CN105849264B - 用于鉴别重复测序读数的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于检测重复测序读数的方法、组合物和试剂盒。在一些实施例中，去除所述重复测序读数。本发明部分基于用于从测序读数群辨别重复测序读数的组合物和方法。本文提出的重复测序读数的检测和/或去除是一种提高评估高通量序列反应(包括复杂多路序列反应)产生的数据的功效的新颖方法。

Description

用于鉴别重复测序读数的组合物和方法
相关申请案的交叉引用
本申请案要求2013年11月13日申请的美国临时申请案第61/903,826号的权益，所述申请案以全文引用的方式并入本文中。
以电子方式提交的文本文档的描述
用电子方式提交的文本文件的内容特此以全文引用的方式并入本文中：序列表的计算机可读格式拷贝(文件名：NUGN_001_01WO_SeqList_ST25.txt，记录日期：2014年11月12日，文件大小3千字节)。
技术领域
本发明大体上涉及高处理量测序反应的领域和辨别通过从作为独特分子的核苷酸分子的序列复制产生的伪影的能力。
背景技术
在RNA测序应用中，精确基因表达测量可能受到文库扩增期间出现的PCR重复伪影妨碍。在分析RNA测序数据时，当发现两个或更多个相同序列时，可能难以知道这些代表性独特cDNA分子是否独立地衍生自不同RNA分子，或其是否为源自单个RNA分子的PCR重复。在通过测序基因分型时，重复读数可以视为无信息的并且可以减少成单个读数，因此减少最终分析中使用的测序读数的数目。一般来说，尽管两个独立产生的分子可能随机具有相同开始位置，但如果正向和反向读数具有相同开始位置，那么测序读数可以判断成是重复。基于单个引物延伸的靶向重新测序遭遇问题，因为测序读数的仅一端随机产生，而另一(反向读数)端由特异性探针产生。这可能使得难以判断两个读数是否重复，因为其已经通过PCR复制或因为其偶然恰好在同一位置开始。
在表达分析研究中，进行配对末端测序时可能存在有限值，因为相对于研究外显子利用率，实验目标是测定存在的转录物的量。在这些研究中，配对末端测序增加成本，而仅有的价值在于帮助区分PCR重复。两个读数在仅一端上的同一位置开始的可能性高于两个读数在两端(正向和反向读数)具有相同开始位置的可能性。需要低成本、高处理量测序关注区域、基因分型或单次检测RNA转录物而不具有固有仪器低效率的改良方法，所述低效率由于产生不可用或非所要数据读数而抬高测序成本。本文所述的本发明满足这一需要。本文中，我们描述允许鉴别真实PCR重复并且将其去除的衔接子方法。
本发明的方法提供用于在测序期间鉴别真实重复读数，从而提高测序数据的数据分析以及其它相关优势的新颖方法。
发明内容
本发明部分基于用于从测序读数群辨别重复测序读数的组合物和方法。本文提出的重复测序读数的检测和/或去除是一种提高评估高处理量序列反应(包括复杂多路序列反应)产生的数据的功效的新颖方法。
因此，本发明提供一种从样品测序读数群检测重复测序读数的方法，所述方法包含从一或多个样品向多个核酸片段的各核酸片段的5'端接合衔接子，其中衔接子包含标引引物结合位点、标引位点、标识位点以及目标序列引物结合位点。接合的衔接子-核酸片段产物可以扩增，因此产生来自扩增的衔接子-核酸接合产物的测序读数群。接着可以从测序读数群检测具有重复标识位点和目标序列的测序读数。所述方法可进一步包括从序列读数群去除具有重复标识位点和目标序列的测序读数。
在一些实施例中，用标引位点或目标序列测序标识位点。在其它实施例中，从标引位点或目标序列单独测序标识位点。
在一些实施例中，衔接子从5'到3'包含标引引物结合位点；标引位点；标识位点；以及目标序列引物结合位点。在其它实施例中，衔接子从5'到3'包含标引引物结合位点；标引位点；目标序列引物结合位点；以及标识位点。
在一些实施例中，多个核酸片段从超过一种样品产生。在一些实施例中，来自各样品的核酸片段具有相同标引位点。在一些实施例中，基于标引位点分离测序读数。在其它实施例中，在检测具有重复标识位点和目标序列的序列读数之前进行测序读数的分离。
在一些实施例中，核酸片段为DNA片段、RNA片段或DNA/RNA片段。在其它实施例中，核酸片段为基因组DNA片段或cDNA片段。
在一些实施例中，标引位点的长度介于2个核苷酸与8个核苷酸之间。在其它实施例中，标引位点的长度为约6个核苷酸。在一些实施例中，标识位点的长度介于1个核苷酸与8个核苷酸之间。在其它实施例中，标识位点的长度为约8个核苷酸。
在一些实施例中，标引引物结合位点为通用标引引物结合位点；并且在一些实施例中，目标序列引物结合位点为通用目标序列引物结合位点。
本发明还涵盖包括包含多个衔接子的试剂盒的实施例，其中各衔接子包含标引引物结合位点；标引位点，以及标识位点，和目标测序引物结合位点。
附图说明
参照以下阐述利用本发明的原理的示范性实施例以及其随附图式的描述将获得本发明的新颖特征和本发明的优势的更好理解：
图1描绘产生文库的测序读数的示意图，所述文库包括标引引物和目标序列引物退火。
图2A描绘单引物增浓技术(SPET)和如何将标识位点带入最终文库并且如何通过标引位点进入标识位点测序提供鉴别核酸分子的数据的机制。
图2B为图2A的接续。
图3提供许多设想实施例中实例衔接子以及标引和标识位点的位置的序列的详细视图(SEQ ID NO:1)。“N”指的是任何核酸。
图4描绘两个单独序列文库的示意图，指出传统文库中相较于使用标识位点的文库中的标引引物和目标引物退火。
图5描绘表明使用衔接子中的标识位点拆分真实重复对比明显或可察觉重复的精确度的数据表。
具体实施方式
本发明部分基于用于从测序读数群辨别重复测序读数的组合物和方法。本发明涵盖检测测序应用中重复的序列，并且进一步去除重复序列读数的方法。本发明进一步涵盖试剂盒，其包含允许自定义应用检测和去除高处理量测序反应中的重复序列读数的方法的组分。组合物和方法可使用多种遗传样品分析应用，例如RNA序列分析、拷贝数变异分析、甲基化测序分析、基因分型和全基因组扩增。
现在将详细参考本发明的示范性实施例。虽然将结合示范性实施例描述所披露的方法和组合物，但应理解，这些示范性实施例并不打算限制本发明。相反，本发明打算涵盖替代方式、改良和等效物，其可以包括于本发明的精神和范畴中。
除非另外规定，否则本文所用的遗传学、分子生物学、生物化学和核酸的术语和符号遵照本领域中标准论文和文本的那些，例如科恩伯格(Kornberg)和贝克(Baker),DNA复制(DNA Replication),第二版(W.H.弗里曼(W.H.Freeman),纽约(New York),1992)；勒宁格尔(Lehninger),生物化学(Biochemistry),第二版(沃斯出版社(Worth Publishers),纽约,1975)；斯特罗恩(Strachan)和里德(Read),人类分子遗传学(Human MolecularGenetics),第二版(威立-利斯(Wiley-Liss),纽约,1999)；埃克斯坦(Eckstein)编,寡核苷酸和类似物：实践方法(Oligonucleotides and Analogs:A Practical Approach)(牛津大学出版社(Oxford University Press),纽约(New York),1991)；盖特(Gait)编,寡核苷酸合成：实践方法(Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach)(IRL出版社(IRLPress),牛津(Oxford),1984)等。
在一些实施例中，本文所披露的方法用于从测序读数群检测测序读数，例如具有重复标识位点和目标序列的重复测序读数。重复测序读数可以是标识位点和目标序列与测序读数群中的另一测序读数相同的测序读数。
衔接子
本发明提供衔接子的组合物和包含使用衔接子的方法。衔接子指的是寡核苷酸序列，其与所关注的目标多核苷酸或目标多核苷酸股的接合使能够产生所关注的目标多核苷酸或目标多核苷酸股的准备扩增产物。目标多核苷酸分子在添加衔接子之前可以分段或不分段。在一些实施例中，本文所披露的方法包含从一或多个样品向多个核酸片段的各核酸片段的5'端接合衔接子。
设想适于产生所关注的目标序列区域/股的准备扩增产物的多种衔接子设计。举例来说，衔接子的两个股可以自身互补、非互补或部分互补。在一些实施例中，衔接子可包含标引引物结合位点、标引位点、标识位点和目标序列引物结合位点。
标引引物结合位点为用于结合标引位点的引物的核苷酸序列。标引位点为充当多个多核苷酸样品的指引的核酸序列，因此允许样品一起汇聚到单个测序操作，这称为多工。在一些实施例中，标引位点的长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施例中，标引位点的长度介于2个核苷酸与8个核苷酸之间。在一些实施例中，标引位点的长度为约6个核苷酸。
标识位点为包含随机碱基的核酸序列并且用于鉴别重复测序读数。在一些实施例中，标识位点的长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。在一些实施例中，标识位点的长度介于1个核苷酸与8个核苷酸之间。在一些实施例中，标识位点的长度为约8个核苷酸。这一标识位点可以设计成一组序列，或其可以半随机，或其可以完全随机。另外，这一标识位点可以是固定长度，或其可以是可变长度。在一些实施例中，多个衔接子中的标识位点具有固定长度。举例来说，标识位点可以全部为八个随机碱基。在另一实施例中，多个衔接子中的标识位点具有可变长度。举例来说，标识位点可以在1到8个碱基的尺寸范围中。在另一实施例中，标识位点可以具有已限定序列的限定组。举例来说，多个衔接子的标识位点可以是96个限定的六碱基核苷酸序列中的一个。
目标序列引物结合位点核苷酸序列用于结合目标序列的引物。引物可用于扩增目标序列(例如来自样品的核酸片段)。因此，在一些实施例中，衔接子包含标引引物结合位点和目标序列引物结合位点。
引物为多核苷酸链，通常小于200个残基长，最通常介于15和100个核苷酸长之间，但可涵盖更长的多核苷酸链。靶向引物结合位点的引物通常设计成与单股核酸股杂交。在一些实施例中，靶向引物结合位点的引物设计成与单股DNA目标杂交。在样品包含基因组DNA或其它双股DNA的情况下，样品可以首先变性以赋予目标单股并且使引物能够杂交到所关注的所要序列区。在这些实施例中，本文所述的方法和组合物可允许所关注序列区的区域特异性增浓和扩增。在一些实施例中，另一双股DNA可以是通过一或多个目标RNA的第一和第二股合成产生的双股cDNA。
在其它实施例中，靶向引物结合位点的引物设计成与双股核酸目标杂交，而不使双股核酸变性。在其它实施例中，靶向引物结合位点的引物设计成与双股DNA目标杂交，而不使dsDNA变性。在这些实施例中，靶向所关注的所选序列区的引物设计成在所关注的所选序列区处形成三螺旋(三链)。可以在不使双股核酸样品事先变性的情况下进行引物与所关注双股DNA序列区的杂交。在此类实施例中，本文所述的方法和组合物可允许所关注序列区的区域特异性增浓以及股特异性增浓以及扩增。这一方法可以适用于无序使dsDNA输入DNA变性即可从复杂核酸产生所关注的股特异性序列区的拷贝，因此使能够增浓和分析原生复杂核酸样品中所关注序列区的多重性。所述方法可用于现场进行的研究和分析，使能够进行单个细胞或极小轮廓分明的细胞群的集合中复杂基因组DNA的研究和分析，以及允许分析复杂基因组DNA而不破坏染色质结构。
本发明的引物一般为用于通过聚合酶沿多核苷酸模板的延伸反应(例如用于扩增目标序列(例如在PCR中))中的寡核苷酸。寡核苷酸引物可以是在3'端含有能够与目标多核苷酸的序列杂交的序列的单股合成多核苷酸。在一些实施例中，与目标核酸杂交的引物的3'区与引物结合位点至少80％，优选90％，更优选95％，最优选100％互补。
在一些实施例中，引物结合位点为通用引物的结合位点。通用引物为可用于扩增许多不同序列的引物。在一些实施例中，通用引物用于扩增不同文库。在一些实施例中，标引引物结合位点为用于通用标引引物的结合位点(即标引引物结合位点为通用标引引物结合位点)。在一些实施例中，用于接合多个核酸片段的衔接子具有通用标引引物结合位点。在一些实施例中，通用标引引物可用于扩增和/或测序许多不同标引位点。
在一些实施例中，目标序列引物结合位点为用于通用目标序列引物的结合位点(即目标序列引物结合位点为通用目标序列引物结合位点)。在一些实施例中，用于接合多个核酸片段的衔接子具有通用目标序列引物结合位点。在一些实施例中，通用目标序列引物可用于扩增和/或测序许多不同目标序列。
在一些实施例中，衔接子包含在标引位点3'的标识位点。在一些实施例中，衔接子包含在标引位点5'的标识位点。在一些实施例中，衔接子从5'到3'包含标引引物结合位点；标引位点；标识位点；以及目标序列引物结合位点。在其它实施例中，衔接子从5'到3'包含标引引物结合位点、标引位点、标识位点以及目标序列引物结合位点。在其它实施例中，衔接子从5'到3'包含标引引物结合位点、标识位点、标引位点以及目标序列引物结合位点。
样品
在一些实施例中，衔接子接合到核酸片段(例如核酸片段的5'端)。核酸片段可以来自一或多个样品的多个核酸片段。核酸片段可以是RNA、DNA或复杂DNA，例如基因组DNA和PNA，在所述情况下可使用修饰的核酸。核酸片段还可以cDNA。cDNA可以从RNA(例如mRNA)产生。
样品可以是生物样品。举例来说，样品可以是动物、植物、细菌、藻类或病毒样品。在一些实施例中，样品为人类、大鼠或小鼠样品。样品可以来自不同物种的基因组的混合物，例如宿主-病原体、细菌群等。样品可以是由不同物种的基因组混合物制成的cDNA。在一些实施例中，样品可以来自合成来源。样品可以是线粒体DNA。样品可以是无细胞DNA。无细胞DNA可以获自例如血清或血浆样品的来源。样品可包含一或多个染色体。举例来说，如果样品来自人类，那么样品可包含染色体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、X或Y中的一或多个。在一些实施例中，样品包含直链或环形基因组。样品可以是质体DNA、粘质体DNA、细菌人工染色体(BAC)或酵母人工染色体(YAC)。样品可以来自超过一种个体或生物体。样品可以是双股或单股。样品可以是染色质的部分。样品可以与组蛋白有关。
在一些实施例中，衔接子接合到来自超过一个样品(例如2、3、4、5个或更多样品)的多个核酸片段。在一些实施例中，来自各样品的核酸片段具有相同标引位点。在一些实施例中，从第一样品和第二样品产生多个核酸片段并且衔接子接合到各核酸片段，其中接合到来自第一样品的各核酸片段的衔接子具有相同第一标引位点并且接合到来自第二样品的核酸片段的衔接子具有相同第二标引位点。在一些实施例中，基于标引位点分离核酸片段或与核酸片段有关的数据(例如测序读数)。
在一些实施例中，样品产生的核酸片段群具有一或多种具体尺寸范围。在一些实施例中，片段的平均长度为约10到约10,000个核苷酸。在一些实施例中，片段的平均长度为约50到约2,000个核苷酸。在一些实施例中，片段的平均长度为约100-2,500、10-1,000、10-800、10-500、50-500、50-250或50-150个核苷酸。在一些实施例中，片段的平均长度小于10,000个核苷酸，例如小于5,000个核苷酸，小于2,500个核苷酸，小于2,500个核苷酸，小于1,000个核苷酸，小于500个核苷酸，例如小于400个核苷酸，小于300个核苷酸，小于200个核苷酸或小于150个核苷酸。
在一些实施例中，可以通过所属领域中已知的方法实现核酸的片段化。可以通过物理片段化方法和/或酶促片段化方法实现片段化。物理片段化方法可包括雾化、超声处理和/或流体动力学剪切。在一些实施例中，可以用机械化方式实现片段化，包含对输入样品中的核酸进行超声处理。在一些实施例中，片段化包含在适于一或多种酶的条件下用一或多种酶处理输入样品中的核酸产生双股核酸断裂。适用于产生核酸或多核苷酸片段的酶的实例包括序列特异性和非序列特异性核酸酶。核酸酶的非限制性实例包括DNaseI、片段酶、限制核酸内切酶、其变体以及其组合。进行酶促片段化反应的试剂市场有售(例如来自新英格兰生物实验室(New England Biolabs))。举例来说，用DNase I消化可在无Mg++存在下和在Mn++存在下诱发DNA中的随机双股断裂。在一些实施例中，片段化包含用一或多种限制核酸内切酶处理输入样品中的核酸。片段化可以制造具有5′悬垂物、3′悬垂物、钝端或其组合的片段。在一些实施例中，例如当片段化包含使用一或多种限制核酸内切酶时，样品聚核苷酸的裂解留下具有可预测序列的悬垂物。在一些实施例中，所述方法包括通过所属领域中已知的标准方法(例如从琼脂糖凝胶柱纯化或分离)尺寸选择片段的步骤。
在一些实施例中，核酸的片段化之后是核酸片段的末端修复。末端修复可包括产生钝端、非钝端(即发粘或内聚端)，或单碱基悬垂物，例如通过不具有3′-核酸外切酶活性的聚合酶向核酸片段的3′-端添加单个dA核苷酸。末端修复可以使用所属领域中已知的多种酶和/或方法进行，包括(但不限于)市场有售的试剂盒，例如EncoreTM Ultra Low InputNGS Library System I。在一些实施例中，可以对双股DNA片段进行末端修复产生钝端，其中双股DNA片段含有5′磷酸基和3′羟基。在一些实施例中，在接合到衔接子之前，双股DNA片段可以经钝端抛光(或“末端修复”)产生具有钝端的DNA片段。可以通过使用单股特异性DNA核酸外切酶(例如核酸外切酶1、核酸外切酶7或其组合)降解双股产物的悬垂单股末端，在双股片段上产生钝端。或者，双股DNA片段可以通过使用单股特异性DNA核酸内切酶(例如(但不限于)绿豆核酸内切酶或S1核酸内切酶)产生钝端。或者，双股产物可以通过使用包含单股核酸外切酶活性的聚合酶(例如T4DNA聚合酶)或包含单股核酸外切酶活性的任何其它聚合酶或其组合降解双股产物的悬垂单股末端产生钝端。在一些情况下，包含单股核酸外切酶活性的聚合酶可以在包含或不包含一或多种dNTP的反应混合物中培育。在其它状况下，单股核酸特异性核酸外切酶和一或多种聚合酶的组合可用于使通过使包含核酸的样品片段化产生的双股片段产生钝端。在其它情形中，核酸片段可以通过在双股片段的悬垂单股端填充产生钝端。举例来说，可以在一或多种dNTP存在下用例如T4DNA聚合酶或克列诺聚合酶(Klenow polymerase)或其组合的聚合酶培育片段，填充双股片段的单股部分。或者，双股DNA片段可以通过使用核酸外切酶和/或聚合酶的单股悬垂物分解反应与在一或多种dNTP存在下使用一或多种聚合酶的填充反应的组合产生钝端。
美国专利公开案第2013-0231253A1号和第2014-0274729A1号进一步描述产生核酸片段的方法、修饰片段和分析片段的方法，并且以全文引用的方式并入本文中。
衔接子的接合
在所关注序列区的所要末端(例如从样品所产生的核酸片段的5'或3'端处)处接合衔接子适于进行本发明的方法。视核酸、核酸修饰酶和核酸的所得可接合末端的选择而定设想多种接合模态。举例来说，当产生包含所关注的目标区/序列的钝端产物时，钝端接合可能适合。或者，当使用已知序列特异性的限制酶进行裂解，导致产生具有已知序列悬垂物的裂解位点时，衔接子的适合末端可以设计成使衔接子能够杂交到所关注序列区的裂解位点并且随后接合。接合还指的是产生单个核酸序列的两个核酸分子的任何接合，所述核酸序列可进一步修饰获得所讨论的核酸的序列。高效和快速接合衔接子的试剂和方法市场有售，并且为所属领域中已知的。
在一些实施例中，在与本发明的衔接子寡核苷酸接合之前，片段化核酸的5′和/或3′端核苷酸序列未经修饰或末端修复。举例来说，通过限制性核酸内切酶片段化可用于留下可预测悬垂物，随后与一或多个包含与核酸片段上的可预测悬垂物互补的悬垂物的衔接子寡核苷酸接合。在另一实例中，通过留下可预测钝端的酶裂解之后可以将钝端核酸片段接合到包含钝端的衔接子寡核苷酸。在一些实施例中，末端修复之后可以添加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个核苷酸(例如一或多个腺嘌呤、一或多个胸腺嘧啶、一或多个鸟嘌呤或一或多个胞嘧啶)，以产生悬垂物。具有悬垂物的核酸片段可以例如在接合反应中接合到具有互补悬垂物的一或多个衔接子寡核苷酸。举例来说，可以使用模板非依赖性聚合酶将单个腺嘌呤添加到末端修复的DNA片段的3′端，随后接合到一或多个各自在3′端具有胸腺嘧啶的衔接子。在一些实施例中，衔接子寡核苷酸可以接合到已通过用一或多个核苷酸延伸3′端随后5′磷酸化修饰的钝端双股核酸片段。在一些情况下，可以用聚合酶(例如克列诺聚合酶或本文提供的任何适合聚合酶)，或通过使用末端去氧核苷酸转移酶，在一或多种dNTP存在下，在含有镁的适合缓冲液中，进行3′端的延伸。在一些实施例中，具有钝端的核酸片段可以接合到一或多个包含钝端的衔接子。可以例如使用T4多核苷酸激酶，在含有ATP和镁的适合缓冲液中，进行核酸片段的5′端的磷酸化。片段化核酸分子可任选地例如通过使用所属领域中已知的酶(例如磷酸酶)处理以使5′端或3′端去磷酸化。
在一些实施例中，可以使用接合反应或引发反应向本文所述的方法产生的核酸片段附接衔接子。在一些实施例中，将衔接子附接到核酸片段包含接合。在一些实施例中，将衔接子接合到核酸片段可以在末端修复核酸片段之后。在另一实施例中，将衔接子接合到核酸片段可以在未对核酸片段进行末端修复即产生核酸片段之后。衔接子可以是所属领域中已知的任何类型的衔接子，包括(但不限于)常规双螺旋体或双股衔接子，其中衔接子包含两条互补股。在一些实施例中，衔接子可以是双股DNA衔接子。在一些实施例中，衔接子可以是具有已知序列的寡核苷酸，并且因此允许产生和/或使用序列特异性引物扩增和/或测序附接或连接衔接子的任何聚核苷酸。在一些实施例中，衔接子可以是常规双螺旋体衔接子，其中衔接子包含所属领域众所周知的序列。在一些实施例中，衔接子可以在多个方向中附接到通过本文所述的方法产生的核酸片段。在一些实施例中，本文所述的方法可涉及使用包含具有已知序列的双股DNA的双螺旋体衔接子，所述已知序列为钝端并且可在两个方向中的任一个中结合到通过本文所述的方法产生的双股核酸片段。在一些实施例中，衔接子可以接合到每一个核酸片段使得每一个核酸片段包含同一衔接子。换句话说，每一个核酸片段包含常见衔接子。在另一实施例中，衔接子可以附接或接合到本文所述的方法产生的核酸片段的文库，使得核酸片段文库中的各核酸片段包含接合到一端或两端的衔接子。在另一实施例中，超过一个衔接子可以附接或接合到本文所述方法产生的核酸片段文库。多个衔接子可彼此靠近、间歇地隔开或在核酸片段的相对端存在。在一些实施例中，衔接子可以接合或附接到本文所述方法产生的核酸片段的5′和/或3′端。衔接子可包含两股，其中各股包含游离3′羟基，但任一股都不包含游离5′磷酸基。在一些实施例中，衔接子的每一股上的游离3′羟基可以接合到本发明的核酸片段的任一端上存在的游离5′磷酸基。在这一实施例中，衔接子包含接合股和非接合股，由此接合股可以接合到核酸片段的任一端上的5′磷酸基，而衔接子的非接合股与核酸片段的任一端上的3′羟基之间可存在缺口或间隙。在一些实施例中，可以通过进行间隙修复反应填充缺口或间隙。在一些实施例中，可以使用具有股置换活性的DNA依赖性DNA聚合酶进行间隙修复。在一些实施例中，可以使用具有弱股置换活性或不具有股置换活性的DNA依赖性DNA聚合酶进行间隙修复。在一些实施例中，衔接子的接合股可用作间隙修复或填充反应的模板。间隙修复或填充反应可包含延伸反应，其中衔接子的接合股充当模板并且导致产生具有互补末端或端的核酸片段。在一些实施例中，间隙修复可以使用Taq DNA聚合酶进行。在一些实施例中，第一衔接子与本文所述方法产生的核酸片段的接合后面可以不接着间隙修复。核酸片段可包含仅在各股的5′端接合的衔接子序列。
衔接子与核酸片段的接合和任选地间隙修复产生衔接子-核酸片段复合物。在一些实施例中，衔接子-核酸片段复合物可以是变性的。变性可以使用所属领域中已知的任何方法实现，包括(但不限于)物理变性、热变性和/或化学变性。在一些实施例中，可以使用热变性(thermal或heat denaturation)实现变性。在一些实施例中，衔接子-核酸片段复合物的变性产生仅在核酸片段的5′端包含衔接子序列的单股核酸片段。在另一实施例中，第一衔接子-核酸片段复合物的变性产生在核酸片段的5′端和3′端都包含衔接子序列的单股核酸片段。
扩增方法
本文所述的方法、组合物和试剂盒可适用于直接从用于下游应用(例如下一代测序以及产生具有增浓所关注序列区群的文库)的核酸源产生准备扩增产物。在一些实施例中，扩增衔接子-核片段接合产物，所述产物例如来自将衔接子接合到一或多个样品的多个核酸片段的各核酸片段的5'端。
扩增方法为所属领域中众所周知。在一些实施例中，扩增是指数扩增，例如在通过聚合酶链反应(PCR)酶促扩增特异性DNA双股序列中。在其它实施例中，扩增方法为线性的。在其它实施例中，扩增方法为等温的。在一些实施例中，扩增是指数扩增，例如在通过聚合酶链反应(PCR)酶促扩增特异性DNA双股序列中。
适合扩增反应可以是指数或等温的并且可包括任何DNA扩增反应，包括(但不限于)聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、线性扩增、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增(RCA)、单引物等温扩增(SPIA，参看例如美国专利第6,251,639号)、Ribo-SPIA或其组合。在一些情况下，用于提供模板核酸的扩增方法可以在限制条件下进行使得仅进行几个回合的扩增(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30等)，例如就像cDNA继代通常所进行的一样。扩增回合数可以是约1-30、1-20、1-15、1-10、5-30、10-30、15-30、20-30、10-30、15-30、20-30或25-30。
PCR为基于变性、寡核苷酸引物退火和通过嗜热性模板依赖性多核苷酸聚合酶的引物延伸的重复循环的体外扩增程序，导致由引物侧接的多核苷酸分析物的所需序列的拷贝以指数方式增加。退火到DNA相对股的两个不同PCR引物定位成使得一个引物的聚合酶催化的延伸产物可充当另一引物的模板股，导致离散双股片段的积聚，所述片段的长度由寡核苷酸引物的5′端之间的距离限定。
LCR使用接合酶接合数对预先形成的核酸探针。探针与核酸分析物(如果存在)的每一互补股杂交，并且采用接合酶使每对探针结合在一起，产生可在下一循环中用以再反覆具体核酸序列的两个模板。
SDA(威斯汀(Westin)等人2000,自然生物技术(Nature Biotechnology),18,199-202；沃克(Walker)等人1992,核酸研究(Nucleic Acids Research),20,7,1691-1696)为等温扩增技术，所述技术基于限制性核酸内切酶(例如HincII或BsoBI)使其识别位点的半硫代磷酸化形式的未经修饰股产生缺口的能力，以及核酸外切酶缺乏DNA聚合酶(例如克列诺exo-聚合酶或Bst聚合酶)在缺口处延伸3′端并且置换下游DNA股的能力。指数扩增由有义及反义反应偶合产生，其中自有义反应移位的股充当反义反应的目标并且反之亦然。
本发明的一些方面利用核酸或聚核苷酸的线性扩增。线性扩增一般指的是涉及形成核酸或多核苷酸分子(通常为核酸或多核苷酸分析物)的仅一股的互补序列的一或多个拷贝的方法。因此，线性扩增与指数扩增之间的主要差异在于：在指数扩增中，产物充当底物用于形成更多产物，而在线性扩增中，开始序列为用于形成产物的底物，但反应产物(即开始模板的复制品)并非用于产生产物的底物。在线性扩增中，所形成的产物的量以时间的线性函数形式增加，与所形成的产物的量为时间的指数函数的指数扩增相对。
下游应用
本发明的一个方面在于本文所披露的方法和组合物可有效地并且节约成本的用于下游分析，例如用于下一代测序或杂交平台，使所关注的生物材料的损失降到最低。本发明的方法还可以用于分析所关注的选择性基因组区域(例如分析SNP或其它疾病标记)以及可与所关注的选择性区域相互作用的基因组区域的遗传信息。本发明的方法可进一步用于分析拷贝数变化以及差异表达。
测序
在一些实施例中，测序读数群从扩增的衔接子-核片段接合产物产生。在一些实施例中，测序读数包含标引读数，其包含标引位点的序列。在一些实施例中，标引读数包含标引位点的序列和标识位点的序列。举例来说，标引位点用标识位点测序。在一些实施例中，标引读数不包括标识位点的序列。举例来说，标引位点不使用标识位点测序。在一些实施例中，测序读数包含目标序列。在一些实施例中，测序读数包含目标序列和标识序列。举例来说，目标序列用标识位点测序。在一些实施例中，目标序列不使用标识位点测序。
本发明的方法适用于通过如美国专利第5,750,341号；第6,306,597号以及第5,969,119号所述的伊路米那(Illumina)的商业化方法测序。
一般来说，双股片段多核苷酸可以通过本发明的方法制备，产生在一端(例如(A)/(A′))或两端(例如(A)/(A′)和(C)/(C′))标记的扩增的核酸序列。在一些情况下，通过本发明的方法(例如通过SPIA或线性PCR)扩增在一端或两端标记的单股核酸。所得核酸接着变性并且单股扩增的多核苷酸随机连接到流动细胞通道的内表面。向初始固相桥扩增添加未标记的核苷酸产生双股DNA的致密簇。为了起始第一碱基测序循环，添加四个标记的可逆终止子、引物和DNA聚合酶。激光激发后，来自流动细胞的各簇的荧光成像。接着记录各簇的第一碱基的标识。进行测序周期从而一次一个碱基的测定片段序列。
在一些实施例中，本发明的方法适用于制备用于通过连接测序方法测序的目标多核苷酸，所述方法由应用生物系统公司(Applied Biosystems)出售(例如SOLiD测序)。在其它实施例中，所述方法适用于制备用于使用454/罗奇生命科学(Roche Life Sciences)商业化的方法合成测序的目标多核苷酸，商业化方法包括(但不限于)马古利斯(Margulies)等人,自然(Nature)(2005)437:376-380(2005)；以及美国专利第7,244,559号；第7,335,762号；第7,211,390号；第7,244,567号；第7,264,929号以及第7,323,305号中所述的方法和设备。在其它实施例中，所述方法适用于制备用于通过赫利克斯生物科学公司(HelicosBioSciences Corporation)(剑桥(Cambridge)，马萨诸塞州(Mass.))商业化的方法测序的目标多核苷酸，所述商业化方法如美国申请案第11/167,046号和美国专利第7,501,245号；第7,491,498号；第7,276,720号；以及美国专利申请公开案第US20090061439号；第US20080087826号；第US20060286566号；第US20060024711号；第US20060024678号；第US20080213770号；以及第US20080103058号中所述。在其它实施例中，所述方法适用于制备用于通过太平洋生物科学(Pacific Biosciences)商业化的方法测序的目标多核苷酸，所述商业化方法如美国专利第7,462,452号；第7,476,504号；第7,405,281号；第7,170,050号；第7,462,468号；第7,476,503号；第7,315,019号；第7,302,146号；第7,313,308号；以及美国申请公开案第US20090029385号；第US20090068655号；第US20090024331号；以及第US20080206764号中所述。
可用于本发明方法中的测序技术的实例为离子激流(Ion Torrent)提供的半导体测序(例如使用离子个人基因组机(Ion Personal Genome Machine，PGM))。离子激流技术可使用具有多个层的半导体芯片，例如具有微加工孔的层、离子敏感层以及离子感测层。核酸可以引入到孔中，例如单核的克隆群可以连接到单头，并且珠粒可以引入到孔中。为了起始珠粒上核酸的测序，一种脱氧核糖核苷酸(例如dATP、dCTP、dGTP或dTTP)可以引入到孔中。当通过DNA聚合酶并入一或多个核苷酸时，在孔中释放质子(氢离子)，其可以通过离子感测器检测到。半导体芯片接着可洗涤并且可使用不同去氧核糖核苷酸重复所述方法。可以在半导体芯片的孔中测序多个核酸。半导体芯片可包含化学敏感场效应晶体管(chemFET)阵列来测序DNA(例如如美国专利申请公开案第20090026082号中所述)。通过chemFET改变电流可检测到一或多个三磷酸酯并入到测序引物的3'端处的新核酸链中。阵列可以具有多个chemFET感测器。
可用于本发明方法中的测序技术的另一实例为纳米孔测序(参看例如索尼G V(Soni G V)和梅勒A(Meller A.)(2007)临床化学(Clin Chem)53:1996-2001)。纳米孔可以是直径为约1纳米的小孔。将纳米孔浸没于导电流体中并且跨越其施加电势可由于离子传导穿过纳米孔而产生微弱电流。流动的电流量对纳米孔的尺寸敏感。随着DNA分子穿过纳米孔，DNA分子上的每个核苷酸会不同程度地阻塞纳米孔。因此，随着DNA分子通过纳米孔时通过纳米孔的电流变化可表示DNA序列的读数。
数据分析
在一些实施例中，序列读数用于所关注的选择性基因组区域以及可与所关注的选择性区域相互作用的基因组区域的遗传学信息的分析中。本文所披露的扩增方法可用于遗传学分析领域中已知的装置、试剂盒和方法中，例如(但不限于)美国专利第6,449,562号、第6,287,766号、第7,361,468号、第7,414,117号、第6,225,109号以及第6,110,709号中存在的那些。
在一些实施例中，测序读数用于检测重复测序读数。在一些实施例中，当测序读数含有与来自同一测序读数群的另一测序读数相同的标识位点和目标序列时，将其鉴别为重复测序读数。
在一些实施例中，重复测序读数彼此分化成真实重复对比明显或可察觉重复。可以从测序文库并且使用常规重复读数措施(即读数使用鲍泰伊(bowtie)映射)鉴别明显或可察觉重复，其中具有相同开始和末端核酸坐标的全部读数都计为重复。可以从已通过接合引入标识位点从而区别随机具有相同开始和末端映射座标的DNA片段的测序文库鉴别出真实重复。
在一些实施例中，如从所产生的核酸片段的目标序列的测序读数所测定，来自任何dsDNA产生的两个核酸的标引读数的标识位点的序列可具有相同开始位点。如果来自两个核酸片段的标引读数的标识位点不相同，那么目标序列读数不是由同一个初始dsDNA分子产生，并且因此不是真实重复读数。随机序列接合到dsDNA分子上并且使用本发明的方法允许鉴别真实重复读数对比明显或可察觉重复读数。
在一些实施例中，测定来自具有相同开始位点的基因组DNA(gDNA)分子产生的两个核酸片段的标引读数的标识位点的序列，具有相同开始位点的基因组DNA可以从核酸片段的目标序列的测序读数测定。如果来自两个核酸片段的标引读数的标识位点不相同，那么目标序列读数不是由同一个初始gDNA分子产生，并且因此不是真实重复读数。在另一实施例中，在衔接子插入结处插入标识位点。通过文库扩增步骤进行标识位点的测序。标识位点为正向读数期间的第一序列读数。因为标识序列并非逻辑上靠近天然存在的序列存在，因此其唯一地鉴别DNA片段。因此，本发明的方法通过在初始gDNA上接合随机序列来鉴别真实重复读数。
在一些实施例中，检测和分析重复测序读数。可以使用‘samtools rmdup’过滤重复读数，其中去除具有相同外部坐标的读数，仅保留一个具有最高映射质量的读数。过滤后，经过滤的重复读数组可用于任何下游分析。相对来说，可跳过这一过滤步骤，并且可使用未过滤的读数(包括重复)进行下游分析。
在一些实施例中，从许多样品产生测序读数。在一些实施例中，衔接子接合到来自样品的多个核酸片段，其中来自各样品的核酸片段具有相同标引位点。在一些实施例中，从第一样品和第二样品产生多个核酸片段并且衔接子接合到各核酸片段，其中接合到来自第一样品的各核酸片段的衔接子具有相同第一标引位点并且接合到来自第二样品的核酸片段的衔接子具有相同第二标引位点。在一些实施例中，在分析目标序列和/或标识位点的测序读数之前，基于标引位点分离与核酸片段有关的数据(例如测序读数)。在一些实施例中，在分析和/或去除重复测序读数之前，基于标引位点分离核酸片段或与核酸片段有关的数据(例如测序读数)。
在一些实施例中，本文所披露的方法相比于其它方法以提高的精确度鉴别或检测一或多个真实重复。举例来说，在一些实施例中，本文所披露的方法相比于其它方法以提高的精确度鉴别真实重复(与鉴别明显或可察觉重复不同)。鉴别一或多个真实重复时提高的分辨率和/或精确度可向现有技术提供更准确鉴别真实重复的显著工作成果。在一些实施例中，本文所披露的方法相比于其它方法(例如配对末端测序)以提高的效率鉴别或检测真实重复。检测重复读数(例如真实重复)时精确度、分辨率和/或效率的提高可提高测序结果的可信度(例如针对表达和CNV分析)。
试剂盒
试剂盒中可以包含本文所述的任何组合物。在非限制性实例中，在适合容器中的试剂盒包含：衔接子或若干衔接子，寡核苷酸引物和用于扩增的试剂中的一或多个。
试剂盒的容器一般将包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其它容器，其中可放置组分，并且优选适合地放置等分试样。如果试剂盒中存在超过一种组分，那么试剂盒一般也将含有第二、第三或其它额外容器，其中可分别放置额外组分。然而，容器中可包含组分的多种组合。
当试剂盒的组分提供于一或多种液体溶液中时，液体溶液可以是水溶液。然而，试剂盒的组分可以干粉形式提供。当试剂和/或组分以干粉形式提供时，可通过添加适合溶剂使粉末复原。
试剂盒可包括使用试剂盒组分以及使用试剂盒中未包括的任何其它试剂的说明书。说明书可包括可执行的变化。
在一些实施例中，本发明提供含有上述方法和组合物中披露的任何一或多种要素的试剂盒。在一些实施例中，试剂盒在一或多个容器中包含本发明的组合物。在一些实施例中，本发明提供包含衔接子、引物和/或本文所述的其它寡核苷酸的试剂盒。在一些实施例中，试剂盒进一步包含以下中的一或多者：(a)DNA接合酶，(b)DNA依赖性DNA聚合酶，(c)RNA依赖性DNA聚合酶，(d)正向衔接子，(e)一或多种包含反向衔接子序列的寡核苷酸以及(f)一或多种适于所述试剂盒中所含的一或多种要素的缓冲液。衔接子、引物、其它寡核苷酸以及试剂可以是(但不限于)上文所述的那些中的任一者。试剂盒的要素可进一步以(但不限于)上文所述的任何量和/或组合提供(例如同一试剂盒或同一容器中)。试剂盒可进一步包含例如上文所述的那些的额外试剂以供根据本发明的方法使用。举例来说，试剂盒可包含为如本文所述的部分双螺旋体衔接子的第一正向衔接子、第二正向衔接子以及特异性针对第一正向衔接子中存在的限制和/或裂解位点的核酸修饰酶。试剂盒要素可提供于任何适合容器中，包括(但不限于)试管、小瓶、烧瓶、瓶子、安瓿、针筒等。试剂可以直接用于本发明方法中的形式提供，或以需要在使用之前制备的形式(例如冻干剂复原)提供。试剂可以等分试样提供用于单次使用，或作为可获得多次使用(例如在许多反应中)的储备液形式提供。
在一些实施例中，试剂盒包含多个衔接子寡核苷酸，其中各衔接子寡核苷酸包含多个标识位点序列中的至少一者，其中多个标识位点序列的各标识位点序列在至少三个核苷酸位置处不同于所述多个标识位点序列中的所有其它标识位点序列，以及其使用说明书。包含不同标识位点序列的衔接子可以单独地供应或与一或多种具有不同标识位点序列的额外衔接子组合供应。在一些实施例中，试剂盒可包含多个衔接子寡核苷酸。
实例
实例1：使用NuGEN Ovation目标增浓文库系统鉴别重复测序读数
样品描述：100ng来自人类HapMap样品的DNA(NA19238)通过用Covaris系统(马萨诸塞州(MA)沃本(Woburn)的科瓦里斯公司(Covaris,Inc.))超声处理片段化成约500个碱基对的长度。所得DNA用末端修复酶混合物NuGEN R01280和R01439(加利福尼亚州(CA)圣卡洛斯(San Carlos)的NuGEN技术公司)根据供应商建议处理产生钝端DNA片段。
文库产生、增浓和标识位点并入：从顶股的5'到3'具有以下区段的寡核苷酸：1)伊路米那标引读数引发位点，例如AGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(SEQ ID NO:2)，2)标引位点，3)具有随机6碱基序列的标识位点，以及4)与伊路米那正向测序引发位点相同的序列，例如TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQ ID NO:3)退火成第二寡核苷酸形成部分双股DNA衔接子。使用来自NuGEN's Ovation Ultralow文库系统(加利福尼亚州圣卡洛斯的NuGEN技术公司)的接合酶和接合酶反应缓冲液根据供应商建议将5μm这些衔接子接合到末端修复DNA上。在25℃下培育30分钟后，用水稀释反应混合物，添加0.8×体积Ampure XP磁珠(马萨诸塞州(MA)贝弗利(Beverly)的安津考特生物科学公司(Agencourt BiosciencesCorporation),贝克曼库尔特公司公司(A Beckman Coulter Company))并且彻底混合溶液。收集、洗涤珠粒并且根据制造商建议洗脱接合的DNA片段。通过最初将溶液加热到95℃，接着以0.6度/分钟将混合物从80℃缓慢冷却到60℃，将探针池退火到洗脱DNA片段。特异性退火的靶向探针根据制造商的方案用Taq DNA聚合酶(马萨诸塞州(MA)伊普威治(Ipswich)的新英格兰生物实验公司(New England Biolabs,Inc.))延伸。延伸后，将DNA片段根据制造商建议收集于安津考特磁珠上，洗涤并且洗脱。这些文库根据供应商建议通过30个PCR周期使用NuGEN文库增浓引物(Ovation目标增浓文库系统，加利福尼亚州圣卡洛斯的NuGEN技术公司)增浓，所述引物也含有伊路米那流动细胞序列(加利福尼亚州圣地亚哥的伊路米那公司)。
所得文库使用KAPA提供的试剂盒通过qPCR定量，稀释到2nM并且施加于伊路米那MiSeq DNA测序器(加利福尼亚州圣地亚哥的伊路米那公司)。进行以下系列：36碱基第一读数，14碱基第二读数，以及24碱基第三读数。
数据分析：根据制造商建议处理测序器输出。为了分析数据，标引读数拆分成两个文档。第一文档含有标引读数的前8个碱基并且用作标准文库解析的文库索引文档。另一文档仅含有随机碱基并且保留用于进一步序列解析。
在用鲍泰伊比对器(兰米德B(Langmead B.)等人,短DNA序列与人类基因组的超快和记忆高效比对(Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNAsequences to the human genome).基因组生物学(Genome Biol.)2009,10:R2.)进行序列比对的数据分析流水线之后，通过基因组开始位置鉴别重复读数。此时，针对随机碱基文档检验在相同基因组位置处开始的测序读数，看其是否接合有相同或不同随机碱基组。如果具有相同开始基因组座标的两个序列具有相同随机碱基组，那么认为其来自相同初始DNA接合事件，而不管使用哪一种Ovation目标增浓靶向探针来产生所讨论的序列片段。这些序列因此不提供关于开始基因组DNA的特有信息并且出于变异分析目的被认为是一个测序读数。具有相同开始基因组座标并且具有不同随机碱基的两个序列读数源自特有接合事件并且出于变异鉴别的目的都被视为有效测序读数。图5提供表明重复读数的鉴别的分析结果。使用标识位点允许对比明显或可察觉重复的数目测定真实复制数目。
如果两个文库的序列相同，那么其复制状态未知，因为这可能偶然出现于任何文库中。如果标识序列与文库读数组合使用，那么可测定状态(如果相同，那么是重复，如果不同，那么是相异)。使用SPET系统，通常是一端，因此两个文库具有相同端的机率增加。这些将看起来是重复序列并且其真实状态可以通过查看标识序列来判断。
由对全部随机所选读数取样，使用标识位点提供对真实重复的存在的分辨提高。当评估两百万个随机读数时，发现明显重复占全部读数的39％。然而，发现通过使用标识位点鉴别的真实重复占全部读数的仅26％。发现使用标识位点的方法显著提高读数池内真实重复数的分辨。
实例2：去除具有8碱基标识位点的重复测序读数
在标准RNA测序文库中，衔接子接合到双股cDNA的末端。这些衔接子含有允许PCR扩增以及在高处理量测序机上测序的通用序列。在接合端使用大额外序列群合成衔接子，其中各额外序列为标识位点。标识位点存在于衔接子和cDNA之间的结处。序列读数以标识位点开始并且后面是cDNA序列。
这一标识位点池用于检测PCR重复，因为PCR重复将含有相同标识位点，而两个不同cDNA分子将接合到含有两个不同标识位点的两个不同衔接子。这一标识位点设计成引入到衔接子末端上的八个随机碱基。来自文库的序列读数由含有8个标识位点碱基，后面是cDNA序列的此类衔接子形成。标准PCR重复去除软件(例如皮卡德、Markduplicates和/或SAMtools rndup)用于鉴别和去除PCR重复，留下碰巧具有相同序列的多个cDNA片段的任何实例用于分析。
实例3：去除具有随机1-8碱基标识位点的混合物的重复测序读数
在标准RNA测序文库中，衔接子接合到双股cDNA的末端。这些衔接子含有允许PCR扩增以及在高处理量测序机上测序的通用序列。在接合端使用大额外序列群合成衔接子，其中各额外序列为标识位点。标识位点存在于衔接子和cDNA之间的结处。序列读数以标识位点开始并且后面是cDNA序列。
这一标识位点池用于检测PCR重复，因为PCR重复将含有相同标识位点，而两个不同cDNA分子将接合到含有两个不同标识位点的两个不同衔接子。
将1到8个随机碱基引入到衔接子的末端上。来自文库的序列读数由含有1到8个标识位点碱基，后面是cDNA序列的此类衔接子形成。标准PCR重复去除软件(例如皮卡德、Markduplicates和/或SAMtools rndup)用于鉴别和去除PCR重复，留下碰巧具有相同序列的多个cDNA片段的任何实例用于分析。
实例4：去除具有96个限定的6碱基标识位点的混合物的重复测序读数
在标准RNA测序文库中，衔接子接合到双股cDNA的末端。这些衔接子含有允许PCR扩增以及在高处理量测序机上测序的通用序列。在接合端使用大额外序列群合成衔接子，其中各额外序列为标识位点。标识位点存在于衔接子和cDNA之间的结处。序列读数以标识位点开始并且后面是cDNA序列。
这一标识位点池用于检测PCR重复，因为PCR重复将含有相同标识位点，而两个不同cDNA分子将接合到含有两个不同标识位点的两个不同衔接子。
将96个限定的六碱基序列的混合物引入到衔接子的末端上。因此，各六碱基序列为标识位点。来自文库的序列读数由含有96个六碱基标识位点，后面是cDNA序列的此类衔接子形成。标准PCR重复去除软件(例如皮卡德、Markduplicates和/或SAMtoolsrndup)用于鉴别和去除PCR重复，留下碰巧具有相同序列的多个cDNA片段的任何实例用于分析。
实例5：测定mRNA表达含量时鉴别重复测序读数
样品描述：为了发现两种样品类型之间转录物表达含量的差异，从肿瘤和正常邻近组织提取总RNA。根据供应商建议，使用USP引物、反应缓冲液以及逆转录酶NuGEN'sEncore完全文库系统(加利福尼亚州圣卡洛斯的NuGEN技术公司)将100ng各样品转化成cDNA。这后面是第二股合成，同样根据建议使用试剂盒中所提供的材料。根据制造商说明使用来自生命技术(加利福尼亚州卡尔斯巴德)的双股cDNA合成试剂盒制备双股cDNA。用科瓦里斯S系列装置(Covaris S-series device)(马萨诸塞州沃本的科瓦里斯公司(Covaris,Inc.,Woburn,MA))，使用仪器提供的200bp超声处理方案(10％工作循环，200次循环/脉冲，5强度，180秒)剪切DNA。DNA用总体积15μL的1.5μLl0×钝化缓冲液，0.5μL钝化酶(马萨诸塞州伊普威治的新英格兰生物实验公司；p/nE1201)和1.2μL 2.5mM各dNTP混合物在25℃下处理30分钟，随后在70℃下处理10分钟。
文库产生：接着使用NuGEN's Ovation超低文库系统(加利福尼亚州圣卡洛斯的NuGEN技术公司)提供的末端修复缓冲液和酶对DNA片段进行末端修复。
正向衔接子5'
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNN(SEQ ID NO:4)，
反向衔接子1)5'
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCCTTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNN(SEQ ID NO:5)，
反向衔接子2)5'
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGAAGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCNNNNNNNN(SEQ ID NO:6)，以及
常见搭配物5'NNNNNNNNAGATCGGAAGAGC(SEQ ID NO:7)全部从IDT(爱荷华州(IA)科勒尔维尔(Coralville)的集成DNA技术(Integrated DNA Technologies),Coralville,IA)订购。反向衔接子各自含有能够突出这些衔接子形成的文库的唯一标识(带下划线的)。在这一情形中，N表示A、C、G和T的等摩尔混合物。将10mM MgCl2、50mM Tris pH 8中的5μM正向、5μM反向以及10μM常见加热到95℃持续5分钟，接着冷却到20℃。通过添加4.5μL水，3μL衔接子混合物(上文制备)，6μL 5×NEBNext快速接合反应缓冲液和1.5μL快速T4DNA接合酶(马萨诸塞州伊普威治的新英格兰生物实验公司；p/n E6056)，随后在25℃下培育30分钟，随后在70℃下培育10分钟，进行衔接子接合。通过添加70μL水和80μL Ampure XP珠粒(安津考特基因组学(Agencourt Genomics))，用70％乙醇洗涤两次并且用20μL 10mM Tris pH8.0洗脱，纯化接合产物。在含有0.5μM各引物(5'AATGATACGGCGACCACCGA(SEQ ID NO:8)和5'CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQ ID NO:9)，10mM Tris-HCl，pH 8.3，50mM KCl，2mM MgC12，0.2mM各dNTP以及1单位Taq聚合酶的50μL PCR中扩增文库产物。反应在95℃下15秒，60℃下1分钟的条件下循环15次。如上文所述用1体积Ampure XP珠粒(马萨诸塞州贝弗利的安津考特生物科学公司，贝克曼库尔特公司)纯化PCR产物。根据供应的说明，通过HS DNA生物分析仪(加利福尼亚州圣克拉拉的安捷伦技术)分析文库并且用KAPA文库定量试剂盒(马萨诸塞州威明顿的KAPA生物系统(KAPA Biosystems,Wilmington,MA)；p/n KK4835)定量。将所得文库组合并且与GAIIx、MiSeq或Hi Seq测序仪器(加利福尼亚州圣地亚哥的伊路米那公司)的标准TruSeq单端或成对伊路米那测序方案相容。操作以下系列步骤：50碱基第一读数，6碱基第二读数。计数目的或复制分析不需要第三读数。
数据分析：根据制造商建议处理测序器输出。标引读数的6个碱基用于标准文库解析、分离两种样品类型的数据文档。彼此比较目标序列读数的前50个碱基。与任何其它读数具有相同序列的任何读数鉴别为重复并且从群去除，因此文档中仅保留单个拷贝。当已去除重复读数后，从各读数微调8个碱基。微调的读数与参考基因组比对。接着通过利用例如cufflinks或cuffdiff的脚本(塔普内(Trapnell)等人.2010,自然生物技术(NatureBiotechnology),28,511-515；塔普内等人.2013,自然生物技术,31,46-53)比较文库之间的FPKM(每百万读数每千碱基的片段数)值测定差异表达。
实例6：使用配对末端读数中的目标序列测序标识位点
根据制造商方案使用针对低复杂度样品的Ovation文库系统(加利福尼亚州圣卡洛斯的NuGEN技术公司)产生四个文库，每一个来自单个扩增子。在伊路米那MiSeq(加利福尼亚州圣地亚哥的伊路米那公司)上以多路形式混合和测序经纯化的文库产生125nt正向、8nt标引1、8nt标引2和25nt反向读数。因为全部扩增子读数在相同序列坐标开始和结束，不能使用所以标记文库PCR重复的传统方法(将在相同基因组坐标开始和结束的读数标记为重复)。实际上，接合到扩增子的衔接子中所含的0-8nt随机序列作为标识序列处理并且用于标记重复。与任何其它配对末端读数共用相同长度和这些随机碱基的序列的任何配对末端读数被称作重复。下表示出了这一重复标记的结果。
表1.
表1证实用于区分重复读数与来自真正独立分子的读数的方法的精确度。表1最后一列中描绘的来自独立分子的读数群表示来自用于产生文库的独立扩增子分子的序列。
实例7：在简化代表性亚硫酸氢盐(RRBS)文库中使用目标序列测序标识位点
通过100ng输入样品的完全限制酶消化，随后选择短片段产生人类基因组的简化代表性亚硫酸氢盐(RRBS)文库。所得片段池接合到包含标引位点和标识位点的衔接子序列。标识位点包含6或8个随机核苷酸。接着对序列进行测序以鉴别标识位点，因此揭露池中的真实重复数。在无标识位点存在的情况下，明显或可察觉重复的数目多于真实重复的数目。相较于明显或可察觉重复的较大数目，标识位点的纳入导致鉴别真实重复的数目。
除非另外规定，否则本文的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管在本发明的实施或测试中也可以使用与本文中描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但是优选的方法和材料描述于本文中。所引用的所有公开案、专利和专利公开案都出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
提供本文中讨论的公开案仅仅针对其在本申请案的申请日之前的披露内容。不应将本文中的任何内容理解为承认本发明无权先于凭借先前发明的此类披露内容。
本文中所引用的所有参考文献、论文、公开案、专利、专利公开案以及专利申请案都出于所有目的特此以全文引用的方式并入。然而，提及本文引用的任何参考文献、论文、公开案、专利、专利公开案以及专利申请案不是并且不应认为是承认或以任何形式暗示其构成有效现有技术或形成世界上任何国家的公共常识的部分。
尽管已结合具体实施例描述本发明，但应理解，其能够进一步修改并且本申请案打算涵盖本发明的任何变化、使用或修改，所述变化、使用或修改一般来说遵循本发明原理并且包括本发明的此类背离作为在本发明所涉及的所属领域内的已知或惯用实践范围内并且作为可以应用于上文阐述和如下的所附权利要求书的范围中的基本特征。

Claims (14)

1.一种用于从样品测序读数群中检测重复测序读数的方法，其包含：
剪切基因组DNA以产生来自一或多个样品的多个核酸片段；
将衔接子接合到所述多个核酸片段的各核酸片段的5'端，其中所述衔接子包含：
(i)标引引物结合位点；
(ii)标引位点；
(iii)标识位点，其由介于1个核苷酸与8个核苷酸之间的核苷酸组成；以及
(iv)目标序列引物结合位点；
杂交靶向寡聚物与衔接子-核酸片段接合产物中的基因组DNA；
延伸所述靶向寡聚物；
扩增已通过衔接子延伸的靶向寡聚物；
从扩增的衔接子-核酸片段接合产物产生测序读数群；
将重复测序读数鉴别为：包括与所述测序读数群中另一测序读数相同的标识位点和核酸片段的测序读数；以及
从所述测序读数群中去除所述重复测序读数，
其中所述标引位点是多个多核苷酸的指引；以及其中所述标识位点的序列在多个衔接子中的序列含量是可变的；
其中所述衔接子从5'到3'包含：
(i)所述标引引物结合位点；
(ii)所述标引位点；
(iii)所述标识位点；以及
(iv)所述目标序列引物结合位点。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述标识位点用所述标引位点测序。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个核酸片段从超过一种样品产生。
4.根据权利要求3所述的方法，其中来自各样品的所述核酸片段具有相同标引位点。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述测序读数基于所述标引位点分离。
6.根据权利要求5所述的方法，其中测序读数的所述分离在所述鉴别步骤之前进行。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸片段为DNA片段、RNA片段或DNA/RNA片段。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述核酸片段为基因组DNA片段或cDNA片段。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述标引位点的长度介于2个核苷酸与8个核苷酸之间。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述标引位点的长度为6个核苷酸。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述标识位点的长度为6个核苷酸。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述标识位点的长度为8个核苷酸。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述标引引物结合位点为通用标引引物结合位点。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标序列引物结合位点为通用目标序列引物结合位点。
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Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3907297A1 (en) 2011-04-15 2021-11-10 The Johns Hopkins University Safe sequencing system
US9487828B2 (en) 2012-05-10 2016-11-08 The General Hospital Corporation Methods for determining a nucleotide sequence contiguous to a known target nucleotide sequence
US20150011396A1 (en) 2012-07-09 2015-01-08 Benjamin G. Schroeder Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing
CN104956225B (zh) 2012-10-29 2018-10-02 约翰·霍普金斯大学 卵巢和子宫内膜癌的帕帕尼科拉乌测试
EP2971130A4 (en) 2013-03-15 2016-10-05 Nugen Technologies Inc SEQUENTIAL SEQUENCING
US9546399B2 (en) 2013-11-13 2017-01-17 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for identification of a duplicate sequencing read
EP3099820A4 (en) 2014-01-27 2018-01-03 The General Hospital Corporation Methods of preparing nucleic acids for sequencing
WO2015121236A1 (en) 2014-02-11 2015-08-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Targeted sequencing and uid filtering
US10102337B2 (en) * 2014-08-06 2018-10-16 Nugen Technologies, Inc. Digital measurements from targeted sequencing
CA2992492A1 (en) 2015-07-17 2017-01-26 Nanostring Technologies, Inc. Simultaneous quantification of gene expression in a user-defined region of a cross-sectioned tissue
US10501777B2 (en) 2015-07-17 2019-12-10 Nanostring Technologies, Inc. Simultaneous quantification of a plurality of proteins in a user-defined region of a cross-sectioned tissue
WO2017021449A1 (en) 2015-08-06 2017-02-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Target enrichment by single probe primer extension
US11286531B2 (en) 2015-08-11 2022-03-29 The Johns Hopkins University Assaying ovarian cyst fluid
KR20180113973A (ko) 2015-11-11 2018-10-17 레졸루션 바이오사이언스, 인크. Dna 라이브러리의 고효율 작제
WO2017210469A2 (en) 2016-06-01 2017-12-07 F. Hoffman-La Roche Ag Immuno-pete
AU2017295717B2 (en) * 2016-07-15 2021-06-24 The Regents Of The University Of California Methods of producing nucleic acid libraries
JP7217224B2 (ja) 2016-08-25 2023-02-02 レゾリューション バイオサイエンス， インコーポレイテッド Ｄｎａ試料中のゲノムコピー変化の検出方法
JP6997773B2 (ja) 2016-09-15 2022-01-18 アーチャーディーエックス， エルエルシー 無細胞ｄｎａの分析用の核酸サンプル調製の方法
ES2903357T3 (es) 2016-09-15 2022-04-01 Archerdx Llc Métodos de preparación de muestras de ácido nucleico
CN106520917A (zh) * 2016-09-20 2017-03-22 美因健康科技（北京）有限公司 一种基因的大片段缺失/重复检测的方法
JP6970205B2 (ja) 2017-03-08 2021-11-24 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft Ｄｎａおよびｒｎａの同時濃縮を含むプライマー伸長標的濃縮およびそれに対する向上
US11505826B2 (en) 2017-07-12 2022-11-22 Agilent Technologies, Inc. Sequencing method for genomic rearrangement detection
CN107513570A (zh) * 2017-09-28 2017-12-26 上海思路迪生物医学科技有限公司 基于高通量测序均一化多靶标文库构建的方法及试剂盒
US11099202B2 (en) 2017-10-20 2021-08-24 Tecan Genomics, Inc. Reagent delivery system
EP3737774A1 (en) 2018-01-12 2020-11-18 Claret Bioscience, LLC Methods and compositions for analyzing nucleic acid
CN112154216A (zh) 2018-02-12 2020-12-29 纳米线科技公司 生物分子探针以及检测基因和蛋白表达的方法
US11629345B2 (en) 2018-06-06 2023-04-18 The Regents Of The University Of California Methods of producing nucleic acid libraries and compositions and kits for practicing same
JP2022503873A (ja) * 2018-10-25 2022-01-12 イルミナ インコーポレイテッド インデックス及びバーコードを使用してアレイ上のリガンドを識別するための方法及び組成物
CN109920480B (zh) * 2019-03-14 2020-02-21 深圳市海普洛斯生物科技有限公司 一种校正高通量测序数据的方法和装置
US20220017956A1 (en) * 2020-07-14 2022-01-20 Accugenomics, Inc. Endogenous complexity calibration ladder target
US20220220550A1 (en) * 2021-01-08 2022-07-14 Agilent Technologies, Inc. Sequencing an insert and an identifier without denaturation

Family Cites Families (363)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US4362867A (en) 1980-12-10 1982-12-07 Research Corporation Recombinant cDNA construction method and hybrid nucleotides useful in cloning
US5171534A (en) 1984-01-16 1992-12-15 California Institute Of Technology Automated DNA sequencing technique
US4582877A (en) 1984-07-27 1986-04-15 The Dow Chemical Company Transamidated poly-2-oxazoline compositions useful as wetting agents for polymer and absorbents for polar materials
US5242794A (en) 1984-12-13 1993-09-07 Applied Biosystems, Inc. Detection of specific sequences in nucleic acids
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5011769A (en) 1985-12-05 1991-04-30 Meiogenics U.S. Limited Partnership Methods for detecting nucleic acid sequences
US4876187A (en) 1985-12-05 1989-10-24 Meiogenics, Inc. Nucleic acid compositions with scissile linkage useful for detecting nucleic acid sequences
US4996143A (en) 1985-12-23 1991-02-26 Syngene, Inc. Fluorescent stokes shift probes for polynucleotide hybridization
US5721098A (en) 1986-01-16 1998-02-24 The Regents Of The University Of California Comparative genomic hybridization
US4935357A (en) 1986-02-05 1990-06-19 New England Biolabs, Inc. Universal restriction endonuclease
US4925065A (en) 1987-01-02 1990-05-15 Helena Laboratories Corporation Dispensing apparatus
US6270961B1 (en) 1987-04-01 2001-08-07 Hyseq, Inc. Methods and apparatus for DNA sequencing and DNA identification
US6090591A (en) 1987-07-31 2000-07-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Selective amplification of target polynucleotide sequences
US4942124A (en) 1987-08-11 1990-07-17 President And Fellows Of Harvard College Multiplex sequencing
US6004745A (en) 1987-09-21 1999-12-21 Gen-Probe Incorporated Hybridization protection assay
JP2650159B2 (ja) 1988-02-24 1997-09-03 アクゾ・ノベル・エヌ・ベー 核酸増幅方法
CA1340807C (en) 1988-02-24 1999-11-02 Lawrence T. Malek Nucleic acid amplification process
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
WO1989009284A1 (en) 1988-03-24 1989-10-05 University Of Iowa Research Foundation Catalytic hybridization systems for the detection of nucleic acid sequences based on their activity as cofactors in catalytic reactions in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
US4988617A (en) 1988-03-25 1991-01-29 California Institute Of Technology Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US6107023A (en) 1988-06-17 2000-08-22 Genelabs Technologies, Inc. DNA amplification and subtraction techniques
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
US5681726A (en) 1988-09-19 1997-10-28 Stratagene Method of double stranded DNA synthesis
ES2091192T3 (es) 1989-01-05 1996-11-01 Leti Lab Aplicacion de propiedades especificas de alergenos, alergenos provenientes de fuentes animales y vegetales y metodos para su aislamiento.
US5508178A (en) 1989-01-19 1996-04-16 Rose; Samuel Nucleic acid amplification using single primer
US5708154A (en) 1989-02-24 1998-01-13 City Of Hope RNA-DNA hybrid molecules of nucleic acid
US5234809A (en) 1989-03-23 1993-08-10 Akzo N.V. Process for isolating nucleic acid
CA2013317A1 (en) * 1989-04-17 1990-10-17 Fred T. Oakes Diagnostic kit, primer composition and their use for replication or detection of nucleic acids
US5043272A (en) 1989-04-27 1991-08-27 Life Technologies, Incorporated Amplification of nucleic acid sequences using oligonucleotides of random sequence as primers
US5683896A (en) 1989-06-01 1997-11-04 Life Technologies, Inc. Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions
US5035996A (en) 1989-06-01 1991-07-30 Life Technologies, Inc. Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
EP0731175A3 (en) 1989-07-11 2004-05-26 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotide probes for HIV nucleic acid
CA2020958C (en) 1989-07-11 2005-01-11 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification methods
US5545522A (en) 1989-09-22 1996-08-13 Van Gelder; Russell N. Process for amplifying a target polynucleotide sequence using a single primer-promoter complex
US5391785A (en) 1990-01-16 1995-02-21 La Jolla Pharmaceutial Company Intermediates for providing functional groups on the 5' end of oligonucleotides
CA2037349C (en) 1990-03-26 2008-06-17 James G. Wetmur Branch migration of nucleotides
CA2036946C (en) 1990-04-06 2001-10-16 Kenneth V. Deugau Indexing linkers
HU218095B (hu) 1990-05-01 2000-05-28 Amgen Inc. Eljárás átvitt szennyeződések csökkentésére, amplifikációs eljárásokban
US5494810A (en) 1990-05-03 1996-02-27 Cornell Research Foundation, Inc. Thermostable ligase-mediated DNA amplifications system for the detection of genetic disease
US5667976A (en) 1990-05-11 1997-09-16 Becton Dickinson And Company Solid supports for nucleic acid hybridization assays
US5194370A (en) 1990-05-16 1993-03-16 Life Technologies, Inc. Promoter ligation activated transcription amplification of nucleic acid sequences
DK0540693T3 (da) 1990-07-24 1999-09-13 Hoffmann La Roche Reduktion af ikke-specifik amplifikation under in vitro-nukleinsyreamplifikation under anvendelse af modificerede nukleinsy
US5386023A (en) 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
WO1992007951A1 (en) 1990-10-19 1992-05-14 Yoke Wah Kow Quantitation of aldehyde-containing lesions in nucleic acids
US5888819A (en) 1991-03-05 1999-03-30 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through primer extension
US6004744A (en) 1991-03-05 1999-12-21 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer
US5518900A (en) 1993-01-15 1996-05-21 Molecular Tool, Inc. Method for generating single-stranded DNA molecules
US5090591A (en) 1991-03-18 1992-02-25 Longford Equipment International Limited Article dispenser for use with continuous strip of articles
US5169766A (en) 1991-06-14 1992-12-08 Life Technologies, Inc. Amplification of nucleic acid molecules
US5644048A (en) 1992-01-10 1997-07-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for preparing phosphorothioate oligonucleotides
US5856097A (en) 1992-03-04 1999-01-05 The Regents Of The University Of California Comparative genomic hybridization (CGH)
ES2161715T3 (es) 1992-03-04 2001-12-16 Univ California Hibridacion genomica comparativa (hgc).
IL104965A (en) 1992-03-05 1999-11-30 Isis Pharmaceuticals Inc Coupled oligonucleotides cross-linked
ATE231920T1 (de) 1992-03-11 2003-02-15 Dana Farber Cancer Inst Inc Methode um mrna zu klonieren
CA2135073C (en) 1992-05-06 2002-11-19 Daniel L. Kacian Nucleic acid sequence amplification method, composition and kit
US5710028A (en) 1992-07-02 1998-01-20 Eyal; Nurit Method of quick screening and identification of specific DNA sequences by single nucleotide primer extension and kits therefor
US6172208B1 (en) 1992-07-06 2001-01-09 Genzyme Corporation Oligonucleotides modified with conjugate groups
ATE152180T1 (de) 1992-07-31 1997-05-15 Behringwerke Ag Verfahren zur einführung von definierten sequenzen am 3' ende von polynukleotiden
US6180338B1 (en) * 1992-08-04 2001-01-30 Beckman Coulter, Inc. Method, reagent and kit for the detection and amplification of nucleic acid sequences
US5422271A (en) 1992-11-20 1995-06-06 Eastman Kodak Company Nucleic acid material amplification and detection without washing
US5445935A (en) 1992-11-23 1995-08-29 Royer; Catherine A. Quantitative detection of macromolecules with fluorescent oligonucleotides
US5591575A (en) 1993-04-07 1997-01-07 Amersham International Plc Subtraction hybridization employing aziridinylbenoquinone cross-linking agents
US5837832A (en) 1993-06-25 1998-11-17 Affymetrix, Inc. Arrays of nucleic acid probes on biological chips
US6027923A (en) 1993-07-23 2000-02-22 Bio-Rad Laboratories, Inc. Linked linear amplification of nucleic acids
DE4344726C2 (de) 1993-12-27 1997-09-25 Deutsches Krebsforsch Verfahren zum Nachweis von nicht balanciertem genetischen Material einer Spezies oder zum Nachweis der Genexpression in Zellen einer Spezies
CA2140081C (en) 1994-01-13 2008-04-01 Dean L. Engelhardt Process, construct and conjugate for producing multiple nucleic acid copies
US5654419A (en) 1994-02-01 1997-08-05 The Regents Of The University Of California Fluorescent labels and their use in separations
US5578832A (en) 1994-09-02 1996-11-26 Affymetrix, Inc. Method and apparatus for imaging a sample on a device
US5637684A (en) 1994-02-23 1997-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphoramidate and phosphorothioamidate oligomeric compounds
DE4406524A1 (de) 1994-02-28 1995-08-31 Boehringer Mannheim Gmbh 3'-RNA-Markierung mit Terminaler Transferase
US6110709A (en) 1994-03-18 2000-08-29 The General Hospital Corporation Cleaved amplified modified polymorphic sequence detection methods
US5641658A (en) 1994-08-03 1997-06-24 Mosaic Technologies, Inc. Method for performing amplification of nucleic acid with two primers bound to a single solid support
US5705628A (en) 1994-09-20 1998-01-06 Whitehead Institute For Biomedical Research DNA purification and isolation using magnetic particles
US5525471A (en) 1994-10-12 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Enzymatic degrading subtraction hybridization
US6280935B1 (en) 1994-10-13 2001-08-28 Lynx Therapeutics, Inc. Method of detecting the presence or absence of a plurality of target sequences using oligonucleotide tags
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US6309843B1 (en) 1994-10-25 2001-10-30 The Curators Of The University Of Missouri Glycoprotein for use in determining endometrial receptivity
US6194211B1 (en) 1994-11-18 2001-02-27 Glaxo Wellcome Inc. Transcriptional regulatory sequence of carcinoembryonic antigen for expression targeting
US5565340A (en) 1995-01-27 1996-10-15 Clontech Laboratories, Inc. Method for suppressing DNA fragment amplification during PCR
US5750341A (en) 1995-04-17 1998-05-12 Lynx Therapeutics, Inc. DNA sequencing by parallel oligonucleotide extensions
EP0832294A1 (en) 1995-06-07 1998-04-01 Pioneer Hi-Bred International, Inc. PCR-BASED cDNA SUBTRACTIVE CLONING METHOD
US5763178A (en) 1995-06-07 1998-06-09 Trevigen, Inc. Oscillating signal amplifier for nucleic acid detection
US5882867A (en) 1995-06-07 1999-03-16 Dade Behring Marburg Gmbh Detection of nucleic acids by formation of template-dependent product
US5789206A (en) 1995-07-07 1998-08-04 Myriad Genetics, Inc. Method for ligating adaptors to nucleic acids which methods are useful for obtaining the ends of genes
NZ298494A (en) 1995-07-11 1999-09-29 Forfas Trading As Bioresearch Glycosylase mediated detection of nucleotide sequences at candidate loci
FR2737223B1 (fr) 1995-07-24 1997-09-12 Bio Merieux Procede d'amplification de sequences d'acide nucleique par deplacement, a l'aide d'amorces chimeres
US5712126A (en) 1995-08-01 1998-01-27 Yale University Analysis of gene expression by display of 3-end restriction fragments of CDNA
US6068829A (en) 1995-09-11 2000-05-30 The Burnham Institute Method of identifying molecules that home to a selected organ in vivo
US6190865B1 (en) 1995-09-27 2001-02-20 Epicentre Technologies Corporation Method for characterizing nucleic acid molecules
GB9600384D0 (en) 1996-01-09 1996-03-13 Nyfotek As Dna glycosylases
US6825011B1 (en) 1998-12-17 2004-11-30 Yuri Rumantichikov Methods for insertion of nucleic acids into circular vectors
EP0912761A4 (en) 1996-05-29 2004-06-09 Cornell Res Foundation Inc DETERMINATION OF DIFFERENCES IN THE NUCLEIC ACID SEQUENCE BY MEANS OF A COMBINATION OF LIGASE DETERMINATION AND POLYMERASE CHAIN REACTION
EP0942917B1 (en) 1996-08-14 2015-02-25 Life Technologies Corporation Method for nucleic acid amplification and sequencing using stable compositions
GB9620209D0 (en) 1996-09-27 1996-11-13 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
US6449562B1 (en) 1996-10-10 2002-09-10 Luminex Corporation Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and method
US6258533B1 (en) 1996-11-01 2001-07-10 The University Of Iowa Research Foundation Iterative and regenerative DNA sequencing method
IL120337A0 (en) 1997-02-27 1997-06-10 Gesher Israel Advanced Biotecs Method for joining DNA fragments
US6197557B1 (en) 1997-03-05 2001-03-06 The Regents Of The University Of Michigan Compositions and methods for analysis of nucleic acids
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
ES2563643T3 (es) 1997-04-01 2016-03-15 Illumina Cambridge Limited Método de secuenciación de ácido nucleico
CA2268368A1 (en) 1997-08-28 1999-03-11 The Perkin-Elmer Corporation Improved detection of mutations in nucleic acids by chemical cleavage
AU9660698A (en) 1997-08-29 1999-03-16 Osvaldo J. Lopez Dna methyltransferase genotyping
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6169194B1 (en) 1997-10-16 2001-01-02 Michael Thompson High surface density covalent immobilization of oligonucleotide monolayers using a 1-(thiotrifluoroacetato)-11-(trichlorososilyl)-undecane linker
DE69840416D1 (de) 1997-10-28 2009-02-12 Los Alamos Nat Security Llc Identifizierung von dna-polymorphismen mittels durchflusszytometrie
US6090553A (en) 1997-10-29 2000-07-18 Beckman Coulter, Inc. Use of uracil-DNA glycosylase in genetic analysis
US20010000077A1 (en) 1998-02-03 2001-03-29 Engelhardt Dean L. Novel process, construct and conjugate for producing multiple nucleic acid copies
US6365346B1 (en) 1998-02-18 2002-04-02 Dade Behring Inc. Quantitative determination of nucleic acid amplification products
US6174680B1 (en) 1998-12-30 2001-01-16 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Method for identifying mismatch repair glycosylase reactive sites, compounds and uses thereof
US6087103A (en) 1998-03-04 2000-07-11 Lifespan Biosciences, Inc. Tagged ligand arrays for identifying target-ligand interactions
US6225451B1 (en) 1998-04-06 2001-05-01 Myriad Genetics, Inc. Chromosome 11-linked coronary heart disease susceptibility gene CHD1
WO1999054501A1 (en) 1998-04-22 1999-10-28 Enterprise Ireland Trading As Bioresearch Ireland A method for the characterisation of nucleic acid molecules involving generation of extendible upstream dna fragments resulting from the cleavage of nucleic acid at an abasic site
US7875440B2 (en) 1998-05-01 2011-01-25 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
GB0002310D0 (en) 2000-02-01 2000-03-22 Solexa Ltd Polynucleotide sequencing
US6787308B2 (en) 1998-07-30 2004-09-07 Solexa Ltd. Arrayed biomolecules and their use in sequencing
US20030022207A1 (en) 1998-10-16 2003-01-30 Solexa, Ltd. Arrayed polynucleotides and their use in genome analysis
GB9817055D0 (en) 1998-08-05 1998-09-30 Medical Res Council Reverse transcription and amplification processes and primers therefore
US6232067B1 (en) 1998-08-17 2001-05-15 The Perkin-Elmer Corporation Adapter directed expression analysis
US6160105A (en) 1998-10-13 2000-12-12 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Monitoring toxicological responses
US6150112A (en) 1998-09-18 2000-11-21 Yale University Methods for identifying DNA sequences for use in comparison of DNA samples by their lack of polymorphism using Y shape adaptors
US6287825B1 (en) 1998-09-18 2001-09-11 Molecular Staging Inc. Methods for reducing the complexity of DNA sequences
AR021833A1 (es) 1998-09-30 2002-08-07 Applied Research Systems Metodos de amplificacion y secuenciacion de acido nucleico
US6440705B1 (en) 1998-10-01 2002-08-27 Vincent P. Stanton, Jr. Method for analyzing polynucleotides
WO2000039345A1 (en) 1998-12-30 2000-07-06 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Mutation scanning array, and methods of use thereof
EP2145963A1 (en) 1999-01-06 2010-01-20 Callida Genomics, Inc. Enhanced sequencing by hybridization using pools of probes
US7074556B2 (en) 1999-03-02 2006-07-11 Invitrogen Corporation cDNA synthesis improvements
CA2362771A1 (en) 1999-03-12 2000-09-21 Amersham Pharmacia Biotech Uk Limited Genetic analysis
AU4739600A (en) 1999-05-17 2000-12-05 Mcgill University Method for subtracting cdnas by suppressing the synthesis of specifically targeted mrnas
US7056661B2 (en) 1999-05-19 2006-06-06 Cornell Research Foundation, Inc. Method for sequencing nucleic acid molecules
US6225109B1 (en) 1999-05-27 2001-05-01 Orchid Biosciences, Inc. Genetic analysis device
US6056661A (en) 1999-06-14 2000-05-02 General Motors Corporation Multi-range transmission with input split planetary gear set and continuously variable transmission unit
US7501245B2 (en) 1999-06-28 2009-03-10 Helicos Biosciences Corp. Methods and apparatuses for analyzing polynucleotide sequences
US6339147B1 (en) 1999-07-29 2002-01-15 Epoch Biosciences, Inc. Attachment of oligonucleotides to solid supports through Schiff base type linkages for capture and detection of nucleic acids
US6232104B1 (en) 1999-08-17 2001-05-15 Dade Behring Inc. Detection of differences in nucleic acids by inhibition of spontaneous DNA branch migration
ES2447419T3 (es) 1999-09-13 2014-03-12 Nugen Technologies, Inc. Composiciones para la amplificación isotérmica lineal de secuencias de polinucleótidos
US6692918B2 (en) 1999-09-13 2004-02-17 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for linear isothermal amplification of polynucleotide sequences
US6262490B1 (en) 1999-11-05 2001-07-17 Advanced Semiconductor Engineering, Inc. Substrate strip for use in packaging semiconductor chips
US7244559B2 (en) 1999-09-16 2007-07-17 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
US7211390B2 (en) 1999-09-16 2007-05-01 454 Life Sciences Corporation Method of sequencing a nucleic acid
AU7537200A (en) 1999-09-29 2001-04-30 Solexa Ltd. Polynucleotide sequencing
US6617442B1 (en) 1999-09-30 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof
US6077674A (en) 1999-10-27 2000-06-20 Agilent Technologies Inc. Method of producing oligonucleotide arrays with features of high purity
US6958225B2 (en) 1999-10-27 2005-10-25 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA
US6582938B1 (en) 2001-05-11 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Amplification of nucleic acids
AU2170901A (en) 1999-12-21 2001-07-03 Lion Bioscience Ag Branched compound for use in nucleic acid detection and analysis reactions
US20010031739A1 (en) 1999-12-21 2001-10-18 Dare Akintade Oyedele Method and kit for quantitating genomic DNA damage and repair capicity
US6913884B2 (en) 2001-08-16 2005-07-05 Illumina, Inc. Compositions and methods for repetitive use of genomic DNA
US7205129B1 (en) 2000-02-28 2007-04-17 Qiagen Gmbh Method for reducing artifacts in nucleic acid amplification
US7056716B2 (en) 2000-03-15 2006-06-06 Invitrogen Corporation High fidelity reverse transcriptases and uses thereof
US6917726B2 (en) 2001-09-27 2005-07-12 Cornell Research Foundation, Inc. Zero-mode clad waveguides for performing spectroscopy with confined effective observation volumes
US6936702B2 (en) 2000-06-07 2005-08-30 Li-Cor, Inc. Charge-switch nucleotides
AU2001271595A1 (en) 2000-06-26 2002-01-08 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
US7846733B2 (en) 2000-06-26 2010-12-07 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification
US20020164634A1 (en) 2000-08-26 2002-11-07 Perlegen Sciences, Inc. Methods for reducing complexity of nucleic acid samples
JP3353149B2 (ja) 2000-08-28 2002-12-03 ホーコス株式会社 工作機械の主軸装置
JP4340779B2 (ja) 2000-10-05 2009-10-07 独立行政法人理化学研究所 可変突出部位を含むオリゴヌクレオチドリンカー及び前記リンカーを用いたポリヌクレオチドライブラリーの調製方法
US6815164B2 (en) 2000-10-06 2004-11-09 Nugen Technologies, Inc. Methods and probes for detection and/or quantification of nucleic acid sequences
AU2002232393A1 (en) 2000-10-27 2002-05-06 Molecular Staging, Inc. Methods for identifying genes associated with diseases or specific phenotypes
IE20000887A1 (en) 2000-11-03 2002-12-11 Univ College Cork Nat Univ Ie Method for the amplification and optional characterisation of nucleic acids
US6777180B1 (en) 2000-11-28 2004-08-17 Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for full-length cDNA cloning using degenerate stem-loop annealing primers
US7001724B1 (en) 2000-11-28 2006-02-21 Applera Corporation Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids using surfactants and proteases
DE60142709D1 (de) 2000-12-13 2010-09-09 Nugen Technologies Inc Methoden und zusammensetzungen zur generierung einer vielzahl von kopien von nukleinsäuresequenzen und methoden zur detektion derselben
US6893820B1 (en) 2001-01-31 2005-05-17 The Ohio State University Research Foundation Detection of methylated CpG rich sequences diagnostic for malignant cells
JP2005508135A (ja) 2001-03-09 2005-03-31 ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド Ｒｎａ配列の増幅のための方法および組成物
ZA200210369B (en) 2001-03-09 2004-07-08 Nugen Technologies Inc Methods and compositions for amplification or RNA sequences.
WO2002081753A1 (en) 2001-04-04 2002-10-17 Advanced Research & Technology Institute Method for identifying and characterizing individual dna molecules
US7060441B2 (en) 2001-05-04 2006-06-13 Biomerieux Method for fragmenting and labeling DNA involving abasic sites and phosphate labeling
FR2824335A1 (fr) 2001-05-04 2002-11-08 Bio Merieux Procede de marquage et de fragmentation d'adn
CA2344599C (en) 2001-05-07 2011-07-12 Bioneer Corporation Selective polymerase chain reaction of dna of which base sequence is completely unknown
AU2002318336A1 (en) 2001-06-08 2002-12-23 U.S. Genomics, Inc. Methods and products for analyzing nucleic acids based on methylation status
GB0114853D0 (en) 2001-06-18 2001-08-08 Medical Res Council Happier Mapping
WO2003002736A2 (en) 2001-06-27 2003-01-09 Roche Diagnostics Gmbh A walk-through technique for in vitro recombination of polynucleotide sequences
WO2003004690A2 (en) 2001-07-06 2003-01-16 454$m(3) CORPORATION Method for isolation of independent, parallel chemical micro-reactions using a porous filter
EP1275735A1 (en) 2001-07-11 2003-01-15 Roche Diagnostics GmbH Composition and method for hot start nucleic acid amplification
US6632611B2 (en) 2001-07-20 2003-10-14 Affymetrix, Inc. Method of target enrichment and amplification
AU2002341891A1 (en) 2001-09-26 2003-04-07 Epigenx Pharmaceuticals, Inc. Assays for dna methylation changes
US20040002371A1 (en) 2001-10-01 2004-01-01 Claude Paquin Method and apparatus for automated system for validating a set of collectible lottery tickets
JP2004148509A (ja) 2001-10-04 2004-05-27 Seiko Epson Corp 液体噴射ヘッド
US6977148B2 (en) 2001-10-15 2005-12-20 Qiagen Gmbh Multiple displacement amplification
ATE405676T1 (de) 2002-03-11 2008-09-15 Nugen Technologies Inc Verfahren zur erzeugung doppelsträngiger dna mit einem 3'-einzelstranganteil und verwendungen dieser komplexe zur rekombination
US7285394B2 (en) 2002-03-15 2007-10-23 Epigenomics Ag Discovery and diagnostic methods using 5-methylcytosine DNA glycosylase
CA2480525A1 (en) 2002-03-29 2003-10-09 Nugen Technologies, Inc. Single primer isothermal nucleic acid amplification-enhanced analyte detection and quantification
US20040137456A1 (en) 2002-04-04 2004-07-15 Hiroki Yokota Method for identifying and characterizing individual dna molecules
US6815167B2 (en) 2002-04-25 2004-11-09 Geneohm Sciences Amplification of DNA to produce single-stranded product of defined sequence and length
US6887709B2 (en) 2002-05-09 2005-05-03 Lifescan, Inc. Devices, systems and methods for the containment and use of liquid solutions
WO2004011665A2 (en) 2002-05-17 2004-02-05 Nugen Technologies, Inc. Methods for fragmentation, labeling and immobilization of nucleic acids
AU2003240795A1 (en) 2002-05-24 2003-12-12 Invitrogen Corporation Nested pcr employing degradable primers
US7291460B2 (en) 2002-05-31 2007-11-06 Verenium Corporation Multiplexed systems for nucleic acid sequencing
US7108976B2 (en) 2002-06-17 2006-09-19 Affymetrix, Inc. Complexity management of genomic DNA by locus specific amplification
EP1554386A2 (en) 2002-07-24 2005-07-20 Immusol Incorporated Single promoter system for making sirna expression cassettes and expression libraries using a polymerase primer hairpin linker
DE60312875T2 (de) 2002-09-05 2007-12-06 Plant Bioscience Ltd., Norwich Genomteilung
US7459273B2 (en) 2002-10-04 2008-12-02 Affymetrix, Inc. Methods for genotyping selected polymorphism
US7704687B2 (en) 2002-11-15 2010-04-27 The Johns Hopkins University Digital karyotyping
US7414117B2 (en) 2002-12-26 2008-08-19 Ngk Insulators, Ltd. Nucleotide derivative and DNA microarray
EP2159285B1 (en) 2003-01-29 2012-09-26 454 Life Sciences Corporation Methods of amplifying and sequencing nucleic acids
US7189512B2 (en) 2003-02-20 2007-03-13 Noga Porat Methods for variation detection
US20090124514A1 (en) 2003-02-26 2009-05-14 Perlegen Sciences, Inc. Selection probe amplification
WO2004092331A2 (en) 2003-04-08 2004-10-28 Li-Cor, Inc. Composition and method for nucleic acid sequencing
WO2004092418A2 (en) 2003-04-14 2004-10-28 Nugen Technologies, Inc. Global amplification using a randomly primed composite primer
US7300755B1 (en) 2003-05-12 2007-11-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods for haplotyping genomic DNA
WO2005038427A2 (en) 2003-06-05 2005-04-28 Medical Gene Center Ltd. Rapid identification of viruses of the upper respiratory tract infection including sars causing coronus viruses
US20050053980A1 (en) 2003-06-20 2005-03-10 Illumina, Inc. Methods and compositions for whole genome amplification and genotyping
US20050123956A1 (en) 2003-09-25 2005-06-09 Affymetrix, Inc. Methods for modifying DNA for microarray analysis
US7169560B2 (en) 2003-11-12 2007-01-30 Helicos Biosciences Corporation Short cycle methods for sequencing polynucleotides
US20050136417A1 (en) 2003-12-19 2005-06-23 Affymetrix, Inc. Amplification of nucleic acids
US20050208538A1 (en) 2003-12-29 2005-09-22 Nurith Kurn Methods for analysis of nucleic acid methylation status and methods for fragmentation, labeling and immobilization of nucleic acids
CA2497324A1 (en) 2004-02-17 2005-08-17 Affymetrix, Inc. Methods for fragmenting and labelling dna
US7595179B2 (en) 2004-04-19 2009-09-29 Applied Biosystems, Llc Recombinant reverse transcriptases
US7462452B2 (en) 2004-04-30 2008-12-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Field-switch sequencing
US7622281B2 (en) 2004-05-20 2009-11-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for clonal amplification of nucleic acid
WO2006007569A2 (en) 2004-07-01 2006-01-19 Somagenics, Inc. Methods of preparation of gene-specific oligonucleotide libraries and uses thereof
US7361468B2 (en) 2004-07-02 2008-04-22 Affymetrix, Inc. Methods for genotyping polymorphisms in humans
US20060024711A1 (en) 2004-07-02 2006-02-02 Helicos Biosciences Corporation Methods for nucleic acid amplification and sequence determination
US7276720B2 (en) 2004-07-19 2007-10-02 Helicos Biosciences Corporation Apparatus and methods for analyzing samples
US20060024678A1 (en) 2004-07-28 2006-02-02 Helicos Biosciences Corporation Use of single-stranded nucleic acid binding proteins in sequencing
US20060216724A1 (en) 2004-07-30 2006-09-28 Affymetrix, Inc. Methods for normalized amplification of nucleic acids
US7867703B2 (en) 2004-08-26 2011-01-11 Agilent Technologies, Inc. Element defined sequence complexity reduction
US7170050B2 (en) 2004-09-17 2007-01-30 Pacific Biosciences Of California, Inc. Apparatus and methods for optical analysis of molecules
CA2579150C (en) 2004-09-17 2014-11-25 Pacific Biosciences Of California, Inc. Apparatus and method for analysis of molecules
GB0422551D0 (en) 2004-10-11 2004-11-10 Univ Liverpool Labelling and sequencing of nucleic acids
JP2008520975A (ja) 2004-11-16 2008-06-19 ヘリコス バイオサイエンシーズ コーポレイション Ｔｉｒｆ単分子分析および核酸を配列決定する方法
CN100413978C (zh) * 2004-12-16 2008-08-27 上海交通大学 基于dna切割过程的双链dna序列测定的方法
EP1841879A4 (en) 2005-01-25 2009-05-27 Population Genetics Technologi ISOTHERMAL DNA AMPLIFICATION
US7462468B1 (en) 2005-01-28 2008-12-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. DNA intercalating agents and methods of use
CA2593855A1 (en) 2005-01-31 2006-08-10 Pacific Biosciences Of California, Inc. Use of reversible extension terminator in nucleic acid sequencing
US20060286566A1 (en) 2005-02-03 2006-12-21 Helicos Biosciences Corporation Detecting apparent mutations in nucleic acid sequences
US20060240451A1 (en) 2005-02-09 2006-10-26 Epicentre Technologies Compositions and methods employing 5' phosphate-dependent nucleic acid exonucleases
US7452671B2 (en) 2005-04-29 2008-11-18 Affymetrix, Inc. Methods for genotyping with selective adaptor ligation
US20060263789A1 (en) 2005-05-19 2006-11-23 Robert Kincaid Unique identifiers for indicating properties associated with entities to which they are attached, and methods for using
EP1910562B1 (en) 2005-06-23 2010-12-08 Keygene N.V. Strategies for high throughput identification and detection of polymorphisms
GB0514909D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Methods of nucleic acid amplification and sequencing
GB0514910D0 (en) 2005-07-20 2005-08-24 Solexa Ltd Method for sequencing a polynucleotide template
DK1924704T3 (da) 2005-08-02 2011-09-05 Rubicon Genomics Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til bearbejdning og mangfoldiggørelse af DNA, herunder ved anvendelse af flere enzymer i en enkelt reaktion
US20090137415A1 (en) 2005-08-05 2009-05-28 Euclid Diagnostics Llc SUBTRACTIVE SEPARATION AND AMPLIFICATION OF NON-RIBOSOMAL TRANSCRIBED RNA (nrRNA)
WO2007030759A2 (en) 2005-09-07 2007-03-15 Nugen Technologies, Inc. Improved nucleic acid amplification procedure
US7405281B2 (en) 2005-09-29 2008-07-29 Pacific Biosciences Of California, Inc. Fluorescent nucleotide analogs and uses therefor
CA2910861C (en) 2005-09-29 2018-08-07 Michael Josephus Theresia Van Eijk High throughput screening of mutagenized populations
EP1940755A2 (en) 2005-10-28 2008-07-09 Praecis Pharmaceuticals Inc. Methods for identifying compounds of interest using encoded libraries
GB0522310D0 (en) 2005-11-01 2005-12-07 Solexa Ltd Methods of preparing libraries of template polynucleotides
EP1957667A1 (en) 2005-11-15 2008-08-20 Solexa Ltd. Method of target enrichment
EP1969153A2 (en) 2005-11-28 2008-09-17 Pacific Biosciences of California, Inc. Uniform surfaces for hybrid material substrates and methods for making and using same
ES2882401T3 (es) 2005-12-22 2021-12-01 Keygene Nv Método de detección de polimorfismos basado en AFLP de alto rendimiento
US20070224613A1 (en) 2006-02-18 2007-09-27 Strathmann Michael P Massively Multiplexed Sequencing
US20080038727A1 (en) 2006-03-10 2008-02-14 Applera Corporation MicroRNA and Messenger RNA Detection on Arrays
US20070231823A1 (en) 2006-03-23 2007-10-04 Mckernan Kevin J Directed enrichment of genomic DNA for high-throughput sequencing
KR101087809B1 (ko) 2006-04-10 2011-11-29 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 단일 세포 및 콜로니의 수집을 위한 시스템
WO2008115185A2 (en) 2006-04-24 2008-09-25 Nimblegen Systems, Inc. Use of microarrays for genomic representation selection
US20080269476A1 (en) 2006-04-26 2008-10-30 Helicos Biosciences Corporation Molecules and methods for nucleic acid sequencing
EP2079838A1 (en) 2006-05-16 2009-07-22 NuGEN Technologies, Inc. Nucleic acid separation and purification method based on reversible charge interactions
WO2007149789A2 (en) * 2006-06-22 2007-12-27 Applera Corporation Conversion of target specific amplification to universal sequencing
US20100022403A1 (en) 2006-06-30 2010-01-28 Nurith Kurn Methods for fragmentation and labeling of nucleic acids
WO2008015396A2 (en) 2006-07-31 2008-02-07 Solexa Limited Method of library preparation avoiding the formation of adaptor dimers
US8293501B2 (en) 2006-09-12 2012-10-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for performing low background multiplex nucleic acid amplification reactions
US20080242560A1 (en) 2006-11-21 2008-10-02 Gunderson Kevin L Methods for generating amplified nucleic acid arrays
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
EP2653861B1 (en) 2006-12-14 2014-08-13 Life Technologies Corporation Method for sequencing a nucleic acid using large-scale FET arrays
WO2008093098A2 (en) * 2007-02-02 2008-08-07 Illumina Cambridge Limited Methods for indexing samples and sequencing multiple nucleotide templates
US20080194416A1 (en) 2007-02-08 2008-08-14 Sigma Aldrich Detection of mature small rna molecules
WO2008112653A1 (en) 2007-03-09 2008-09-18 Dxtech, Llc Electrochemical detection system
US20080241831A1 (en) 2007-03-28 2008-10-02 Jian-Bing Fan Methods for detecting small RNA species
US7767805B2 (en) 2007-05-03 2010-08-03 Helicos Biosciences Corporation Methods and compositions for sequencing a nucleic acid
US9248076B2 (en) 2007-05-16 2016-02-02 Mystic Pharmaceuticals, Inc. Dose dispensing containers
EP2164985A4 (en) * 2007-06-01 2014-05-14 454 Life Sciences Corp SYSTEM AND METHOD FOR IDENTIFYING INDIVIDUAL SAMPLES FROM A MULTIPLEX MIXTURE
CA2689626C (en) 2007-06-06 2016-10-25 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and processes for calling bases in sequence by incorporation methods
AR066922A1 (es) 2007-06-08 2009-09-23 Monsanto Technology Llc Metodos de mejoramiento molecular del germoplasma de una planta por secuenciamiento dirigido
CA2693979A1 (en) 2007-07-26 2009-02-05 Pacific Biosciences Of California, Inc. Molecular redundant sequencing
US8748100B2 (en) 2007-08-30 2014-06-10 The Chinese University Of Hong Kong Methods and kits for selectively amplifying, detecting or quantifying target DNA with specific end sequences
US9388457B2 (en) 2007-09-14 2016-07-12 Affymetrix, Inc. Locus specific amplification using array probes
EP2053132A1 (en) 2007-10-23 2009-04-29 Roche Diagnostics GmbH Enrichment and sequence analysis of geomic regions
EP2209912A1 (en) 2007-10-26 2010-07-28 Rosetta Inpharmatics LLC Cdna synthesis using non-random primers
US8518640B2 (en) 2007-10-29 2013-08-27 Complete Genomics, Inc. Nucleic acid sequencing and process
WO2009102878A2 (en) 2008-02-12 2009-08-20 Nugen Technologies, Inc. Method for archiving and clonal expansion
US20090203531A1 (en) 2008-02-12 2009-08-13 Nurith Kurn Method for Archiving and Clonal Expansion
GB0804690D0 (en) 2008-03-13 2008-04-16 Netherlands Cancer Inst The Method
GB2470672B (en) 2008-03-21 2012-09-12 Nugen Technologies Inc Methods of RNA amplification in the presence of DNA
US8236499B2 (en) 2008-03-28 2012-08-07 Pacific Biosciences Of California, Inc. Methods and compositions for nucleic acid sample preparation
CN104862383B (zh) 2008-03-28 2019-05-28 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 用于核酸测序的组合物和方法
US20110129827A1 (en) 2008-04-04 2011-06-02 Helicos Biosciences Corporation Methods for transcript analysis
WO2010003153A2 (en) 2008-07-03 2010-01-07 Life Technologies Corporation Methylation analysis of mate pairs
JP5221248B2 (ja) 2008-08-26 2013-06-26 株式会社日立ハイテクノロジーズ 高発現遺伝子由来のｃＤＮＡクローンの含有率を低減させたｃＤＮＡライブラリーの作製方法
WO2010030683A1 (en) 2008-09-09 2010-03-18 Rosetta Inpharmatics Llc Methods of generating gene specific libraries
US9156010B2 (en) 2008-09-23 2015-10-13 Bio-Rad Laboratories, Inc. Droplet-based assay system
WO2010039991A2 (en) 2008-10-02 2010-04-08 The Texas A&M University System Method of generating informative dna templates for high-throughput sequencing applications
US20100137143A1 (en) 2008-10-22 2010-06-03 Ion Torrent Systems Incorporated Methods and apparatus for measuring analytes
US20100113296A1 (en) 2008-11-05 2010-05-06 Joel Myerson Methods And Kits For Nucleic Acid Analysis
US8017328B2 (en) 2008-11-21 2011-09-13 Agilent Technologies, Inc. Genome partitioning using a nicking endonuclease
JP2012510810A (ja) 2008-12-04 2012-05-17 キージーン・エン・フェー アダプター連結制限断片における反復配列を減少させる方法
GB2465986A (en) 2008-12-04 2010-06-09 Angeletti P Ist Richerche Bio Method of generating diversity in polynucleotide sequences
WO2010085715A1 (en) 2009-01-22 2010-07-29 Quanta Biosciences Method for enrichment of selected rna molecules
US20100323348A1 (en) 2009-01-31 2010-12-23 The Regents Of The University Of Colorado, A Body Corporate Methods and Compositions for Using Error-Detecting and/or Error-Correcting Barcodes in Nucleic Acid Amplification Process
CN102387966A (zh) 2009-02-06 2012-03-21 西北大学 爆炸性液体包装及其用途
JP5985390B2 (ja) 2009-04-02 2016-09-06 フリューダイム・コーポレイション 標的核酸にバーコードを付加するためのマルチプライマー増幅方法
WO2010129937A2 (en) 2009-05-08 2010-11-11 Life Technologies Corporation Methods for detecting genetic variations in dna samples
CN101565746B (zh) * 2009-06-03 2012-08-08 东南大学 带奇偶校验的信号组合编码dna连接测序方法
EP2272976A1 (en) 2009-07-06 2011-01-12 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method for differentiation of polynucleotide strands
US8481699B2 (en) 2009-07-14 2013-07-09 Academia Sinica Multiplex barcoded Paired-End ditag (mbPED) library construction for ultra high throughput sequencing
GB0912909D0 (en) 2009-07-23 2009-08-26 Olink Genomics Ab Probes for specific analysis of nucleic acids
WO2011019964A1 (en) 2009-08-12 2011-02-17 Nugen Technologies, Inc. Methods, compositions, and kits for generating nucleic acid products substantially free of template nucleic acid
CN102858995B (zh) * 2009-09-10 2016-10-26 森特瑞隆技术控股公司 靶向测序方法
US20110189679A1 (en) 2009-09-11 2011-08-04 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for whole transcriptome analysis
GB2487341A (en) 2009-11-02 2012-07-18 Nugen Technologies Inc Compositions and methods for targeted nucleic acid sequence selection and amplification
US20120245041A1 (en) 2009-11-04 2012-09-27 Sydney Brenner Base-by-base mutation screening
WO2011056866A2 (en) 2009-11-05 2011-05-12 Epicentre Technologies Corporation Methods and kits for 3'-end-tagging of rna
GB0921264D0 (en) 2009-12-03 2010-01-20 Olink Genomics Ab Method for amplification of target nucleic acid
US20110269647A1 (en) * 2010-04-28 2011-11-03 Medical Research Council Method
CA2798758C (en) 2010-05-18 2019-05-07 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
ITRM20100293A1 (it) 2010-05-31 2011-12-01 Consiglio Nazionale Ricerche Metodo per la preparazione e amplificazione di librerie rappresentative di cdna per il sequenziamento massivo, loro uso, kit e cartucce per kit di automazione
EP2580378A4 (en) 2010-06-08 2014-01-01 Nugen Technologies Inc MULTIPLEX SEQUENCING METHODS AND COMPOSITION
EP3425062B1 (en) * 2010-06-09 2023-08-02 Keygene N.V. Combinatorial sequence barcodes for high throughput screening
WO2012003374A2 (en) 2010-07-02 2012-01-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Targeted sequencing library preparation by genomic dna circularization
WO2012012037A1 (en) 2010-07-19 2012-01-26 New England Biolabs, Inc. Oligonucleotide adaptors: compositions and methods of use
GB201012748D0 (en) 2010-07-29 2010-09-15 Univ St Andrews Improved RACE
ES2523140T3 (es) * 2010-09-21 2014-11-21 Population Genetics Technologies Ltd. Aumento de la confianza en las identificaciones de alelos con el recuento molecular
IN2013MN00522A (zh) 2010-09-24 2015-05-29 Univ Leland Stanford Junior
US8715933B2 (en) 2010-09-27 2014-05-06 Nabsys, Inc. Assay methods using nicking endonucleases
HUE039766T2 (hu) 2010-10-22 2019-02-28 Cold Spring Harbor Laboratory Nukleinsavak változatainak megszámlálása genom kópiaszám információ megszerzésére
US20120102054A1 (en) 2010-10-25 2012-04-26 Life Technologies Corporation Systems and Methods for Annotating Biomolecule Data
US8829171B2 (en) * 2011-02-10 2014-09-09 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
EP2635679B1 (en) * 2010-11-05 2017-04-19 Illumina, Inc. Linking sequence reads using paired code tags
EP2652148B1 (en) 2010-12-17 2016-11-30 Life Technologies Corporation Methods, compositions, systems, apparatuses and kits for nucleic acid amplification
CN103608466B (zh) 2010-12-22 2020-09-18 纳特拉公司 非侵入性产前亲子鉴定方法
US9163281B2 (en) * 2010-12-23 2015-10-20 Good Start Genetics, Inc. Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction
WO2012103154A1 (en) 2011-01-24 2012-08-02 Nugen Technologies, Inc. Stem-loop composite rna-dna adaptor-primers: compositions and methods for library generation, amplification and other downstream manipulations
AU2011358564B9 (en) 2011-02-09 2017-07-13 Natera, Inc Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
WO2012112804A1 (en) * 2011-02-18 2012-08-23 Raindance Technoligies, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
US20130059738A1 (en) 2011-04-28 2013-03-07 Life Technologies Corporation Methods and compositions for multiplex pcr
US8722585B2 (en) 2011-05-08 2014-05-13 Yan Wang Methods of making di-tagged DNA libraries from DNA or RNA using double-tagged oligonucleotides
CN112592960A (zh) 2011-05-20 2021-04-02 富鲁达公司 核酸编码反应
US8841071B2 (en) 2011-06-02 2014-09-23 Raindance Technologies, Inc. Sample multiplexing
SG11201401628WA (en) 2011-10-19 2014-05-29 Nugen Technologies Inc Compositions and methods for directional nucleic acid amplification and sequencing
WO2013059740A1 (en) 2011-10-21 2013-04-25 Foundation Medicine, Inc. Novel alk and ntrk1 fusion molecules and uses thereof
US20160153039A1 (en) 2012-01-26 2016-06-02 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for targeted nucleic acid sequence enrichment and high efficiency library generation
CA2862552A1 (en) 2012-01-26 2013-08-01 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for targeted nucleic acid sequence enrichment and high efficiency library generation
EP3321378B1 (en) 2012-02-27 2021-11-10 Becton, Dickinson and Company Compositions for molecular counting
ES2776673T3 (es) * 2012-02-27 2020-07-31 Univ North Carolina Chapel Hill Métodos y usos para etiquetas moleculares
EP2825675B1 (en) * 2012-03-13 2017-12-27 Patel, Abhijit Ajit Measurement of nucleic acid variants using highly-multiplexed error-suppressed deep sequencing
US8209130B1 (en) 2012-04-04 2012-06-26 Good Start Genetics, Inc. Sequence assembly
AU2013266394B2 (en) 2012-05-21 2019-03-14 The Scripps Research Institute Methods of sample preparation
JP6181751B2 (ja) 2012-06-18 2017-08-16 ニューゲン テクノロジーズ， インコーポレイテッド 望まれない核酸配列のネガティブ選択のための組成物および方法
US11261494B2 (en) 2012-06-21 2022-03-01 The Chinese University Of Hong Kong Method of measuring a fractional concentration of tumor DNA
US20150011396A1 (en) 2012-07-09 2015-01-08 Benjamin G. Schroeder Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing
US20140378345A1 (en) 2012-08-14 2014-12-25 10X Technologies, Inc. Compositions and methods for sample processing
EP2893040B1 (en) 2012-09-04 2019-01-02 Guardant Health, Inc. Methods to detect rare mutations and copy number variation
EP2922989B1 (en) 2012-11-26 2018-04-04 The University of Toledo Methods for standardized sequencing of nucleic acids and uses thereof
EP4293125A3 (en) 2012-12-10 2024-02-28 Resolution Bioscience, Inc. Methods for targeted genomic analysis
EP2971130A4 (en) * 2013-03-15 2016-10-05 Nugen Technologies Inc SEQUENTIAL SEQUENCING
US20140274729A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Nugen Technologies, Inc. Methods, compositions and kits for generation of stranded rna or dna libraries
KR102536833B1 (ko) 2013-08-28 2023-05-26 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 대량의 동시 단일 세포 분석
US10149951B2 (en) 2013-10-15 2018-12-11 Mystic Pharmaceuticals, Inc. Controllable rate turbulating nozzle
US9546399B2 (en) 2013-11-13 2017-01-17 Nugen Technologies, Inc. Compositions and methods for identification of a duplicate sequencing read
GB201320542D0 (en) 2013-11-21 2014-01-01 Randox Lab Ltd Assay fluid delivery system
WO2015131107A1 (en) 2014-02-28 2015-09-03 Nugen Technologies, Inc. Reduced representation bisulfite sequencing with diversity adaptors
US10102337B2 (en) 2014-08-06 2018-10-16 Nugen Technologies, Inc. Digital measurements from targeted sequencing
US9527077B2 (en) 2015-01-29 2016-12-27 David W. Wright Diagnostic cartridge, fluid storage and delivery apparatus therefor and methods of construction thereof
US20160275240A1 (en) 2015-02-18 2016-09-22 Nugen Technologies, Inc. Methods and compositions for pooling amplification primers
CN105890722A (zh) 2016-06-13 2016-08-24 常州大学 利用共振原理测量dna分子质量的方法
WO2020159608A1 (en) * 2019-01-31 2020-08-06 Children's Medical Center Corporation Cost-effective detection of low frequency genetic variation

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TruSeq RNA and DNA Sample Preparation Kits v2;Illumina;《https://web.archive.org/web/20130410190518/http://www.illumina.com/documents/products/datasheets/datesheet_ truseq _sample_prep_kits.pdf》;20110427;附图4D和Sequence-Ready Libraries部分 *

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