CN105603100A - 检测f8基因突变的扩增引物、试剂盒及方法 - Google Patents

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CN105603100A CN201610121122.5A CN201610121122A CN105603100A CN 105603100 A CN105603100 A CN 105603100A CN 201610121122 A CN201610121122 A CN 201610121122A CN 105603100 A CN105603100 A CN 105603100A
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Abstract

本发明公开了一种检测F8基因突变的扩增引物、试剂盒及方法，本发明属于基因检测技术，扩增引物利用F8基因的序列信息设计65对PCR引物，通过PCR靶向扩增F8基因目标区域，扩增区域覆盖F8基因外显子编码区的99.5%。所述方法将多重PCR靶向扩增结合Ion？torrent？PGM高通量测序技术，实现多个样品的同时并行检测，提高了F8基因突变的检测范围和通量，缩短了检测周期，降低成本。

Description

检测F8基因突变的扩增引物、试剂盒及方法
技术领域
本发明属于体外基因检测领域，尤其涉及一种检测F8基因突变的扩增引物、试剂盒及方法
背景技术
血友病(hemophilia)是一种遗传性凝血功能障碍的出血性疾病，患者由于凝血因子基因突变而导致凝血因子浓度下降或缺乏，从而造成凝血时间延长、轻微创伤后有出血倾向性。根据缺乏凝血因子的不同，临床上分为血友病A(hemophiliaA,HA)和血友病B(hemophiliaB,HB)。其临床表现主要为自发性、轻微外伤后出血难止或创伤、手术后严重出血等。出血的部位常见于负重的大关节(如膝、肘、踝、腕、髂、肩等)和肌肉/软组织，也可表现为内脏出血(如腹腔内、腹膜后、泌尿、消化、呼吸道等)、皮肤、黏膜出血(如皮肤淤血、鼻出血、口腔出血、牙龈出血等)。由于凝血因子Ⅷ(Ⅷ因子)和凝血因子Ⅸ(Ⅸ因子)的编码基因位于X染色体上，因此大多数血友病患者分布于男性，男性人群中血友病A和B的发病率分别约为1/5000和1/30000。其中，血友病A(hemophiliaA,HA)是最常见的X连锁隐性遗传性出血性疾病，由于FVIII的遗传性缺陷或缺乏所致，从而引起凝血功能障碍，发病率在男性中约为1/5000，女性通常为携带者，约60％患者有遗传病家族史。患者常常发生自发性或者外伤后出血不止，反复关节出血往往导致关节畸形，重要脏器出血可危及生命，目前尚无有效的根治方法，患者主要输注FVIII制品或新鲜全血预防和治疗出血。由于HA的危害性、遗传性及终生性，有必要开展HA的基因检测，为临床干预和遗传咨询提供依据。遗传学研究表明血友病A主要由F8基因突变引起；该基因位于X性染色体长臂末端((Xq28,chrX:154,064,070-154,250,998,inhg19)，其长度约有186kb并转录形成大约9kb的mRNA；该基因含有26个外显子(exon)，各外显子的大小不一，范围在69bp至3106bp之间。F8基因结构复杂，突变种类多，包括基因点突变、缺失、插入和倒位等，可能涉及整个基因，几乎覆盖了所有外显子的区域，因此特异性检测F8基因突变较为困难。很多年来，F8基因的复杂性导致很难对F8基因进行有效地突变分析。直到1991年，Higuchi等人首次使用变性梯度凝胶电泳法(denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE)以分析F8基因的整个编码区，在29个轻度或中度血友病A患者(包括15名德国人和14名日本人)中发现25名(86％)患者F8基因致病突变，而在重度血友病A患者中仅发现53％的患者F8基因致病突变。在1998年，Liu等首先基于LD-PCR技术建立了Inv22突变检测方法，随后Bagnall等在2002年基于LD-PCR技术建立了Inv1突变检测方法，这两种方法一直沿用至今。随后，多种突变筛查方法，如单链构象多态性(singlestrandconformationpolymorphism，SSCP)、构象敏感凝胶电泳(conformationsensitivegelelectrophoresis)、DGGE和化学裂解错配(chemicalcleavagemismatch)分析方法，被使用于许多实验室。但这些分析方法仍只能检出的血友病A患者中80-90％的F8基因突变。对F8基因的直接测序(PCR扩增+Sanger测序)，并且针对血友病A患者的F8基因突变检出率可达97％。最近几年随着二代测序技术的发展，二代测序技术也逐渐在各实验室使用并应用于血液疾病的遗传检测分析。目前，对PCR产物进行直接Sanger测序是常用的F8基因检测方法，虽然该方法更为准确，但测序工作量巨大、效率低，对操作人员要求较高，限制了该方法的大规模临床应用，仅能在有条件的实验室开展。
当前，CN102230002A公开了一种检测血友病致病基因F8基因和F9基因是否发生突变的试剂盒，但其在扩增F8基因过程中所需要使用的引物组达24对，每对引物需要单独扩增，虽然较为准确，但方法过于繁琐，反应体系需要后续纯化，再结合Sanger进行后续处理，检测成本过高、效率低、分析困难。蔡晓红等(女性血友病AFVIII基因的双重杂合突变一例基因分析，《血栓与止血学》，2005年，第11卷第02期，52-56页)采用的方法与CN102230002A类似，也有类似的缺陷。
第二代测序技术(next-generationsequencing,NGS)具有高通量、快速、准确和成本低的优点，可实现多样本、多个基因、多外显子的同时检测。其中，LifeTechnologies公司的IontorrentPGM高通量测序平台是其中的代表，它是基于半导体芯片的新一代革命性测序技术，使用一种布满小孔的高密度半导体芯片，一个小孔就是一个测序反应池；当DNA聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的DNA链上时会释放出一个H+，反应池中的pH值发生变化，位于池下的离子感受器感受到此信号，把化学信号直接转化为数字信号，从而读出DNA序列。IonTorrent测序平台原理不同于其他第二代测序技术，不属于核酸标记、荧光检测的生化技术，相比其他测序技术，更简单、经济，具有强大的扩展性。在上千万个纳米孔中，同时对上百万的序列进行大规模平行测序，此项技术的产生摆脱了一代测序技术效率低，费时费力的特点。因此，IontorrentPGM测序技术可以对PCR产物进行直接测序，而不需要片段化处理，而且采用标签技术，不需要对每个样本单独建库，可以显著提高检测通量，降低单个样品的检测成本。目前还未有将多重PCR技术和IontorrentPGM测序技术结合，并将其应用于F8基因检测的研究。
发明内容
本发明的目的是为了克服以上不足，将多重PCR技术和IontorrentPGM测序技术结合，并将其应用于F8基因检测。本发明通过设计了一组多重的引物，结合多重PCR技术，实现了对F8基因26个外显子编码区的同步扩增富集，大大简化了实验操作；再结合标签技术，使多个样本混合成一个文库通过IonTorrentPGM测序文库构建环节同时处理，大大简化了实验操作，最终每个样本的检测结果可以通过其独特的标签序列找回，实现多样本平行测序，提高了检测效率，降低了检测成本。而在本发明的优化PCR引物设计，采用65个PCR反应可以在单管中同步扩增获得F8基因全部外显子序列及侧翼内含子序列，与其它目标区域捕获技术(如芯片捕获技术)相比，该方法操作更为简单，成本较低，而且结合IonTorrent半导体测序技术后更为节约了检测时间和检测成本，弥补了已有二代高通量测序方法工作时间过长的缺陷
本发明提供的技术方案为：
用于多重PCR特异性扩增检测F8基因突变的引物组，所述PCR引物共65对，分别如下：
用于扩增F8基因外显子1和内含子1的引物，其正向引物如SEQIDNO:1所示，反向引物如SEQIDNO:2所示；
用于扩增F8基因内含子1到外显子2的引物，其正向引物如SEQIDNO:3所示，反向引物如SEQIDNO:4所示；
用于扩增F8基因外显子2到内含子2的引物，其正向引物如SEQIDNO:5所示，反向引物如SEQIDNO:6所示；
用于扩增F8基因内含子2到内含子3的引物，其正向引物如SEQIDNO:7所示，反向引物如SEQIDNO:8所示；
用于扩增F8基因内含子3到外显子4的引物，其正向引物如SEQIDNO:9所示，反向引物如SEQIDNO:10所示；
用于扩增F8基因外显子4到内含子4的引物，其正向引物如SEQIDNO:11所示，反向引物如SEQIDNO:12所示；
用于扩增F8基因内含子4到内含子5的引物，其正向引物如SEQIDNO:13所示，反向引物如SEQIDNO:14所示；
用于扩增F8基因内含子5到内含子6的引物，其正向引物如SEQIDNO:15所示，反向引物如SEQIDNO:16所示；
用于扩增F8基因内含子6到外显子7的引物，其正向引物如SEQIDNO:17所示，反向引物如SEQIDNO:18所示。
用于扩增F8基因外显子7到内含子7的引物，其正向引物如SEQIDNO:19所示，反向引物如SEQIDNO:20所示。
用于扩增F8基因内含子7到外显子8的引物，其正向引物如SEQIDNO:21所示，反向引物如SEQIDNO:22所示。
用于扩增F8基因外显子8到内含子8的引物，其正向引物如SEQIDNO:23所示，反向引物如SEQIDNO:24所示。
用于扩增F8基因内含子8到外显子9的引物，其正向引物如SEQIDNO:25所示，反向引物如SEQIDNO:26所示。
用于扩增F8基因外显子9到内含子9的引物，其正向引物如SEQIDNO:27所示，反向引物如SEQIDNO:28所示。
用于扩增F8基因内含子9到外显子10的引物，其正向引物如SEQIDNO:29所示，反向引物如SEQIDNO:30所示。
用于扩增F8基因内含子10到外显子11的引物，其正向引物如SEQIDNO:31所示，反向引物如SEQIDNO:32所示。
用于扩增F8基因外显子11到内含子11的引物，其正向引物如SEQIDNO:33所示，反向引物如SEQIDNO:34所示。
用于扩增F8基因内含子11到内含子12的引物，其正向引物如SEQIDNO:35所示，反向引物如SEQIDNO:36所示。
用于扩增F8基因外显子12到内含子12的引物，其正向引物如SEQIDNO:37所示，反向引物如SEQIDNO:38所示。
用于扩增F8基因内含子12到外显子13的引物，其正向引物如SEQIDNO:39所示，反向引物如SEQIDNO:40所示。
用于扩增F8基因外显子13到内含子13的引物，其正向引物如SEQIDNO:41所示，反向引物如SEQIDNO:42所示。
用于扩增F8基因内含子13到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:43所示，反向引物如SEQIDNO:44所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:45所示，反向引物如SEQIDNO:46所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:47所示，反向引物如SEQIDNO:48所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:49所示，反向引物如SEQIDNO:50所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:51所示，反向引物如SEQIDNO:52所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:53所示，反向引物如SEQIDNO:54所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:55所示，反向引物如SEQIDNO:56所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:57所示，反向引物如SEQIDNO:58所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:59所示，反向引物如SEQIDNO:60所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:61所示，反向引物如SEQIDNO:62所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:63所示，反向引物如SEQIDNO:64所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:65所示，反向引物如SEQIDNO:66所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:67所示，反向引物如SEQIDNO:68所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:69所示，反向引物如SEQIDNO:70所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:71所示，反向引物如SEQIDNO:72所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:73所示，反向引物如SEQIDNO:74所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:75所示，反向引物如SEQIDNO:76所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:77所示，反向引物如SEQIDNO:78所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:79所示，反向引物如SEQIDNO:80所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:81所示，反向引物如SEQIDNO:82所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:83所示，反向引物如SEQIDNO:84所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:85所示，反向引物如SEQIDNO:86所示。
用于扩增F8基因外显子14到内含子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:87所示，反向引物如SEQIDNO:88所示。
用于扩增F8基因内含子14到外显子15的引物，其正向引物如SEQIDNO:89所示，反向引物如SEQIDNO:90所示。
用于扩增F8基因外显子15到内含子15的引物，其正向引物如SEQIDNO:91所示，反向引物如SEQIDNO:92所示。
用于扩增F8基因内含子15到外显子16的引物，其正向引物如SEQIDNO:93所示，反向引物如SEQIDNO:94所示。
用于扩增F8基因外显子16到内含子16的引物，其正向引物如SEQIDNO:95所示，反向引物如SEQIDNO:96所示。
用于扩增F8基因内含子16到外显子17的引物，其正向引物如SEQIDNO:97所示，反向引物如SEQIDNO:98所示。
用于扩增F8基因外显子17到内含子17的引物，其正向引物如SEQIDNO:99所示，反向引物如SEQIDNO:100所示。
用于扩增F8基因内含子17到内含子18的引物，其正向引物如SEQIDNO:101所示，反向引物如SEQIDNO:102所示。
用于扩增F8基因内含子18到内含子19的引物，其正向引物如SEQIDNO:103所示，反向引物如SEQIDNO:104所示。
用于扩增F8基因外显子19到内含子19的引物，其正向引物如SEQIDNO:105所示，反向引物如SEQIDNO:106所示。
用于扩增F8基因内含子19到内含子20的引物，其正向引物如SEQIDNO:107所示，反向引物如SEQIDNO:108所示。
用于扩增F8基因内含子20到内含子21的引物，其正向引物如SEQIDNO:109所示，反向引物如SEQIDNO:110所示。
用于扩增F8基因内含子21到外显子22的引物，其正向引物如SEQIDNO:111所示，反向引物如SEQIDNO:112所示。
用于扩增F8基因外显子22到内含子22的引物，其正向引物如SEQIDNO:113所示，反向引物如SEQIDNO:114所示。
用于扩增F8基因内含子22到外显子23的引物，其正向引物如SEQIDNO:115所示，反向引物如SEQIDNO:116所示。
用于扩增F8基因外显子23到内含子23的引物，其正向引物如SEQIDNO:117所示，反向引物如SEQIDNO:118所示。
用于扩增F8基因内含子23到外显子24的引物，其正向引物如SEQIDNO:119所示，反向引物如SEQIDNO:120所示。
用于扩增F8基因外显子24到内含子24的引物，其正向引物如SEQIDNO:121所示，反向引物如SEQIDNO:122所示。
用于扩增F8基因内含子24到内含子25的引物，其正向引物如SEQIDNO:123所示，反向引物如SEQIDNO:124所示。
用于扩增F8基因外显子25到内含子25的引物，其正向引物如SEQIDNO:125所示，反向引物如SEQIDNO:126所示。
用于扩增F8基因内含子25到外显子26的引物，其正向引物如SEQIDNO:127所示，反向引物如SEQIDNO:128所示。
用于扩增F8基因外显子26到外显子26的引物，其正向引物如SEQIDNO:129所示，反向引物如SEQIDNO:130所示。
一种用于多重PCR特异性扩增检测F8基因突变的试剂盒，所述试剂盒包含引物组中的一对或多对引物。
优选的是，所述的用于多重PCR特异性扩增检测F8基因突变的试剂盒，还包括以下一种或多种试剂：
用于从样品提取基因组DNA的试剂；
利用所述引物进行多重PCR反应的试剂；
用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于高通量测序技术中的试剂。
优选的是，在所述的用于多重PCR特异性扩增检测F8基因突变的试剂盒中，所述引物进行多重PCR反应的试剂为DNA聚合酶、缓冲液和dNTP的混合物。
优选的是，所述的用于多重PCR特异性扩增检测F8基因突变的试剂盒，还包括5XIonAmpliSeqTMHiFiMix缓冲液和Nuclease-freeWater。
一种用于体外检测F8基因突变的方法，包括以下步骤：
(1)采集受检者标本，如外周血，提取基因组DNA；
(2)应用基因组DNA作为模板，使用权利要求1的引物组，在适于扩增目的核酸的条件下，采用多重PCR技术对F8基因进行靶向扩增，其中每一对引物由正向引物和反向引物构成并扩增出目的片段；
(3)针对多重PCR产物，采用IonAmpliSeqLibraryKit2.0进行文库构建，对多重PCR扩增产物加上特定序列标签及测序接头；
(4)对已加接头的PCR产物进行纯化，得到1个受检DNA样品(对应1个受检者)的PCR产物文库；
(5)将多个受检者的PCR产物文库进行等量混合直接构建单一文库；
(6)将多个受检者的产物文库进行等量混合，直接在IonOneTouch(LifeTechnologies)上进行乳液PCR，并对模板阳性磁珠颗粒在IonOneTouchES(LifeTechnologies)上进行富集；
(7)在IonTorrentPGM测序仪上进行测序，获得多重PCR产物的序列；
(8)基于标签序列区分不同的基因组DNA样品，采用IonTorrentSuitev3.0软件通过识别序列结果中的标签序列，建立各个标签对应DNA样品测序结果的数据，通过生物信息学分析将单个样品测序获得的DNA序列片段比对到参考F8基因上，进行SNVs和Indels提取，排除多态性变异获得该标本F8基因突变信息。
本发明的有益效果是，本发明首次实现了多重PCR(MultiplePCR)技术和IonTorrentPGM测序技术结合使用，并且首次将技术结合应用于F8基因检测的研究。本发明通过设计了一组多重的引物，结合多重PCR技术，实现了对F8基因26个外显子编码区的同步扩增富集，大大简化了实验操作；再结合标签技术，使多个样本混合成一个文库通过IonTorrentPGM测序文库构建环节同时处理，大大简化了实验操作，最终每个样本的检测结果可以通过其独特的标签序列找回，实现多样本平行测序，提高了检测效率，降低了检测成本。此外，在本发明基于多重PCR技术靶向扩增F8基因方法中，由于F8基因的65个多重PCR扩增片段均为短片段(125bp-225bp)，普通的PCR反应体系和条件很难成功，而在本发明的优化PCR引物设计，采用65个PCR反应可以在单管中同步扩增获得F8基因全部外显子序列及侧翼内含子序列，与其它目标区域捕获技术(如芯片捕获技术)相比，该方法操作更为简单，成本较低，而且结合IonTorrent半导体测序技术后更为节约了检测时间和检测成本，弥补了已有二代高通量测序方法工作时间过长的缺陷，一般从文库制备到测序产出数据仅需2天时间。
附图说明
图1为基因多重PCR(MultiplePCR)的扩增范围示意图。该扩增范围示意图显示65个F8基因扩增片段，PCR产物为一系列片段大小125bp-225bp的短片段。
图2为IonTorrentPGM文库质检图。该图显示了片段大小的分布在125bp-225bp，说明IonTorrentPGM文库质检合格。
图3为F8基因IonTorrentPGM测序的覆盖深度和覆盖率的示意图，图中显示所有外显子平均覆盖深度达到300×，除第10外显子，所有外显子覆盖率为100％。
图4A、图4B、图4C、图4D、图4E、图4F、图4G、图4H均为IonTorrent测序结果中F8突变检测为阳性结果的IGV视图。图4A为IVS5+5G>A突变的IGV视图；图4B为c.2393_2394insT突变的IGV视图；图4C为c.1331A>C突变的IGV视图；图4D为c.6544C>T突变的IGV视图；图4E为c.6506G>A突变的IGV视图；图4F为c.43C>T突变的IGV视图；图4G为c.6320delG突变的IGV视图；图4H为c.1648C>T突变的IGV视图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。在本发明的实施例中，采用了多重PCR靶向扩增联合IonTorrent半导体测序的检测方法，该方法以基因组DNA为模板，采用多重PCR技术靶向扩增F8基因目标区域，PCR产物直接建单一IonTorrent文库，将多个样品的文库进行混合，进行IonTorrentPGM测序，对测序结果进行生物信息学分析，获得F8基因突变信息。
一种用于多重PCR特异性扩增检测F8基因突变的引物组，该组PCR引物共65对。65对引物分别如下：用于扩增F8基因外显子1和内含子1的引物，其正向引物如SEQIDNO:1所示，反向引物如SEQIDNO:2所示；用于扩增F8基因内含子1到外显子2的引物，其正向引物如SEQIDNO:3所示，反向引物如SEQIDNO:4所示；用于扩增F8基因外显子2到内含子2的引物，其正向引物如SEQIDNO:5所示，反向引物如SEQIDNO:6所示；用于扩增F8基因内含子2到内含子3的引物，其正向引物如SEQIDNO:7所示，反向引物如SEQIDNO:8所示；用于扩增F8基因内含子3到外显子4的引物，其正向引物如SEQIDNO:9所示，反向引物如SEQIDNO:10所示；用于扩增F8基因外显子4到内含子4的引物，其正向引物如SEQIDNO:11所示，反向引物如SEQIDNO:12所示；用于扩增F8基因内含子4到内含子5的引物，其正向引物如SEQIDNO:13所示，反向引物如SEQIDNO:14所示；用于扩增F8基因内含子5到内含子6的引物，其正向引物如SEQIDNO:15所示，反向引物如SEQIDNO:16所示；用于扩增F8基因内含子6到外显子7的引物，其正向引物如SEQIDNO:17所示，反向引物如SEQIDNO:18所示；用于扩增F8基因外显子7到内含子7的引物，其正向引物如SEQIDNO:19所示，反向引物如SEQIDNO:20所示；用于扩增F8基因内含子7到外显子8的引物，其正向引物如SEQIDNO:21所示，反向引物如SEQIDNO:22所示；用于扩增F8基因外显子8到内含子8的引物，其正向引物如SEQIDNO:23所示，反向引物如SEQIDNO:24所示；用于扩增F8基因内含子8到外显子9的引物，其正向引物如SEQIDNO:25所示，反向引物如SEQIDNO:26所示；用于扩增F8基因外显子9到内含子9的引物，其正向引物如SEQIDNO:27所示，反向引物如SEQIDNO:28所示；用于扩增F8基因内含子9到外显子10的引物，其正向引物如SEQIDNO:29所示，反向引物如SEQIDNO:30所示；用于扩增F8基因内含子10到外显子11的引物，其正向引物如SEQIDNO:31所示，反向引物如SEQIDNO:32所示；用于扩增F8基因外显子11到内含子11的引物，其正向引物如SEQIDNO:33所示，反向引物如SEQIDNO:34所示；用于扩增F8基因内含子11到内含子12的引物，其正向引物如SEQIDNO:35所示，反向引物如SEQIDNO:36所示；用于扩增F8基因外显子12到内含子12的引物，其正向引物如SEQIDNO:37所示，反向引物如SEQIDNO:38所示；用于扩增F8基因内含子12到外显子13的引物，其正向引物如SEQIDNO:39所示，反向引物如SEQIDNO:40所示；用于扩增F8基因外显子13到内含子13的引物，其正向引物如SEQIDNO:41所示，反向引物如SEQIDNO:42所示；用于扩增F8基因内含子13到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:43所示，反向引物如SEQIDNO:44所示；用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:45所示，反向引物如SEQIDNO:46所示；用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:47所示，反向引物如SEQIDNO:48所示；用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:49所示，反向引物如SEQIDNO:50所示；用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:51所示，反向引物如SEQIDNO:52所示；用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:53所示，反向引物如SEQIDNO:54所示；用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:55所示，反向引物如SEQIDNO:56所示；用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:57所示，反向引物如SEQIDNO:58所示；用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:59所示，反向引物如SEQIDNO:60所示；用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:61所示，反向引物如SEQIDNO:62所示；用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:63所示，反向引物如SEQIDNO:64所示；用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:65所示，反向引物如SEQIDNO:66所示；用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:67所示，反向引物如SEQIDNO:68所示；用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:69所示，反向引物如SEQIDNO:70所示；用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:71所示，反向引物如SEQIDNO:72所示；用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:73所示，反向引物如SEQIDNO:74所示；用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:75所示，反向引物如SEQIDNO:76所示；用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:77所示，反向引物如SEQIDNO:78所示；用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:79所示，反向引物如SEQIDNO:80所示；用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:81所示，反向引物如SEQIDNO:82所示；用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:83所示，反向引物如SEQIDNO:84所示；用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:85所示，反向引物如SEQIDNO:86所示；用于扩增F8基因外显子14到内含子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:87所示，反向引物如SEQIDNO:88所示；用于扩增F8基因内含子14到外显子15的引物，其正向引物如SEQIDNO:89所示，反向引物如SEQIDNO:90所示；用于扩增F8基因外显子15到内含子15的引物，其正向引物如SEQIDNO:91所示，反向引物如SEQIDNO:92所示；用于扩增F8基因内含子15到外显子16的引物，其正向引物如SEQIDNO:93所示，反向引物如SEQIDNO:94所示；用于扩增F8基因外显子16到内含子16的引物，其正向引物如SEQIDNO:95所示，反向引物如SEQIDNO:96所示；用于扩增F8基因内含子16到外显子17的引物，其正向引物如SEQIDNO:97所示，反向引物如SEQIDNO:98所示；用于扩增F8基因外显子17到内含子17的引物，其正向引物如SEQIDNO:99所示，反向引物如SEQIDNO:100所示；用于扩增F8基因内含子17到内含子18的引物，其正向引物如SEQIDNO:101所示，反向引物如SEQIDNO:102所示；用于扩增F8基因内含子18到内含子19的引物，其正向引物如SEQIDNO:103所示，反向引物如SEQIDNO:104所示；用于扩增F8基因外显子19到内含子19的引物，其正向引物如SEQIDNO:105所示，反向引物如SEQIDNO:106所示；用于扩增F8基因内含子19到内含子20的引物，其正向引物如SEQIDNO:107所示，反向引物如SEQIDNO:108所示；用于扩增F8基因内含子20到内含子21的引物，其正向引物如SEQIDNO:109所示，反向引物如SEQIDNO:110所示；用于扩增F8基因内含子21到外显子22的引物，其正向引物如SEQIDNO:111所示，反向引物如SEQIDNO:112所示；用于扩增F8基因外显子22到内含子22的引物，其正向引物如SEQIDNO:113所示，反向引物如SEQIDNO:114所示；用于扩增F8基因内含子22到外显子23的引物，其正向引物如SEQIDNO:115所示，反向引物如SEQIDNO:116所示；用于扩增F8基因外显子23到内含子23的引物，其正向引物如SEQIDNO:117所示，反向引物如SEQIDNO:118所示；用于扩增F8基因内含子23到外显子24的引物，其正向引物如SEQIDNO:119所示，反向引物如SEQIDNO:120所示；用于扩增F8基因外显子24到内含子24的引物，其正向引物如SEQIDNO:121所示，反向引物如SEQIDNO:122所示；用于扩增F8基因内含子24到内含子25的引物，其正向引物如SEQIDNO:123所示，反向引物如SEQIDNO:124所示；用于扩增F8基因外显子25到内含子25的引物，其正向引物如SEQIDNO:125所示，反向引物如SEQIDNO:126所示；用于扩增F8基因内含子25到外显子26的引物，其正向引物如SEQIDNO:127所示，反向引物如SEQIDNO:128所示；用于扩增F8基因外显子26到外显子26的引物，其正向引物如SEQIDNO:129所示，反向引物如SEQIDNO:130所示。优选的PCR引物如表1所示，扩增片段1大小为225bp，扩增片段2大小为163bp，扩增片段3大小为211bp，扩增片段4大小为222bp，扩增片段5大小为220bp，扩增片段6大小为197bp，扩增片段7大小为190bp，扩增片段8大小为224bp，扩增片段9大小为222bp，扩增片段10大小为224bp，扩增片段11大小为223bp，扩增片段12大小为220bp，扩增片段13大小为218bp，扩增片段14大小为167bp，扩增片段15大小为146bp，扩增片段16大小为208bp，扩增片段17大小为159bp，扩增片段18大小为225bp，扩增片段19大小为184bp，扩增片段20大小为218bp，扩增片段21大小为225bp，扩增片段22大小为214bp，扩增片段23大小为211bp，扩增片段24大小为220bp，扩增片段25大小为144bp，扩增片段26大小为166bp，扩增片段27大小为143bp，扩增片段28大小为177bp，扩增片段29大小为196bp，扩增片段30大小为151bp，扩增片段31大小为225bp，扩增片段32大小为222bp，扩增片段33大小为223bp，扩增片段34大小为220bp，扩增片段35大小为197bp，扩增片段36大小为224bp，扩增片段37大小为164bp，扩增片段38大小为215bp，扩增片段39大小为225bp，扩增片段40大小为181bp，扩增片段41大小为164bp，扩增片段42大小为152bp，扩增片段43大小为213bp，扩增片段44大小为138bp，扩增片段45大小为190bp，扩增片段46大小为163bp，扩增片段47大小为156bp，扩增片段48大小为223bp，扩增片段49大小为201bp，扩增片段50大小为225bp，扩增片段51大小为224bp，扩增片段52大小为210bp，扩增片段53大小为214bp，扩增片段54大小为217bp，扩增片段55大小为220bp，扩增片段56大小为221bp，扩增片段57大小为196bp，扩增片段58大小为208bp，扩增片段59大小为126bp，扩增片段60大小为181bp，扩增片段61大小为209bp，扩增片段62大小为213bp，扩增片段63大小为217bp，扩增片段64大小为125bp，扩增片段65大小为221bp，65个片段总共扩增12836bp的基因序列。一种用于多重PCR特异性扩增检测F8基因突变的试剂盒，包含上述的引物组中的一对或多对引物。该试剂盒中还可以包含以下一种或多种试剂：用于从样品提取基因组DNA的试剂；利用引物进行多重PCR反应的试剂；用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于高通量测序技术中的试剂；利用引物进行多重PCR反应的试剂为DNA聚合酶、缓冲液和dNTP混合物。试剂盒还包括5XIonAmpliSeqTMHiFiMix缓冲液和Nuclease-freeWater。在总体积为20μl的PCR反应体系中含有下述组分：多重PCR引物混合液10μl，每种引物的浓度为0.1μmol/L；5×IonAmpliSeqTMHiFiMix缓冲液4μl，Nuclease-freeWater5μl，10μg/μlDNA模板1μl。本发明的多重PCR引物组或试剂盒用于检测F8基因突变。
一种用于体外检测F8基因突变的方法，包括以下步骤：(1)采集受检者标本，如外周血，提取基因组DNA；(2)应用基因组DNA作为模板，使用本发明的由65对引物组成的引物组，在适于扩增目的核酸的条件下，采用多重PCR技术对F8进行靶向扩增，其中每一对引物由正向引物和反向引物构成；(3)对扩增的PCR产物，采用IonAmpliSeqLibraryKit2.0进行文库构建，对PCR扩增产物加上序列标签及测序接头，不同样品的PCR扩增产物所用序列标签彼此不同，以区分不同DNA样品的扩增产物；(4)对已加接头的PCR产物进行纯化，得到1个受检者的PCR产物文库；(5)将多个受检者的PCR产物文库进行等量混合直接构建单一文库；(6)采用IonPGMXpressTemplate200Kit在IonOneTouch(LifeTechnologies)上进行乳液PCR，对模板阳性磁珠颗粒(IonSphereParticles，ISPs)在IonOneTouchES(LifeTechnologies)上进行富集；(7)采用IonPGMSequencing200Kit及IonTorrent316芯片在IonTorrentPGM测序仪上进行测序，获得多重PCR产物的序列；(8)基于标签序列区分不同的基因组DNA样品，采用IonTorrentSuitev3.0软件通过识别序列结果中的标签序列，建立各个标签对应DNA样品测序结果的数据，通过生物信息学分析将单个样品测序获得的DNA序列片段比对到参考F8基因上，进行SNVs和Indels提取，经dbSNP数据库过滤后，检索千人基因组数据库，获得千人基因组最小等位基因频率，排除多态性变异，获得该标本F8基因突变信息。
实施例
基因组DNA提取：
采集受检者外周血2ml，置于EDTA抗凝管中。取EDTA抗凝外周血标本0.2ml，按全血DNA提取试剂盒说明书提取DNA。DNA浓度及纯度用Qubit2.0进行分析，提取的基因组DNA准备做下一步PCR模板用。本次研究共对8个基因DNA样品进行检测，均存在已知致病突变位点。
多重PCR扩增：
根据F8基因序列，设计合成65对F8基因特异性引物，采用IonAmpliSeqHiFiMasterMix进行多重PCR，共扩增65个短片段序列，分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64和65，引物序列和扩增产物大小如表1所示。采用IonAmpliSeqHiFiMasterMix，设定反应条件在Veriti96-wellThermalCyclerPCR仪上进行多重PCR。PCR反应总体积为20μl，包括每种PCR引物为0.1μmol/L的混合液，10μL；5XIonAmpliSeqTMHiFiMix，4μL；Nuclease-freeWater，5μL；10ng/μLgDNA模板1μL。PCR循环参数：99℃酶激活2min，99℃变性15sec，60℃退火及延伸4min，共18个循环，最后4℃保持。PCR反应在Veriti96-wellThermalCyclerPCR仪(美国ABI公司)上完成。
表1，扩增F8基因的多重PCR引物
注：F为正向引物(上游引物)，R为反向引物(下游引物)。表中的PCR引物序列依次为：SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、SEQIDNO:55、SEQIDNO:56、SEQIDNO:57、SEQIDNO:58、SEQIDNO:59、SEQIDNO:60、SEQIDNO:61、SEQIDNO:62、SEQIDNO:63、SEQIDNO:64、SEQIDNO:65、SEQIDNO:66、SEQIDNO:67、SEQIDNO:68、SEQIDNO:69、SEQIDNO:70、SEQIDNO:71、SEQIDNO:72、SEQIDNO:73、SEQIDNO:74、SEQIDNO:75、SEQIDNO:76、SEQIDNO:77、SEQIDNO:78、SEQIDNO:79、SEQIDNO:80、SEQIDNO:81、SEQIDNO:82、SEQIDNO:83、SEQIDNO:84、SEQIDNO:85、SEQIDNO:86、SEQIDNO:87、SEQIDNO:88、SEQIDNO:89、SEQIDNO:90、SEQIDNO:91、SEQIDNO:92、SEQIDNO:93、SEQIDNO:94、SEQIDNO:95、SEQIDNO:96、SEQIDNO:97、SEQIDNO:98、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:101、SEQIDNO:102、SEQIDNO:103、SEQIDNO:104、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107、SEQIDNO:108、SEQIDNO:109、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111、SEQIDNO:112、SEQIDNO:113、SEQIDNO:114、SEQIDNO:115、SEQIDNO:116、SEQIDNO:117、SEQIDNO:118、SEQIDNO:119、SEQIDNO:120、SEQIDNO:121、SEQIDNO:122、SEQIDNO:123、SEQIDNO:124、SEQIDNO:125、SEQIDNO:126、SEQIDNO:127、SEQIDNO:128、SEQIDNO:129、SEQIDNO:130。
文库构建：
文库构建采用LifetechnologyIonAmpliSeqTMLibraryKit2.0通用建库试剂进行制备(美国LifeTechnologies公司)，用IonXpressBarcodeAdapters试剂(美国LifeTechnologies公司)对多重PCR产物加上文库接头(BarcodeAdapter)，具体操作流程详见试剂说明书。运用BioAnalyzer进行定性和定量分析，图2为文库质检图，显示片段大小的分布，Iontorrent测序文库质检合格。
IonTorrentPGM测序
乳液PCR和ISPs富集：采用IonPGMXpressTemplate200Kit在IonOneTouch(LifeTechnologies)上进行乳液PCR，对模板阳性磁珠颗粒(IonSphereParticles，ISPs)在IonOneTouchES(LifeTechnologies)上进行富集。将已上样的IonTorrent316芯片转移到IonTorrentPGM测序仪的芯片槽中，采用IonPGMTMSequencing200Kitv2试剂盒，按照IonTorrentPGM测序仪说明书进行测序操作，共500次核酸流动注射(flows)。
结果分析：
产出的测序结果是一系列DNA读序(reads)，采用IonTorrentSuitev3.0软件通过识别序列结果中的标签序列，建立各个标签对应DNA样品测序结果的数据，通过生物信息学分析(Burrows-WheelerAligner，BWA)将单个样品测序获得的DNA序列片段读序比对到参考F8基因上，进行SNVs和Indels提取，经dbSNP数据库过滤后，检索千人基因组数据库，获得千人基因组最小等位基因频率，排除多态性变异，获得该标本F8基因突变信息。对比对BAM文件应用IntegrativeGenomicsViewer(IGV)软件进行比对读序的可视化分析。图3显示F8基因IonTorrentPGM测序的覆盖深度和覆盖率，显示所有外显子平均覆盖深度达到300×，除第10外显子外所有外显子覆盖率为100％。
通过本发明检测了8例血友病A患者，发现了8例F8突变检测阳性患者，图4显示这8例F8突变检测阳性结果，A为IVS5+5G>A突变；B为c.2393_2394insT突变；C为c.1331A>C突变；D为c.6544C>T突变；E为c.6506G>A突变；F为c.43C>T突变；G为c.6320delG突变；H为c.1648C>T突变。得到的F8基因突变结果与Sanger测序的结果是一致的，说明本发明的方法是可行的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
[0001]
序列表
<110>许争峰，马定远，刘刚
<120>检测F8基因突变的扩增引物、试剂盒及方法
<160>130
<210>1
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
ccttttgcttctccagttgaacatt25
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
cacaatcctggccccgat18
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ctgctttttgaagtgtccaccaaa24
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
gccttggcttagcgatgttga21
<210>5
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
tgtttgtagaattcacggatcaccttt27
<210>6
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
atgcagtcagtgtatttccctataggta28
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
ccaagtaacctttggcggaca21
<210>8
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
aagcacacacatctcactgttct23
<210>9
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
tgagtgtacagtggatatagaaaggacaa29
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
gtcttttaccaggtccacatgaga24
<210>11
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
cactgtgccttacctactcatatctt26
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
cctctttcaggtgaaggaacaca23
<210>13
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
tctcctcctagtgacaatttcctacaat28
<210>14
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
gcagaggatttctttcaggaatcca25
<210>15
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
cggtcattcatgagacacatgct23
<210>16
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
ggtgctgaatttggaagaccct22
<210>17
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
acttcatagccataggtgtcttattcct28
<210>18
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
ctgtccaaggtccatcaagagt22
<210>19
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
gccaataactttccttactgctcaaac27
<210>20
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
tcttggctgaggtctaatacagtaact27
<210>21
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
tgtttggtttgtctgactccagatg25
<210>22
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
aatgtacccaagttttaggatgcttctt28
<210>23
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
ctttatccaaattcgctcagttgcc25
<210>24
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
ctgtacctaaccttaaacatggcttca27
<210>25
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
cctacctagaatttttcttcccaacct27
<210>26
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
gtgtgtctccaacttccccataa23
<210>27
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>27
gaatcaggaatcttgggacctttact26
<210>28
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>28
ttttaaaagatcatgtccattggagaca28
<210>29
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
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acagttttcttgttgatcctagtcgttt28
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>30
ctccttgaatacaaaggacggacat25
<210>31
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<400>31
tggcttgttgtactctaattgagctattt29
<210>32
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>32
gtcctgaagctagatctctctccat25
<210>33
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
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gacccgctattactctagtttcgttaat28
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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gggacatacactgagaatgaaacc24
<210>35
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
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aacatcagtagcatttctttacccctt27
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>36
actggacttaagtgctgctttactc25
<210>37
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
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gcctccaacatcatgcacagt21
<210>38
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
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tgggttatatgatcacgtgtgtttgag27
<210>39
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>39
cctgggaataagataatgggcataacat28
<210>40
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>40
aggaagtcagtctgtgctcca21
<210>41
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>41
gtggcatactggtacattctaagcat26
<210>42
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>42
caaaagagcatacgaatggctagtg25
<210>43
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>43
ttatctgggaatgggagagaacct24
<210>44
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>44
gctgaaatatcttcataactgtcctcgt28
<210>45
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>45
agttgtgacaagaacactggtgattatt28
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>46
gcataggtgttctgtgtgcaaac23
<210>47
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>47
aaaatgacatagagaagactgacccttg28
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<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
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tgtgtcatttcagacaggctgtt23
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<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>49
catcacctggagcaatagacagtaat26
<210>50
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>50
ctgcagttgtccccagtttct21
<210>51
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
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tgagtcaggcctccaattaagattaaatg29
<210>52
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>52
gggtcctaaggaacttgtattatcagta28
<210>53
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>53
ccatcagacaatttggcagcag22
<210>54
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>54
ctcagaggtccaccagactca21
<210>55
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>55
tggcaaaaagtcatctccccttac24
<210>56
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>56
ggtccatgagctcttttccctttaa25
<210>57
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>57
tcgtcaacagagagtggtaggttat25
<210>58
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>58
gccagactgatggactattctcaattaa28
<210>59
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>59
actcacattgatggcccatcat22
<210>60
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<212>DNA
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gatttagcctcaaagctgtagcatttt27
<210>61
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>61
cacctttgattcatgacagaatgctt26
<210>62
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>62
gagagttctttccatgagtcctttgt26
<210>63
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>63
gccagaatcagcaaggtggat21
<210>64
<211>26
<212>DNA
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agaaataggtttctgctgcttggaaa26
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>65
gacgtaggactcaaagagatggtt24
<210>66
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>66
gcctagtgctcagtaagaaaaggt24
<210>67
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
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tgactggcactaagaatttcatgaaga27
<210>68
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>68
ttctctacaatttgcttggtttgatttcc29
<210>69
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>69
gaggaagaaaacttggaaggcttg24
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<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
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gttgaggtgtcatccacaattatcctt27
<210>71
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>71
tcccactagaagaaacagaacttgaaaa28
<210>72
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>72
tgatacctttgcaatgggtaatggag26
<210>73
<211>27
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<213>人工序列
<400>73
gtcatagcatccctcaagcaaatagat27
<210>74
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>74
gctttcttggaccccagaatctttc25
<210>75
<211>28
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<213>人工序列
<400>75
ctcatcttccagcagcatcttatagaaa28
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<213>人工序列
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caagtctggtttcgggagaaca22
<210>77
<211>28
<212>DNA
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cagtcacatacaagaaagttgagaacac28
<210>78
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<212>DNA
<213>人工序列
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cttttccaggtctgtttgcttcatt25
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<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>79
aacagagggagcgattaagtgg22
<210>80
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>80
ttctggtgacttctcttgggatt23
<210>81
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>81
ggtactcagataccaaaagaagagtgga28
<210>82
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>82
caggtgacttctatttcgggctta24
<210>83
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>83
caatagcagcaataaatgagggacaaaa28
<210>84
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>84
ttgatctgactgaagagtagtacgagt27
<210>85
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>85
tgaaacgccatcaacgggaaata23
<210>86
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>86
agctactcatcccataatcccagag25
<210>87
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>87
actattttattgctgcagtggagagg26
<210>88
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>88
tgtcatcatctggtaaagtcaaatgtca28
<210>89
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>89
ggcatttctacccacttggtacat24
<210>90
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>90
ctcttatatatggccccaggagtc24
<210>91
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>91
ccttataccgtggagaactaaatgaaca28
<210>92
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<400>92
ccaaaagtgggaatacattatagtcagca29
<210>93
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>93
gggatgtaaaccctaaggaccttaaga27
<210>94
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>94
cttgcctctgatcttcctcataagaa26
<210>95
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>95
cgtccctattccttctattctagcctta28
<210>96
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>96
caaaaagtggtcagcacaatagaca25
<210>97
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>97
ataggattgatgtcttccctccct24
<210>98
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>98
gagccctgcagtttctttccata23
<210>99
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>99
accaaaagctggtacttcactgaaaa26
<210>100
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>100
ggattccactcccacagatatactct26
<210>101
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>101
tctctgtgtccttctccagca21
<210>102
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>102
aagagcacaaacaagctcatacct24
<210>103
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>103
gcataaaccaatgtatctcatgctcatt28
<210>104
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>104
ctgcccacattgctactcact21
<210>105
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>105
cacactttttctggtgtacagcaat25
<210>106
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>106
caaagcttcaagtatatctgccctact27
<210>107
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>107
atttgagaagctgaattttgtgcactt27
<210>108
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>108
ggattcattatctgagattctccaccag28
<210>109
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>109
tgtctaggactaacccagctga22
<210>110
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>110
atcctttgagcttgcaagaggaa23
<210>111
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>111
cacctgtagcaatgtagattcttcctaa28
<210>112
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>112
cacttcttcccatcaagactatacatga28
<210>113
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>113
ccagcctctacatctctcagtttatca27
<210>114
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<400>114
ttggaattaagtttgtggaagctaagagt29
<210>115
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<400>115
cgcacaaagcaaattagaaggaagatatg29
<210>116
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>116
agagtgctgcgaatgctataatgag25
<210>117
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>117
cgatacatccgtttgcacccaa22
<210>118
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>118
ctacccatggttgagggaagaa22
<210>119
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>119
agcatgtccttgtgataaccttctttt27
<210>120
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>120
ccaggcattactcctcccttg21
<210>121
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>121
cttcaaaagctcgacttcacctc23
<210>122
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>122
ctgtgtggttgtctgcccata21
<210>123
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>123
ggctactagtccaactctattgcc24
<210>124
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>124
agcttacctttactttgccattctga26
<210>125
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>125
ggccatcagtggactctcttttt23
<210>126
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>126
cttaaagtcactgtgttctctcagaat27
<210>127
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>127
cctgtcagacaaccaataaatgctatct28
<210>128
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>128
ggtgaattcgaaggtagcgagt22
<210>129
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>129
actctctagacccaccgttactg23
<210>130
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<400>130
ctgctaggatttagcacaaaggtaga26

Claims (6)

1.用于多重PCR特异性扩增检测F8基因突变的引物组，其特征在于，所述PCR引物共65对，分别如下：
用于扩增F8基因外显子1和内含子1的引物，其正向引物如SEQIDNO:1所示，反向引物如SEQIDNO:2所示；
用于扩增F8基因内含子1到外显子2的引物，其正向引物如SEQIDNO:3所示，反向引物如SEQIDNO:4所示；
用于扩增F8基因外显子2到内含子2的引物，其正向引物如SEQIDNO:5所示，反向引物如SEQIDNO:6所示；
用于扩增F8基因内含子2到内含子3的引物，其正向引物如SEQIDNO:7所示，反向引物如SEQIDNO:8所示；
用于扩增F8基因内含子3到外显子4的引物，其正向引物如SEQIDNO:9所示，反向引物如SEQIDNO:10所示；
用于扩增F8基因外显子4到内含子4的引物，其正向引物如SEQIDNO:11所示，反向引物如SEQIDNO:12所示；
用于扩增F8基因内含子4到内含子5的引物，其正向引物如SEQIDNO:13所示，反向引物如SEQIDNO:14所示；
用于扩增F8基因内含子5到内含子6的引物，其正向引物如SEQIDNO:15所示，反向引物如SEQIDNO:16所示；
用于扩增F8基因内含子6到外显子7的引物，其正向引物如SEQIDNO:17所示，反向引物如SEQIDNO:18所示。
用于扩增F8基因外显子7到内含子7的引物，其正向引物如SEQIDNO:19所示，反向引物如SEQIDNO:20所示。
用于扩增F8基因内含子7到外显子8的引物，其正向引物如SEQIDNO:21所示，反向引物如SEQIDNO:22所示。
用于扩增F8基因外显子8到内含子8的引物，其正向引物如SEQIDNO:23所示，反向引物如SEQIDNO:24所示。
用于扩增F8基因内含子8到外显子9的引物，其正向引物如SEQIDNO:25所示，反向引物如SEQIDNO:26所示。
用于扩增F8基因外显子9到内含子9的引物，其正向引物如SEQIDNO:27所示，反向引物如SEQIDNO:28所示。
用于扩增F8基因内含子9到外显子10的引物，其正向引物如SEQIDNO:29所示，反向引物如SEQIDNO:30所示。
用于扩增F8基因内含子10到外显子11的引物，其正向引物如SEQIDNO:31所示，反向引物如SEQIDNO:32所示。
用于扩增F8基因外显子11到内含子11的引物，其正向引物如SEQIDNO:33所示，反向引物如SEQIDNO:34所示。
用于扩增F8基因内含子11到内含子12的引物，其正向引物如SEQIDNO:35所示，反向引物如SEQIDNO:36所示。
用于扩增F8基因外显子12到内含子12的引物，其正向引物如SEQIDNO:37所示，反向引物如SEQIDNO:38所示。
用于扩增F8基因内含子12到外显子13的引物，其正向引物如SEQIDNO:39所示，反向引物如SEQIDNO:40所示。
用于扩增F8基因外显子13到内含子13的引物，其正向引物如SEQIDNO:41所示，反向引物如SEQIDNO:42所示。
用于扩增F8基因内含子13到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:43所示，反向引物如SEQIDNO:44所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:45所示，反向引物如SEQIDNO:46所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:47所示，反向引物如SEQIDNO:48所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:49所示，反向引物如SEQIDNO:50所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:51所示，反向引物如SEQIDNO:52所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:53所示，反向引物如SEQIDNO:54所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:55所示，反向引物如SEQIDNO:56所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:57所示，反向引物如SEQIDNO:58所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:59所示，反向引物如SEQIDNO:60所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:61所示，反向引物如SEQIDNO:62所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:63所示，反向引物如SEQIDNO:64所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:65所示，反向引物如SEQIDNO:66所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:67所示，反向引物如SEQIDNO:68所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:69所示，反向引物如SEQIDNO:70所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:71所示，反向引物如SEQIDNO:72所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:73所示，反向引物如SEQIDNO:74所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:75所示，反向引物如SEQIDNO:76所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:77所示，反向引物如SEQIDNO:78所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:79所示，反向引物如SEQIDNO:80所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:81所示，反向引物如SEQIDNO:82所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:83所示，反向引物如SEQIDNO:84所示。
用于扩增F8基因外显子14到外显子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:85所示，反向引物如SEQIDNO:86所示。
用于扩增F8基因外显子14到内含子14的引物，其正向引物如SEQIDNO:87所示，反向引物如SEQIDNO:88所示。
用于扩增F8基因内含子14到外显子15的引物，其正向引物如SEQIDNO:89所示，反向引物如SEQIDNO:90所示。
用于扩增F8基因外显子15到内含子15的引物，其正向引物如SEQIDNO:91所示，反向引物如SEQIDNO:92所示。
用于扩增F8基因内含子15到外显子16的引物，其正向引物如SEQIDNO:93所示，反向引物如SEQIDNO:94所示。
用于扩增F8基因外显子16到内含子16的引物，其正向引物如SEQIDNO:95所示，反向引物如SEQIDNO:96所示。
用于扩增F8基因内含子16到外显子17的引物，其正向引物如SEQIDNO:97所示，反向引物如SEQIDNO:98所示。
用于扩增F8基因外显子17到内含子17的引物，其正向引物如SEQIDNO:99所示，反向引物如SEQIDNO:100所示。
用于扩增F8基因内含子17到内含子18的引物，其正向引物如SEQIDNO:101所示，反向引物如SEQIDNO:102所示。
用于扩增F8基因内含子18到内含子19的引物，其正向引物如SEQIDNO:103所示，反向引物如SEQIDNO:104所示。
用于扩增F8基因外显子19到内含子19的引物，其正向引物如SEQIDNO:105所示，反向引物如SEQIDNO:106所示。
用于扩增F8基因内含子19到内含子20的引物，其正向引物如SEQIDNO:107所示，反向引物如SEQIDNO:108所示。
用于扩增F8基因内含子20到内含子21的引物，其正向引物如SEQIDNO:109所示，反向引物如SEQIDNO:110所示。
用于扩增F8基因内含子21到外显子22的引物，其正向引物如SEQIDNO:111所示，反向引物如SEQIDNO:112所示。
用于扩增F8基因外显子22到内含子22的引物，其正向引物如SEQIDNO:113所示，反向引物如SEQIDNO:114所示。
用于扩增F8基因内含子22到外显子23的引物，其正向引物如SEQIDNO:115所示，反向引物如SEQIDNO:116所示。
用于扩增F8基因外显子23到内含子23的引物，其正向引物如SEQIDNO:117所示，反向引物如SEQIDNO:118所示。
用于扩增F8基因内含子23到外显子24的引物，其正向引物如SEQIDNO:119所示，反向引物如SEQIDNO:120所示。
用于扩增F8基因外显子24到内含子24的引物，其正向引物如SEQIDNO:121所示，反向引物如SEQIDNO:122所示。
用于扩增F8基因内含子24到内含子25的引物，其正向引物如SEQIDNO:123所示，反向引物如SEQIDNO:124所示。
用于扩增F8基因外显子25到内含子25的引物，其正向引物如SEQIDNO:125所示，反向引物如SEQIDNO:126所示。
用于扩增F8基因内含子25到外显子26的引物，其正向引物如SEQIDNO:127所示，反向引物如SEQIDNO:128所示。
用于扩增F8基因外显子26到外显子26的引物，其正向引物如SEQIDNO:129所示，反向引物如SEQIDNO:130所示。
2.一种用于多重PCR特异性扩增检测F8基因突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1的引物组中的一对或多对引物。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括以下一种或多种试剂：
用于从样品提取基因组DNA的试剂；
利用所述引物进行多重PCR反应的试剂；
用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于高通量测序技术中的试剂。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物进行多重PCR反应的试剂为DNA聚合酶、缓冲液和dNTP的混合物。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括5XIonAmpliSeqTMHiFiMix缓冲液和Nuclease-freeWater。
6.一种用于体外检测F8基因突变的方法，包括以下步骤：
(1)采集受检者标本，如外周血，提取基因组DNA；
(2)应用基因组DNA作为模板，使用权利要求1的引物组，在适于扩增目的核酸的条件下，采用多重PCR技术对F8基因进行靶向扩增，其中每一对引物由正向引物和反向引物构成并扩增出目的片段；
(3)针对多重PCR产物，采用IonAmpliSeqLibraryKit2.0进行文库构建，对多重PCR扩增产物加上特定序列标签及测序接头；
(4)对已加接头的PCR产物进行纯化，得到1个受检者的受检DNA样品的PCR产物文库；
(5)将多个受检者的PCR产物文库进行等量混合直接构建单一文库；
(6)将多个受检者的产物文库进行等量混合，直接在IonOneTouch上进行乳液PCR，并对模板阳性磁珠颗粒在IonOneTouchES上进行富集；
(7)在IonTorrentPGM测序仪上进行测序，获得多重PCR产物的序列；
(8)基于标签序列区分不同的基因组DNA样品，采用IonTorrentSuitev3.0软件通过识别序列结果中的标签序列，建立各个标签对应DNA样品测序结果的数据，通过生物信息学分析将单个样品测序获得的DNA序列片段比对到参考F8基因上，进行SNVs和Indels提取，排除多态性变异获得该标本F8基因突变信息。
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