CN111979353A - 一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组测序的文库构建方法 - Google Patents

一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组测序的文库构建方法 Download PDF

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CN111979353A CN202010876278.0A CN202010876278A CN111979353A CN 111979353 A CN111979353 A CN 111979353A CN 202010876278 A CN202010876278 A CN 202010876278A CN 111979353 A CN111979353 A CN 111979353A
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Abstract

本发明涉及一种针对新型冠状病毒SARS‑CoV‑2全长基因组测序的文库构建方法，为基因测序建立完整突变信息基因组的文库，满足NGS技术的要求，克服市面上现有的一些新型冠状核酸类测序建库试剂盒的检测的灵敏度低，特异性差，出现假阳性多以及检测的基因区域不全面，不能对病毒的变异情况进行进一步检测分析的问题。

Description

一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组测序的文库构 建方法
技术领域
本发明属于基因测序技术领域，具体涉及一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组测序的文库构建方法。
背景技术
新型冠状病毒(Corona Virus Disease 2019，SARS-CoV-2)仅是含有RNA(Ribonucleic Acid)遗传物质的一类病毒，其特异性RNA序列是识别该病毒的标志物。通过实时荧光定量PCR(RT-PCR)和基因测序等技术进行特异性核酸序列检测，已经作为确诊新型冠状病毒感染的标准。目前，由于基因测序的方法要求条件相对苛刻，过程相对繁琐，检验流程耗时较长，成本相对较高，因此，针对新型冠状病毒的核酸检测主要是基于RT-PCR的方法。
高通量测序技术NGS(next-generation sequencing)又称“下一代”测序技术，是基因测序中应用最为广泛的技术，NGS技术以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志，具有高通量、不依赖于已知核酸序列和具有更高的灵敏度的特点，NGS技术在新型冠状病毒的鉴定、分型、溯源、诊断等方面都有重要作用。在面对RNA病毒变异强、阳性检出率低等问题时，NGS技术无疑会弥补实时荧光定量PCR(RT-PCR)的缺陷，因此，要充分发挥NGS技术在新型冠状病毒核酸检测方面的优越性，就亟需一种高效且精准的文库构建方法，面对有限的样本，能够建立完整突变信息基因组的文库，进而满足NGS技术的要求，得到更加准确、可靠、全面的检测结果。
公开号为CN106283200B的中国专利公开了一种提高扩增子文库数据均一性的文库构建方法，包括确定多个目标区域的扩增子序列并设计引物；将引物划分为多个反应管；计算每条引物的起始用量，保证每个扩增子得到均一化扩增；用每个反应管的引物混合物对目标区域进行第1轮扩增；对所得到的扩增子进行纯化和定量；将所述每个反应管的扩增子进行混合，使得各个扩增子的数目大致相当；以混合后的扩增子混合物为模板进行第2轮PCR反应，将测序接头P5和P7引入到扩增子的两侧；对扩增子文库进行纯化、定量、测序等步骤；该专利的技术方案中样本需要在多个反应管中进行，反应后需要重新定量均一化再进行第二轮反应，大大增加了操作的复杂度，其次，该专利主要是针对基因物的特异性位点进行的文库构建测序，并不能对的全长基因组序列进行检测，不适合对一些发生变异的微生物进行基因测序的一些分析和研究；公开号为CN106498504A的中国专利公开了基于多重PCR的二代测序建库技术，该专利的技术方案中利用两轮多重PCR来建库。针对每个靶标区域或者靶标位点，设计两条特异性引物，上游的引物OP用于第一轮多重PCR，下游的引物IP用于第二轮多重PCR。将第二轮PCR产物纯化后，进行Q-PCR定量，稀释到合适的浓度用于二代测序；该专利的技术方案通过用两个引物池进行PCR，采用特殊接头互补的通用引物，将目标低频突变序列扩增后直接测序，整过过程需要两次加入引物池，增加了多重PCR扩增的交叉污染，导致扩增均一性差，容易造成多重PCR少数反应未进行而产生的假阴性等等，并且该技术并不能对全长基因组序列进行全面检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组测序的文库构建方法，为基因测序建立完整突变信息基因组的文库，满足NGS技术的要求，客户市面上现有的一些新型冠状核酸类测序建库试剂盒的检测的灵敏度低，特异性差，出现假阳性多以及检测的基因区域不全面，不能对病毒的变异情况进行进一步检测分析的问题。
为实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：
本发明提供一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组测序的文库构建方法，具体包括如下步骤：
S1、cDNA合成：提取病毒RNA与随机引物六聚体、病毒RNA以及无核酸酶水配制反应体系后在冰上PCR管中混匀，置于PCR仪中进行首次反应，反应结束后将PCR管取出，加入逆转录酶反应液后混匀再次置于PCR仪中按照设定的温度程序进行二次反应得的逆转录产物；
S2、多重PCR扩增：利用逆转录产物、SARS-CoV-2引物池1、SARS-CoV-2引物池2、2xPCR酶反应液以及无核酸酶水配制反应体系在PCR管中混匀后置于PCR仪中按照温度设定程序进行扩增反应，扩增反应结束后进行多重PCR纯化制得多重PCR纯化产物；所述2xPCR酶反应液中包括改造后的Mutli-PCR酶；
S3、末端修饰：利用经过步骤S2获得的多重PCR纯化产物、末端修复酶缓冲液、末端修复酶以及无核酸酶水配制反应体系在PCR管中混匀，瞬时离心后置于PCR仪中，在20℃下反应20min，接着升温至65℃反应20min，最后降温至4℃后立即进行下一步操作；所述末端修复酶缓冲液和末端修复酶中包括DNA修复酶、修饰酶、聚合酶中至少一种工具酶；
S4、接头连接：按照经过步骤S3反应后获得的DNA、连接酶缓冲液、接头以及连接酶在冰上依次加入到PCR管中配制连接体系，将其置于PCR仪上进行连接反应，反应结束后对反应体系进行多重PCR纯化制得连接纯化产物；所述反应后获得的DNA、连接酶缓冲液、接头以及连接酶的总体积为34～37μL；
S5、PCR扩增：利用经过步骤S4获得的连接纯化后产物、高保真PCR反应液以及带标签N的PCR引物配制反应体系，将其置于PCR仪中按照设定温度程序进行扩增反应，经历多次扩增反应循环后结束反应；所述连接纯化后产物、高保真PCR反应液以及带标签N的PCR引物的总体积为50μL。
进一步地，所述步骤S1中反应体系包括如下组份：1pg～500ng病毒RNA、1μL随机引物六聚体以及至少8μL无核酸酶水。
进一步地，所述步骤S1cDNA的合成中首次反应在65℃条件下反应5min，PCR仪的热盖温度为75℃，二次反应的PCR仪的热盖温度升至95℃，二次反应设定的温度程度为在55℃下反应20min，接着升温至85℃条件下反应30s，最后将反应温度维持在4℃直至反应结束。
进一步地，所述步骤S2多重PCR扩增反应的具体步骤如下：
A1、按照1μL逆转录产物、1μL SARS-CoV-2引物池1、1μL SARS-CoV-2引物池2、10μL2xPCR酶反应液以及至少20μL无核酸酶水配制反应体系，并将其置于PCR反应仪中按照温度设定程序进行反应；
A2、将反应体系从PCR仪取出后加入提前静置至室温的0.9x纯化磁珠18μL，涡旋混匀后快速离心；
A3、将离心后PCR管在室温静置5～6min，移至磁力架上静置2～3min，吸取弃除上清液；
A4、将PCR管保持在磁力架上，加入新鲜配置的80％乙醇溶液，静置30～40s后弃除全部上清液；
A5、重复步骤A4并将PCR管中残留液体彻底吸干；
A6、干燥磁珠2～3min，待PCR管内酒精挥发完全后，加入文库洗脱液混匀；
A7、将经过步骤A6处理后的PCR管室温静置2～3min后移至磁力架上静置1～2min，直到溶液变澄清，小心吸取上清液至另一新的PCR管中质控备用，或准备进行下一步操作。
进一步地，所述步骤S2中PCR仪的温度设定程序为在98℃下反应30s后进入循环扩增，循环扩增反应条件为在98℃下反应15s后在65℃下反应5min，实现35次以上循环扩增后进入维稳阶段，在72℃下反应5min，最后将温度维持在4℃直至反应结束。
进一步地，所述步骤S3中反应体系包括如下组份：145～155ng多重PCR纯化产物、5μL末端修复酶缓冲液、1.5μL末端修复酶以及至少25μL无核酸酶水。
进一步地，所述步骤S4接头连接的具体步骤如下：
B1、按照经过步骤S3反应后获得的DNA 25μ、连接酶缓冲液8μL、接头1.5μL以及连接酶1.5μL配制连接体系，在PCR仪上进行连接反应，反应温度为22℃，连接反应时间为5min，同时关闭PCR仪的热盖温度；
B2、将反应后的连接体系从PCR仪中取出后加入提前静置至室温的0.8x纯化磁珠28μL，涡旋混匀后快速离心；
B3、将离心后PCR管在室温静置5～6min，移至磁力架上静置2～3min，直至溶液变澄清，小心弃除上清，注意吸头不要沾到磁珠；
B4、将PCR管保持在磁力架上，加入80％乙醇溶液，静置30～40s后弃除全部上清液；
B5、重复步骤B3并将PCR管中残留液体彻底吸干；
B6、干燥磁珠2～3min，待PCR管内酒精挥发完全后，加入22μL文库洗脱液混匀；
B7、将经过步骤B6处理后的PCR管室温静置2～3min后移至磁力架上静置1～2min，直到溶液变澄清，小心吸取上清液至另一新的PCR管中备用。
进一步地，所述步骤S5中PCR扩增的具体步骤如下：
C1、按照经过步骤S4获得的连接纯化后产物20μL、高保真PCR反应液25μL以及带标签N的PCR引物5μL配制反应体系在PCR管中混匀、微离心，置于PCR仪中按照温度设定程序进行PCR扩增，经历7次以上扩增反应循环后结束反应。
配制PCR体系后，将其置于PCR仪中按照设定温度程序进行扩增反应；
C2、将PCR体系从PCR仪中取出后加入提前静置至室温纯化磁珠45μL，涡旋混匀后快速离心；
C2、将离心后PCR管在室温静置5～6min，移至磁力架上静置2～3min，吸取弃除上清液；
C3、将PCR管保持在磁力架上，加入新鲜配置的80％乙醇溶液，静置30～40s后弃除全部上清液；
C4、重复步骤C3并将残留液体彻底吸干；
C5、干燥磁珠2～3min，待酒精挥发完全后，加入22μL文库洗脱液混匀；
C6、将经过步骤C5处理后的PCR管室温静置2～3min后移至磁力架上静置1～2min，直到溶液变澄清，吸取上清液至另一PCR管中用于后续质控和混库、上机测序。
进一步地，所述步骤C1中温度设定程序为在98℃下反应45s后进入循环扩增，循环扩增反应条件为在98℃下反应10s后在60℃下反应15s，再在72℃下反应30s，实现7次以上循环扩增后进入维稳阶段，在72℃下反应1min，最后将温度维持在4℃直至反应结束。
本发明还提供一种新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组检测的试剂盒，所述试剂盒包括利用一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组测序的文库构建方法构建的基因文库。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明提供一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组测序的文库构建方法，病毒灭火处理后，通过对病毒RNA逆转录cDNA、多重PCR扩增病毒基因组、末端修饰、接头连接和PCR扩增等步骤，为基因测序建立完整突变信息基因组的文库，满足NGS技术的要求，能快速的获得新型冠状病毒感染者样本中新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组的文库，能够克服现有技术检测过程中出现假阳性多以及检测的基因区域不全面的问题，尤其对弱阳性患者或无症状感染者等样本时，其灵敏度高，特异性好，所构建的文库可以满足后续illumina平台的高通量测序；对RT-PCR检测阳性的样本，也可以进一步利用本技术进行病毒全序列的分析，从而帮助获得病毒变异的信息，为疫苗、药物研发等提供可靠依据。
2、本发明在针对新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组测序的文库构建方法中，通过对扩增子的覆盖区域、多重PCR扩增、接头连接、末端修饰等步骤进行条件优化，提高DNA测序文库构建的连接效率、文库质量与有效文库产量，对于一些低频突变样本有高检出率，同时也能够满足对病毒全长序列的检测的需求。
3、本发明末端修饰步骤中在配制反应体系时加入末端修复酶缓冲液和末端修复酶，末端修复酶缓冲液和末端修复酶中包含DNA修复酶、修饰酶、聚合酶中至少一种工具酶，通过工具酶的修饰，使DNA两端形成粘性末端方便与接头序列连接，同时，在完成DNA分子的修复工作的能够避免修复工作过程引入的错误，为测序接头连接打下基础，以进一步的完成构建成完整的文库分子。
4、本发明多重PCR扩增步骤中在配制反应体系时加入2xPCR酶反应液，2xPCR酶反应液中包括改造后的Mutli-PCR酶，采用改造后的multi-PCR酶，通过对酶的结构进行格外的修饰，解决了多对引物在同一反应管内进行反应的偏好性，保证了每一对引物均可以以相近的扩增效率进行反应，对于多重PCR扩增反应来说，可以达到多重反应扩增效率的均一性好，扩增效率高，延伸时间仅需要1-2min就能保证满足核酸扩增的需求，降低了了PCR扩增的偏好性，同时大大节省了多重扩增的需要耗费的时间。
附图说明
附图1为本发明测序文库构建原理图；
附图2为利用本发明提供的新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组检测的试剂盒使用不同数量的引物池进行多重PCR扩增23次循环后的测序覆盖度效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来对本发明进行详细的说明。
本发明提供一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组测序的文库构建方法，具体包括如下步骤：
S1、cDNA合成：提取病毒RNA与随机引物六聚体、病毒RNA以及无核酸酶水配制反应体系后在冰上PCR管中混匀，置于PCR仪中进行首次反应，反应结束后将PCR管取出，加入Reverse Transcription mix G2(逆转录酶反应液)后混匀再次置于PCR仪中按照设定的温度程序进行二次反应得的逆转录产物，具体操作方法如下：
(1)将提取的病毒RNA取1pg～500ng按照下表的成分在一干净PCR管中冰上配置体系，并用移液器多次吹打混匀：
成分 含量
随机引物六聚体 1μL
病毒RNA 1pg～500ng
无核酸酶水 ≧8μL
(2)将PCR管放入PCR仪(热盖温度75℃)中进行首次反应，在65℃下反应5min；
(3)将PCR管取出，加入2μL Reverse Transcription mix G2(逆转录酶反应液)，用移液器多次吹打混匀，按照温度设定程序在PCR仪中(热盖温度95℃)进行二次反应；二次反应设定的温度程度为在55℃下反应20min，接着升温至85℃条件下反应30s，最后将反应温度维持在4℃直至反应结束；
S2、多重PCR扩增：利用逆转录产物、SARS-CoV-2引物池1、SARS-CoV-2引物池2、2xPCR酶反应液以及无核酸酶水配制反应体系在PCR管中混匀后置于PCR仪中按照温度设定程序进行扩增反应，扩增反应结束后进行多重PCR纯化制得多重PCR纯化产物；所述2xPCR酶反应液中包括改造后的Mutli-PCR酶，具体操作方法如下：
(1)按照下表配制反应体系：
成分 含量
逆转录产物 1μL
SARS-CoV-2引物池1 1μL
SARS-CoV-2引物池2 1μL
2xPCR酶反应液 10μL
无核酸酶水 ≧20μL
(2)使用移液器对反应体系进行多次吹打混匀，瞬时离心，将反应体系置于PCR仪中按照温度设定程序进行扩增反应；PCR仪的温度设定程序为在98℃下反应30s后进入循环扩增，循环扩增反应条件为在98℃下反应15s后在65℃下反应5min，实现35次以上循环扩增后进入维稳阶段，在72℃下反应5min，最后将温度维持在4℃直至反应结束；
(3)将反应体系从PCR仪取出后加入提前静置至室温的0.9x纯化磁珠18μL，涡旋混匀后快速离心；
(4)将离心后PCR管在室温静置5～6min，移至磁力架上静置2～3min，吸取弃除上清液；
(5)将PCR管保持在磁力架上，加入200μL新鲜配置的80％乙醇溶液，静置30～40s后弃除全部上清液；
(6)重复步骤(5)并将PCR管中残留液体彻底吸干；
(7)干燥磁珠2～3min，待PCR管内酒精挥发完全后，加入22μL文库洗脱液吹打混匀；
(8)将经过步骤(7)处理后的PCR管室温静置2～3min后移至磁力架上静置1～2min，直到溶液变澄清，小心吸取上清液至另一无核酸酶的PCR管中质控备用，或准备进行下一步操作；
S3、末端修饰：利用经过步骤S2获得的多重PCR纯化产物、末端修复酶缓冲液、末端修复酶以及无核酸酶水配制反应体系在PCR管中混匀，瞬时离心后置于PCR仪中，在20℃下反应20min，接着升温至65℃反应20min，最后降温至4℃后立即进行下一步操作；所述末端修复酶缓冲液和末端修复酶中包括DNA修复酶、修饰酶、聚合酶中至少一种工具酶，且工具酶不仅限于上述三种酶中；所述反应体系的组成成分如下表所示：
成分 含量
上述多重PCR纯化产物 145～155ng
末端修复酶缓冲液 5μL
末端修复酶 1.5μL
无核酸酶水 ≧25μL
S4、接头连接：按照经过步骤S3反应后获得的DNA、连接酶缓冲液、接头以及连接酶在冰上依次加入到PCR管中配制连接体系，将其置于PCR仪上进行连接反应，反应结束后对反应体系进行多重PCR纯化制得连接纯化产物；所述反应后获得的DNA、连接酶缓冲液、接头以及连接酶的总体积为34～37μL，具体操作方法如下：
(1)按照下表配制连接体系：
成分 含量
步骤S3反应完的DNA 25μL
连接酶缓冲液 8μL
接头 1.5μL
连接酶 1.5μL
在配制连接体系时，连接酶缓冲液、连接酶与接头不需要进行预先混合，需在进行下一步操作前再加入接头，以免产生接头二聚体影响连接效率。
(2)对连接体系进行多次吹打混匀，瞬时离心，并置于PCR仪上进行连接反应(热盖温度关闭)；反应温度为22℃，连接反应时间为5min；
(3)将反应后的连接体系从PCR仪中取出后加入提前静置至室温的0.8x纯化磁珠28μL，涡旋混匀后快速离心；
(4)将离心后PCR管在室温静置5～6min，移至磁力架上静置2～3min，直至溶液变澄清，小心弃除上清，注意吸头不要沾到磁珠；
(5)将PCR管保持在磁力架上，加入200μL 80％乙醇溶液，静置30～40s后弃除全部上清液；
(6)重复步骤(5)并将PCR管中残留液体彻底吸干；
(7)干燥磁珠2～3min，待PCR管内酒精挥发完全后，加入22μL文库洗脱液吹打混匀；
(8)将经过步骤(7)处理后的PCR管室温静置2～3min后移至磁力架上静置1～ 2min，直到溶液变澄清，小心吸取上清液至另一无核酸酶的PCR管中备用； S5、PCR扩增：利 用经过步骤S4获得的连接纯化后产物、高保真PCR反应液以及带标签N的PCR引物配制反应 体系，将其置于PCR仪中按照设定温度程序进行扩增反应，经历多次扩增反应循环后结束反 应；所述连接纯化后产物、高保真PCR反应液以及带标签N的PCR引物的总体积为50μL，具体 操作方法如下：（1）按照下表配制反应体系在PCR管中利用枪头吹打混匀、微离心：
成分 含量
连接纯化后产物 20μL
高保真PCR反应液 25μL
带标签N的PCR引物 5μL
（2）将反应体系置于PCR仪中按照温度设定程序进行PCR扩增，所述温度设定程序为在98℃下反应45s后进入循环扩增，循环扩增反应条件为在98℃下反应10s后在60℃下反应15s，再在72℃下反应30s，实现7次以上循环扩增后进入维稳阶段，在72℃下反应1min，最后将温度维持在4℃直至反应结束；（3）将PCR体系从PCR仪中取出后加入提前静置至室温纯化磁珠45μL，涡旋混匀后快速离心；（4）将离心后PCR管在室温静置5～6min，移至磁力架上静置2～3min，直至溶液变澄清，小心弃除上清，注意吸头不要沾到磁珠；（5）将PCR管保持在磁力架上，加入200μL新鲜配置的80%乙醇溶液，静置30～40s后弃除全部上清液；（6）重复步骤（5），用10μL枪头将残留液体彻底吸干；（7）干燥磁珠2～3min，待酒精挥发完全后，加入22μL文库洗脱液吹打混匀；（8）将经过步骤（7）处理后的PCR管室温静置2～3min后移至磁力架上静置1～2min，直到溶液变澄清，吸取上清液至另一无核酸酶PCR管中用于后续质控和混库、推荐
Figure BDA0002649913790000091
系列PE250测序平台上机测序。上述实施例中测序文库构建原理参见附图1；参见附图2为利用本发明提供的新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组检测的试剂盒使用不同数量的引物池进行多重PCR扩增23次循环后的测序覆盖度效果图，附图2中横坐标代表病毒基因上的不同区域(新冠病毒共约3万碱基)，纵坐标代表对应区域的测序深度(测序测到每一片段的遍数)，从图2中可以看出在相同的扩增循环数下，利用本发明提供的试剂盒在使用不同数量引物池(yb1为1管，yb2为2管，yb3为3管)时，对应区域测序覆盖度及不同区域测序深度的均一性基本一致，反映出本发明提供的试剂盒在建库中具有良好的性能，同时反映出本发明提供的一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组测序的文库构建方法的均一性好。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组测序的文库构建方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
S1、cDNA合成：提取病毒RNA与随机引物六聚体、病毒RNA以及无核酸酶水配制反应体系后在冰上PCR管中混匀，置于PCR仪中进行首次反应，反应结束后将PCR管取出，加入逆转录酶反应液后混匀再次置于PCR仪中按照设定的温度程序进行二次反应得的逆转录产物；
S2、多重PCR扩增：利用逆转录产物、SARS-CoV-2引物池1、SARS-CoV-2引物池2、2xPCR酶反应液以及无核酸酶水配制反应体系在PCR管中混匀后置于PCR仪中按照温度设定程序进行扩增反应，扩增反应结束后进行多重PCR纯化制得多重PCR纯化产物；所述2xPCR酶反应液中包括改造后的Mutli-PCR酶；
S3、末端修饰：利用经过步骤S2获得的多重PCR纯化产物、末端修复酶缓冲液、末端修复酶以及无核酸酶水配制反应体系在PCR管中混匀，瞬时离心后置于PCR仪中，在20℃下反应20min，接着升温至65℃反应20min，最后降温至4℃后立即进行下一步操作；所述末端修复酶缓冲液和末端修复酶中包括DNA修复酶、修饰酶、聚合酶中至少一种工具酶；
S4、接头连接：按照经过步骤S3反应后获得的DNA、连接酶缓冲液、接头以及连接酶在冰上依次加入到PCR管中配制连接体系，将其置于PCR仪上进行连接反应，反应结束后对反应体系进行多重PCR纯化制得连接纯化产物；所述反应后获得的DNA、连接酶缓冲液、接头以及连接酶的总体积为34～37μL；
S5、PCR扩增：利用经过步骤S4获得的连接纯化后产物、高保真PCR反应液以及带标签N的PCR引物配制反应体系，将其置于PCR仪中按照设定温度程序进行扩增反应，经历多次扩增反应循环后结束反应；所述连接纯化后产物、高保真PCR反应液以及带标签N的PCR引物的总体积为50μL。
2.如权利要求1所述的一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组测序的文库构建方法，其特征在于：所述步骤S1中反应体系包括如下组份：1pg～500ng病毒RNA、1μL随机引物六聚体以及至少8μL无核酸酶水。
3.如权利要求1所述的一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组测序的文库构建方法，其特征在于：所述步骤S1 cDNA的合成中首次反应在65℃条件下反应5min，PCR仪的热盖温度为75℃，二次反应的PCR仪的热盖温度升至95℃，二次反应设定的温度程度为在55℃下反应20min，接着升温至85℃条件下反应30s，最后将反应温度维持在4℃直至反应结束。
4.如权利要求1所述的一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组测序的文库构建方法，其特征在于，所述步骤S2多重PCR扩增反应的具体步骤如下：
A1、按照1μL逆转录产物、1μL SARS-CoV-2引物池1、1μL SARS-CoV-2引物池2、10μL2xPCR酶反应液以及至少20μL无核酸酶水配制反应体系，并将其置于PCR反应仪中按照温度设定程序进行反应；
A2、将反应体系从PCR仪取出后加入提前静置至室温的0.9x纯化磁珠18μL，涡旋混匀后快速离心；
A3、将离心后PCR管在室温静置5～6min，移至磁力架上静置2～3min，吸取弃除上清液；
A4、将PCR管保持在磁力架上，加入新鲜配置的80％乙醇溶液，静置30～40s后弃除全部上清液；
A5、重复步骤A4并将PCR管中残留液体彻底吸干；
A6、干燥磁珠2～3min，待PCR管内酒精挥发完全后，加入文库洗脱液混匀；
A7、将经过步骤A6处理后的PCR管室温静置2～3min后移至磁力架上静置1～2min，直到溶液变澄清，小心吸取上清液至另一新的PCR管中质控备用，或准备进行下一步操作。
5.如权利要求4所述的一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组测序的文库构建方法，其特征在于：所述步骤A1中PCR仪的温度设定程序为在98℃下反应30s后进入循环扩增，循环扩增反应条件为在98℃下反应15s后在65℃下反应5min，实现35次以上循环扩增后进入维稳阶段，在72℃下反应5min，最后将温度维持在4℃直至反应结束。
6.如权利要求1所述的一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组测序的文库构建方法，其特征在于：所述步骤S3中反应体系包括如下组份：145～155ng多重PCR纯化产物、5μL末端修复酶缓冲液、1.5μL末端修复酶以及至少25μL无核酸酶水。
7.如权利要求1所述的一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组测序的文库构建方法，其特征在于，所述步骤S4接头连接的具体步骤如下：
B1、按照经过步骤S3反应后获得的DNA 25μ、连接酶缓冲液8μL、接头1.5μL以及连接酶1.5μL配制连接体系，在PCR仪上进行连接反应，反应温度为22℃，连接反应时间为5min，同时关闭PCR仪的热盖温度；
B2、将反应后的连接体系从PCR仪中取出后加入提前静置至室温的0.8x纯化磁珠28μL，涡旋混匀后快速离心；
B3、将离心后PCR管在室温静置5～6min，移至磁力架上静置2～3min，直至溶液变澄清，小心弃除上清，注意吸头不要沾到磁珠；
B4、将PCR管保持在磁力架上，加入80％乙醇溶液，静置30～40s后弃除全部上清液；
B5、重复步骤B3并将PCR管中残留液体彻底吸干；
B6、干燥磁珠2～3min，待PCR管内酒精挥发完全后，加入文库洗脱液混匀；
B7、将经过步骤B6处理后的PCR管室温静置2～3min后移至磁力架上静置1～2min，直到溶液变澄清，小心吸取上清液至另一新的PCR管中备用。
8.如权利要求1所述的一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组测序的文库构建方法，其特征在于，所述步骤S5中PCR扩增的具体步骤如下：
C1、按照经过步骤S4获得的连接纯化后产物20μL、高保真PCR反应液25μL以及带标签N的PCR引物5μL配制反应体系在PCR管中混匀、微离心，置于PCR仪中按照温度设定程序进行PCR扩增，经历7次以上扩增反应循环后结束反应。
配制PCR体系后，将其置于PCR仪中按照设定温度程序进行扩增反应；
C2、将PCR体系从PCR仪中取出后加入提前静置至室温纯化磁珠45μL，涡旋混匀后快速离心；
C2、将离心后PCR管在室温静置5～6min，移至磁力架上静置2～3min，吸取弃除上清液；
C3、将PCR管保持在磁力架上，加入新鲜配置的80％乙醇溶液，静置30～40s后弃除全部上清液；
C4、重复步骤C3并将残留液体彻底吸干；
C5、干燥磁珠2～3min，待酒精挥发完全后，加入文库洗脱液混匀；
C6、将经过步骤C5处理后的PCR管室温静置2～3min后移至磁力架上静置1～2min，直到溶液变澄清，吸取上清液至另一PCR管中用于后续质控和混库、上机测序。
9.如权利要求8所述的一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组测序的文库构建方法，其特征在于：所述步骤C1中温度设定程序为在98℃下反应45s后进入循环扩增，循环扩增反应条件为在98℃下反应10s后在60℃下反应15s，再在72℃下反应30s，实现7次以上循环扩增后进入维稳阶段，在72℃下反应1min，最后将温度维持在4℃直至反应结束。
10.一种新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括利用如权利要求1至9任一所述的一种针对新型冠状病毒SARS-CoV-2全长基因组测序的文库构建方法构建的基因文库。
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