CN107513570A - 基于高通量测序均一化多靶标文库构建的方法及试剂盒 - Google Patents
基于高通量测序均一化多靶标文库构建的方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及高通量测序均一化多靶标文库构建的方法及试剂盒。通过以嵌套式基因特异性引物，在初阶PCR阶段富集靶标，在二阶PCR阶段使用通用引物扩增反应体系内的所有靶标，使靶标能够均一化扩增，降低因PCR引物扩增效率的差异导致的产量差异。
Description
发明领域
本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种基于高通量测序均一化多靶标文库构建的方法及试剂盒。
背景技术
精准医疗是以个体化医疗为基础、随着基因组测序技术快速进步以及生物信息与大数据科学的交叉应用而发展起来的新型医学概念与医疗模式。其本质是通过基因组、蛋白质组等组学技术和医学前沿技术，对于大样本人群与特定疾病类型进行生物标记物的分析与鉴定、验证与应用，从而精确寻找到疾病的原因和治疗的靶点，并对一种疾病不同状态和过程进行精确分类，最终实现对于疾病和特定患者进行个性化精准治疗的目的，提高疾病诊治与预防的效益。
高通量测序技术以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，高通量测序技术可以在较短时间内测定人类基因组目标区域序列，使快速获取个目标区域序列信息成为现实。然而，以往的多重PCR扩增测序文库构建方法具有一些不足。例如，多重PCR反应中的每对靶标引物都具有自身特定的最佳反应条件，而多重PCR又只能在单一反应条件下进行，导致在条件下，绝大多数引物的反应条件不是最佳条件。另外，体系中多种高浓度引物经常在PCR反应中产生引物二聚体或其他非特异性扩增产物，这种现象不但需要大量消耗酶和底物，降低靶标扩增效率，同时还需要增加反应后的纯化和洗涤步骤。而更严重的，扩增效率、反应条件及特异性的差异还将导致多重PCR每种扩增子产量的显著差异，致使某些扩增子能够有效扩增，并且在反应终产物中占比较高，而某些扩增子扩增效果差甚至不能扩增，并且在反应终产物中占比较低，甚至有可能在后续纯化过程中丢失。同时，传统多重PCR构建的测序文库仅能检测插入、缺失，无法进行基因融合检测。为提高测序性能，提升建库质量，增加对融合基因的检测，对多靶标文库构建改进新方法有较强烈的需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于高通量测序均一化多靶标文库构建的方法及试剂盒。本方法能够以嵌套式基因特异性引物，在初阶PCR阶段富集靶标，在二阶PCR阶段使用通用引物扩增反应体系内的所有靶标，使靶标能够均一化扩增，降低因PCR引物扩增效率的差异导致的产量差异。
根据本发明的一个方面，提供用于高通量测序检测文库构建的嵌套式扩增引物，靶核酸可以是DNA或 RNA，扩增反应可以通过PCR、RT-PCR或RT-PCR与PCR相结合进行，可对基因融合变异进行检测。靶核酸的来源可以是一份或多份临床样本。
在优选的实施方案中，所述文库扩增引物引物混合物为SEQ ID NO:1-188所示的188条引物的混合物。
在一些优选的实施方案中，文库扩增引物混合物中包含的引物按相同比例混合在一起。
本发明的文库扩增引物混合物的工作浓度是0.02PM～120PM，优选30PM；其中PM＝皮摩尔/升。
本发明的文库扩增引物F的工作浓度是0.01PM～60PM，优选30PM；其中PM＝皮摩尔/升。
本发明的文库扩增引物R的工作浓度是0.01PM～60PM，优选30PM；其中PM＝皮摩尔/升。
本发明的通用引物混合物的工作浓度是0.02PM～120PM，优选30PM；其中PM＝皮摩尔/升。
根据本发明的另一个方面，提供多基因变异检测试剂盒，其中包含上述文件扩增引物混合物。
本发明的多基因变异检测试剂盒还可以包含用于基因变异的高通量测序检测的任何其它组分。在优选的实施方案中，所述基因变异检测试剂盒进一步包含选自文库扩增反应液、文库扩增引物混合物、文库扩增引物F、文库扩增引物R、通用引物、PCR预混液、阴性对照、阳性对照、核酸纯化磁珠、磁珠清洗液的一种或多种试剂。在特别优选的实施方案中，所述检测试剂盒包含上述全部试剂。
根据本发明的又一方面，提供上述用于人多靶标文库扩增引物在制备用于多基因变异的高通量测序检测的试剂中的应用。
具体实施方式
本文所述的“文库”是将某生物的全部DNA或RNA切割成一定长度的片段克隆形成的集合，可用于下游的扩增、Sanger测序或新一代测序。
本文所述的“新一代测序技术”又称大规模平行测序massively parallelsequencing(MPS)，是指采用“边合成边测序”的原理、对于几十万到几百万DNA分子同时进行平行的测序反应，然后通过生物信息学分析所得到的原始图像数据或电化学信号、最终得到待测样品的核酸序列或拷贝数等信息的测序技术，又称为高通量测序、深度测序、二代测序等。高通量测序的基本程序是将待测DNA随机打断成小片段，经末端修复、连接接头序列、PCR等步骤进行文库构建，最后使用Illumina，Ion Torrent等测序仪进行测序。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料和试剂，如无特殊说明，均可以从商业途径获得。
实施例1：基因变异检测质控品的制备
1.1.从ATCC购买获得两株常用的可稳定传代人肿瘤细胞系HCC1937、HCT-15。
1.2.采用专用培养基培养这两株人肿瘤细胞系，培养条件：37℃恒温，5％CO2，湿度50％。培养至细胞密度达培养皿面积80-90％时传代，在细胞生长对数期收集，800-1000r/min的速度离心取沉淀，分别抽提每个细胞系的基因组DNA，并过柱纯化、洗脱。
1.3.将纯化后的每个细胞系的基因组DNA分别用Tris-EDTA buffer solution缓冲液稀释至100±5ng/μL，外观为透明液体，无肉眼可见杂质，纯度为1.9＞OD260/280＞1.7，得到质控品原料DNA。
1.5.将两种细胞系HCC1937、HCT-15的质控品原料DNA按照1：1的体积比进行均匀混合分装作为质控品Ⅰ(阳性对照)，-20℃保存。
1.6.将细胞系HCT-15的质控品原料DNA分装作为质控品Ⅱ(阴性对照)，-20℃保存。
实施例2：多基因变异检测试剂盒的制备
2.1.设计并合成多基因文库扩增引物。所述基因文库扩增引物包括SEQ ID NO:1-188所示序列。
2.2.设计并合成多基因文库扩增引物F。所述基因文库扩增引物包括SEQ ID NO:1-94所示序列。
2.3.设计并合成多基因文库扩增引物R。所述基因文库扩增引物包括SEQ ID NO:95-188所示序列。
2.4.设计并合成通用引物。所述通用引物包括SEQ ID NO:189-200所示序列。
2.5.将设计合成的文库扩增引物F按相同质量混合在一起，并将混合物稀释为工作浓度30PM(PM＝皮摩尔/升)，-20℃保存。
2.6.将设计合成的文库扩增引物R按相同质量混合在一起，并将混合物稀释为工作浓度30PM(PM＝皮摩尔/升)，-20℃保存。
2.7.将设计合成的文库扩增引物按相同质量混合在一起，并将混合物稀释为工作浓度30PM(PM＝皮摩尔/升)，-20℃保存。
2.8.将设计合成的通用引物按相同质量混合在一起，并将混合物稀释为工作浓度30PM(PM＝皮摩尔/ 升)，-20℃保存。
2.9.将文库扩增引物混合物、文库扩增引物混合物F、文库扩增引物混合物R、通用引物和实施例1中获得的质控品分别分装。
2.10.准备说明书、外包装，组装封口。
实施例3：多靶标文库构建及基因变异检测
本实施例中测序所使用的仪器为CN 500。
采用以下方法分别以本发明实施例2试剂盒对样本进行基因变异检测。质控品的制备方法同实施例1。
3.1.从12例经验证的组织样本中提取DNA和RNA，质控品直接使用，无需提取。
3.2.文库构建
3.2.1.一阶PCR与纯化(优选)
向0.2mL PCR反应管中分别加入2～25μL PCR反应液(优选15μL)、0.1～10μL文库扩增引物混合物(优选5μL)、5～500ng提取基因组核酸(优选50ng)，震荡混匀，短暂离心后在PCR仪中按下述程序进行扩增： 95℃1～20min；1-30个循环(优选2个循环)，每个循环为94℃15s～45s，55℃15s～45s，72℃10s～45s； 2-30个循环(优选20个循环)，每个循环为94℃15s，60～70℃15s～45s；4℃保存备用。扩增后取出PCR 反应管，短暂离心后将扩增产物全部转移至1.5mL离心管中。向离心管中加入1.8×核酸纯化磁珠，震荡混匀，室温静置5min后短暂离心，转移至磁力架上静置1min，吸弃上清。然后加入200μL磁珠清洗液，静置 30s后，吸弃上清。重复洗涤一次，开盖静置3min。向离心管中加入2～100μL Nuclease-freewater重悬磁珠，室温静置5min，转移至磁力架上静置1min。所述磁珠清洗液为80％乙醇。
3.2.2.一阶PCR与纯化
向0.2mL PCR反应管中分别加入2～25μL PCR反应液(优选的15μL)、0.1～10μL文库扩增引物F(优选 2.5μL)、5～500ng提取基因组核酸(优选50ng)，震荡混匀，短暂离心后在PCR仪中按下述程序进行扩增： 95℃1～20min；1-30个循环(优选2个循环)，每个循环为94℃15s～45s，55℃15s～45s，72℃10s～45s； 2-30个循环(优选20个循环)，每个循环为94℃15s，60～70℃15s～45s；4℃保存备用。扩增后取出PCR 反应管，短暂离心后将扩增产物全部转移至1.5mL离心管中。向离心管中加入1.8×核酸纯化磁珠，震荡混匀，室温静置5min后短暂离心，转移至磁力架上静置1min，吸弃上清。然后加入200μL磁珠清洗液，静置 30s后，吸弃上清。重复洗涤一次，开盖静置3min。向离心管中加入2～100μL Nuclease-freewater重悬磁珠，室温静置5min，转移至磁力架上静置1min。
向0.2mL PCR反应管中分别加入2～25μL PCR反应液(优选15μL)、0.1～10μL文库扩增引物R(优选 2.5μL)、5～500ng提取基因组核酸(优选50ng)，震荡混匀，短暂离心后在PCR仪中按下述程序进行扩增： 95℃1～20min；1-30个循环(优选2个循环)，每个循环为94℃15s～45s，55℃15s～45s，72℃10s～45s； 2-30个循环(优选20个循环)，每个循环为94℃15s，60～70℃15s～45s；4℃保存备用。扩增后取出PCR 反应管，短暂离心后将扩增产物全部转移至1.5mL离心管中。向离心管中加入1.8×核酸纯化磁珠，震荡混匀，室温静置5min后短暂离心，转移至磁力架上静置1min，吸弃上清。然后加入200μL磁珠清洗液，静置 30s后，吸弃上清。重复洗涤一次，开盖静置3min。向离心管中加入2～100μL Nuclease-free water重悬磁珠，室温静置5min，转移至磁力架上静置1min。
3.2.3.二阶PCR与纯化
取全部上清至新的0.2mL PCR反应管中分别加入2～25μL PCR预混液(优选15μL)、0.1～10μL通用引物(优选5μL)，震荡混匀，短暂离心后在PCR仪中按下述程序进行扩增：95℃1～20min；20-30个循环(优选25个循环)，每个循环为94℃15s，55℃15s，72℃15s；72℃3min；4℃保存备用。扩增后取出PCR 反应管，短暂离心后将扩增产物全部转移至1.5mL离心管中。向离心管中加入0.5～1.7×核酸纯化磁珠(优选0.8×)，震荡混匀，室温静置5min后短暂离心，转移至磁力架上静置1min，吸弃上清。然后加入200μL 磁珠清洗液，静置30s后，吸弃上清。重复洗涤一次，开盖静置3min。向离心管中加入10～100μL Nuclease-freewater重悬磁珠，室温静置5min，转移至磁力架上静置1min。取2μL文库DNA进行定量(使用Qubit荧光定量仪)。
3.3.测序及数据分析
3.3.1.测序
按照测序仪器及配套试剂使用说明进行上机测序。要求平均有效覆盖深度：≥100×。
3.4.数据处理与分析
获得原始测序数据后，与参比数据库比对，比对后的数据含有样本中包含的所有变异信息及背景信号。对比对后的数据进行过滤处理，最终得到样本的变异信息。
检测结果如下：
临床样本的基因变异检测结果如表1所示。实施例2试剂盒测定结果与临床样本突变的验证结果一致，同时本方法及试剂盒可准确检出临床样本中存在的基因融合变异形式。
表1临床样本及质控品基因变异检测结果
实施例4：可重复性实验
按照实施例1的制备方法制备质控品Ⅰ。
按照实施例2的制备方法生产三批试剂盒，批号分别为20170920，20170921，20170922。
按照实施例3的检测方法用对质控品Ⅰ进行检测。同一批次试剂盒20170920，检测质控品Ⅰ3次，检测结果见表2。不同批次试剂盒20170920，20170921，20170922，检测质控品Ⅰ各3次，检测结果见表3。
表2批内差异
| 批号 | 样本名称 | 检测标准 | 检测结果 |
| 20170920 | 质控品Ⅰ | 检测结果均为阳性 | 阳性，3/3 |
| 20170920 | 质控品Ⅰ | 检测结果均为阳性 | 阳性，3/3 |
| 20170920 | 质控品Ⅰ | 检测结果均为阳性 | 阳性，3/3 |
表3批间差异
检测结果：试剂盒可重复性满足要求。
实施例5：与常规多靶标扩增法文库建库对比分析
对实施例3中12例临床样本应用以下常规多靶标扩增法文库建库方法(以下简称常规法)进行文库构建，检测结果见表4，与实施例3测序性能对比见表5。
5.1.测序及数据分析
取0.2mL PCR反应管中分别加入25μL PCR预混液、5μL常规引物、100ng提取基因组核酸，震荡混匀，短暂离心后在PCR仪中按下述程序进行扩增：95℃5min；25个循环，每个循环为94℃15s，55℃15s，72℃ 15s；72℃3min；4℃保存备用。扩增后取出PCR反应管，短暂离心后将扩增产物全部转移至1.5mL离心管中。向离心管中加入1×核酸纯化磁珠，震荡混匀，室温静置5min后短暂离心，转移至磁力架上静置1min，吸弃上清。然后加入200μL磁珠清洗液，静置30s后，吸弃上清。重复洗涤一次，开盖静置3min。向离心管中加入50μL Nuclease-free water重悬磁珠，室温静置5min，转移至磁力架上静置1min。取2μL文库DNA 进行定量(使用Qubit荧光定量仪)。所述常规引物包括SEQ ID NO:201-388所示序列。所述常规引物序列不包含通用引物结合位点。
5.2.测序及数据分析
按照测序仪器及配套试剂使用说明进行上机测序。要求平均有效覆盖深度：≥100×。
5.3.数据处理与分析
获得原始测序数据后，与参比数据库比对，比对后的数据含有样本中包含的所有变异信息及背景信号。对比对后的数据进行过滤处理，最终得到样本的变异信息。
表4常规法检测结果
表5本发明与常规法临床样本测序性能对比
对比检测结果：常规法无法准确检出融合变异；
常规法平均测序深度低于本发明平均测序深度；
常规法测序深度CV值大于本发明测序深度CV值，不同扩增子产物对应的测序深度波动剧烈，检测性能不均一。
序列表
<110> 上海思路迪生物医学科技有限公司
<120> 基于高通量测序均一化多靶标文库构建的方法及试剂盒
<130> 2017
<160> 388
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 人工序列()
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aatgtacatt attgcgtacg ccagccctac ccctgggggt 40
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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ctttttatag aaaaaatata 20
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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<212> DNA
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<212> DNA
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aacgtgatga aaagatcaaa 20
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<213> 人工序列()
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aatatgcaaa tctacatacc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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aacacaatca aggatgatac 20
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<213> 人工序列()
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<213> 人工序列()
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gccaccaccg ccaccagctg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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cttcagtgaa tataagaatt 20
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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ctacgtaatc agtcggcgcc 20
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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cagcatcttc tgtttcctgg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列()
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gtctctacac tggaggtgga 20
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<213> 人工序列()
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cccgatagag gagccccact 20
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<212> DNA
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<213> 人工序列()
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ggtgagtcac aggttcagtt 20
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agccaaggga gtttgtggag 20
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gctgaattat cacatgaata 20
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<212> DNA
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tcagagaaga tgataatgaa 20
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<211> 20
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atacagagtc cctgagagtc 20
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<211> 20
<212> DNA
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gtgtgtctga agtctttcat 20
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<212> DNA
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aacaggacgg acctccatgc 20
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acattgacgg cccccactgc 20
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<213> 人工序列()
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agtcagcaga gccttctgag 20
Claims (13)
1.一种基于高通量测序均一化多靶标文库构建的方法，包括在一阶PCR阶段所使用的文库扩增引物混合物或文库扩增引物F、文库扩增引物R扩增一种或多种靶核酸，在二阶PCR阶段所使用的通用引物与至少一个通用引物结合位点结合，扩增至少一种核酸扩增子。
2.权利要求1的文库扩增引物混合物，所述文库扩增引物包括具有SEQ ID NO:1-188所示序列的188条引物组成。
3.权利要求1的文库扩增引物F，所述文库扩增引物F包括具有SEQ ID NO:1-94所示序列的94条引物组成。
4.权利要求1的文库扩增引物R，所述文库扩增引物R包括具有SEQ ID NO:95-188所示序列的94条引物组成。
5.权利要求1的通用引物，所述通用引物包括具有SEQ ID NO:189-200所示序列的12条引物组成。
6.权利要求2的文库扩增引物混合物，其中文库扩增引物混合物中包含的引物按相同质量混合在一起。
7.权利要求3的文库扩增引物F，其中文库扩增引物F中包含的引物按相同质量混合在一起。
8.权利要求4的文库扩增引物R，其中文库扩增引物R中包含的引物按相同质量混合在一起。
9.权利要求5的通用引物，其中通用引物中包含的引物按相同质量混合在一起。
10.多基因变异检测试剂盒，其中包含权利要求2-5的引物。
11.权利要求10的试剂盒，所述试剂盒进一步包含选自文库扩增反应液、文库扩增引物混合物、文库扩增引物F、文库扩增引物R、通用引物、PCR预混液、阴性对照、阳性对照、核酸纯化磁珠、磁珠清洗液的的一种或多种试剂。
12.权利要求10的试剂盒，所述试剂盒进一步包含文库扩增反应液、文库扩增引物混合物、文库扩增引物F、文库扩增引物R、通用引物、PCR预混液、阴性对照、阳性对照、核酸纯化磁珠、磁珠清洗液。
13.权利要求2-5的文库扩增引物混合物、文库扩增引物F、文库扩增引物R、通用引物在制备用于基因变异检测的试剂中的应用。
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