung und ein Ver­ fahren angegeben, das eine Vermehrung (Amplifikation) der Ko­ piezahl der nachzuweisenden Nucleinsäuremoleküle (Nucleinsäu­ resequenzen) in zytologischen und histologischen Präparaten erlaubt. Dadurch wird eine Anwendung der in situ Hybridisie­ rung zur mikroskopischen Darstellung spezieller Nucleinsäure­ sequenzen im natürlichen Zell- und Gewebeverband ohne Sensiti­ vitäts-Beschränkung möglich. Da die Verbindungen in zytologi­ schen und histologischen Präparaten aus wasserlöslichen basi­ schen Polymeren mit Nucleinsäuren, darunter den nachzuweisen­ den Nucleinsäuresequenzen, hergestellt werden, haben sie die Eigenschaft, bei einer anschließend durchgeführten Polymerase- Kettenreaktion oder reversen Transkriptase-Reaktion neusynthe­ tisierte Nucleinsäuresequenzen zu binden und so deren Diffu­ sion aus den Zellen einzuschränken. Damit wird eine spezifi­ sche Erhöhung (Amplifikation) der Kopiezahl spezifischer Nu­ cleinsäuresequenzen erlaubt, mit der die untere Nachweisgren­ ze (Sensitivität) der in situ Hybridisierung überschritten wird. Untersuchungen haben ergeben, daß durch die Behandlung von Zellen und Geweben mit wassergelösten basischen Polymeren deren Penetrationsfähigkeit für Oligonucleotide, Nucleosidtri­ phosphate und Nucleinsäurepolymerasen - eine Bedingung für die Durchführbarkeit der Polymerase-Kettenreaktion und der rever­ sen Transkription - nicht beeinträchtigt wird, ebenso wenig wie die in situ Hybridisierung.

Anschließend soll die Erfindung an Beispielen näher erläutert werden.

Beispiel Nachweis von Human papillom Virus Typ 16 (HPV 16) in menschli­ chem Cervixkarzinom

Es ist bekannt, daß die Präkanzerosen des Cervixkarzinoms mit der Infektion des Gewebes durch Papillom Viren begleitet sind. In den Karzinomen gelingt jedoch der Virusnachweis durch in situ Hybridisierung im Gegensatz zu den Präkanzerosen nur sel­ ten. Zur Untersuchung wird Karzinomgewebe in bekannter Weise mit neutralisierter Formaldehyd-Lösung fixiert und in Paraffin eingebettet. 7 mikro-m starke Paraffinschnitte des Gewebes werden auf mit 3-(Triethoxysilyl)-Propylamin vorbehandelte Glas-Objektträger für die Lichtmikroskopie aufgetragen. Es er­ folgt eine Vorbehandlung der Objektträger, wie sie für die in situ-Hybridisierung vorgeschrieben wird (Melchers et al, siehe oben) bis zur Stufe der Inkubation mit Proteinase K-Lösung. Es werden stets Inkubations-Puffer-Bestandteile eingesetzt, die keine freien Aminogruppen enthalten. Anschließend erfolgt eine Inkubation der Objektträger mit den Präparaten in 5% Poly­ ethylenimin (M ca. 30 000-40 000) in Wasser für 30 Minuten bei 37°C. Die Objektträger werden mit Wasser abgespült und ge­ trocknet, und es wird ein Lichtmikroskopie-Deckglas mit Hilfe von 1 mm dicken PVC-Streifen mit Gummilösung so über die Kar­ zinom-Präparate geklebt, daß eine nach einer Seite offene Kam­ mer mit einer Weite von ca. 1 mm und einem Volumen von ca. 100 mikro-l entsteht. In dieser Kammer wird eine Polymerase- Kettenreaktion in an sich bekannter Weise durch Eintauchen der Präparate bis unterhalb des Kammerrands in Thermostaten-Bäder in 20 Zyklen durchgeführt. Anschließend wird der Rest des für die Polymerase-Kettenreaktion verwendeten Reaktionsgemischs verworfen, und die Kammer über dem Karzinom-Präparat wird mit einem Skalpell vorsichtig entfernt. An diesem Punkt wird das Protokoll für eine in situ Hybridisierung in bekannter Weise mit der Vorinkubation in 2 × SSC (SSC: 0,15 M NaCl, β, β 15 M Na-Citrat) für die Hybridisierungsinkubation fortgesetzt. Als Gensonde wird eine Biotin-markierte HPV 16-DNS verwendet. Die Nachweisreaktion der gebundenen Biotin-Markierung ergibt eine Kern- und Zellfärbung von Zellen des Cervixkarzinomanteils des Präparates als Nachweis von in den Zellen vorhandener HPV 16- Desoxyribonucleinsäure.

Claims (7)

1. Nucleinsäure-Addukte, gekennzeichnet durch ein an sich was­ serlösliches, basisches Polymer, das an Zellen in histolo­ gischen oder zytologischen Präparaten adsorbiert ist, und Nucleinsäuresequenzen, die in den Zellen enthalten sind und während einer Polymerase-Kettenreaktion und/oder einer reversen Transkriptase-Reaktion gebildet wurden, die ampli­ fizierbar sind, wobei sie mit freien Bindungsvalenzen des intracellulär- und zirkumzellulär-adsorbierten, basischen Polymers des Präparats Bindungen eingehen.

2. Nucleinsäure-Addukte nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich­ net, daß das basische Polymer Polyethylenimin oder DEAE- Dextran ist.

3. Verfahren zur Herstellung von Nucleinsäure-Addukten, da­ durch gekennzeichnet, daß man Zellen von histologischen oder zytologischen Präparaten im fixierten oder unfixierten Zustand, die nach an sich bekannten Verfahren behandelt wurden, mit einer wäßrigen Lösung eines basischen Polymers inkubiert und diese anschließend den Bedingungen einer Polymerase-Kettenreaktion unterwirft.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als basisches Polymer Polyethylenimin oder DEAE-Dextran verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß für die Polymerase-Kettenreaktion ein mikroskopischer Objektträger mit einer aufgeklebten Kammer verwendet wird, und die Kammer nach der Reaktion entfernt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das histologische oder zytologische Präparat auf eine optisch klare Kunststoff-Folie adsorbiert, daß die In­ kubation des Folien-adsorbierten Präparats in einer Lösung des basischen Polymers erfolgt, und daß anschließend das Folie-adsorbierte Präparat zur Polymerase-Kettenreaktion in für diese Reaktion übliche Gefäße eingebracht wird.

7. Verfahren zur Verwendung der Nucleinsäure-Addukte gemäß der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß man doppel­ strängige und einsträngige Desoxyribonucleinsäure oder Ribonucleinsäure zellulären oder viralen Ursprungs in situ an basische Polymere bindet und anschließend durch Poly­ merase-Kettenreaktion amplifiziert und in situ Hybridisie­ rung mit markierten Gensonden mikroskopisch sichtbar macht.