DE69011722T2

DE69011722T2 - Diagnoseausrüstung, Primerzusammensetzung und ihre Verwendung zur Erwiderung oder zum Nachweis von Nukleinsäuren.

Info

Publication number: DE69011722T2
Application number: DE69011722T
Authority: DE
Inventors: Fred Terry Oakes
Original assignee: Eastman Kodak Co
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1989-04-17
Filing date: 1990-04-09
Publication date: 1995-04-27
Anticipated expiration: 2010-04-10
Also published as: DE69011722D1; EP0393743A2; US5384242A; JPH02299599A; CA2013317A1; EP0393743A3; EP0393743B1; JPH074247B2; ATE110420T1; HK134895A; FI901916A0; KR900016473A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Primer-Zusammensetzung und einen diagnostischen Testsatz sowie ihre Verwendung zur Replikation oder Erkennung einer Target- oder Ziel-Nukleinsäure in einer Testprobe. Die Erfindung läßt sich anwenden in verschiedenen medizinischen Studien und Forschungsstudien, forensischen Untersuchungen und diagnostischen Verfahren, wie beispielsweise zur Bestimmung von genetischen Störungen oder infektiösen Krankheiten.
Die Nukleinsäure-Sondentechnologie hat sich in den vergangenen Jahren rasch entwickelt, als Forscher ihren Wert für die Erkennung von verschiedenen Störungen, Organismen oder genetischen Merkmalen erkannt hatten, die in sehr geringen Mengen in einer Testprobe vorliegen. Die Verwendung von Sonden beruht auf dem Konzept der Komplementarität. Beispielsweise ist DNA doppelsträngig, wobei die Stränge aneinander durch Wasserstoffbindungen zwischen komplementären Nukleotiden (auch bekannt als Nukleotidpaare) gebunden sind.
Der DNA-Komplex ist normalerweise stabil, doch können die Stränge voneinander getrennt werden (oder denaturiert werden) durch Bedingungen, bei denen die Wasserstoffbindung aufbricht. Die freigesetzten einzelnen Stränge verbinden sich lediglich wieder mit einem anderen Strang, der eine komplementäre Sequenz von Nukleotiden aufweist. Dieses Hybridisierungsverfahren kann in Lösung oder auf einem festen Substrat erfolgen. RNA ist gewöhnlich einzelsträngig. Sie kann auch mit einem anderen Strang oder einem Teil hiervon eine Hybridisierung eingehen, der eine komplementäre Sequenz von Nukleotiden aufweist.
Eine Target-Nukleinsäure-Sequenz der DNA oder RNA eines Ziel- Organismus oder einer Zelle kann lediglich einen kleinen Anteil des Gesamtstranges ausmachen, so daß es sehr schwierig ist, dessen Vorhandensein unter Anwendung der meisten bekannten markierten Sonden zu bestimmen. Viele Untersuchungen sind durchgeführt wurden, um dieses Problem zu überwinden, einschließlich der Verbesserung der Sondenempfindlichkeit und der Synthesen von Nukleinsäuren.
Ein wesentlicher Fortschritt im Stande der Technik stellt das Verfahren dar, das in der US-A-4 683 302 beschrieben wird. Ohne bezüglich dieses Verfahrens ins Detail zu gehen, besteht es aus einer Amplifikationstechnik, bei der Primer zu Nukleinsäuretemplaten hybridisiert werden, und zwar in Gegenwart eines Polymerisationsmittels (wie zum Beispiel einer Polymerase) und vier Nukleotidtriphosphaten, wobei Extensionsprodukte von diesen Primern erzeugt werden. Diese Produkte werden denaturiert und als Template in einer Cyclisierungsreaktion eingesetzt, welche die Anzahl und die Menge von existierenden Nukleinsäuren amplifiziert unter Erleichterung ihrer nachfolgenden Erkennung. Das Amplifizierungsverfahren kann cyclisch so oft wie gewünscht durchgeführt werden und erzeugt eine größere Menge an bestimmbarem oder erkennbarem Material von einer geringen Menge einer Target-Nukleinsäure-Sequenz.
In dem Verfahren der US-A-4 683 202 werden zwei Primer für jeden Strang der zu amplifizierenden Target-Nukleinsäure verwendet. Im günstigsten Falle der Amplifikation ist die Nukleinsäure-Sequenz, die amplifiziert werden soll, vollständig komplementär dem Primer, mindestens nahe dem 3'-Ende der Target-Sequenz. Dies bedeutet, daß lediglich ein Primer pro Strang für eine effektive Amplifikation benötigt wird. Es ist bekannt, daß, wenn die Target-Sequenz nicht vollständig bekannt ist, mindestens an dem 3'-Ende eine Ansammlung von Primern verwendet werden kann, die alle möglichen Codon-Variationen aufweisen, um mindestens einen Primer zu haben, der vollständig komplementär ist. Ein solcher Primer wird als ein Primer mit einer 100 % igen "Homologität" mit dem Ende des zu amplifizierenden Stranges bezeichnet.
Dieses Verfahren kann in manchen Fällen das gewünschte Amplifikationsverfahren durchführen, doch kann es in anderen Fällen ineffizient oder ineffektiv sein. Die Herstellung der Ansammlung von Random-Primern ist unwirtschaftlich und führt zur Verwendung von keine Extension bewirkenden Konkurrenz-Primern. Überdies wird, wenn die Ungewißheit der Target-Nukleotid-Sequenz größer ist, die Ansammlung von benötigten Primern stark erhöht.
Fehlpaarungen (mismatches) zwischen der Target-Sequenz und Primern können nicht vollständig vermieden werden, insbesondere dann nicht, wenn die Target-Sequenz nicht vollständig identifiziert werden kann. In anderen Fällen, wie zum Beispiel der Erkennung von proviraler DNA von Retroviren, ist die Target- Nukleinsäure stark veränderlich und eine vollständige Identität läßt sich nicht feststellen. Im Falle von HIV-I erzeugt eine Vielzahl von Sequenzen in dem Genom einen lebensfahigen Virus. Es ist bekannt, daß Basen-Substitutionen in willkürlichen und häufigen Intervallen über das gesamte Genom auftreten können. Infolgedessen ist wahrscheinlich, daß Isolate provirale DNA aufweisen, die unterschiedliche Nukleinsäure-Sequenzen haben.
Derartige Fehlpaarungen vermindern die Wirksamkeit der Amplifikation durch Primer beträchtlich. Mit anderen Worten, Fehlpaarungen führen zu einer Verminderung des Amplifikationsprozesses aufgrund der Veränderung der Kinetik des Starts (priming) und der Primerextension. Im schlechtesten Falle erfolgt keine Amplifikation, wenn der Primer sich nicht an das Zielorgan bindet oder wenn es gebunden wird, eine Bildung eines Extensionsproduktes inhibiert wird (d.h. wenn der Primer einer "Fehlzündung" unterliegt).
Wünschenswert wäre es, wenn wirksame Mittel zur Amplifikation von Nukleinsäure-Sequenzen zur Verfügung stünden und zwar auch dann, wenn Fehlpaarungen zwischen der Target-Sequenz und einem bekannten Primer für diese Sequenz zu vermuten sind.
Die oben erwähnten Probleme wurden gelöst durch die Verwendung einer Primer-Zusammensetzung, die für die Amplifikation oder Replikation einer vorbestimmten Target-Nukleinsäure geeignet ist und umfaßt eine wäßrige Mischung von:
a) einem ersten Oligonukleotidprimer, der im wesentlichen oder praktisch komplementär ist und hybridisierbar mit einer ersten spezifischen Nukleinsäure-Sequenz eienr Target-Nukleinsäure, und
b) mindestens einem zusätzlichen Oligonukleotidprimer, der mindestens im wesentlichen oder praktisch komplementär ist und hybridisierbar mit einer zusätzlichen Nukleinsäure-Sequenz der Target-Säure,
wobei die Zusammensetzung dadurch gekennzeichnet ist, daß die zusätzliche Nukleinsäure-Sequenz der Target-Nukleinsäure entweder.
i) nur einen Teil der ersten spezifischen Nukleinsäure- Sequenz einschließt,
ii) sich in unmittelbarer Nachbarschaft zur ersten spezifischen Nukleinsäure-Sequenz befindet, oder
iii) von der ersten spezifischen Nukleinsäure-Sequenz durch ein oder mehrere Nukleotidbasen getrennt ist, wobei der zusätzliche Primer dazu befähigt ist, ein Primer-Extensionsprodukt zu bilden, das komplementär ist zu und hybridisierbar ist mit der ersten spezifischen Nukleinsäure-Sequenz.
Diese Erfindung stellt ferner einen diagnostischen Testsatz bereit, der geeignet ist für die Amplifikation oder Replikation einer vorbestimmten Target-Nukleinsäure, wobei in einzelnen Pakkungen vorliegen:
a) der erste oben beschriebene Primer, und
b) mindestens ein zusätzlicher Primer, wie oben beschrieben.
Ein Verfahren zur Replikation einer vorbestimmten Target-Nukleinsäure umfaßt:
A. die Herstellung einer Probe mit einer vorbestimmten Target- Nukleinsäure für die Replikation,
B. das Inkontaktbringen der hergestellten Probe mit der oben beschriebenen Primer-Zusammensetzung, unter Bildung einer Mischung von hybridisierten Produkten des Primers und der Target-Nukleinsäure, und
C. die Bildung eines ersten Primer-Extensionsproduktes in mindestens einem der hybridisierten Produkte und Starten (priming) und Verlängern oder Ausdehnen des ersten Primer-Extensionsproduktes.
Weiterhin umfaßt ein Verfahren zur Erkennung oder Bestimmung einer vorbestimmten Target-Nukleinsäure:
A. das Kontaktieren einer Probe, von der angenommen wird, daß sie eine Target-Nukleinsäure enthält, mit der oben beschriebenen Primer-Zusammensetzung, unter Bildung einer Mischung von hybridisierten Produkten des Primers und der Target- Nukleinsäure,
B. die Bildung eines ersten Primer-Extensionsproduktes in mindestens einem der hybridisierten Produkte, das Starten (priming) und Ausdehnen oder Verlängern des ersten Primer-Extensionsproduktes, und die Verstärkung des ersten Primer- Extensionsproduktes,
C. die Trennung der erhaltenen Primer-Extensionsprodukte und das Inkontaktbringen derselben mit einer bestimmbaren Oligonukleotidsonde unter Erzeugung eines bestimmbaren komplementären Produktes, und
D. die Bestimmung des bestimmbaren komplementären Produktes als Anzeichen des Vorhandenseins der Target-Nukleinsäure in der Probe.
Die vorliegende Erfindung stellt Mittel oder Maßnahmen bereit für die rasche und genaue Replikation, Amplifikation oder Erkennung von Nukleinsäure-Sequenzen, die in sehr geringen Mengen in einer Testprobe vorliegen. Überdies können diese Verfahren durchgeführt werden selbst dann, wenn eine Komplementaritäts- Fehlpaarung zwischen der Target-Sequenz und einem Primer vorliegt, von dem die das Verfahren durchführende Person annimmt, daß diese Sequenz gestartet wird. Dies macht die Verfahren beträchtlich wirksamer bezüglich der Erkennung genomischer Sequenzen, die unterschiedlich sind von Isolat zu Isolat, wie im Falle von Retroviren.
Diese Vorteile werden erreicht durch Verwendung einer Primer- Zusammensetzung, zu der gehört ein erster Primer, der eine Fehlpaaring (mismatch) mit der Target-Sequenz aufweisen kann oder nicht, am oder nahe dem 3'-Ende des Primers. Liegt keine Fehlpaarung vor, so werden die Hybridisierung und die späteren Verfahren wirksam durchgeführt. Treten jedoch ein oder mehrere Fehlpaarungen auf, so kann der erste Primer dennoch mit der Sequenz hybridisieren, doch kann die Bildung des Extensionsproduktes verzögert oder vollständig inhibiert werden, je nachdem, wo die Fehlpaarung erfolgt. Die vorliegende Erfindung überwindet dieses Problem, indem sie in der Zusammensetzung einen oder mehrere zusätzliche Primer verwendet, von denen mindestens einer in geeigneter Weise hybridisiert und Extensionsprodukte, wie gewünscht, liefert. Diese zusätzlichen Primer können eine unterschiedliche Anzahl von Nukleotiden aufweisen, im Vergleich zu dem ersten Primer, sind jedoch dennoch mit diesem in einer besonderen Weise verwandt, wie es genauer weiter unten beschrieben werden wird. Dieser Satz von Primern in der Primer- Zusammensetzung wird hier definiert als ein Satz von "homologen" Primern.
Fig. 1 ist ein schematisches Diagramm, das eine übliche Priming- und Amplifikationstechnik bezüglich einer Target-Nukleinsäure veranschaulicht.
Fig. 2-6 sind schematische Diagramme, die beispielsweise Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen unter Verwendung eines Satzes von Primern, die gegen eine Target-Nukleinsäure gerichtet sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Replikation, Amplifikation und Erkennung von einer oder mehreren spezifischen Nukleinsäure-Sequenzen, die in einer oder mehreren Target-Nukleinsäuren in einer Testprobe vorliegen. Derartige Proben können enthalten cellulares oder virales Material, Haare, Körperflüssigkeiten oder andere Materialien oder Stoffe, die genetische DNA oder RNA enthalten, die bestimmt werden soll. Obgleich der primäre Zweck der Erkennung von diagnostischer Natur ist, kann die Erfindung auch angewandt werden zur Verbesserung der Wirksamkeit der Klonierung von DNA oder von Boten-RNA oder zur Gewinnung großer Mengen an der erwünschten Sequenz aus einer Mischung von Nukleinsäuren, die bei chemischen Synthesen anfallen.
Die vorliegende Erfindung eignet sich insbesondere in Kombination mit einer Kettenreaktion für die Erzeugung mindestens einer spezifischen Nukleinsäure-Sequenz in exponentiellen Mengen relativ zur Anzahl von angewandten Reaktionsstufen. Das Produkt ist ein diskreter Nukleinsäure-Doppelstrang mit Termini entsprechend den Enden der spezifischen verwendeten Primer. Ein jeder Nukleinsäure-Lieferant, gereinigt oder nicht, kann als Ausgangsmaterial eingesetzt werden, vorausgesetzt, er enthält oder es wird vermutet, daß er enthält, die spezifische Nukleinsäuresequenz, die erkannt werden soll. Falls erwünscht, kann eine Mischung von Nukleinsäuren verwendet werden. Die Sequenz, die verdoppelt werden soll, kann ein Fragment oder die gesamte Nukleinsäure sein. Überdies können mehr als nur eine Nukleinsäure-Sequenz gleichzeitig amplifiziert werden, durch Verwendung eines spezifischen Satzes von Primern sowie markierten Sonden für jede Sequenz, die amplifiziert werden soll. Die Sequenzen können in der gleichen oder verschiedenen Nukleinsäuren vorliegen.
Nukleinsäuren lassen sich aus verschiedenen Quellen erhalten einschließlich von Plasmiden, natürlich vorkommender DNA oder RNA von jedem Lieferanten (wie beispielsweise Bakterien, Hefe, Viren, Pflanzen und höheren Tieren, wie dem Menschen). Sie können aus verschiedenen Geweben extrahiert werden, einschließlich Blut, peripheren mononuklearen Blutzellen (PBMC), Gewebematerial oder anderen Lieferanten, die aus dem Stande der Technik bekannt sind, unter Anwendung bekannter Verfahren. Die vorliegende Erfindung ist besonders geeignet für die Erkennung von Nukleinsäure-Sequenzen, die sich in Viren oder Zellen beliebiger Organismen finden, wie zum Beispiel in genomischer DNA, bakterieller DNA, viraler RNA oder DNA oder RNA, die sich in bakteriell oder viral infizierten Zellen finden. Diese Erfindung ist besonders geeignet für die Erkennung von viraler DNA aus Zellen, die durch HIV-I oder anderen Retroviren infiziert sind.
Der hier unter Bezugnahme auf Primer, Sonden oder zu bestimmende Oligomerfragmente verwendete Ausdruck "Oligonukleotid" bezieht sich auf ein Molekül aus zwei oder mehreren Deoxyribonukleotiden oder Ribinukleotiden und vorzugsweise mehr als drei derselben. Die genaue Größe ist nicht kritisch, hängt jedoch von vielen Faktoren ab, einschließlich dem letztlichen Verbrauch oder der Funktion des Oligonukleotids. Das Oligonukleotid kann synthetischen Ursprungs sein oder nach anderen aus dem Stande der Technik bekannten Methoden erhältlich sein.
Der Ausdruck "Primer" bezieht sich auf ein Oligonukleotid, das natürlichen Ursprungs sein kann oder auf synthetischem Wege hergestellt sein kann, das dazu in der Lage ist, als Ausgangs- oder Startpunkt von Synthesen zu dienen, wenn es Bedingungen ausgesetzt wird, in denen eine Synthese eines Primer-Extensionsproduktes, komplementär zu einem Nukleinsäurestrang, in duziert wird. Zu derartigen Bedingungen gehören das Vorhandensein von Nukleotiden (zum Beispiel die 4-strängigen Deoxyribonukleosidtriphosphate) sowie ein Mittel für die Polymerisation, wie zum Beispiel eine DNA-Polymerase sowie eine geeignete Temperatur und ein geeigneter pH-Wert.
Die Zusammensetzung dieser Erfindung weist einen ersten Oligonukleotid-Primer auf, der praktisch oder im wesentlichen komplementär ist einer ersten Nukleinsäure-Sequenz der Target-Nukleinsäure. Mit "praktisch oder im wesentlichen komplementär" ist gemeint, daß eine ausreichende Anzahl von Basen im Primer vorliegt, die mit den entsprechenden Basen in der Nukleinsäuresequenz zusammenpassen, die der Primer mit der Sequenz hybridisiert. Der Ausdruck bedeutet jedoch nicht, daß jedes Basenpaar zusammenpaßt. Tatsächlich beabsichtigt diese Erfindung, die Probleme zu lösen, die auftreten, wenn ein oder mehrere Fehlpaarungen vorliegen, insbesondere am oder nahe am 3'-Ende des ersten Primers, wo eine Primer-Extension auftreten soll, Es ist darauf hinzuweisen, daß die vorliegende Erfindung auch dann gut durchgeführt werden kann, wenn keine Fehlpaarungen vorliegen. Ob Fehlpaarungen auftreten können, läßt sich nicht immer vorhersagen.
In der Praxis dieser Erfindung kann jeder der verwendeten Primer (sowohl der erste Primer wie auch zusätzliche Primer) einen doppelsträngigen, markierten Nukleinsäurebereich aufweisen benachbart zu einem einsträngigen Bereich. Der einsträngige Bereich enthält eine Nukleinsäure-Sequenz, die ausreichend komplementär ist dem Templat-Strang, um eine Hybridisierung zu bewirken. Der doppelsträngige Bereich, oder Schwanz des Primers kann markiert sein mit einem bestimmbaren oder ermittelbaren Rest, der dazu in der Lage ist, ein bestimmbares oder erkennbares Signal zu erzeugen, oder der dazu geeignet ist, das Extensionsprodukt einzufangen (capturing) oder zu immobilisieren.
Im Falle von anderen und bevorzugten Ausführungsformen sind die Primer vollständig einzelsträngig. Vorzugsweise sind die Primer einzelsträngige Oligodeoxyribonukleotide. Die genaue Größe eines jeden Primers hängt ab von dem vorgeschlagenen Verwendungszweck, der Komplexität der Target-Sequenz, der Reaktionstemperatur und dem Ursprung des Primers. Im allgemeinen weisen die im Rahmen dieser Erfindung verwendeten Primer 15 bis 50 Nukleotide, vorzugsweise 20 bis 30 Nukleotide, auf.
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Primer werden ausgewählt, damit sie "im wesentlichen oder praktisch" komplementär sind gegenüber den verschiedenen Strängen von jeder spezifischen Sequenz, die amplifiziert werden soll. Dies bedeutet, daß sie ausreichend komplementär sein müssen für eine Hybridisierung mit ihren entsprechenden Strängen unter Bildung der gewünschten hybridisierten Produkte. Im Idealfalle hat der Primer die genaue Komplementarität bezüglich der Target-Nukleinsäure. In vielen Fällen jedoch ist eine genaue Komplementarität nicht möglich oder nicht wahrscheinlich und ein oder mehrere Fehlpaarungen können existieren, die entweder dazu führen, daß der Primer schlecht hybridisiert oder, falls ein Start erfolgt, Extensionsprodukte erzeugt werden in entweder einer sehr unwirksamen Weise (d.h. mit niedriger Geschwindigkeit der Zuführung der ersten Base zum Primer während der Extension) oder überhaupt nicht.
Primer, die sich für das Verfahren der vorliegenden Erfindung eignen, können verschiedenen Ursprungs sein oder unter Anwendung bekannter Techniken und Vorrichtungen hergestellt werden, einschließlich beispielsweise einem ABI DNA-Synthesizer (erhältlich von der Firma Applied Biosystems) oder einem Synthesizer vom Typ Biosearch 8600 Series oder 8800 Series (erhältlich von der Firma Milligen-Biosearch, Inc.) sowie bekannten Methoden ihrer Anwendung. Natürlich vorkommende Primer, die aus biologischen Quellen isoliert werden, sind ebenfalls geeignet (wie beispielsweise Restriktions-Endonukleasen-Digestierungen).
Die Praxis dieser Erfindung erfordert den Einsatz einer Primer- Zusamensetzung, die einschließt den oben beschriebenen ersten Primer sowie ein oder mehrere zusätzliche Oligonukleotid-Primer. Diese zusätzlichen Primer sind praktisch oder im wesentlichen komplementär bezüglich einer Nukleinsäure-Sequenz, die in gewisser Weise verwandt ist mit der Nukleinsäure-Sequenz des ersten Primer. Mit anderen Worten, der erste Primer ist komplementär bezüglich einer ersten Sequenz. Liegen beispielsweise vier zusätzliche Primer vor, so sind sie im wesentlichen oder praktisch komplementär gegenüber vier zusätzlichen Nukleinsäure-Sequenzen, die in gewisser Weise verwandt sind mit der ersten Sequenz (wie unten beschrieben).
Vorzugsweise werden 1 bis 10 zusätzliche Primer verwendet.
Diese zusätzlichen Primer können sich ableiten oder hergestellt werden, wie oben beschrieben, und haben für die gewünschten Zwecke eine geeignete Große. Im Falle mancher Ausführungsformen (wie in größerem Detail weiter unten beschrieben) können die Größen der Primer spezifisch in Relation zu dem ersten Primer abgestimmt werden.
Die Nukleinsäure-Sequenzen, denen gegenüber die zusätzlichen Primer komplementär sind, sind verwandt oder stehen in Beziehung zu der Nukleinsäure-Sequenz des ersten Primer in einer oder in mehreren der folgenden Beziehungen:
i) nur ein Teil der ersten spezifischen Nukleinsäure- Sequenz ist eingeschlossen,
ii) sie liegen unmittelbar benachbart zur ersten spezifischen Nukleinsäure-Sequenz vor, oder
iii) sie sind entfernt von der ersten spezifischen Nukleinsäure-Sequenz durch ein oder mehrere Nukleotidbasen, wobei jedoch der zusätzliche Primer dazu befähigt ist, ein Primer-Extensionsprodukt zu erzeugen, das komplementär ist der ersten spezifischen Nukleinsäure-Sequenz.
Es ist festzustellen, daß auch eine Vielzahl von zusätzlichen Primern in der Praxis der Erfindung verwendet werden kann, einschließlich eines oder mehrerer Primer von jeder Kategorie (i)- (iii), wie oben angegeben.
Diese Beziehungen des oder der zusätzlichen Primer zum ersten Primer lassen sich besser verstehen unter Bezugnahme auf die Figuren 1-6. In sämtlichen dieser Figuren werden die Nukleinsäuren in einfacher Weise dargestellt durch gerade horizontale Linien (für die Nukleotide) mit undefinierter Länge und individuellen Basen, die sich von der Nukleinsäurekette erstrecken, die durch vertikale Linien dargestellt wird. Derartige vertikale Linien können einzelne oder individuelle Basen oder Basenpaare darstellen (wo Doppelstränge oder Einzelstränge mit Primer dargestellt sind). Die Primer sind ähnlich dargestellt durch Pfeile mit gepunkteten Linien, um die Richtung der Primer-Extension von dem 3'-Ende darzustellen. Zunächst sollte darauf hingewiesen werden, daß Figur 1 eine stark vereinfachte schematische Darstellung des bekannten Amplifikationsverfahrens ist, das in größerem Detail in der US-A-4 683 202 beschrieben wird. Dieses Verfahren erfordert im allgemeinen lediglich einen Primer für jeden Strang, der praktisch komplementär ist der Nukleinsäuresequenz von Interesse, um eine rasche und wirksame Amplifikation zu erreichen.
Die Figuren 2-6 veranschaulichen mehrere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Es ist darauf hinzuweisen, daß andere Ausführungsformen möglich sind und in den Bereich dieser Erfindung fallen. Überdies sind die dargestellten Target-Nukleinsäure-Sequenzen und Primer als relativ kurze Produkte dargestellt, wobei dies lediglich aus Illustrationsgründen erfolgt, da sie jede beliebige Länge von Nukleotidbasen aufweisen können.
Figur 2 zeigt eine Ausführungsform der Kategorie (i), wie oben angegeben, in welchem Falle die zusätzlichen Primer komplementär sind gegenüber lediglich einem Teil der ersten Nukleinsäure- Sequenz. In diesem Falle haben die zusätzlichen Primer die gleiche Basensequenz nahe ihrem 5'-Ende wie der erste Primer, doch unterscheiden sie sich in ihrer Länge durch zwei Basen von einander. Diese Basenvariation ist im Falle dieser Darstellung willkürlich. Die Basensequenz könnte in gleicher Weise durch eine, drei oder eine andere Anzahl von Basen variieren. Die Base an dem 5'-Ende eines jeden Primers ist in dieser Ausführungsform in jedem Falle die gleiche. Im Falle einer bevorzugten Ausführungsform sind die Primer komplementär den Nukleinsäure-Sequenzen, die sich vollständig innerhalb der ersten Sequenz finden.
Figur 3 veranschaulicht eine andere Ausführungsform der Kategorie (i), wie oben angegeben, wobei die zusätzlichen Primer die gleiche Länge wie der erste Primer aufweisen, wobei sie jedoch komplementär mit lediglich einem Teil der ersten Nuklein- Säure-Sequenz sind. Überdies überlappen sie den ersten Primer durch mindestens eine Base. Die veranschaulichten zusätzlichen Primer sind dargestellt derart, daß sie voneinander durch drei Basen verschoben sind, doch können sie in ähnlicher Weise durch jede beliebige andere Anzahl von Basen versetzt sein, solange nur eine Überlappung von mindestens einer Base mit dem ersten Primer vorliegt. Im Falle einer bevorzugten Ausführungsform ist jeder zusätzliche Primer komplementär bezüglich einer Sequenz, die durch eine einzelne Base verschoben ist.
In Figur 4 ist eine Ausführungsform der Kategorie (ii), wie oben angegeben, dargestellt, worin der zusätzliche Primer komplementär ist bezüglich einer Nukleinsäure-Sequenz "unmittelbar benachbart" zur Sequenz des ersten Primers. Wie in der Figur dargestellt ist, bedeutet dies, daß das 3'-Ende des zusätzlichen Primers eine Base aufweist, die komplementär ist der Base der Target-Sequenz, bei der es sich um eine Base handelt, die entfernt ist von der Base, die komplementär ist bezüglich des 5'- Endes des ersten Primers. Mehr als nur ein zusätzlicher Primer kann eingesetzt werden (nicht dargestellt), solange sie alle die gleiche Base an dem 3'-Ende aufweisen.
Figur 5 veranschaulicht eine weitere Ausführungsform, die in die oben angegebene Kategorie (iii) fällt. Der eine oder weitere zusätzliche Primer sind komplementär einer Nukleinsäure- Sequenz oder Nukleinsäure-Sequenzen, die von der ersten Sequenz durch ein oder mehrere Basen entfernt ist. Mindestens einer dieser zusätzlichen Primer ist jedoch, selbst wenn er durch mehrere Basen entfernt ist, dazu befähigt, ein Primer-Extensionsprodukt zu erzeugen, das komplementär ist der ersten Nukleinsäure-Sequenz. Im allgemeinen bedeutet dies, daß mindestnes einer der zusätzlichen Primer komplementär ist einer Nukleinsäure-Sequenz, die weniger als 50 Kilodalton von der Nukleinsäure-Sequenz des ersten Primers entfernt ist. Die Auswahl der zusätzlichen Primer kann einige Routineversuche erfordern, um solche auszuwählen, die Extensionsprodukte über die vermutete Fehlpaarung bilden. Derartige Versuche liegen jedoch innerhalb des Könnens eines Fachmannes. In Figur 5 sollen die doppelten Unterbrechungslinien anzeigen, daß der zusätzliche Primer um mehr als die drei Basen, die speziell dargestellt sind, entfernt ist.
In Figur 6 ist eine Ausführungsform dargestellt, die zusätzliche Primer von allen drei Kategorien (i)-(iii), wie oben angegeben, verwendet. Einige der zusätzlichen Primer sind komplementär zu einer Nukleinsäure-Sequenz, die sich mit einem Teil der ersten Sequenz überlappt, wohingegen ein dargestellter Primer eine "benachbarte" Sequenz aufweist und ein anderer Primer eine Sequenz aufweist, die durch drei Basen entfernt ist. Andere Mischungen von zusätzlichen Primern können gebildet und unter Anwendung der hier beschriebenen Lehre verwendet werden.
Bevorzugte Zusammensetzungen dieser Erfindung entsprechen jenen, die in den Figuren 2 oder 3 dargestellt sind.
In der Zusammensetzung sowie in den Verfahren der vorliegenden Erfindung können die Konzentrationen von jedem der ersten und zusätzlichen Primer verändert werden von 0,001 bis 99,99 molaren Prozenten. Die genauen Konzentrationen der Primer in der Zusammensetzung können variiert werden je nach der speziellen Beziehung der Primer. Beispielsweise hat es sich als vorteilhaft erwiesen, daß im Falle der in Figur 2 dargestellten Zusammensetzung der kürzeste Primer in der größten Konzentration vorliegt. Dies bedeutet, daß selbst wenn der größere Primer effektiv Extensionsprodukte liefert, die kürzeren Primer für spätere Amplifikationszyklen bereitstehen, und daß die Wirksamkeit des Verfahrens weiter verbessert wird. Im Falle anderer Ausführungsformen liegen die Primer im allgemeinen in gleichen Konzentrationen vor.
Die Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist geeignet für die Replikation einer vorbestimmten Target-Nukleinsäure. Die erste Stufe eines solchen Verfahrens besteht in der Herstellung einer Probe mit der Target-Nukleinsäure für die Replikation. Dies bedeutet in der Regel die Entfernung unerwünschter Proteine und cellularer Produkte aus der Probe in geeigneter Weise. Verschiedene Verfahren sind nach dem Stande der Technik bekannt, einschließlich jener, die beschrieben werden von Laure & Mitarbeitern in der Literaturstelle The Lancet, S. 538-540 (3. September 1988) und von Gross-Belland & Mitarbeitern in der Zeitschrift Eur. J. Biochem., 36, 32 (1973).
Nachdem die Probe hergestellt worden ist, wird sie mit der Zusammensetzung dieser Erfindung in Kontakt gebracht, und zwar unter Bedingungen derart, daß eine Mischung von hyvridisierten Produkten von Primern und Target-Nukleinsäure erzeugt wird. Derartige Bedingungen sind normalerweise solche, die für die Amplifikation angewandt wird, die in der US-A-4 683 202 beschrieben wird. Dann werden Primer-Extensionsprodukte erzeugt im Falle von mindestens einem der hybridisierten Produkte, worauf sich eine zusätzliche Verlängerung und Bildung von Extensionsprodukten anschließt. Nach einer Denaturierung (d.h. Abtrennung von komplementären Produkten) kann die replizierte Target-Nukleinsäure von der Reaktionsmischung nach üblichen Verfahren und unter Anwendung einer üblichen Vorrichtung isoliert werden.
Im Falle einer bevorzugten Ausführungsform schließt die Replikation eine weitere Amplifikation der Target-Nukleinsäure ein, unter Anwendung einer Polymerase-Kettenreaktion (die weiter unten im größeren Detail beschrieben wird). Die Replikation einer Target-Nukleinsäure kann geeignet sein für die Herstellung von Genen oder Genfragmenten oder für die Sequenzierung von genomischer DNA.
Die vorliegende Erfindung ist ferner geeignet für die Erkennung einer spezifischen Nukleinsäure mit zwei komplementären Strängen. Die meisten Nukleinsäure-Sequenzen von Interesse sind bereits doppelsträngig, wie beispielsweise jene, die in DNA gefunden werden. Jedoch können einzelsträngige Nukleinsäure-Sequenzen, wie beispielsweise mRNA, in entsprechender Weise ermittelt werden, nachdem sie in doppelsträngige Sequenzen überführt wurden, unter Anwendung von Umkehr-Transkriptase.
Eine spezifische Nukleinsäure-Sequenz wird unter Verwendung der Nukleinsäure erzeugt, die die Sequenz als ein Templat enthält. Enthält die Säure zwei Stränge, so ist es notwendig, die Stränge voneinander zu trennen, entweder in einer separaten Stufe oder gleichzeitig mit der Bildung der Primer-Extensionsprodukte. Die Denaturierung kann unter Anwendung beliebiger geeigneter physikalischer, chemischer oder enzymatischer Methoden erfolgen, wie sie aus dem Stande der Technik bekannt sind. Die Erhitzung auf eine geeignete Temperatur ist eine bevorzugte Maßnahme.
Liegen die voneinander getrennten Stränge zur Verwendung vor, so kann eine Synthese von zusätzlichen Nukleinsäuresträngen durchgeführt werden, unter Verwendung der Primer-Zusammensetzung dieser Erfindung in einer abgepufferten wäßrigen Lösung, im allgemeinen bei einem pH-Wert von 7 bis 9. Ein Primer für den komplementären DNA-Strang kann ebenfalls zugesetzt werden. Vorzugsweise wird ein molarer Überschuß der Primer zu der abgepufferten Lösung zugegeben, wobei spezielle Mengen im Stande der Technik beschrieben werden (beispielsweise in der US-A- 4 683 202). Die Deoxyribonukleosidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP werden ebenfalls der Synthesemischung in adäquaten Mengen zugegeben und die erhaltene Lösung wird bis zu 10 Minuten lang, vorzugsweise 1 bis 4 Minuten lang, auf 90 bis 100ºC erhitzt. Nach dieser Erhitzung wird die Lösung vorzugsweise auf Raumtemperatur abgekühlt und ein geeignetes Mittel für die Induzierung (oder Katalyse) der Bildung von Primer-Extensionsprodukten wird eingeführt. Dieses induzierende Mittel ist aus dem Stande der Technik im allgemeinen als ein Polymerisationsmittel bekannt. Die Reaktion zur Erzeugung dieser Produkte kann unter bekannten Bedingungen durchgeführt werden (im allgemeinen von Raumtemperatur bis zu der Temperatur, bei der eine Polymerisation nicht länger erfolgt).
Das Polymerisationsmittel kann aus einer beliebigen Verbindung oder aus einer Kombination von Reagentien bestehen, die dahingehend wirken, daß sie die Synthese von Primer-Extensionsprodukten bewirken, wozu gehören Enzyme (beispielsweise E. coli DNA-Polymerase I, T4 DNA-Polymerase, Klenow-Polymerase, Umkehr- Transkriptase und andere Stoffe, die aus dem Stande der Technik bekannt sind). Besonders geeignete Enzyme sind thermisch stabile Enzyme, die kloniert sind oder in der Natur vorkommen, wie beispielsweise solche, die erhältlich sind von verschiedenen bakteriellen Thermus-Spezies. Andere Polymerisationsmittel werden in der US-A-4 683 202 beschrieben.
Bevorzugte thermisch stabile Enzyme sind DNA-Polymerasen von Thermus aquaticus, wie sie beispielsweise beschrieben werden in EP-A-0 258 017. Andere geeignete Enzyme werden beschrieben von Rossi & Mitarbeitern in Syst. Appl. Microbiol. 7(2-3), s. 337-341, 1986. Viele geeignete Polymerasen sind im Handel erhältlich. Im allgemeinen wird die Synthese der Extensionsprodukte an dem 3'-Ende eines jeden Primers eingeleitet und verläuft in der 5'- bis 3'-Richtung längs des Templates, bis die Synthese abgeschlossen ist. Einige Polymerisationsmittel (zum Beispiel Umkehr-Transkriptase) können zu einer Synthese in der 3'- bis 5'-Richtung längs des Templates führen. Die neu gebildeten Primer-Extensionsprodukte mit den neu synthetisierten Strängen und ihre entsprechenden Primer bilden doppelsträngige Moleküle mit den Anfangs-Target-Strängen, die in den folgenden Stufen des Verfahrens angewandt werden. Diese Stränge werden dann durch Denaturierung, wie oben beschrieben, abgetrent, unter Bereitstellung von einsträngigen Molekülen, auf die neue Nukleinsäuren, wie oben beschrieben, synthetisiert werden. Zusätzliche Reagentien können erforderlich sein, damit das Amplifikationsverfahren fortschreitet, worauf die meisten der Extensionsprodukte bestehen aus der spezifischen Nukleinsäuresequenz, die durch die Primer gebunden wird (d.h. aus komplementären Produkten).
Die Stufen der Strangtrennung und der Synthese des Extensionsproduktes können so oft wie erforderlich wiederholt werden, um die gewünschte Menge an der spezifischen Nukleinsäure zu erzeugen, die zur Verwendung benötigt wird, beispielsweise zur Erkennung. Im allgemeinen wird die Folge der Stufen mindestens einmal wiederholt und vorzugsweise mindestens 10- bis 50-mal.
Ist es erwünscht, mehr als eine spezifische Nukleinsäure von der ersten Nukleinsäure oder einer Mischung hiervon zu erzeugen, so kann die geeignete Anzahl von Sätzen von Primern in dem oben beschriebenen allgemeinen Verfahren verwendet werden.
Zu jedem beliebigen Zeitpunkt des Verfahrens dieser Erfindung nach der Erzeugung mindestens eines Primer-Extensionsproduktes, kann das Produkt hybridisiert werden mit einer erkennbaren oder bestimmbaren markierten Sonde (wie weiter unten beschrieben). Dieser Kontakt von Sonde und Extensionsprodukt kann zu jedem geeigneten Zeitpunkt während des Verfahrens erfolgen.
Im allgemeinen wird, wenn die gewünschte Menge an der Nukleinsäure-Sequenz von Interesse erzeugt worden ist und wenn die Primer-Extensionsprodukte letztmalig getrennt worden sind, das erste Primer-Extensionsprodukt (d.h. das Extensionsprodukt, das unter Verwendung der Primer-Zusammensetzung dieser Erfindung erzeugt worden ist) in Kontakt gebracht mit einer Oligonukleotid- Sonde, die für die Erkennung markiert ist und hiermit komplementär ist unter Erzeugung eines Produktes. Die Sonde ist eine Nukleinsäure-Sequenz, die komplementär ist der Target-Nukleinsäure- Sequenz. Die Sonden können jede beliebige Länge von Nukleinsäuren aufweisen, weisen jedoch vorzugsweise 15 bis 40 Nukleinsäuren auf. Sie sind markiert (gewöhnlich an dem 5'-Ende) mit einem beliebigen geeigneten erkennbaren Material (entweder direkt oder indirekt). Verfahren zur Anbringung von Markierungen und Verfahren zur Herstellung von Sonden sind aus dem Stande der Technik bekannt, und werden beispielsweise beschrieben von Agrawal & Mitarbeitern in der Literaturstelle Nucleic Acid Res., 14, S. 6227-45 (1986) und in den Literaturstellen, die oben angegeben wurden für die Bindung eines spezifischen Bindungsliganden an einen Primer. Zu geeigneten Markierungen gehören Radioisotope, Elektronendichte-Reagentien, Chromogene, Fluorogene, phosphoreszierende Reste, Ferritin und andere magnetische Teilchen, chemilumineszierende Reste sowie Enzyme (die bevorzugt verwendet werden). Zu geeigneten Enzymen gehören Glukoseoxidase, Peroxidase, Uricase, alkalische Phosphatase und andere, aus dem Stande der Technik bekannte Enzyme. Substrate und Farbstoffe liefernde Zusammensetzungen für solche Enzyme sind ebenfalls bekannt.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform besteht die Markierung aus Peroxidase und zu einem geeigneten Zeitpunkt bei der Bestimmung werden Wasserstoffperoxid und eine geeignete, einen Farbstoff bildende Zusammensetzung zugegeben, um einen bestimmbaren Farbstoff zu erzeugen. Beispielsweise gehören zu geeigneten, Farbstoffe liefernden Reagentien Tetramethylbenzidin und Derivate hiervon, sowie Leukofarbstoffe, wie zum Beispiel Triarylimidazolleukofarbstoffe (wie sie in der US-A- 4 089 747 beschrieben werden) oder andere Verbindungen, die unter Erzeugung eines Farbstoffes in Gegenwart von Peroxidase und Wasserstoffperoxid reagieren. Besonders geeignete Zusammensetzungen für die Erzeugung von Farbstoffen werden beschrieben in den WO-A-88/02806 sowie WO-A-88/02807 sowie in der EP-A- 0 308 236.
Die Erkennung des Vorhandenseins der Sonde, die sich in dem komplementären Produkt befindet, kann unter Anwendung geeigneter und bekannter Erkennungsvorrichtungen und Verfahren erfolgen. Bestimmte Sonden können mit dem Auge sichtbar sein ohne Anwendung einer Erkennungs- oder Bestimmungsvorrichtung. Es kann ferner zweckmäßig sein, das Verfahren in einem geeigneten Behälter durchzuführen. Der einfachste Behälter besteht in einem Teströhrchen, einem Kolben oder Becher, doch sind kompliziertere Behälter entwickelt worden, um automatische Verfahren zur Durchführung der Methode zu erleichtern. Beispielsweise ist eine Küvette konstruiert worden, um bestimmte Temperatur-Charakteristika während der Praxis der Methode einzuhalten, die beschrieben und beansprucht wird in der EP-A-0 318 255. Andere geeignete Behälter können in geeigneter Weise an automatisierte Verfahren oder den einmaligen Gebrauch der Methode dieser Erfindung angepaßt werden.
Damit die Sonde in dem komplementären Produkt vorliegt, das erkannt werden soll, ist es oftmals wichtig, daß das komplementäre Produkt von den anderen Stoffen des Reaktionsmediums abgetrennt wird. Dies kann nach einer Anzahl von Methoden erfolgen, einschließlich der Verwendung eines Einfangmittels auf einem Primer, so daß die Primer-Extensionsprodukte, die in dem Verfahren repliziert werden, und an die die Sonde gebunden ist, von der Reaktionsmischung abgetrennt werden. Primer können an unlösliche Materialien in geeigneter Weise gebunden werden oder sie können so beschaffen sein, daß sie einfangbar sind, d.h. reaktiv mit einem Einfangmittel zu einem bestimmten Zeitpunkt bei der Durchführung des Verfahrens.
Ein geeignetes Einfangmittel wird in der EP-A-0 310 694 beschrieben. Ein Primer weist einen spezifischen, hieran gebundenen Bindungsliganden auf (wie zum Beispiel Biotin, ein Antikörper oder ein Lectin), der dazu befähigt ist, spezifisch an ein Rezeptormolekül gebunden zu werden (wie beispielsweise Avidin, ein antigenes Material oder einen Zucker), das in geeigneter Weise an ein unlösliches Material gebunden ist. Weitere Details können jener Patentschrift entnommen werden. Das anfallende unlöslich gemachte komplexe Produkt kann von den nicht komplex gebundenen Materialien durch Filtration, Zentrifugieren oder andere geeignete Trennungstechniken abgetrennt werden.
Besonders geeignete Trennungsmittel sind mikroporöse Filtermembranen, ie zum Beispiel Polyamid-Membranen (beispielsweise Loprodyne oder Biodyne Membranen). Diese können unbeschichtet oder vorbeschichtet mit oberflächenaktiven Mitteln oder anderen Materialien, die das analytische Verfahren erleichtern, verwendet werden.
Die Membranen können als separates Substrat mit geeigneten Behältern zur Durchführung anderer Stufen des Assays verwendet werden. Vorzugsweise jedoch liegen sie fest montiert als Teil einer Testvorrichtung vor. Es sind verschiedene Testvorrichtungen aus dem Stande der Technik bekannt, einschließlich jener, die beschrieben werden in den US-A-3 825 410, US-A-3 888 629, US-A-3 970 429 und US-A-4 446 232. Besonders geeignete Vorrichtungen oder Geräte werden in der EP-A-0 308 231 beschrieben.
Jeder geeignete feste Träger kann für die Abtrennung des zu bestimmenden Produktes verwendet werden, wozu gehören eine Mikrotiter-Platte, ein Teströhrchen, ein Becher, Kügelchen, eine Folie, Membranfilter, Filterpapiere, Gele, magnetische Teilchen oder Glaswolle. Er kann aus einer Anzahl von Materialien hergestellt werden, wozu gehören Glas, keramische Stoffe, Metalle, natürlich vorkommende oder synthetische Polymere, Cellulosematerialien, Filtermaterialien und andere Materialien, die für den Fachmann als geeignet erkannt werden können.
Besonders geeignete feste Trägermaterialien sind polymere Kügelchen, die im allgemeinen eine mittlere Teilchengröße von 0,1 bis 10 um aufweisen. Weitere Details bezüglich bevorzugter polymerer Teilchen, einschließlich geeigneter Monomerer, Verfahren zur Herstellung derselben und die Bindung von Rezeptormolekülen finden sich in der EP-A-0 302 715.
Das hier beschriebene Verfahren kann dazu verwendet werden, um die Erkennung oder Charakterisierung von spezifischen Nukleinsäure-Sequenzen herbeizuführen, die verbunden sind mit infektiösen Krankheiten, genetischen Störungen oder cellularen Störungen, wie beispielsweise Krebs. Das Verfahren kann ferner zu forensischen Untersuchungen sowie zur DNA-Typisierung verwendet werden. Im Sinne dieser Erfindung gehören zu genetischen Störungen spezifische Deletionen oder Mutationen in genomischer DNA von irgend welchen Organismen, wie zum Beispiel Sichelzellenanämie, cystischer Fibrose, α-Thalassemia, β-Thalassemia und anderen, die für den Fachmann leicht erkennbar sind. Die Gegenwart von menschlichem Leukocyten-Antigen (HLA) kann bei Anwendung der vorliegenden Erfindung festgestellt werden. Verschiedene infektiöse Krankheiten lassen sich durch das Vorhandensein kleiner Mengen spezifischer DNA-Sequenzen, die charakteristisch für den Organismus sind, gleichgültig, ob sie in einer Hefe, einem Bakterium oder einem Virus vorliegen, in einer klinischen Probe feststellen. Zu derartigen Bakterien, die festgestellt werden können, gehören, ohne daß hierauf eine Beschränkung erfolgen soll, Salmonella, Chlamydia, Gonorrhea, Shigella und Listeria. Zu Viren, die feststellbar sind, gehören, obgleich eine Beschränkung hierauf nicht beabsichtigt ist, Hperes, Epstein Barr-Viren, Cytomegalovirus, Hepatitis sowie Retroviren, wie zum Beispiel HTLV-I und HIV-I. Protozoen-Parasiten, Hefen und Schimmel sind ebenfalls feststellbar. Andere feststellbare Spezies sind für den Fachmann leicht feststellbar. Die Erfindung eignet sich insbesondere für die Erkennung der Gegenwart von Retroviren, wie beispielsweise HIV-I, in Testproben, durch Ermittlung des Vorhandenseins von viraler DNA.
Der diagnostische Testsatz dieser Erfindung ist oben allgemein beschrieben worden. Zu kritischen Komponenten des Testsatzes gehören der erste Oligonukleotid-Primer und ein oder mehrere zusätzliche Primer, wie oben beschrieben. Der Testsatz kann einen Satz von Primern für jede Nukleinsäure-Sequenz enthalten, die von Interesse ist.
Vorzugsweise enthält der Testsatz ferner ein Mittel für eine Primer-Polymerisation, wie zum Beispiel eine DNA-Polymerase (wie zum Beispiel eine Polymerase, erhalten von Thermus aquaticus), die vier verschiedenen Deoxyribonukleosidtriphosphate (dATP, dCTP, dGTP und dTTP), eine feststellbare Sonde, eine einen Farbstoff liefernde Zusammensetzung, wenn die Sonde mit einem Enzym markiert ist, sowie ein unlösliches Substrat, wie hier beschrieben, im allgemeinen in separaten Behältnissen.
Die Testsatz-Komponenten sind in geeigneter Weise abgepackt, und können versehen sein mit einer Anzahl von gegebenenfalls vorliegenden Komponenten, wie beispielsweise Pipetten, Küvetten, Instruktionen, Puffern, Waschlöschungen, Verdünnungsmitteln und anderen Reagentien, Materialien und Ausrüstungsgegenständen, die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Diese zusätzlichen Komponenten sind aus dem Stande der Technik bekannt.
Die folgenden Beispiele sind beigefügt, um die Praxis dieser Erfindung zu veranschaulichen, womit damit nicht beabsichtigt ist, irgend eine Beschränkung herbeizuführen.
Die DNA-Polymerase, die im Falle des Beispieles 2 verwendet wurde, wurde aus dem Handel gezogen. Sie wurde isoliert von Thermus aquaticus und hatte eine Aktivität von 2,5 Einheiten/ul, wobei eine Einheit die Menge repräsentiert, die erforderlich ist, um 10 mMol dNTP in ein Primer-Extensionsprodukt in 30 Minuten bei 74ºC einzuführen.
Der "laufende Puffer" (pH 8), der für die Elektrophorese eingesetzt wurde, bestand aus Tris(hydroxymethyl)aminomethan (89 mmolar), Borsäure (89 mmolar) sowie Ethylendiamintetraessigsäure (2 mmolar).

Proben-Herstellung:

Eine aus vollständigem Blut bestehende Probe (100 ul) wurde einem Patienten entnommen, von dem vermutet wurde, daß er Träger des HIV-I-Virus ist, worauf die Probe in ein Teströhrchen gegeben wurde, das eine wäßrige Dextranlösung (250 ul, 3 Gew.-% Dextran mit einem Molekulargewicht von 24 000) enthielt, worauf eine Mischung erfolgte, indem das Teströhrchen mehrmals umgedreht wurde. Nach 5 Minuten bei Raumtemperatur wurde die überstehende Flüssigkeit in ein anderes Teströhrchen gegeben und 5 Minuten lang auf 100ºC erhitzt. Die Mischung wurde dann einige Sekunden lang zentrifugiert, worauf die überstehende Flüssigkeit (50 ul Aliquots) in ein anderes Teströhrchen gegeben wurde, die für eine Amplifikation bereit war. Durch das Verfahren wurde die virale Ziel-DNA extrahiert.

Beispiel 1: Primer-Zusammensetzungen für HIV-I DNA-Bestimmung

Es wurden zwei Primer-Zusammensetzungen dieser Erfindung, wie unten für die Verwendung im Falle des Beispieles 2 beschrieben, hergestellt. Die Zusammensetzungen bestanden aus zwei Sätzen von jeweils fünf Primern.
Zwei Sätze mit jeweils fünf Primern wurden für die zwei Stränge der Ziel-DNA hergestellt. Die homologen Primersätze sind unten identifiziert als A, A&sub1;, A&sub2;, A&sub3; und A&sub4;, sowie B, B&sub1;, B&sub2;, B&sub3; und B&sub4;. Die Sequenzen der A- und B-Primer wurden erhalten nach Laure & Mitarbeitern gemäß The Lancet (wie oben angegeben). Wie es im tande der Technik üblich ist, wurden die Sequenzen durch Buchstaben identifiziert, welche die individuellen Nukleotidbasen kennzeichnen, d.h. Adenin(A), Thymin(T), Guanin(G) sowie Cytosin(C). Die Primer hatten die folgenden Nukleotid-Sequenzen:
Primer A (+), 25 Basen:
5'-TGGGAAGTTCAATTAGGAATACCAC-3'
zusätzliche Primer (+):
A&sub1;, 24 Basen:
5'-TGGGAAGTTCAATTAGGAATACCA-3'
A&sub2;, 23 Basen:
5'-TGGGAAGTTCAATTAGGAATACC-3'
A&sub3;, 22 Basen:
5'-TGGGAAGTTCAATTAGGAATAC-3'
A&sub4;, 21 Basen:
5'-TGGGAAGTTCAATTAGGAATA-3'
Primer B (-), 26 Basen:
5'-CTACATACAAATCATCCATGTATTC-3'
zusätzliche Primer (-):
B&sub1;, 25 Basen:
5'-CTACATACAAATCATCCATGTATT-3'
B&sub2;, 24 Basen:
5'-CTACATACAAATCATCCATGTAT-3'
B&sub3;, 23 Basen:
5'-CTACATACAAATCATCCATGTA-3'
B&sub4;, 22 Basen:
5'-CCTACATACAAATCATCCATGT-3'
Die Primer wurden nach dem folgenden Verfahren getrennt:

Automatisiertes Synthese-Verfahren:

Die Diisopropylphosphoramidite (erhalten von der Firma American Bionetics) wurden in Folge kondensiert auf mit einem Nukleotid versehenen, gesteuerten Glasträger mit Poren (erhalten von der Firma Biosearch) unter Verwendung eines Biosearch 8700 DNA Synthesizers von Milligen/Biosearch
Das Verfahren schloß ein die Detritylierung unter Verwendung von Dichloroessigsäure in Dichloromethan, eine Kondensation unter Verwendung von 5-Methylthiotetrazol als aktivierendem Protonen-Donor sowie das Einfangen mit Essigsäureanhydrid und N-Methylimidazol/Pyridin in Tetrahydrofuran Die Zyklusdauer betrug etwa 6 Minuten. Die Ausbeuten in jeder Stufe waren grösser als 98 % und wurden bestimmt durch Sammlung und spektroskopische Untersuchung des Dimethoxytritylalkohols, der während der Detritylierung freigesetzt wurde.

Oligonukleotid-Deprotektion sowie Reinigungsverfahren

Der feste Träger wurde aus der Kolonne entfernt und 6 bis 18 Stunden lang bei 25ºC der Einwirkung von 2 ml konzentriertem Ammoniumhydroxid ausgesetzt. Der Träger wurde dann durch Filtration entfernt und die Ammoniaklösung wurde auf 1 ml eingedampft, wobei Stickstoff über die Lösung strömen gelassen wurde.
Die Probe (in einem 0,1 molaren Triethylaminacetat-Puffer, pH-Wert 6,9) wurde durch eine NAP-10-Kolonne (Pharmacia AB) geführt, dann weiter gereinigt durch HPLC unter Verwendung einer PRP-1-Kolonne (Hamilton Co.) nach der üblichen Trityl- auf/Trityl-ab-Methode, die in der Biosearch-Produkt-Literatur beschrieben wird, oder direkt nach der Detritylierung verwendet. Die Entfernung der Tritylgruppen erfolgte mit 100 mmolarer Essigsäure innerhalb eines Zeitraums von einer Stunde bei 20-25ºC, worauf sich eine Neutralisation mit Triethylamin anschloß und eine zweite Passage durch eine HAP-10-Kolonne.

Charakterisierung der Oligonukleotide:

Die Basen-Zusammensetzung wurde bestimmt durch Digestion des Oligodeoxyribonukleotides zu Bestandteil-Nukleotiden, unter Verwendung von Schlangen-Venom-Phosphodiesterase, worauf sich eine Trennung und quantitative Bestimmung der anfallenden Nukleotide anschloß, unter Anwendung einer Umkehr-Phasen-HPLC- Kolonne und einer mobilen Acetonitril/Ammoniumacetatphase.

Beispiel 2: Ermittlung der HIV-I-Target-DNA

Die vorliegende Erfindung wurde dargestellt unter Verwendung der Primer-Zusammensetzungen des Beispieles 1 bei der Amplifikation und Erkennung von viraler Target-HIV-I-DNA. Die Erfindung wurde verglichen mit einem Versuch zur Erkennung des gleichen Zieles unter Verwendung von lediglich den Primern A und B.
Es wurde die folgende Test-Amplifikations-Lösung (100 ul) hergestellt:
Eine abgepufferte Lösung, enthaltend Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid-Puffer (pH 8, 10 mmolar) sowie Magnesiumchlorid (10 mmolar) wurde mit einer Lösung (2 ul) vermischt, welche die Primer-Zusammensetzungen (+ und -) , wie oben beschrieben, enthielt (100 pmolar mit jeweils 10 % Primer A, A&sub1;, A&sub2; und A&sub3; sowie 60 % Primer A&sub4;, und entsprechend für die B-Primer-Zusammensetzung) sowie Deoxynukleotidtriphosphaten (dNTP, jeweils 1500 pmolar). Dann wurde DNA-Target (0,1 pmolar) zugegeben, gefolgt durch die Zugabe von DNA-Polymerase (2,5 Einheiten).
Die Testlösungen und Vergleichslösungen (lediglich Primer A und B) wurden einzeln in Mikrozentrifugen-Röhrchen gebracht und Polymerasekettenreaktionen wurden in 30 aufeinanderfolgenden Zyklen, wie im folgenden beschrieben, durchgeführt:
Erhitzen auf 94ºC eine Minute lang,
Aufbewahren über 30 Sekunden,
Verminderung der Temperatur auf 50ºC in 80 Sekunden,
Beibehalten der Temperatur 30 Sekunden lang,
Erhöhen der Temperatur auf 70ºC in 45 Sekunden, und
Beibehalten der Temperatur eine Minute lang.
Aliquote Teile (5 ul) wurden abgezo en und auf 4 %ige Agarosegele (3 % NuSieve nd 1 % SeaKem erhältlich von der Firma FMC-BioProducts) gegeben. Die Gele wurden mit 4 ul einer wäßrigen Ethidiumbromidlösung (10 mg/ml) eingetärbt. Der "laufende Puffer" (600 ul) enthielt 24 ul Ethidiumbromid. Die Gele wurden einer Elektrophorese unterworfen bei 160 Volt/cm über einen Zeitraum von einer Stunde, worauf sie photographiert und die erhaltenen Banden festgestellt wurden.
Die Testmischung, welche die Primer-Zusammensetzungen dieser Erfindung enthielt, ergab stark sichtbare Banden in dem Gel. Die Vergleichsmischung (die lediglich die Primer A und B enthielt), lieferte keine feststellbaren Banden in dem Gel.

Claims

1. Primer-Zusammensetzung, die für die Amplifikation oder Replikation einer vorbestimmten Target-Nukleinsäure geeignet ist, mit einer wäßrigen Mischung von:

a) einem ersten Oligonukleotidprimer, der praktisch komplementär ist zu und hybridisierbar ist mit einer ersten spezifischen Nukleinsäuresequenz einer Target-Nukleinsäure, und

b) mindestens einem zusätzlichen Oligonukleotidprimer, der mindestens praktisch komplementär ist zu und hybridisierbar ist mit einer zusätzlichen Nukleinsäuresequenz der Target-Säure,

dadurch gekennzeichnet, daß die zusätzliche Nukleinsäuresequenz der Target-Nukleinsäure entweder:

i) nur einen Teil der ersten spezifischen Nukleinsäuresequenz einschließt,

ii) sich in unmittelbarer Nachbarschaft zur ersten spezifischen Nukleinsäuresequenz befindet, oder

iii) von der ersten spezifischen Nukleinsäuresequenz durch ein oder mehrere Nukleotidbasen getrennt ist, wobei der zusätzliche Primer dazu befähigt ist, ein Primer-Extensionsprodukt zu bilden, das komplementär ist zu und hybridisierbar ist mit der ersten spezifischen Nukleinsäuresequenz.

2. Primer-Zusammensetzung nach Anspruch 1 mit 1 bis 10 zusätzlichen Oligonukleotidprimern.

3. Primer-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 und 2, worin die zusätzlichen Oligonukleotidprimer die gleiche Anzahl von Nukleotidbasen aufweisen wie der erste Primer, wobei jedoch jeder zusätzliche Primer praktisch komplementär ist zu und hybridisierbar ist mit einer Nukleinsäuresequenz, die um eine einzelne Nukleotidbase verschoben ist.

4. Primer-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 und 2, bei der die zusätzlichen Oligonukleotidprimer weniger als die Anzahl der Nukleotidbasen des ersten Primer aufweisen und wobei jeder zusätzliche Oligonukleotidprimer praktisch komplementär ist zu und hybridisierbar ist mit einer Nukleinsäuresequenz, die vollständig in der ersten spezifischen Primer-Nukleinsäuresequenz eingeschlossen ist.

5. Primer-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in der mindestens einer der Oligonukleotidprimer an ein unlösliches Substrat gebunden ist oder an ein unlösliches Substrat gebunden werden kann.

6. Primer-Zusammensetzung nach Anspruch 5, in der das Substrat ein polymeres Teilchen ist.

7. Diagnostischer Testkit, der für die Amplifikation oder Replikation einer vorbestimmten Target-Nukleinsäure geeignet ist, mit in einzelner Abpackung:

i) nur einen Teil der ersten spezifischen Nukleinsäuresequenz einschließt,

iii) von der ersten spezifischen Nukleinsäuresequenz durch ein oder mehrere Nukleotidbasen getrennt ist, wobei der zusätzliche Primer dazu befähigt ist, ein Primer-Extensionsprodukt zu bilden, das komplementär ist mit und hybridisierbar ist mit der ersten spezifischen Nukleinsäuresequenz.

8. Testkit nach Anspruch 7, der ferner eine DNA-Polymerase enthält.

9 Kit nach Anspruch 7 oder 8, der weiter eine erfaßbare Gensonde aufweist, die komplementär der Target-Nukleinsäure ist.

10. Verfahren zur Replikation einer vorbestimmten Target- Nukleinsaure, bei dem man:

A. eine Probe mit einer vorbestiminten Target-Nukleinsäure für eine Replikation herstellt, und

B. die hergestellte Probe mit einer Primer-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in Kontakt bringt, unter Bildung einer Mischung von hybridisierten Produkten des Primers und der Target-Nukleinsäure, und bei dem man

C. ein erstes Primer-Extensionsprodukt an mindestens einem der hybridisierten Produkte bildet, und bei dem man das erste Primer-Extensionsprodukt mit einem Primer hybridisiert und verlängert.

11. Verfahren nach Anspruch 10 mit der weiteren Stufe der Amplifikation des ersten Primer-Extensionsproduktes.

12. Verfahren zur Bestimmung einer vorbestimmten Target- Nukleinsäure, bei dem man:

A. eine Probe, von der man erwartet, daß sie eine Target- Nukleinsäure enthält, mit einer Primer-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in Kontakt bringt, um eine Mischung von hybridisierten Produkten der Primer und der Target-Nukleinsäure zu erzeugen, bei dem man

B. ein erstes Primer-Extensionsprodukt in mindestens einem der hybridisierten Produkte erzeugt, das erste Primer- Extensionsprodukt mit einem Primer hybridisiert und verlängert und das erste Primer-Extensionsprodukt amplifiziert, bei dem man

C. die erhaltenen Primer-Extensionsprodukte voneinander trennt und sie mit einer erfaßbaren Oligonukleotid- Gensonde in Kontakt bringt, unter Erzeugung eines erfaßbaren komplementären Produktes, und bei dem man

D. das erfaßbare komplementäre Produkt als Anzeichen des Vorhandenseins der Target-Nukleinsäure in der Probe bestimmt.

13. Verfahren nach Anspruch 12 für die Bestimmung von menschlichem Leukozyten-Antigen.

14. Verfahren nach Anspruch 12 zur Bestimmung von HTLV-I oder HIV-I.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, bei dem die Amplifikation unter Anwendung einer Polymerase-Kettenreaktion durchgeführt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem die Amplifikation unter Verwendung einer Polymerase aus Thermus aquaticus durchgeführt wird.