DE68928769T2

DE68928769T2 - Amplifizierter dns-assay

Info

Publication number: DE68928769T2
Application number: DE68928769T
Authority: DE
Inventors: Simon James Flemington Vic 3031 Foote; David James North Balwyn Vic 3104 Kemp; Michael Gregory Lower Templestowe Vic 3107 Peterson; Nicholas Caulfield Vic 3162 Samaras; Donald Berwickshire Td13 5Xe Smith
Original assignee: Amrad Corp Ltd
Current assignee: CSL Innovation Pty Ltd
Priority date: 1988-12-09
Filing date: 1989-12-08
Publication date: 1999-04-01
Anticipated expiration: 2009-12-09
Also published as: EP0447464A1; WO1990006374A1; JPH04502251A; DE68928769D1; AU4663789A; JP3068848B2; HK1009705A1; NO912169D0; DK108091D0; AU633036B2; ATE169341T1; NO912169L; EP0447464B1; CA2004990A1; EP0447464A4; ES2121750T3; DK108091A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Einfangen und Nachweisen von vervielfältigter (amplifizierter) Ziel-DNA in einer Probe. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung einen DNA-Vervielfältigungs-Test (ADA) in einem oder mehreren Schritten und dessen Verwendung zu einem schnellen Einfangen und Nachweisen der Ziel-DNA in einer Probe, wie z. B. zur Detektion eines Pathogens.
Es hat sich bereits gezeigt, daß das System der Polymerase- Kettenreaktion (PCR) (1, 2) zur Vervielfältigung bestimmter DNA-Segmente in der experimentellen Biologie von großem Wert ist. (1-8, siehe auch Australische Patentanmeldungen Nr. 55322/86, 55323/86, 69962/87 aund 77298/87 im Namen der Cetus Corporation). Im PCR-Verfahren wird eine Probe, welche die interessierende DNA enthält, wiederholt Zyklen von jeweils drei Temperaturen ausgesetzt. Dies führt nacheinander zu einer Denaturierung der DNA, Anlagerung der synthetischen Oligonukleotide an den Enden der interessierenden Sequenz und zur Verlängerung der Oligonukleotide durch die DNA- Polymerase von Thermus aquaticus (Taq) (2). Das exponentiell vervielfältige DNA-Segment kann dann durch einfache Methoden, wie beispielsweise eine Färbung mit Ethidiumbromid nach Agarose-Gelelektrophorese, nachgewiesen werden oder durch Hybridisierung oder Sequenzierung, um sicherzustellen, daß es sich um die erwartete Sequenz handelt (1-6).
Das PCR-System sollte schnell konventionelle Verfahren in den Bereichen von Massen-Screening ersetzen (7). Aufgrund der generellen Einsatzmöglichkeit und der ausgezeichneten Empfindlichkeit dieser Methode ist einer dieser Bereiche der Nachweis von Pathogenen. Das Testen von Blutproben auf Sequenzen des humanen Immunschwäche-Virus (HIV) ist ein weiterer Bereich, zu welchem bereits vorläufige Studien beschrieben sind (8). Andere Bereiche umfassen epidemiologische und humangenetische Anwendungen, wie z. B. HLA-Typisierung und das Screening nach genetisch bedingten Krankheiten. Jedoch sind die üblichen Methoden des Nachweises von Produkten der PCR-Reaktionen nicht besonders für ein Screening in großem Maßstab geeignet, da die üblichen Methoden normalerweise eine Gelelektrophorese benötigen. Weiterhin sind Hybridisierungs- und Sequenzinformationen zur sicheren Identifizierung des Moleküls notwendig, da leicht (Artefakt)- DNA-Moleküle durch solche Ereignisse wie Primer-Dimerisierung oder Falscheinbau der Primer in irrelevante Sequenzen auftreten können. Folglich ist ein Testsystem zum Nachweis von durch PCR vervielfältigter DNA wünschenswert, welches hochspezifisch, schnell, ohne weiteres einsetzbar für das Screening in größerem Maßstab geeignet und für alle bekannten Sequenzen einzusetzen ist sowie sich der Ausrüstung bedient, die bereits in vielen Laboratorien vorhanden ist.
Syvänen et al. (1988) Nucleic Acids Research 16 11327-11338 zeigen dis Verwendung von Oligonukleotiden, die am 5'-Ende mit Biotin modifiziert sind, als Primer in der Polymerase- Kettenreaktion (PCR)-Vervielfältigung. Dies resultiert in der Synthese von 5'-biotinilierten DNA-Molekülen, die durch Hybridisierung mit einer markierten Probe in Lösung nachgewiesen werden. Die gebildeten Hybride werden durch Vermittlung des Biotinrestes des Ziel-Moleküls an einer Avidin-Matrix gesammelt. Die auf Affinität basierende Hybrid- Sammlungsmethode ist quantitativ und ermöglicht die Messung der DNA-Menge, die durch die PCR-Vervielfältigung gewonnen wurde.
GB-A-2 202 328 offenbart ein schnelles und empfindliches Verfahren zur Untersuchung von Nukleinsäuren durch Hybridisierung, in welchem die Detektionssonde modifizierte Primer sind, die in die Kopien der Ziel-Nukleinsäure vor der Hybridisierungsreaktion inkorporiert werden, sowie eine Kombination von Reagenzien und einen Kit für die Durchführung des Verfahrens. Es wird weiterhin ein Verfahren zur Untersuchung von Nukleinsäuren durch Hybridisierung zur Verfügung gestellt, bei welchem einfangende Sonden modifizierte Primer sind, die in Kopien der Ziel- Nukleinsäuren vor der Hybridisierung eingebaut wurden.
Yamane et. al. (1988) Nucleic Acids Symp. Ser. 1988 20 91-92 offenbaren eine schnelles und sehr sensitives Verfahren für den Nachweis von DNA. Eine bestimmte Sequenz wird durch die Polymerase-Kettenreaktion mit zwei verschiedenen Primern vervielfältigt. Einer der Primer ist am 5'-Ende über die Hydroxylgruppe durch einer Affinitätsmarkierung (z. B. Biotin) verändert. Der andere Primer ist für die Detektion am 5'-Ende mit Radioisotopen oder Fluorophoren versehen. Dieses Verfahren wurde für die Detektion von humanen B-Globin-Gensegmenten angewendet.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Einfangen und Nachweisen von Ziel-DNA zur Verfügung, wobei die Ziel-DNA einer Polymerase-Kettenreaktion unter Benutzung eines Satzes von Oligonukleotid-Primern unterzogen wird, welche als komplementär zu den Strängen der Ziel-DNA ausgewählt wurden, und wobei einer der Primer des Oligonukleotid-Satzes einen ersten Liganden trägt, der eine (Bindungs)-Stelle für ein Doppelstrang-DNA spezifisches Bindungsprotein enthält und der andere der Primer einen zweiten Liganden oder einen Marker trägt, und wobei die vervielfältigte doppelsträngige DNA mit einem festen Substrat, welches das Doppelstrang-DNAspezifische Bindungsprotein in immobilisierter Form aufweist, in Kontakt tritt und der zweite Ligand oder die Markierung detektiert wird, während die vervielfältigte doppelsträngige DNA auf dem festen Substrat gebunden ist, um die Gegenwart der vervielfältigten doppelsträngigen DNA anzuzeigen.
In einer Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens wird die Ziel-DNA fakultativ mit der Methode der Polymerase-Kettenreaktion vervielfältigt, wobei ein erster Satz von Oligonukleotid-Primern benutzt wird, die als komplementär zu den Strängen der Ziel-DNA ausgewählt worden sind. Diese erste PCR ist insoweit fakultativ, daß eine ausreichende Menge von Ziel-DNA vorhanden sein kann, die es dem Anwender ermöglicht, ohne die erste Vervielfältigung direkt zum nächsten Schritt überzugehen. Die Ziel-DNA, vervielfältigt oder nicht, wird unter Benutzung eines zweiten Satzes von Oligonukleotid-Primern durch die Methode der Polymerase- Kettenreaktion vervielfältigt, wobei die Primer des zweiten Satzes als komplementär zu den Strängen der Ziel-DNA ausgewählt wurden und zwischen den Primern des ersten Satzes eingenistet sind. Dabei trägt einer der Primer des zweiten Satzes einen ersten Liganden, der eine Stelle für ein Doppelstrang-DNA spezifisches DNA-Bindungsprotein enthält und der andere Primer des zweiten Satzes trägt einen zweiten Liganden oder einen Marker. Die vervielfältigte DNA wird in Kontakt gebracht mit einem festen Substrat, welches das Doppelstrang-DNA spezifische Bindungsprotein für den ersten Liganden in immobilisierter Form aufweist. Somit umfaßt die Erfindung ein Verfahren für das Einfangen und Nachweisen von Ziel-DNA in einer Probe, wobei das Verfahren die Vervielfältigung der Ziel-DNA, soweit sie in der Probe vorhanden ist, durch eine Polymerase-Kettenreaktion einschließt unter Benutzung eines ersten Satzes von Oligonukleotid-Primern, die als komplementär zu den Strängen der Ziel-DNA ausgewählt wurden, sowie das Nachweisen der vervielfältigten Ziel-DNA durch ein Verfahren, wie es in dem vorhergehenden Abschnitt beschrieben wurde, wobei der Satz von Primern, der in dem Verfahren eingesetzt wird (bezugnehmend auf den vorhergehenden Abschnitt) zwischen dem ersten Satz von Oligonukleotid-Primern eingenistet wird. Der erste und zweite Vervielfältigungsschritt kann in einem einzigen oder in zwei aufeinanderfolgenden Reaktionsansätzen durchgeführt werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf einen Testkit zum Einfangen und Nachweisen von Ziel-DNA in einer Probe durch den DNA-Vervielfältigungs-Test. Besagter Kit umfaßt in kompartimentierter Form ein erstes Behältnis enthaltend einen Satz von Oligonukleotid-Primern, die als komplementär zu den Strängen der Ziel-DNA ausgewählt wurden und wobei einer der Primer dieses Oligonukleotid-Satzes eine Stelle für ein Doppelstrang-DNA spezifisches Bindungsprotein aufweist, und der andere der Primer einen zweiten Liganden oder einen Marker trägt. In diesem ersten Behältnis oder in einem zweiten Behältnis sind Reagentien für eine Polymerase- Kettenreaktion, ein festes Substrat beschichtet mit dem Doppelstrang-DNA spezifischen Bindungsprotein, sowie Mittel für den Nachweis der an dem festen Substrat gebundenen vervielfältigten doppelsträngigen DNA enthalten.
Die Ziel-DNA kann direkt einem oder mehreren Zyklen der PCR unter Verwendung des markierten zweiten Primersatzes ausgesetzt und sodann der Bindung an das Substrat unterzogen werden. Dies ist besonders zweckmäßig, wenn die Ziel-DNA reichlich vorhanden ist und/oder die Nachweismittel sehr empfindlich sind.
Die folgenden Abkürzungen werden in der vorliegenden Beschreibung verwendet:
PCR Polymerase-Kettenreaktion
PCR Polymerase-Kettenreaktion
DNA Deoxyribonukleinsäure
A Adenin
T Thymin
G Guanin
C Cytosin
GST Glutathion-S-Transferase
ADA DNA-Vervielfältigungs-Test
HIV humanes Immunschwäche-Virus
TMB Tetramethylbenzidin
ABTS 2,2'-Azino-bis-(3-Ethylbenzthiazolin-6- Sulfonsäure)
MTPBS Maus-Tonizität-Phosphat-gepufferte Saline
RT Raumtemperatur
PBS Phosphat-gepufferte Saline
In den beigefügten Zeichnungen ist folgendes dargestellt:
Fig. 1 zeigt die drei grundlegenden Schritte einer Ausführungsform des ADA. In Schritt 1 wird ein DNA-Segment aus einer biologischen Probe durch die Oligonukleotide a und b vervielfältigt. In Schritt 2 werden spezifische Liganden in das vervielfältigte DNA-Segment durch wenigstens drei weitere Zyklen der Vervielfältigung über intern eingenistete Oligonukleotide inkorporiert. Oligonukleotid c weist ein Biotin-Molekül an seinem 5'-Ende auf und Oligonukleotid d trägt eine 5'-Nukleotidsequenz, die spezifisch von einem DNA- Bindungsprotein aus Saccharomyces cerevisiae, GCN4, erkannt wird. In Schritt 3 werden DNA-Segmente, die Liganden tragen, an einen festen Träger gebunden, welcher mit gereinigtem GCN4, welches in Bakterien produziert wurde (GST-GCN4), beschichtet ist. Die DNA-Segmente werden über die Bindung von Avidin-Peroxidase an das Biotin des Oligonukleotid c durch eine nachfolgende colorimetrische Detektion der Peroxidase-Aktivität nachgewiesen.
Fig. 2 zeigt die Struktur von GCN4 und GST-GCN4 aus Hefe. Oben ist die Struktur des GCN4-Gens aus Saccharomyces cerevisiae (9) mit der kodierenden Region (281 Aminosäuren) durch Einrahmung markiert und angenommener Transkriptionsaktivierungsregion und DNA-Bindungsregionen des GCN4-Proteins durch Schraffierung markiert (10). Weiterhin sind die Positionen der Oligonukleotide 1 bis 3 angezeigt, die für die Vervielfältigung des GCN4-Gens aus Hefe durch PCR eingesetzt werden. Fig. 2 zeigt außerdem die Struktur von Genen, welche GST-GCN4-Fusionsproteine kodieren, die in E. coli durch Einführen von Fragmenten des GCN4-Gens in den Plasmid-Expressionsvektor pGEX-2T hergestellt werden (11). Um Plasmide zu generieren, die partielle (GST-GCN4 3.12) oder komplette (GST-GCN4 6.8) Versionen der Fusion des Polypeptides GCN4 mit der Glutathion-S-Transferase (GST) aus Schistosoma japonicum kodieren, wurde das GCN4-Gen aus Hefe- DNA unter Verwendung der Oligonukleotide 2 und 3 oder 1 und 3 vervielfältigt.
Fig. 3a zeigt die Auftrennung durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Gesamtprotein (Spuren 1 und 4) des E. coli-Stammes 7118, der mit den Plasmiden pGST-GCN4 3.12 (Spuren 1 bis 3) oder pGST-GCN4 6.8 (Spuren 4 bis 6) transfiziert und in der Gegenwart von 0,1 mM IPTG für eine Stunde bei 37ºC kultiviert wurde. Weiterhin ist Material gezeigt, welches aus lysierten Bakterien durch eine Ein- Schritt-Affinitätschromatographie (Spuren 3 und 6) gereinigt wurde, sowie lösliche Proteine, die nach der Inkubation mit Glutathion-Agarosekügelchen zurückgeblieben waren (Spuren 2 und 5). Fig. 3b zeigt einen Gel-Retardations-Test, der demonstriert, daß die Mobilität eines ³²P-markierten DNA- Fragmentes, welches eine GCN4-Bindungsstelle aufweist, im Vergleich mit der Mobilität in Abwesenheit von Protein (Spur 1), verringert ist, wenn das DNA-Fragment mit gereinigtem GST-GCN4 3.12 (Spuren 2 und 4) oder mit GST-GCN 6.8 (Spur 6) gemischt ist.
Fig. 4 zeigt den Einfluß von zugesetzter Carrier-DNA (Träger-DNA) auf die Spezifität von ADAs auf DNA des HIV- Plasmids pHXBc2. In Reihe A war keine Carrier-DNA der Mikrotiterplatte zugesetzt worden, wohingegen die Reihen B, C und D 1 ug/ml, 0,1 ug/ml bzw. 0,01 ug/ml sonifizierte humane DNA enthielten. Der erste Schritt des ADA wurde unter Verwendung der Oligonukleotide a. und b. und einem Sac1 - Sah-Fragment von pHXBc2 (12) mit 30 Zyklen, wie nachfolgend in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Proben (5 ml) von Schritt 1 wurden dann in weiteren zehn Zyklen unter Verwendung der Oligonukleotide c. plus b. (Spalten 1 bis 3), c. plus d. (Spalten 4 bis 6) oder c. plus d2 (Spalten 7 bis 9) vervielfältigt. Proben (5 ul in 1, 4 und 7; 0,5 ul in 2, 5 und 8; Q,05 ul in 3, 6 und 9) wurden anschließend in die Vertiefungen von Platten gegeben, welche mit gereinigtem GST- GCN4 3.12 (a) oder GST-GCN4 6.8 (b) beschichtet worden waren. Die verbleibenden Schritte der ADAs waren wie in Beispiel 1.
Fig. 5 zeigt ADAs auf DNA von HIV infizierten Zellen. Proben 1 bis 3, humane DNA (&supmin;100 ng) von Burkitt's Lymphoma; Proben 4 bis 6, humane DNA (&supmin;100 ng) von HIV infizierten Zellen; Proben 7 bis 9, keine DNA; Proben 10 bis 12, Plasmid-DNA pHXBc2 (&supmin;1 ng). Schritt 1 des ADAs wurde mit 35 Zyklen unter Verwendung der Oligonukleotide a. und b., wie in Experiment 1 beschrieben, durchgeführt. Proben von 10 ul von Schritt 1 wurden anschließend in weiteren sechs Zyklen unter Verwendung der Oligonukleotide c. plus d. vervielfältigt. Den Vertiefungen von Mikrotiterplatten, die mit gereinigtem GST- GCN4 3.12 beschichtet worden waren, wurden Proben (15 ul für 1, 4, 7 und 10; 3 ul für 2, 5, 8 und 11; und 0,6 ul für 3, 6, 9 und 12) in der Gegenwart von sonifizierter humaner DNA (1 ug/ml) zugegeben. Die verbleibenden Schritte der ADAs waren wie in Beispiel 1.
Fig. 6A zeigt die Spezifität der Ein-Schritt-ADA-Reaktion. Kompetition von nicht-reagierten biotinilierten Oligonukleotiden in einer Ein-Schritt-Bindungsreaktion. Eine PCR wurde unter Verwendung der Oligonukleotide c1 und d1 (0,2 ug) mit 1 ng Plasmid pHXBc2 in einem Reaktionsansatz von 100 ul mit 24 Zyklen durchgeführt. Die Kontrolle enthielt keine Plasmid- DNA. Für die Reihen 1 und 3 wurden die angezeigten Volumina der PCR-Reaktion zu 50 ul Bindungsgemisch (ohne Trockenmilch), welches die angezeigten Verdünnungen einer 5 mg/ml Avidin-Peroxidase-Lösung enthielt, zugegeben. Für die Reihen 2 und 4 wurden die angezeigten Volumina der PCR-Reaktion zugesetzt, außerdem wurden jeder Vertiefung 8 ul der Kontroll-PCR zugegeben. Die Bindungsreaktionen und die Farbentwicklung sind in Beispiel 3 beschrieben.
Fiaur 6B zeigt die Spezifität der Ein-Schritt-Bindungsreaktion. Das Vorgehen war wie bei Fig. 6A, mit der Ausnahme, daß die Vertiefungen die angegebenen % (w/v) von fettfreier Trockenmilch enthielten. Die obere und die untere Reihe enthielten 5 ul/Vertiefung des oben beschriebenen PCR- Gemisches. Für Reihe 2 war Oligonukleotid d fortgelassen worden. Für Reihe 3 war keine DNA in der PCR. Reihe 4 war wie für Reihe 3, bis auf daß ein unspezifisches Oligonukleotid (1 ug/ml) zugesetzt worden war. Für Reihe 5 waren die Vertiefungen nicht mit GCN4 beschichtet worden.
Fig. 7 zeigt den Effekt der Anlagerungstemperatur auf die Inkorporation. PCRs wurden mit 1 ng Plasmid pHXBc2 und Oligonukleotiden a1 und b1 (1 ug/ml) sowie c2 und d2 (2 ug/ml) wie angezeigt mit der Zyklenanzahl unter den angegebenen Bedingungen ausgeführt. 10 ul-Proben wurden in einem 1,6% (w/v) Agarose-Gel in der Gegenwart von 1 ug/ml Ethidiumbromid aufgetrennt. Für A waren die Konzentrationen von a1 und b1 0,3 ug/ml. Für B waren die Konzentrationen der Oligonukleotide a1 und c1 in der PCR die folgenden in den aufeinanderfolgenden Bahnen: a1 = 6, 6, 2, 0,6, 2 ug/ml, b1 = 3 ug/ml, c1 = 20, 30, 10, 10, 20 ug/ml, d1 = 5 ug/ml.
Fig. 8A zeigt die Empfindlichkeit bei verschiedenen Oligonukleotidkonzentrationen. Zwei-Schritt-PCRs wurden mit den Oligonukleotiden a2 und b2 (Konzentrationen wie angegeben) sowie c2 und d2 (5 ug/ml) mit den angezeigten Mengen von Plasmid (auf der rechten Seite in ug) in einem Reaktionsansatz von 20 ul bei 30 Zyklen (95ºC/30 sec, 65ºC/60 sec) und dann 12 Zyklen (95ºC/30 sec, 40ºC/60 sec, 65ºC/30 sec) durchgeführt. 5 ul des Produktes wurde in einem ADA mit einer Ein-Schritt-Bindungsreaktion analysiert.
Fig. 8B zeigt die Empfindlichkeit der ADA-Reaktionen. Vergleich der Empfindlichkeiten der ADA-Reaktionen unter Verwendung der a- und b-Oligonukleotide mit verschiedenen Abständen zu c2 und d2. Die Konzentration der a- und b- Oligonukleotide war jeweils 0,3 ug/ml.
Fig. 9 zeigt die Abhängigkeit des ADA von Temperaturverschiebungen. Zwei-Schritt-PCRs wurden unter Verwendung der Oligonukleotide a2, b2, c2 und d2 wie in Fig. 3B durchgeführt. Die DNA stammte aus 5 · 103 HIV infizierten Zellen. Die PCRs wurden bei 95ºC/30 sec, 65ºC/60 sec, für die mit den Pfeilen angezeigte Zahl an Zyklen, und dann bei 95ºC/30 sec, 40ºC/60 sec, 65ºC/30 sec für 0, 5 and 10 weitere Zyklen durchgeführt. Die im unteren Teil angegebene Anzahl der Zyklen ist die Gesamtanzahl für jede Probe.
Fig. 10 zeigt den Nachweis von HIV in kultivierten Zellen. DNA von nicht-infizierten oder mit HIV infizierten CEM- Zellen wurde als Ausgangs-DNA für PCR-Reaktionen eingesetzt, die die Oligonukleotide a2 und b2 (0,3 ug/ml) sowie c2 (2,5 ug/ml) und d2 (5 ug/ml) enthielten. Es wurden 30 Zyklen (95ºC/30 sec, 65ºC/60 sec) gefolgt von weiteren 10 (obere drei Reihen im rechten Abschnitt) oder 15 (untere drei Reihen im rechten Abschnitt und linker Abschnitt) Zyklen (95ºC/30 sec, 40ºC/60 sec, 65ºC/30 sec) durchgeführt. Für eine Positivkontrolle wurde Plasmid-DNA verwendet. ADA-Reaktionen mit einer Ein-Schritt-Bindungsreaktion wurden mit 5 ul Probe durchgeführt, für Agarose-Gelelektrophorese wurde 10 ml Proben eingesetzt. Die DNA-Proben, die mit ADAs oder durch Gelelektrophorese analysiert wurden, repräsentieren das Material, welches aus der angegebenen Zahl an Zellen oder aus der angegebenen Anzahl von Plasmid-Molekülen gewonnen wurde.
Fig. 11 zeigt die Quantifizierung der ADA-Reaktionen, die in Fig. 10 dargestellt sind.
Fig. 12 zeigt den Vergleich von TMB und ABTS in einem ADA, vermittelt GCN4-beschichtete Stifte.
Fig. 13 zeigt den Vergleich von GCN4 und TyrR in einer ADA- Reaktion.
Fig. 14 zeigt den Effekt von mit Thrombin gespaltenem GCN4 in dem ADA.
Fig. 15 zeigt die Ergebnisse eines klinischen Versuches, welcher mit peripheren Blut-Lymphozyten (PBLs) durchgeführt wurde. Die PBLs waren von Patienten entnommen worden, denen eine positive Diagnose in Bezug auf eine AIDS-Erkrankung gestellt worden war, bzw. PBLs von entsprechend negativen Kontrollen. Die Vorgehensweise ist wie bei Fig. 10, mit der Ausnahme, daß zwei PCRs mit 35 bzw. 12 Zyklen durchgeführt wurden. Die Abkürzungen sind in Beispiel 9 definiert.
Allgemein gesprochen, wird in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung die Ziel-DNA zunächst durch eine PCR unter Benutzung eines ersten Satzes von geeigneten Oligonukleotid-Primern in Übereinstimmung mit der bekannten PCR-Methode vervielfältigt; dann wird ein zweiter Satz von Oligonukleotid-Primern, welche zwischen den ersten beiden Primern eingenistet sind, durch eine kleine Anzahl von weiteren Zyklen inkorporiert. Die Nukleotide im zweiten Primersatz weisen Liganden auf: der eine Primer kann z. B. biotiniliert sein und der andere weist eine Stelle für ein Doppelstrang-DNA spezifisches Bindungsprotein auf. Nach der Verknüpfung mit einem immobilisierten Affinitätsreagenz, wie z. B. einem DNA-Bindungsprotein, und Markierung mit einem zweiten Affinitätsreagenz, beispielsweise mit Meerrettich- Peroxidase konjugiertes Avidin, erlaubt die Reaktion mit einem chromogenen Substrat die Detektion der amplifizierten DNA. Weiterhin kann ein System wie Digoxigenin eingesetzt werden. Wenn ausreichend Ziel-DNA ohne eine erste Vervielfältigung vorhanden ist oder auch aus anderen Gründen (wie beispielsweise eine bequeme Handhabung oder eine schnelle Testdurchführung) kann die Ziel-DNA direkt für den Schritt der Inkorporation von markierten Primern eingesetzt werden.
Die Vorgehensweise des Testes der vorliegenden Erfindung ist hier detailliert beschrieben, wobei ein Test zur Detektion von Sequenzen des humanen Immunschwäche-Virus (HIV) besonders berücksichtigt ist. Es ist einleuchtend, daß dieser spezielle Test lediglich beispielhaft für die Erfindung beschrieben ist. Die Erfindung hat breitere Anwendungsmöglichkeiten, wie weiter unten diskutiert wird. Folglich ist mit "Ziel-DNA" jede eukaryotische, prokaryotische oder virale Nukleinsäure- Sequenz gemeint, und umfaßt die Identifizierung von Pathogenen oder das Screening von genetischen Krankheiten von Menschen oder anderen Säugetieren, beispielsweise in Krebszellen. Weiterhin umfaßt "Ziel-DNA" RNA, wobei durch die Wirkung von Reverser Transkriptase zunächst eine korrespondierende DNA synthetisiert wird, d. h. cDNA wird durch die Reverse Transkriptase von der RNA kopiert. "Ziel- DNA" umfaßt demnach auch RNA-Viren. "Ziel-DNA" umfaßt weiterhin pflanzliche genetische Sequenzen und deren Pathogene.
Überdies kann die Quelle der Ziel-DNA abhängig von den besonderen Umständen und der relativen Bequemlichkeit variieren. Beispielsweise ist eine Ausführungsform der behandelten Erfindung zum Nachweis von HIV-Sequenzen in Blut beschrieben. Darunter ist jedoch zu verstehen, daß diese und auch andere Zielsequenzen auch aus anderen Körperflüssigkeiten, wie z. B., doch nicht ausschließlich, Speichelflüssigkeit, isoliert werden können. Demgemäß erstreckt sich die vorliegende Erfindung auf den Nachweis von Ziel-DNA in allen geeigneten biologischen Flüssigkeiten aus, wie z. B. Blut, Speichel, Lymphe, Zell- und Gewebeextrakten, Kulturüberständen, pflanzlichen Säfte und/oder Flüssigkeiten oder Zellextrakten, Aerosolen, verschiedenen Umweltstandorten (z. B. Boden, Wasser usw.) und dergleichen.
Das ADA-Verfahren dieser Erfindung stellt ein sehr empfindliches, spezifisches, einfaches und bequemes Verfahren zum Nachweis von spezifischen DNA-Segmenten bereit, wobei die DNA-Segmente durch wenigstens eine PCR vervielfältigt werden. Die Empfindlichkeit des Verfahrens resultiert aus einer Kombination der inhärenten Empfindlichkeit der PCR-Methode selbst (die PCR kann ein einzelnes DNA-Molekül gegen einen Hintergrund von wenigstens 106 humanen Genomen detektieren (2)) und einer empfindlichen neuen Methode für den Nachweis der vervielfältigten DNA. Die unten aufgeführten Ergebnisse zeigen, daß Moleküle der Liganden-enthaltenden vervielfältigten DNA leicht detektiert werden können, und es ist nur eine kleiner Teil des Produktes einer typischen PCR- Reaktion für den Nachweis notwendig.
Die Spezifität des Verfahrens wird durch die Tatsache widergespiegelt, daß, in einer Ausführungsform, die ADA zwei aufeinanderfolgende PCR-Reaktionen mit eingenisteten Oligonukleotid-Primern benutzt. Nur DNA-Moleküle, die in dem zweiten Schritt gebildet werden, werden in dem abschließenden Schritt detektiert, da die Liganden nur während des zweiten Schrittes eingeführt werden. Alternativ dazu kann die Ziel- DNA direkt dem Bindungsschritt ohne eine dazu erforderliche erste PCR unterzogen werden. Diese Spezifität kann weiterhin durch die Tatsache erhöht werden (siehe Beispiel 2), daß GST- GCN4 nur an doppelsträngige DNA bindet, es erkennt nicht die einzelsträngigen Oligonukleotide. Da der zweite Schritt lediglich eine kleine Anzahl von Zyklen verwendet (z. B. 3 bis 12 Zyklen), ist nicht ausreichend Zeit für eine Anhäufung von signifikanten Mengen von Primer-Dimeren, die von den Oligonukleotiden des zweiten Satzes herrühren, oder von anderen doppelsträngigen DNA-Artefakten. Außerdem werden alle möglichen Artefakte, die im ersten Schritt der PCR generiert werden, z. B. durch falsche Anlagerung der Primer an andere Stellen des Genoms, im zweiten Schritt der PCR nicht vervielfältigt, da sie nicht die eingenisteten Sequenzen des zweiten Satzes von Primern aufweisen. Primer-Dimere, die im ersten Schritt gebildet werden, werden nicht detektiert, da sie die Liganden nicht enthalten.
Es ist eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, daß die PCR in einem einzigen Reaktionsansatz durchgeführt werden kann, woraus wirkungsvoll ein "Ein- Schritt-ADA" resultiert. Diese Modifikation des Viel-Schritt- Verfahrens, welches im Vorhergehenden ausgeführt wurde, basiert z. T. auf einer starken Abhängigkeit der thermischen Stabilität einer Oligonukleotid-Duplex von ihrer Länge, und daher können Oligonukleotid-Primer so ausgewählt werden, daß ihre Inkorporation in einer PCR kritisch abhängig von der Anlagerungstemperatur ist. Konsequenterweise können dann, wenn ein Satz von Primern deutlich länger als ein zweiter Satz von Primern ist, aufeinanderfolgende PCR-Reaktionen in einem einzigen Reaktionsansatz durchgeführt werden, durch zyklische Temperaturvorgabe zunächst einer hohen und dann einer tiefen Temperatur. (siehe Beispiel 5).
Die vorliegende Erfindung umfaßt demzufolge sowohl den Viel- Schritt- als auch den Ein-Schritt-ADA.
Der Ein-Schritt-ADA weist weiterhin Vorteile in dem Bindungs- Schritt auf. Hier findet die Bindung des vervielfältigten Produktes an das auf einem festen Stoff immobilisierte Doppelstrang-DNA-Bindungsprotein gleichzeitig mit der Bindung von oder mit der Bindung an einen Detektionskomplex statt. In einer Ausführungsform, wird die vervielfältigte DNA an GST- GCN4 gebunden, welches in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte immobilisiert ist, während gleichzeitig die Bindung an das Avidin-Peroxidase-Konjugat erfolgt.
Ein weiterer Aspekt des Ein-Schritt-ADA bezieht sich auf den Einsatz von einzelnen oder vielen Kügelchen oder Stiften, die mit einem Doppelstrang-DNA-Bindungsprotein beschichtet sind. Hierdurch wird das vervielfältigte Produkt aus einem Reaktionsgefäß, nach Waschen und Kontaktieren des immobilisierten vervielfältigten Produktes mit einem Detektionskomplex, zum Detektionssubstrat überführt. Beispielsweise wird die vervielfältigte DNA aus der Vertiefung einer Mikrotiterplatte durch eine Anordnung von GST-GCN4-beschichteten Kügelchen oder Stiften transferiert, und, nach Waschen und Kontaktieren mit Avidin-Peroxidase, werden die Kügelchen in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte getaucht, die ABTS-Substrat enthält.
Die aufeinanderfolgenden PCR-Reaktionen können in einer einzigen Reaktionsmischung durchgeführt werden, indem das Gemisch einfach zunächst bei einer Hochtemperatur- und dann bei einer Niedrigtemperatur-Zyklustemperaturvorgabe inkubiert wird. Da das komplette PCR-Gemisch alle vier Oligonukleotide und Enzym (minus Proben-DNA) umfaßt und daher eingefroren gelagert werden kann, wird das Protokoll sehr vereinfacht, nämlich (1) die DNA-Probe wird dem PCR-Gemisch zugesetzt, ein Tropfen Paraffin-Öl wird zugegeben und das Reaktionsgefäß wird im Thermozyklus-Gerät plaziert und zwei aufeinanderfolgenden Temperaturvorgaben ausgesetzt; (2) die Probe wird dann in eine mit GST-GCN4-beschichtete Vertiefung einer Mikrotiterplatte für gleichzeitige Immobilisierung und Bindung gegeben; und (3) die Platte wird dann gewaschen und Substrat wird zugesetzt. Dieses Protokol ist für die Handhabung einer moderaten Anzahl von Proben sehr geeignet. Beispielsweise kann das Ergebnis für 50 Proben in etwa einer Stunde nach Beendigung der PCRs erhalten werden.
In dem Ein-Schritt-Test bindet die vervielfältigte DNA an GST-GCN4, welches in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte immobilisiert ist, während sie gleichzeitig an die Avidin- Peroxidase-Konjugate bindet. Ohne die Empfindlichkeit oder die Spezifität zu senken, vermindert dies zum einen die Anzahl der notwendigen Handgriffe sowie die Zeit, die für die Handhabung der Proben benötigt wird. Dennoch konkurrieren nicht-eingebaute biotinilierte Oligonukleotide mit der vervielfältigten DNA um die Bindung an Avidin, und es ist notwendig sicherzustellen, daß die Menge von Biotin nicht die Bindungskapazität des Avidin übersteigt.
Weiterhin stellt der Ein-Schritt-Test ein Protokoll zur Verfügung, bei welchem die PCR mit zwei aufeinanderfolgenden Temperaturvorgaben selbst in einer modifizierten Mikrotiterplatte durchgeführt wird. Die vervielfältigten DNA-Moleküle werden dann an GCN4 gebunden, welches auf Polystyrol-Kügelchen immobilisiert ist, welche mit dem Deckel der Mikrotiterplatte verbunden sind. Während dieses Verfahren keinen Vorteil aus der gleichzeitigen Immobilisierung und Bindung von Avidin-Peroxidase ziehen kann, hat es den sehr bedeutenden Vorteil, daß, nach dem Pipettieren individueller DNA-Proben in die erste Mikrotitervertiefung, 96 Proben in analoger Weise zu dem weit verbreiteten "FAST ELISA"-System gleichzeitig gehandhabt werden können.
In allen diesen Systemen hat die Rationalisierung von Detektionssystemen nun den Punkt erreicht, wo die Zeit, die für die Präparation und Handhabung individueller DNA-Proben aufgewendet wird, der geschwindigkeitsbestimmende Faktor ist. Je geringer die Menge der Ziel-DNA ist, umso höher wird der Aufwand der Reinigung sein, der notwendig wird. Wenn die Zielsequenz in weniger als 1 ul des Gesamt-Bluts nachweisbar ist, kann das Kochen der Probe ausreichend sein. Wenn es jedoch die benötigte Empfindlichkeit erfordert, daß die gesamte DNA eines großen Volumens von Blut einem einzigen PCR-Ansatz zugesetzt wird, ist eine Reinigung notwendig. Es ist offensichtlich, daß dies sowohl von der Empfindlichkeit des Testes an sich (d. h. von der Anzahl der relevanten Moleküle, die in einer idealen Situation detektiert werden können) als auch von der maximalen Menge der Probe, bevor Inhibierung des Systems auftritt, abhängig ist. Aufgrund des hohen Proteingehaltes scheint Blut eine besonders schlechte DNA-Quelle zu sein. Es ist einleuchtend, daß das minimale Reinigungsprotokoll für ein bestimmtes System von diesen Parametern abhängig ist. Zusätzlich sind die Modifikationen des Viel-Schritt-Protokols, die hier beschrieben sind, in der Lage HIV-Sequenzen gegen einen Hintergrund von humaner DNA zu detektieren.
Die Einfachheit und die Annehmlichkeit des ADA resultiert aus der Tatsache, daß nach den PCR-Schritten die Probe in genau der gleichen Weise wie ein routinemäßiger "enzyme-linked immunosorbent assay" (ELISA) unter Verwendung der gleichen Ausrüstung behandelt werden kann. Da die Immobilisierung durch Affinitätsbindung an die Festphase (z. B. GST-GCN4 oder Avidin) innerhalb des gleichen Schrittes wie die Markierung des anderen Endes des DNA-Molküls (in dem Beispiel mit Avidin-Peroxidase) durchgeführt werden kann, ist die Anzahl der Pipettier- und Waschschritte minimiert. Ferner kann das Waschen vereinfacht werden, wenn die mit Affinitätsreagenz beschichtete Festphase aus Stiften im Deckel der Mikrotiterplatte besteht. Dieser letzte Ansatz kann leicht für eine Automatisierung der Detektionsschritte genutzt werden. Aufgrund der hohen Affinitäten von Avidin und GCN4 zu ihren Substraten und dem hohen Vmax von Meerrettich-Peroxidase sind die Reaktionen in dem beschriebenen Beispiel extrem schnell.
Das hier detailliert beschriebene ADA-System ist nur eine mögliche Ausführung, welche viele Alternativen besitzt. Offensichtlich kann dieser Ansatz für den Nachweis von vielen anderen viralen, bakteriellen, protozoischen, Pilz- und mykoplasmalen Pathogenen verwendet werden. Die Screenings nach Hepatitis, Tuberkulose, Malaria und Candida- Infektionen gehören zu den offensichtlichen Anwendungen, die diese verschiedenen Organismen umfassen. Gleichermaßen kann das System für den Nachweis von zellulären Störungen, wie beispielsweise bei Krebserkankungen und dergleichen, eingesetzt werden. Das ausgesprochen nützliche Merkmal des ADA-Ansatzes ist, daß lediglich das Auswechseln der Oligonukleotidsequenzen notwendig ist, um jedes Gen von jedem Organismus durch einen einfachen Farbtest nachzuweisen. Wenn die Länge der Test-DNA-Segmente in jedem Fall die gleiche ist, sollten die Kinetiken der Detektionsschritte identisch sein, da die gleichen Affinitätsreagenzien mit den gleichen Liganden in allen Fällen interagieren. Hier liegen Unterschiede zum ELISA-System, wo die Affinitäten und die Kinetiken durch die monoklonalen Antikörper bestimmt werden, welche in jeder Situation unterschiedlich sind. Eine andere mögliche Anwendung liegt in der Bestimmung des Genotypes von bestimmten Pathogenen. Beispielsweise enthalten in Plasmodium falciparum einige Gene variable Regionen, die verschiedene antigenische Determinanten definieren, welche von relativ konservierten Regionen umgeben sind (13). Wenn die Sonden des ersten Satzes von Primern mit diesen flankierenden konservierten Regionen korrespondieren, können die Produkte des ersten PCR-Schrittes mit einigen Oligonukleotid-Paaren getestet werden, die mit internen variablen Regionen, die die verschiedenen Serotypen definieren, korrespondieren. Der hier beschriebene ADA ist ebenfalls für das Screening nach genetischen Krankheiten, wie unter anderen Cystischer Fibrose und Krebs, anwendbar.
Das ADA-System der vorliegenden Erfindung kann theoretisch mit einer breiten Palette von Liganden und/oder Affinitätsreagenzien eingesetzt werden. In einer Ausführungsform ist das Doppelstrang-DNA spezifische DNA-Bindungsprotein vom Leucin-Zipper (Reißverschluß)-Typ, d. h. GCN4. Eine Reihe von anderen DNA-Bindungsproteinen dieses Typs kann eingesetzt werden, einschließlich Thrombingespaltenes GCN4 (Fig. 2, 14). Solange die DNA-Bindungsaktivität erhalten bleibt, erstreckt sich die vorliegende Erfindung demgemäß auf DNA- Bindungsproteine vom Leucin-Zipper-Typ, wie z. B. GCN4 und/oder dessen Derivate, welche GST-GCN4, Thrombingespaltenes GCN4 and alle anderen Modifikationen davon, wie Additionen, Deletionen und/oder Substitutionen des Aminosäure- und/oder Kohlenhydrat-Anteils von GCN4, umfassen. Ein weiteres DNA-Bindungsprotein, welches in dem ADA eingesetzt werden kann, ist das TyrR-Protein vom "Helix-Biegung- Helix"-Typ, welches eine C-terminale DNA-Bindungsdomäne aufweist (Dr. V. Argyropolous, Dissertation, Universität von Melbourne, Parkville, Victoria, Australien). Andere DNA- Bindungsproteine, welche in dem ADA eingesetzt werden können, sind bekannt, und umfassen beispielsweise Proteine vom "Zink- Finger"-Typ. Diese Bindungsproteine sind in einem Übersichtsartikel von Struhl behandelt (19).
Neben den Anwendungen für Pathogene wie z. B. HIV, welche für die Entwicklung des Systems hier benutzt wurden, und den Anwendungen zur Bestimmung des Genotyps von Pathogenen, die weiter oben erwähnt wurden, kann das ADA-System mit geeigneter Modifikation für praktisch alle Anwendungen eingesetzt werden, die der PCR selbst zugänglich sind (siehe z. B. Referenz (1) bis (8) und die oben zitierten australischen Patentanmeldungen). Wichtige Beispiele umfassen humangeneti sche Anwendungen wie die Typisierung von HLA und die pränatale Diagnose von genetischen Krankheiten. Die Einfachheit, Spezifität und allgemeine Anwendbarkeit dieses Ansatzes sollte viele andere Anwendungen finden.
Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung setzt eine einzelne PCR ein, um direkt die Marker und/oder Ligandtragenden Primer in die Ziel-DNA einzubauen, ohne daß diese zuvor vervielfältigt wurde. Anschließend folgt die Wechselwirkung der markierten Ziel-DNA mit dem festen Träger, was vor oder gleichzeitig mit der Nachweisreaktion erfolgen kann. Dies stellt ein noch eleganteres Verfahren zur Detektion von Ziel-DNA dar, und macht die erste PCR, abhängig von den Umständen, zu einem fakultativen Schritt.
Die vorliegende Erfindung umfaßt weiterhin ein Konjugat, welches im wesentlichen aus einem Träger, darauf immobilisiertem GST-GCN4 und einer vervielfältigten doppelsträngigen DNA, die über ein erstes Ende an das GST-GCN4 gebunden ist, besteht. Das Konjugat kann zusätzlich am zweiten Ende der doppelsträngigen DNA einen Marker tragen, und vorzugsweise ist dieser Marker ein Enzym. In einer Ausführungsform ist der Marker mit der vervielfältigten DNA über eine Avidin-Biotin- Brücke konjugiert.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden nichtlimitierenden Beispiele weiter beschrieben.

BEISPIEL 1

Viel-Schritt-ADA Materialien und Methoden

Isolierung und Expression des GCN4-Gens aus S. cerevisiae.

Die komplette kodierende Region des GCN4-Gens aus S. cerevisiae (9) wurde durch PCR aus einer rohen DNA-Präparation synthetisiert, dabei wurden Oligo 1 (GGAATTCTAATGTCCGAATAT- CAGCCA) und Oligo 3 (GGAATTCAGCGTTCGCCAACTAATTTC) von GCN4 benutzt und an den 5'-Enden EcoR1-Schnittstellen eingefügt (Fig. 2). Nach dem Schneiden mit EcoR1 wurde die DNA in mit EcoR1 geschnittene DNA des Expressionsvektors pGEX-2T (11) ligiert. Ein kleinerer Teil von GCN4 wurde ebenfalls durch PCR isoliert unter Verwendung von Oligo 3 (siehe oben) und von Oligo 2 (CGGATCCATGTTTGAGTATGAAAACC), welches eine BamH1- Stelle am 5'-Ende enthält (Fig. 2). Die Insertion des PCR- Produktes nach dem Schneiden mit BamH1 und EcoR1 erfolgte in den BamH1- und EcoR1-Schnitt von pGEX-2T-DNA.

Gel-Retardations-Test

Bis auf die Abweichung, daß keine blockierende DNA anwesend war, wurde die Gel-Retardation wie beschrieben in (15) auf 7,5% (w/v) Polyacrylamid-Gelen durchgeführt. Das Substrat für die Bindung wurde durch Anlagerung von jeweils 40 ng der beiden Oligonukleotide (CCACCTAGCGGATGACTCATTTTTTTTCTTAGCG und CGCTAAGAAAAAAAATGAGTC) und deren Inkubation mit Taq-DNA- Polymerase (Cetus) in einem Reaktionsgemisch hergestellt, welches identisch mit dem war, welches für die PCR benutzt wurde, mit der Ausnahme, daß dATP durch 20 mCi a³²P-dATP (Amersham) ersetzt worden war. Nach 5 Minuten bei 70ºC, wurde dATP bis zu einer Konzentration von auf 0,25 mM zugegeben.
Die Inkubation wurde für 5 Minuten fortgesetzt. Nichteingebautes a³²P-dATP wurde durch eine Passage durch eine Sephadex G-10 (Trade Mark) Zentrifugations-Säule entfernt.

Vervielfältigung von 111 V-Sequenzen - Schritt 1

PCR-Reaktionen zur Vervielfältigung von p24-Sequenzen aus DNA, welche von HIV infizierten Zellen isoliert worden war, enthielten 50 mM KCl, 10 mM Tris pH 8,4, 2,5 mM MgCl&sub2;, jeweils 0,25 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 0,01% Gelatine, 1,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (Cetus), 4 ng Oligonukleotid-Primer a. und b. sowie 100 ng gereinigte DNA. Die Reaktionsgemische (100 ml) wurden ungefähr 30-mal dem Zyklus 40ºC, 70ºC und 95ºC für 1,5, 2,0 bzw. 1,5 min ausgesetzt.

Inkorporation der Liganden - Schritt 2

1/10 der PCR-Reaktion von Schritt 1 wurde unter identischen Bedingungen mindestens drei weiteren PCR-Zyklen unterzogen, wobei jedoch die benutzten Primer die Oligonukleotide b. und c., c. und d. oder c. und d1 waren.

Sequenz der Oligonukleotide

Die Sequenzen (12) der Oligonukleotide, die mit dem p24-Gen von HIV korrespondieren, waren:
a. AGAGAACCAAGGGGAAGTGA (Positionen 1481-1500)
b. TCTCTAAAGGGTTCCTTTGG (Positionen 1661-1680)
c. CATAGCAGGAACTACTAGTC (Positionen 1501-1520) Oligonukleotid c. war am 5'-Ende biotiniliert.
d. AAGTGACTCAAGTGACTCAA/TCCTTGTCTTATGTCCAGAA (die Nukleotide 5' von dem Schrägstrich korrespondieren mit einer künstlichen GCN4-Bindungsstelle (14), während die Nukleotide 3' vom Schrägstrich mit den Positionen 1641-1660 korrespondieren).
d1. AGCGGATGACTCATTTTTTTT/TCCTTGTCTTATGTCCAGAA (die Nukleotide 5' von dem Schrägstrich korrespondieren mit einer künstlichen GCN4-Bindungsstelle (14), während die Nukleotide 3' vom Schrägstrich mit den Positionen 1641-1660 korrespondieren).

Präparation von D~ aus HIV infizierten Zellen

CEM-Zellen wurden durch Kultivierung von humanen peripheren Blutzellen aus einem Patienten mit akuter lymphoblastischer Leukämie gewonnen; die Zellen wurden dann mit HTLV Ilib infiziert. Die DNA wurde unter Verwendung von Guanidin-HCl und CsCl-Zentrifugation gewonnen.

Detektion der vervielfältigten DM1 - Schritt 3

Mikrotiter-Träger (Dynatech Laboratories Inc.) wurden mit gereinigten GST-GCN4-Fusionspolypeptiden mit etwa 1 ug/ml in Maus-Tonizitäts-Phosphat-gepufferter Saline (MTPBS) für drei Stunden bei 37ºC (50 ul pro Vertiefung) beschichtet und dann mit 1% (w/v) Rinder-Serum-Albumin (Fraktion V) (Flow Laboratories) in MTPBS für eine Stunde bei 37ºC blockiert. Die Träger wurden anschließend mit MTPBS, welches 0,05% (v/v) Tween-20 (Trade Mark) (MTPBS-Tw-20) enthielt, und zweimal mit MTPBS allein gewaschen, bevor eine Inkubation bei 20ºC für 30 Minuten mit 50 ul ligandentragender DNA erfolgte, die in MTPBS-Tw-20 verdünnt war. Die Träger wurden wie vorher gewaschen und nochmals bei 20ºC für 30 Minuten mit 50 ul Meerrettich-Peroxidase-Avidin D-Konjugat (Vektor Laboratories, Inc.) bei einer Konzentration von 2,5 ug/ml in MTPBS-Tw-20 inkubiert. Nach einmaligem Waschen in MTPBS-Tw-20 und viermaligem Waschen in MTPBS, wurde 100 ul frisches 0,1 M Citrat pH 4,2, welches 1 mM 2,2'-Azino-bis(3-Ethylbenzthiazolin-6-Sulfonsäure) und 0,1% Hydrogenperoxid enthielt, zu jeder Vertiefung zugegeben und die Absorption in einem Titertek Multiskan MCC/340 (Trade Mark)-Scanner unter Einsatz von Filtern für 414 nm und 492 nm abgelesen.

BEISPIEL 2

Ergebnisse des Viel-Schritt-ADA

a. Die drei grundlegenden Schritte des ADA

Der Ansatz für den Nachweis von spezifisch vervielfältigter DNA ist in Fig. 1 ausgeführt. Der ADA besteht aus drei grundlegenden Schritte, die ersten beiden Schritte davon sind verschiedene PCR-Reaktionen, die nacheinander durchgeführt werden. Eine Probe der vervielfältigten DNA wird dann für den Nachweis in einer Vertiefung einer Mikrotiterplatte plaziert. Wie oben beschrieben existieren viele verschiedene mögliche Permutationen des ADA mit variierender Spezifität und Einfachheit. Aus Gründen der Klarheit wird in diesem Abschnitt nur ein Beispiel für die theoretisch spezifischste Ausführung beschrieben.

Schritt 1: Vervielfältigung

Dieser Schritt ist einfach eine standardmäßige PCR-Reaktion, die mit jedem geeigneten DNA-enthaltenden Extrakt, welcher für die interessierende Sequenz relevant ist, mit einer hohen Anzahl von Zyklen durchgeführt wird. Die Oligonukleotide für Schritt 1 (in Fig. 1 als a und b bezeichnet) sind für diese Reaktion limitierend. Schritt 1 vervielfältigt einfach das gewünschte Segment der DNA.

Schritt 2: Seguenzspezifische Inkorporation von Liganden.

Dieser Schritt schafft Spezifität und baut gleichzeitig Liganden in die PCR-Produkte ein, welche mit Affinitätsreagenzien reagieren können und hierdurch in Schritt 3 detektiert werden. Für Schritt 2 werden zwei neue Oligonukleotide (in Fig. 1 als c und d bezeichnet) für eine zweite PCR eingesetzt, die mit nur drei Zyklen durchgeführt werden kann. Dies schafft Spezifität, da die Oligonukleotide c und d zwischen den Oligonukleotiden a und b eingenistet sind. Es gibt nur eine geringe Anzahl von Zyklen und daher sind die einzigen Moleküle, die sich bis zu einem detektierbaren Ausmaß bilden werden, diejenigen, die durch Vervielfältigung der korrekten Sequenz in Schritt 1 entstehen. Schritt 2 baut ebenfalls die Liganden ein. Dies kann einerseits so geschehen, wie es für Oligonukleotid c, welches biotiniliert ist, gezeigt wurde, oder andererseits so, wie es für Oligonukleotid d gezeigt wurde, welches zusätzliche Sequenzen aufweist, welche die Erkennungsstelle für ein Doppelstrang-DNA-Bindungsprotein, wie beispielsweise das Heferegulationsgen GCN4 (14), kodieren. Um Moleküle mit glatten Enden (blunt ended) zu generieren, die diese Liganden an beiden Enden aufweisen (Fig. 1), sind wenigstens drei Zyklen von Schritt 2 notwendig.

Schritt 3: Verankerung und Enzym-vermittelte Markierung der vervielfältigten DNA durch Affinitätsbindung.

Dieser Schritt heftet die vervielfältigte DNA an eine feste Phase an, indem das eine Ende der DNA mit einem Doppelstrang- DNA-Bindungsprotein eine Affinitätsbindung eingeht. Nach Waschen folgt die Anheftung eines Enzyms durch Affinitätsbindung an das andere Ende für die nachfolgende Farbentwicklung. Für Schritt 3 wird eine Probe von Schritt 2 in die Vertiefung einer Mikrotiterplatte gegeben. Diese Vertiefung ist mit dem DNA-Bindungsprotein vorbeschichtet worden, z. B. mit einem klonierten fusionierten Polypeptid, welches das DNA-Bindungsprotein GCN4 trägt (siehe unten). Aufgrund seiner Affinität zu doppelsträngiger DNA immobilisiert dieses Polypeptid spezifisch die vervielfältigten Moleküle, die die korrekte Sequenz enthalten, welche durch Oligonukleotid d inkorporiert wurde. Nach dem Waschen wird eine Lösung mit dem anderen Affinitätsreagenz, das mit einem Enzym, beispielsweise mit Meerrettich-Peroxidase verknüpftes Avidin, konjugiert sind, hinzugegeben. Avidin bindet an das Biotin, welches mit Oligonnukleotid c verbunden ist.
Nach dem Waschen wird ein chromogenes Substrat zu der Mikrotiterplatte gegeben, welches entwickelt wird, und die Absorption wird in einem Mikrotiterplatten-Lesegerät abgelesen.

b. Erzeugung eines DNA-Bindungsproteins, welches leicht gereinigt werden kann.

Um große Mengen eines hochspezifischen DNA-Bindungsproteins zu erzeugen, welches für den routinemäßigen Gebrauch in dem ADA geeignet ist, wurde das regulatorische Protein GCN4 aus Saccharomyces cerevisiae als ein Glutathion-S-Transferase (GST)-Fusionsprotein, wie in Fig. 2 gezeigt, exprimiert. Das Plasmid pGST-GCN4-3.12 enthält den größten Teil der Sequenz GCN4 von Saccharomyces cerevisiae unter Einschluß der Cterminalen DNA-Bindungsregion als Insertion in dem Plasmid pGEX-2T (11), wohingegen das Plasmid pGST-GCN4-6.8 die komplette kodierende Sequenz von GCN4 enhält. Am N-Terminus enthält das GST-GCN4-fusionierte Polypeptid die gesamte Sequenz der Glutathion-S-Transferase (GST) aus Schistosoma japonicum, was die Reinigung des Moleküls in einem einfachen Affinitätsschritt durch Bindung an Glutathion- Agarosekügelchen erlaubt (11). Fig. 3 zeigt, daß die GST- GCN4-Polypeptide in Escherichia coli-Klonen, welche mit den Plasmiden transformiert wurden, stark vertreten sind. Nach einer Ein-Schritt-Affinitätsreinigung wurde jedes der GST- GCN4-Polypeptide als zwei mit Coomassie-Blau anfärbbare Banden nach Polyacrylamid-Gelelektrophorese nachgewiesen (Fig. 3a). Diese gereinigten Proteine haben die Eigenschaft bewahrt, die Konsensus-GCN4-Bindungssequenzen zu binden, wie durch einen Gel-Retardations-Test gezeigt wurde (Fig. 3b). Somit stehen beide notwendigen Affinitäts-Reagenzien (GST- GCN4 und Avidin) nun einfach zur Verfügung.

c. Anwendung des ADA auf ein DNA-Segment, welches eine Human- Immunschwäche-Virus (HIV) -Sequenz kodiert.

Wegen der wichtigen klinischen Anwendungen wurde eine Region des HIV-Genoms als eine Test-Sequenz ausgewählt. Oligonukleotide, die mit Positionen korrespondieren, die als a, b, c und d in Fig. 1 bezeichnet sind, wurden für das p24-Gen von HIV synthetisiert und sind in "Materialien und Methoden" beschrieben. Um den ADA zu entwickeln wurde zunächst das Plasmid pHXBc2, welches dieses Gen aufweist, als Test-Quelle eingesetzt. In anfänglichen Untersuchungen, die bestätigen sollten, daß die Affinitätsreagenzien geeignet sind, wurden DNA-Moleküle mit einem Biotin-Liganden an einem Ende und einer GCN4-Bindungsstelle an dem anderen Ende durch PCR- Vervielfältigung des Plasmids mit den Oligonukleotide a. und b., gefolgt von einer Vervielfältigung mit den Oligonukleotiden c und d, erzeugt. Nach Bindung dieser Produkte an eine Mikrotiter-Vertiefung, die mit GST-GCN4 vorbeschichtet war, gefolgt von Waschen und Binden von mit Peroxidase verknüpftem Avidin, weiterem Waschen und Reaktion mit dem chromogenen Substrat, wurde eine intensive Reaktion beobachtet (Fig. 4). Dies wurde nicht festgestellt, wenn die PCR in der Abwesenheit von Plasmid-DNA durchgeführt wurde (Fig. 5, Proben 7 bis 9).
Wenn die vervielfältigte DNA zu der Mikrotiterplatte in der Abwesenheit von Carrier-DNA zugegeben wurde, wurde gefunden, daß GST-GCN4 doppelsträngige DNA unabhängig von einer GCN4- Bindungssequenz bindet, Dies kann in Reihe A in Fig. 4 erkannt werden, hier wurden die Oligonukleotide b. und c. (welche beide keine GCN4-Bindungsstelle aufweisen) im zweiten Schritt eingesetzt. Doch dieses Produkt, welches mit den Oligonukleotiden b. und c. gebildet wurde, band nicht in der Gegenwart von Carrier-DNA (Reihe B in Fig. 4, Spalten 1 bis 3), wohingegen die korrespondierenden Produkte, die mit Oligonukleotiden c. und d. (Reihe B in Fig. 4, Spalten 4 bis 6) oder c. und d2 (Reihe B in Fig. 4, Spalten 7 bis 9) noch banden, wie durch die starke Reaktion gezeigt wird, obwohl dieses Signal schwächer ist als in Reihe A.
Dazwischenliegende Level von Carrier-DNA kompetierten zum Teil (Reihe C und D). Es sieht so aus, als ob GST-GCN 3.12 und 6.8 die gleichen Aktivitäten und Spezifitäten aufweisen.

d. Anwendung des äDg auf humane HIV-infisierte Zellen.

Um zu untersuchen, ob der ADA HIV-Sequenzen spezifisch in DNA von infizierten humanen Zellen nachweisen kann, wurde gereinigte DNA von persistent infizierten Zellen eingesetzt. Mit DNA von nicht-infizierten Zellen konnte kein detektierbares Signal beobachtet werden (Fig. 5, Proben 1 bis 3), wohingegen ein starkes Signal mit HIV-enthaltender DNA erzielt wurde (Fig. 5, Proben 4 bis 6).

BEISPIEL 3

Ein-Schritt-ADA

Materialien und Methoden

GST-GCN4

Das fusionierte Polypeptid von dem Klon GST-GCN4 3.12 (16) wurde durch Bindung an Glutathion-Agarose wie beschrieben (11) gereinigt.

TorR

TyrR ist ein DNA-Bindungsprotein vom "Helix-Schleife-Helix"- Typ. Es besitzt eine C-terminale DNA-Bindungsdomäne und wurde für die Untersuchungen von Dr. V. Argyropolous (18) zur Verfügung gestellt.

PCR-Reaktionen

PCR-Reaktionen für die Vervielfältigung von p24-Sequenzen von HIV enthielten 50 mM KCl, 10 mM Tris pH 8,4, 2,5 mM MgCl&sub2;, 0,25 mM von jedem dNTP, Taq-Polymerase (0,5 Einheiten) und Oligonukleotid-Primer in verschiedenen Konzentrationen. Reaktionsgemische wurden unter Paraffinöl unter den unten beschriebenen Bedingungen inkubiert. Bei dem routinemäßigen Gebrauch wurden die PCR-Gemische, die alle Komponenten bis auf die DNA enthielten, als eingefrorene Aliquots gelagert.

DNA-Vervielfältiguxigs-Tests

i) Ein-Schritt-Bindungstests: Mikrotiter-Träger (Dynatech Laboratories Inc.) wurden mit gereinigtem GST-GCN4-Fusionspo lypeptid (bei einer Konzentration von etwa 5 ug/ml des(r) aktiven Produkte(s) in Phosphat-gepufferter Saline (PBS)) für eine Stunde bei 37ºC beschichtet, einmal gewaschen und anschließend mit 10% (w/v) fettfreier Trockenmilch in PBS blockiert. Die Platten wurden dann geleert (aber nicht gewaschen) und 50 ul/Vertiefung von einem Gemisch, welches 10 % (w/v) fettfreie Trockenmilch in PBS, 4 ug/ml sonifizierte Lachs-DNA, 0,05% (v/v) Tween-20 und 50 ug/ml Meerrettich- Peroxidase-Avidin D-Konjugat (Vector Laboratories Inc.) in PBS enthielt, zugegeben. Proben der PCR-Reaktionen (1-10 ul) wurden nun zugesetzt und es wurde ihnen erlaubt, für wenigstens 20 Minuten bei RT zu reagieren. Die Träger wurden viermal mit MTPBS-Tween-20, viermal mit MTPBS und einmal mit H&sub2;O gewaschen. Die Flüssigkeit wurde abgenommen und 100 ml frisches 0,1 M NaCitrat, pH 4,2, welches 1 mM 2,2'-Azinobis(3-Ethylbenzthiazolin-6-Sulfonsäure) (ABTS) und 0,1% (v/v) Wasserstoffperoxid enthielt, zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Absorption wurde in einem Titertek Multiskan MCC/340 Scanner im Mode 2 unter Verwendung von Filtern für 414 nm und 492 nm abgelesen.

ii) ADAs mit auf Kügelchen immobilisierter GST-GCN4

Die Kügelchen im Deckel einer "FAST ELISA" Platte (Falcon plastics) mit abgeschnittenen Ecken wurden mit GST-GCN4 beschichtet, indem sie in 50 ul-Aliquots von GST-GCN4-PBS in einem Mikrotiter-Träger (Dynatech Laboratories Inc.) wie oben für eine Stunde bei 37ºC plaziert wurden. Anschließend wurden · die Kügelchen in einer Lösung mit 10% (w/v) fettfreier Trockenmilch, 4 ug Lachs-DNA und 0,05% (v/v) Tween-20 in MTPBS blockiert. Um überschüssige Lösung zu entfernen wurde der Deckel dann leicht geschlagen und die Kügelchen wurden in die Mikrotiterplatte gegeben, die die PCR-Proben enthielt. Nach 20 Minuten bei RT wurden die Kügelchen mit PBS-0,05% (v/v) Tween-20 gewaschen. Anschließend erfolgte die Reaktion der Kügelchen mit 10 ug/ml Peroxidase-Avidin-Konjugat in 10% (w/v) Trockenmilch, 0,05% (v/v) Tween-20 in MTPBS für 20 Minuten. Nach ausgiebigem Waschen mit PBS erfolgte die Reaktion mit ABTS wie oben. Alternativ dazu erfolgte die Reaktion mit 0,4 mM Tetramethylbenzidin (TMB) in 0,1 M NaAc, pH 5, 5 plus 1,41 mM Wasserstoffperoxid. Das Ablesen erfolgte in einem Titertek Multiskan MCC/340-Scanner mit Mode 1 unter Benutzung des Filters Nr. 7.

Oligonukleotide

Konsensus-Oligonukleotide, die mit Sequenzen des gag-Gens von HIV korrespondieren, wurden nach Übereinanderlegen von verfügbaren Sequenzen aus der HIV-Datenbank ausgewählt. Die synthetisierten Oligonukleotide waren:

DNA von 111 V-infizierten Zellen

CEM-Zellen wurden aus kultivierten humanen peripheren Blutzellen eines Patienten mit akuter lymphoblastischer Leukämie gewonnen. Die Zellen wurden dann mit dem HIV-Isolat HTLV Ilib infiziert. DNA wurde unter Verwendung von Guanidin-HCl und CsCl-Zentrifugation gereinigt.

DNA von klinischen Blutproben

DNA wurde von peripheren Blut-Leukozyten unter Verwendung von Guanidin-HCl und Phenol/Chloroform/Ethanol-Zentrifugation gereinigt.

Plasmid-DNA

Das Plasmid pHXBc2 (12), welches das GAG-Gen von HIV kodiert, wurde als Quelle von DNA zur Entwicklung der Reaktionen eingesetzt. Im allgemeinen wurde 1 ul einer Lösung mit einer Konzentration von 1 ug/ml pro 1000 ml PCR-Ansatz eingesetzt.

BEISPIEL 4

Eine Ein-Schritt-Bindungsreaktion für den ADA

In dem ADA, wie er in Beispiel 1 und 2 beschrieben ist, wurde die vervielfältigte DNA zunächst von GST-GCN4, welches in einer Mikrotiter-Vertiefung immobilisiert war, gefangen; die nicht-inkorporierten Substrate wurden durch Waschen entfernt und dann Avidin-Peroxidase an die vervielfältigten DNA- Moleküle gebunden. Um das Vorgehen zu vereinfachen wurde die vervielfältigte DNA mit dem Avidin-Peroxidase-Konjugat in der Gegenwart von Protein und DNA-Carriern gemischt und diese wurden in einem einzigen Reaktionsgemisch an das immobili sierte GST-GCN4 gebunden. Experimente mit ansteigenden Mengen der PCR-Probe und mit PCR-Gemisch ohne DNA-Vorlage zeigten, das nicht-inkorporierte biotinilierte Oligonukleotide schnell die Bindung auskompetetierten, wie bei der nachfolgenden Farbentwicklung nach dem Fortwaschen des Konjugats und dem Zugeben des Substrats gemessen wurde (Fig. 6A). Durch Erhöhen der Konzentration von Avidin und Vermindern der Menge des Biotins konnte dieser Effekt leicht ausgeglichen werden. Das angestiegene Maß von Peroxidase erhöhte jedoch den Hintergrund. Dies kann durch Blockieren der Protein- Bindungsstellen mit hohen Mengen von Protein-Carrier, z. B. mit 10% (w/v) Trockenmilch, nach der Beschichtung der Vertiefungen mit GST-GCN4 verhindert werden (Fig. 6B). Kontrollexperimente zeigten, daß es notwendig ist, GST-GCN4 auf der Platte und eine geeignete Zielsequenz in der vervielfältigten DNA zu haben (Fig. 6B).

BEISPIEL 5

Thermische Trennung der beiden PCR-Schritte

Da eine sehr starke Abhängigkeit der thermischen Stabilität einer Oligonukleotid-Duplex von deren Länge besteht wurde angenommen, daß es möglich sei, Längen für die Oligonukleotide a, b, c und d in der Weise zu wählen (siehe Seite 32), daß der Einbau der Oligonukleotide in einer PCR kritisch abhängig von der Anlagerungstemperatur ist. Wenn die Oligonukleotide a und b deutlich länger als c und d sind, so daß sie Duplices bilden, die deutlich stabiler sind als die von c und d, dann sollte eine Anlagerung (annealing) bei ausreichend hohen Temperaturen den Einbau von c und d verhindern, so daß eine Trennung der Reaktionen in einem Ansatz mit allen vier Oligonukleotiden ermöglicht wird. Vorstudien zeigten unerwarteterweise, daß, wann verschiedene Oligonukleotide mit einer Länge von 18 bis 20 Basen benutzt wurden, eine Anlagerungstemperatur von 70ºC nicht die Inkorporation verhinderte, obwohl die Effizienz reduziert war. Trotzdem konnte eine klare thermische Trennung bei 65ºC erreicht werden, wenn c und der Teil von d, der komplementär zu der HIV-Sequenz war, 15 Basen lang waren.
Daher wurden Oligonukleotide a1 und b1 (20 bzw. 28 Basen lang) in 24 Zyklen mit einer zyklischen Temperaturvorgabe von nur zwei Schritten pro Zyklus, 95ºC für 1 min gefolgt von 65ºC für 2 min (genannt "ohne Anlagerung"), unter Einsatz von 1 ng Plasmid-DNA als Vorlage eingebaut; ein Einbau von c2 und d2 (Fig. 7A, linker Abschnitt) fand selbst bei dieser großen Menge an Vorlage nicht statt. Wenn ein Anlagerungsschritt von 40ºC für 1 Minute ("mit Anlagerung") mit den beiden anderen Schritten zusammen durchgeführt wurde, wurden c2 und d2 effizient in 24 zusätzlichen Zyklen eingebaut (Fig. 7A, linker Abschnitt). Entsprechend wurden c und d bei einer Gesamtzyklus-Anzahl von 24 mit Anlagerung effizient eingebaut (Fig. 7A, rechter Abschnitt). Mit Anlagerung war der Einbau von a1 und b1 weniger effizient (Fig. 7A, rechte Abschnitt).
Wenn alle vier Oligonukleotide enthalten waren (Fig. 7A & B) wurden bei Zyklen ohne Anlagerung nur a1 und b1 wie erwartet eingebaut. Überraschenderweise wurde mit Anlagerung das erwartete c2-d2-Produkt trotzdem nicht erhalten. Stattdessen wurde eine längeres Produkt, welches a1-d2 und/oder c2-b1 entspricht, erhalten. Es sieht demnach so aus, als ob entweder c2 oder d2 oder beide durch a1 und/oder b1 fortkompetitiert würden. Bei Abwesenheit von c2 wurde dieses Produkt erhalten, doch bei Abwesenheit von d2 ist nicht gezeigt, daß es ein a1-d2-Produkt ist (Fig. 7A, rechter Abschnitt). Demgemäß wurde der Effekt der Erniedrigung der relativen Mengen von a1 und b1 zu c2 und d2 untersucht. Fig. 7B zeigt, daß, wenn die Mengen von a1 und b1 ausreichend vermindert wurden, das erwartete c2-d2-Produkt wirklich auftrat, wenn die Zyklen mit Anlagerung durchgeführt wurden. Wie erwartet wurde nur das a1-b1-Produkt ohne Anlagerung gebildet, und die Mengen dieses Produktes wurden nicht sehr von einer Erniedrigung der Konzentration von a1 und b1 beeinflußt (Fig. 7B, linke Seite).
ADAs mit den Produkten dieser Reaktionen wurden ebenfalls durchgeführt (Ergebnisse nicht gezeigt). Damit die vervielfältigte DNA in solch einem Test funktioniert, muß sie einen Biotin-Anteil an einem Ende und eine GCN4-Bindungsstelle an dem anderen Ende enthalten. Nur die Reaktionsgemische, die das kurze c-d-Produkt enthielten, zeigten eine signifikante Farbreaktion in den ADAs, wodurch die Struktur dieser Moleküle bestätigt wurde.
Es wird daraus geschlossen, daß es möglich ist, die PCR- Schritte 1 und 2 thermisch zu trennen, wenn Oligonukleotide von geeigneter Länge ausgewählt werden. Die Produkte der zweiten Reaktion wirken als Substrate in ADAs wie erwartet. Wenn die Konzentrationen der Oligonukleotide a und b nicht sorgfältig kontrolliert werden, tritt jedoch ein Kompetitionseffekt auf, der die Reaktion sofort eliminieren kann.
Untersuchungen mit einer Serie von Verdünnungen des HIV- Plasmids, die einer variierenden Anzahl von Zyklen unter den zwei verschiedenen Temperaturvorgaben ausgesetzt wurden, offenbarten einige weitere Merkmale der Reaktionen. Zunächst war es offensichtlich, daß die Farbintensität abhängig von der Anzahl der Zyklen mit und ohne Anlagerung war. Trotzdem ist unter diesen Bedingungen die Empfindlichkeit begrenzt: wenigstens 104 Moleküle werden benötigt (Beispiel 6 unten).
Dessen ungeachtet ist das System empfindlich genug, um HIV- Sequenzen in humaner DNA aus persistent infizierten Zellen nachzuweisen, während die nicht-infizierte Kontrolle negativ war.

BEISPIEL 6

Thermische Trennung von zwei PCRs unter Verwendung von weiter auseinanderliegenden Oligonukleotiden.
Die auftretende Kompetition der a- und b-Oligonukleotide mit den c- und d-Oligonukleotiden (Beispiel 5) könnte zum Teil von sterischen Behinderungen und von kinetischen Effekten herrühren, die mit den Raten der Anlagerung der Oligonukleotide in Beziehung stehen. Es wurde früher angemerkt (16), daß dies möglicherweise durch nahe Abstände von a/c und b/d verschlimmert werden könnte. Alternativ dazu könnten a- und b-Oligonukleotide, die sich an die a-b-Vorlage anlagern und hier verlängert werden, nachfolgend durch Nick-Translation nach einem zweiten Initiations-Ereignis mit einem a- oder b- Oligonukleotid an dem gleichen Vorlage-Molekül in dem gleichen Verlängerungszyklus, entfernt werden. Es ist nun klar, daß die Tag-Polymerase eine 5'-> 3'-Exonuklease-Aktivität besitzt und daher Nicks übersetzen kann. Alle diese Effekte sollten vermindert werden, wenn die Abstände von a/c und b/d erhöht werden. Demgemäß wurden Oligonukleotide a2 und b2 synthetisiert, die mit konservierten Positionen korrespondieren, die deutlich weiter entfernt von c2 und d2 als a1 und b1 sind.
Nach der Durchführung der Zyklen zunächst mit und dann ohne Anlagerung, zeigte sich, daß die Inkorporation der Oligonukleotide c2 und d2 von der Konzentration der Oligonukleotide a2 und b2 abhängig war (Fig. 8a). Bei der optimalen Konzen tration von a2 und b2 konnte das c2-d2-Produkt entweder durch eine ADA-Reaktion oder durch EtBr-Färbung mit etwa 100- fach geringerer Eingabemenge von Plasmid-DNA, bezogen auf die Menge der Oligonukleotide a1 und b1, nachgewiesen werden (Fig. 8b). Die Bildung des c2-d2-Produktes und die Farbintensität in einem ADA waren abhängig von der Anzahl der Zyklen ohne und mit Anlagerung, und sogar nach 40 Zyklen war kein signifikantes c2-d2-Produkt bei zyklischer Temperaturvorgabe ohne Anlagerung festzustellen (Fig. 9). Unter diesen Bedingungen konnten HIV-Sequenzen in der DNA nachgewiesen werden, die von etwa 250 Zellen einer mit HIV infizierten CEM-Kultur gewonnen wurde, wobei kein signifikanter Hintergrund bei sogar 100-fach mehr DNA aus nichtinfizierten Zellen auftrat (Fig. 10 und 11). Auf dem in Fig. 10 gezeigten Gel ist zu erkennen, daß die zwei aufeinanderfolgenden Reaktionen mit eingenisteten Oligonukleotiden wirklich entscheidend für die Spezifität sind - es tauchen viele Banden auf, die mit der nicht-infizierten DNA erzeugt werden, doch keine dieser Bande tritt als positive Bande in dem ADA in Erscheinung.
Demzufolge führt der Gebrauch von a- und b-Oligonukleotiden, die weiter außerhalb von c und d lokalisiert sind, zu einer deutlichen Erhöhung der Empfindlichkeit ohne dabei einen Verlust der Spezifität zu bewirken.

BEISPIEL 7

Entwicklung eines Systems zur Untersuchung von PCR-Reaktio- nen, die in Mikrotiterplatten durchgeführt werden

Ein Weg für eine weitere Vereinfachung des ADA-Systems ist, die PCRs in einer Mikrotiterplatte durchzuführen und die vervielfältigte DNA von jeder der 96 Vertiefungen auf eine zweite Platte unter Verwendung einer Anordung von GST-GCN4- beschichteten Kügelchen oder Stiften einzufangen und zu übertragen. Um zu überprüfen, ob dies durchführbar ist, wurden Proben von 1-10 ul einer PCR-Reaktion, die mit den Oligonukleotiden c2 und d2 durchgeführt worden war, auf 20 ul in einer Mikrotiterplatte aufgefüllt und mit einem Tropfen Paraffin-Öl bedeckt. Die Kügelchen einer FAST-ELISA Screening-Platte wurden mit GST-GCN4 beschichtet, mit Trockenmilch-DNA blockiert und anschließend in die PCR-Proben für 20 Minuten eingetaucht. Nachfolgend wurden die Kügelchen gewaschen, Avidin-Peroxidase ausgesetzt, gewaschen und in einer Mikrotiterplatte plaziert, welche ABTS-Substrat enthielt. Die erzielten Antworten waren proportional zu der Menge der amplifizierten DNA (Fig. 12), und es trat ein zu vernachlässigender Hintergrund bei gleichen Mengen eines PCR- Gemisches auf, welches ohne Substrat-DNA inkubiert worden war. Die Farbintensität dieser Reaktionen war um den Faktor 2 bis 3 niedriger als die Farbintensität von Reaktionen, die mit GST-GCN4-beschichteten Vertiefungen mit dem gleichen Material durchgeführt worden waren (Daten nicht gezeigt); dies spiegelt die kleinere Oberfläche der Kügelchen wider. Wenn TMB als Substrat verwendet wird kann die Empfindlichkeit jedoch ohne einen signifikanten Anstieg des Hintergrundes um etwa das 10-fache erhöht werden (Fig. 12). So können also vervielfältigte DNA-Moleküle effizient unter Verwendung von mit GCN4 beschichteten Kügelchen gefangen und übertragen werden. Dies ist überraschend, da die beschichteten Kügelchen zunächst durch eine Schicht von Paraffin-Öl getaucht wurden, um die Bedingungen nachzuahmen, die für eine PCR notwendig sind.
Um die Durchführung von PCR-Reaktionen in einer Mikrotiterplatte mit anschließendem Transferieren der Proben (wie oben beschrieben) zu etablieren, wurden Reaktionen mit den Oligonukleotiden a1 und b1, c2 und d2 oder mit allen vier Oligonukleotiden wie für Fig. 2 vorbereitet und in den Vertiefungen einer flexiblen Mikrotiterplatte inkubiert, die auf einem hohlen Aluminiumblock angebracht wurde, durch welchen Wasser in geeigneter Temperatur zirkuliert wurde. Der obere Teil des Blockes war in der Weise bearbeitet, daß er zu dem Boden der Platte paßte; zur Sicherstellung des thermischen Kontaktes wurde eine Wärmeübertragungs-Paste aus Zinkoxid eingesetzt. Eine Evaporation wurde durch einen Tropfen Paraffin-Öl verhindert. Nach 24 Zyklen mit einem Anlagerungsschritt von 40ºC waren die Oligonukleotide a1-b1 und c2-d2 in Produkte der erwarteten Größe eingebaut.
Weiterhin gab das c2-d2-Produkt eine ADA-Reaktion wie erwartet (Daten nicht gezeigt).

Beispiel 8

Einsatz eines anderen DNA-Bindungsproteins, TyrR und Tbroinbin- gespaltene GCN4 in der ADA

Es würde für manche Zwecke nützlich sein, andere DNA-Bindungsproteine mit anderen DNA-Erkennungssequenzen, die in einer ADA-Reaktion funktionieren, zur Verfügung zu haben. Beispielsweise könnte ein Satz von HIV-Oligonukleotiden mit einer GST-GCN4-Stelle in dem gleichen Gemisch wie ein Satz von Hepatitis B-Virus-Oligonukleotiden, welche mit einer zweiten DNA-Bindungsprotein-Stelle markiert sind, vorhanden sein, so daß jedes spezifisch von einer PCR gelesen werden kann. TyrR ist ein DNA-Bindungsprotein des "Helix-Biegung- Helix"-Typs, welches eine C-terminale DNA-Bindungsdomäne besitzt und für die Untersuchungen von Dr. V. Argyropolous (18) zur Verfügung gestellt wurde.
Es wurde eine Oligonukleotid-Sonde mit einer TyrR- Erkennungsstelle und einer HIV-Sequenz hergestellt, d. h. diese Sonde entspricht dem im Beispiel 3 beschriebenem Oligo "d", mit der Ausnahme, daß die GCN4-Bindungsstelle durch eine TyrR-Erkennungsstelle ersetzt ist.
Die Sequenz der Sonde war 5,
Diese Sonde wurde in den ADA-Test mit dem Oligo "c" eingebaut, und die Reaktionsprodukte wurden mit Platten getestet, die mit GST-GCN4 oder TyrR beschichtet worden waren.
Die Ergebnisse wurden mit denen des gleichen Experimentes verglichen, bei welchem jedoch das Original-Oligo "d" eingesetzt wurde, welches die GST-GCN4-Bindungsstelle trägt, wie in Fig. 13 gezeigt ist.

BEISPIEL 9

Klinische Versuche

Das folgende Beispiel zeigt die Ergebnisse eines klinischen Versuches, der mit peripheren Blutlymphozyten (PBLs) durchgeführt wurde. Die PLBs wurden von einem Patienten entnommen, dem eine positive Diagnose bezüglich einer AIDS-Erkrankung gestellt worden war bzw. von entsprechend negativen Kontrollen. Der Versuch wurde blind durchgeführt.
Die PBLs wurden aus den Blutproben durch Lyse in Guanidin- Thiocyanat-Puffer (4 M) und Zentrifugation präpariert.
DNA aus PBLs wurde unter Einsatz der gleichen Technik der Guanidin-Thiocyanat-Zentrifugation extrahiert und gereinigt.
Die Reaktionen der Ein-Schritt-ADA wurden unter Verwendung der Oligos a2, b2, c2 und d2, wie unter Beispiel 3 beschrieben, durchgeführt.
Die Legende für die Ergebnisse, die in Fig. 15 dargestellt sind, ist wie folgt:
- keine DNA
DO humane DNA (negative Kontrolle)
CC positive Kontrolle mit CEM-Zellen transfiziert mit HIV
CP positive Kontrolle mit Plasmid-DNA
+ positive Kontrolle mit CEM-Zellen mit inkorporierter Plasmid-DNA
20-55 klinische Proben
Die Proben 20 und 46 wurden von gesunden Menschen erhalten. Die Ergebnisse zeigen deutlich die Empfindlichkeit und die Spezifität des ADA bei dem Nachweis von HIV.

BEISPIEL 10

Nachweis von Mycoplasma pneumoniae unter Einsatz von ADA

Dieses Beispiel zeigt, daß der ADA für den Nachweis von DNA aus M. pneumoniae, einem Pathogen, welches schwere Infektio nen des Atmungsapparates verursachen kann, genutzt werden kann. Das erste Experiment verwendet Plasmid-DNA, die das P1- Gen von M. pneumoniae trägt, wie beschrieben in Hu et al. Gene, 64, 217, sowie ein Paar von ADA-Primern. Das zweite Experiment setzt klinische Proben (nasopharyngiale Aspirate) ein, zu welchen ganze M. Dneumoniae-Zellen gegeben wurden, und zwei eingenistete Primer-Paare.
(i) Dieses Experiment nutzt nur ein Paar der ADA-Primer, von denen der eine biotiniliert ist und der andere eine GCN4- Erkennungsstelle aufweist, wie folgt:
(korrespondierend mit den Nukleotiden 4144-4100 des P1-Gens; die ersten zehn Nukleotide bilden die GCN4-Stelle aus)
Der ADA wurde durchgeführt, indem gereinigtes P1-Plasmid genommen wurde und 0,6 umolar/120 ng von jedem der ADA-Primer 1 und 2 zugesetzt wurde. Die ersten 5 Zyklen der Vervielfältigung wurden wie folgt durchgeführt: 94ºC - 1 Minute (Schmelzen); 37ºC - 2 Minuten (Anlagerung); 60ºC - 3 Minuten (Verlängerung). Die nächsten 25 Zyklen waren: 90ºC - 1 Minute; 37ºC - 2 Minuten; 60ºC - 3 Minuten; die abschließende Verlängerung wurde bei 72ºC für 10 Minuten durchgeführt.
Ungefähr 1/5 des Produktes wurde dann in einer Ein-Schritt- Bindungsreaktion analysiert, für welche Mikrotiterplatten mit GST-GCN4 (250 ng/Vertiefung in PBS) über Nacht bei 4ºC beschichtet wurden. Der Nachweis der vervielfältigten DNA wurde wie vorher beschrieben durchgeführt. In einem zweiten Teil dieses Experiments wurde eine kleinere Menge (d. h. 1/10) an DNA als Ausgangsmaterial eingesetzt.
Das Gemisch, welches für die Durchführung der PCR verwendet wurde, war:
2 Einheiten Taq-Polymerase (Cetus),
10 mM Tris HCl pH 8,3,
50 mM KCl,
1,5 mM MgCl&sub2;,
0,2% umolar dNTPs,
plus ADA-Primer wie oben,
in einem Volumen von 50 ul.
(ii) Dieses Experiment setzt zwei Primer-Paare ein - die ADA-Primer, die oben beschrieben sind, und ein anderes Paar, die PCR-Primer, welche außerhalb der ADA-Primer liegen, wie folgt:
Variierende Mengen von ganzen M. pneumoniae-Zellen wurden zu nasopharyngealem Aspirat zugegeben und die Menge der zugegebenen Zellen durch eine Bestimmung der ungefähren Anzahl der Genome gemessen. Das Material wurde zentrifugiert und der Niederschlag gesammelt. Dieser wurde zur Freisetzung der DNA mit Proteinase K (30 u1, 200 ug/ml in 10 mM Tris CL pH 8,3) bei 37ºC/l Stunde behandelt. Anschließend erfolgte die Inaktivierung der Proteinase K bei 95ºC/10 Minuten. Der ADA wurde wie unten beschrieben durchgeführt.
Das verwendete PCR-Gemisch war wie für Experiment (i), bis auf daß 250 ng von jedem ADA-Primer und 5 ng von jedem PCR- Primer enthalten waren.
Die erste Zyklusrunde (d. h. diejenige, die die PCR-Primer bevorzugt) umfaßte 30 Zyklen wie folgt: 94ºC - 1 Minute; 65ºC - 2 Minuten; 72ºC - 3 Minuten. Die zweite Runde (für die ADA- Primer) umfaßte 15 Zyklen wie folgt: 90ºC - 1 Minute, 40ºC - 1 Minute; 60ºC - 3 Minuten; gefolgt von einem abschließenden Verlängerungsschritt am Ende mit 72ºC für 10 Minuten.
Analyse und Detektion der amplifizierten DNA wurde in der gleichen Weise wie in Experiment (i) durchgeführt.
(iii) Die in den Experimenten (i) und (ii) gewonnenen Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen dargestellt (in welchen die Ergebnisse unter Verwendung einer Plus(+)-Skala abgestuft sind, die maximale Farbe wird mit ++++ und keine Farbe wird mit - dargestellt): Experiment (i) Experiment (ii)

REFERENZEN:

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18. Argyropolous, V. (1989) Thesis for Doctor of Philosophy, The University of Melbourne, Parkville, Victoria, Australia.
19. Struhl K. (1989) Trends in Biological Sciences, 14, 137.

Claims

1. Verfahren zum Einfangen und Nachweisen von Ziel-DNA, wobei das Verfahren umfaßt: Unterziehen der Ziel-DNA einer Polymerasekettenreaktion unter Verwendung eines Sets von Oligonukleotidprimern, die so ausgewählt sind, daß sie zu den Strängen der Ziel-DNA komplementär sind, und worin einer der Primer des Sets von Oligonukleotiden einen ersten Liganden trägt, der eine Stelle für ein auf doppelsträngige DNA spezifisches Bindungsprotein enthält, und der andere Primer einen zweiten Liganden oder einen Marker trägt, in Kontakt bringen der amplifizierten doppelsträngigen DNA mit einem festen Substrat, das das für doppelsträngige DNA spezifische DNA-Bindungsprotein für den ersten Liganden darauf immobilisiert aufweist, und Nachweisen des zweiten Liganden oder Markers, während die amplifizierte doppelsträngige DNA an das feste Substrat gebunden ist, um das Vorhandensein der amplifizierten doppelsträngigen DNA anzuzeigen.

2. Verfahren zum Einfangen und Nachweisen von Ziel-DNA in einer Probe, wobei das Verfahren umfaßt: Amplifizieren der Ziel-DNA, wenn sie in der Probe vorhanden ist, durch ein Polymerasekettenreaktionsverfahren unter Verwendung eines ersten Sets von Oligonukleotidprimern, die so ausgewählt sind, daß sie zu den Strängen der Ziel-DNA komplementär sind, und Nachweisen der amplifizierten Ziel-DNA durch ein Verfahren nach Anspruch 1, worin das in dem Verfahren nach Anspruch 1 verwendete Set von Primern zwischen das erste Set von Oligonukleotidprimern eingenistet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin die erste und zweite Polymerasekettenreaktion in einer einzigen Reaktionsmischung ablaufen.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Bindung der amplifizierten DNA an das feste Substrat gleichzeitig mit der Bindung an einen Nachweiskomplex erfolgt.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das doppelsträngige DNA pezifische DNA-Bindungsprotein vom Leucin-Reißverschluß-Typ ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin das DNA-Bindungsprotein GCN4 und/oder eines seiner Derivate ist.

7. Verfahren nach Anspruch 6·, worin das DNA-Bindungsprotein GST-GCN4 ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das auf doppelsträngige DNA spezifische DNA-Bindungsprotein vom Typ Helix-Biegung-Helix ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin das DNA-Bindungsprotein TyrR ist.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die gebundene DNA unter Verwendung eines Nachweisreagens nachgewiesen wird, das Avidinperoxidase umfaßt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin die Bindungsgruppe für das Nachweisreagens Biotin ist.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Ziel-DNA HIV-DNA ist.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das mit dem auf doppelsträngige DNA spezifischen DNA- Bindungsprotein beschichtete feste Substrat eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte ist.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das mit dem auf doppelsträngige DNA spezifischen DNA- Bindungsprotein beschichtete feste Substrat eine Vorrichtung mit einer einzelnen oder mehreren Kugeln oder Stiften ist, der in der Lage ist, das amplifizierte Produkt mit Nachweiskomplex in ein Nachweissubstrat zu überführen.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Ziel-DNA cDNA ist, die durch reverse Transkriptase aus RNA kopiert ist.

16. Testkit zum Einfangen und Nachweisen von Ziel-DNA in einer Probe durch das Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Kit in Form von Teilen umfaßt: einen ersten Behälter mit einem Set von Oligonukleotidprimern, die so ausgewählt sind, daß sie zu den Strängen der Ziel-DNA komplementär sind, und worin einer der Primer des Sets von Oligonukleotiden einen ersten Liganden trägt, der eine Stelle für ein auf doppelsträngige DNA spezifisches Bindungsprotein enthält, und der andere Primer trägt einen zweiten Liganden oder einen Marker; und im ersten Behälter oder in einem zweiten Behälter Reagenzien für eine Polymerasekettenreaktion, ein festes Substrat, das mit dem auf doppelsträngige DNA spezifischen Bindungsprotein beschichtet ist, und ein Mittel zum Nachweisen der amplifizierten doppelsträngigen DNA, die an das feste Substrat gebunden ist.

17. Testkit nach Anspruch 16 ferner umfassend ein erstes Set von Primern, die in der Lage sind, die Ziel-DNA zu amplifizieren, worin während der Polymerasekettenreaktion das Set von Primern wie sie in Anspruch 16 definiert sind, zwischen das erste Set von Primern eingenistet wird.

18. Konjugat zur Verwendung in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 bestehend im wesentlichen aus einem Träger, GST-GCN4 auf dem Träger immobilisiert und einer amplifizierten doppelsträngigen DNA, die an einem ersten Ende an GST-GCN4 gebunden ist.

19. Konjugat nach Anspruch 18, worin an einem zweiten Ende die DNA mit einem Marker konjugiert ist.

20. Konjugat nach Anspruch 19, worin der Marker ein Enzym ist.

21. Konjugat nach Anspruch 20, worin der Marker mit der amplifizierten DNA durch eine Avidin-Biotinbrücke konjugiert ist.