CN111455114A - SARS-CoV-2的高通量检测试剂盒 - Google Patents

SARS-CoV-2的高通量检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了SARS‑CoV‑2的高通量检测试剂盒。该试剂盒包括274个引物，274个引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：274所示。本发明采用多重PCR加NGS测序技术，对SARS‑CoV‑2分析进行百万倍富集，并通过设置已知拷贝数的外参和内参，来达到既能够灵敏的检测SARS‑CoV‑2的有无，也能够对SARS‑CoV‑2的浓度进行判断；还可以获得SARS‑CoV‑2的全长数据，对SARS‑CoV‑2进化和变异进行研究，具有极高的灵敏度、特异性和准确性。同时本发明将逆转录和多重PCR技术合并成一步，减少SARS‑CoV‑2RNA降解的风险。本发明具有重要的应用价值。

Description

SARS-CoV-2的高通量检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及SARS-CoV-2的高通量检测试剂盒。
背景技术
SARS-CoV-2属于β冠状病毒，其传播能力强于SARS。SARS-CoV-2的早期检测、快速检测不仅对病人确诊非常重要，而且对于有效防止疫情进一步扩散，特别是发现无症状或在潜伏期的病毒携带者，具有关键性的作用。
目前，SARS-CoV-2的常规检测方法是实时荧光RT-PCR检测，其核酸检测主要是针对病毒基因组中开放读码框La/b(Openreding frame Lab，ORF Lab)与核壳蛋白(nuleocapsid protein，N)。RT-PCR会采取其中的一个或几个靶标对病毒进行检测，其在确诊患病人群中具有举足轻重的作用，但因为β冠状病毒为单链正链RNA病毒，RNA病毒均具有变异迅速的特点，常规的RT-PCR无法应对变异的病毒进行检测，会导致假阴性的产生。
对病人及时确诊对疫情的遏制很重要，对病毒变异进化研究以及疫情预测同样不可忽略，此时RT-PCR技术就无法承担起病毒变异检测的重任。随着高通量测序技术的发展，其可以在非常微量的样本的情况下获得病毒全长信息，获取病毒变化信息并监测动态过程，对疫情具有很好的监测作用。现有基于高通量测序技术的方法有基于全基因组的测序方法、基于探针捕获的全基因组测序方法和基于多重PCR的全基因组捕获方法。基于全基因组的测序方法能获得样本中所有核酸数据，缺点是外源核酸数据占比过多，能获取的需要的靶标病毒(SARS-CoV-2)数据量少，特别是在弱阳性的情况下，很容易出现漏检的情况。基于探针捕获的全基因组测序方法可以先对靶标病毒(SARS-CoV-2)进行几万倍的富集，然后进行测序，但其建库过程非常繁琐，并且所需要时间长，不利于病毒的防控。基于多重PCR的全基因组捕获方法采用特异性的引物对靶标病毒进行百万倍的富集，然后进行测序，获得病毒全基因组数据，操作简单，其有非常高的灵敏度，能将非常弱阳性的样本检测出来，但其无法判断样本的阳性程度，也就是病毒的相对浓度。
发明内容
本发明的第一个目的为快速获取SARS-CoV-2的基因组序列，从而及时掌握SARS-CoV-2的变异情况。
本发明首先保护一种检测SARS-CoV-2的试剂盒，可包括SARS-CoV-2引物组；
所述SARS-CoV-2引物组可包括若干个特异引物对甲；每个特异引物对甲由上游特异引物甲和下游特异引物甲组成；
上游特异引物甲从5’末端到3’末端依次可包括DNA片段1和DNA片段3；
下游特异引物甲从5’末端到3’末端依次可包括DNA片段2和DNA片段4；
DNA片段3和DNA片段4分别与SARS-CoV-2的基因组上的两个区段相同或互补；
每个特异引物对甲的DNA片段3和DNA片段4的核苷酸序列不同，可结合至SARS-CoV-2的基因组上的不同位置；每个特异引物对甲检测的靶区域长度为300-400bp(如300-350bp、350-400bp、300bp、350bp或400bp)；所有特异引物对甲的靶区域拼接后可以覆盖SARS-CoV-2的基因组。
所述上游特异引物甲具体可由所述DNA片段1和所述DNA片段3组成。
所述下游特异引物甲具体可由所述DNA片段2和所述DNA片段4组成。
所述SARS-CoV-2引物组具体可由若干个特异引物对甲组成。在本发明的一个实施例中，所述SARS-CoV-2引物组具体可由113个特异引物对甲组成。
上述任一所述试剂盒具体可由SARS-CoV-2引物组组成。
上述任一所述试剂盒还可包括内参引物组和/或外参引物组。
所述内参引物组可包括若干个特异引物对乙；每个特异引物对乙由上游特异引物乙和下游特异引物乙组成；
上游特异引物乙从5’末端到3’末端依次可包括DNA片段1和DNA片段5；
下游特异引物乙从5’末端到3’末端依次可包括DNA片段2和DNA片段6；
DNA片段5和DNA片段6分别与人内参基因上的两个区段相同或互补；
每个特异引物对乙的DNA片段5和DNA片段6的核苷酸序列不同，可结合至人内参基因上的不同位置；每个特异引物对乙检测的靶区域长度为300-400bp(如300-350bp、350-400bp、300bp、350bp或400bp)；所有特异引物对乙的靶区域拼接后可以完全或部分覆盖人内参基因。
所述上游特异引物乙具体可由所述DNA片段1和所述DNA片段5组成。
所述下游特异引物乙具体可由所述DNA片段2和所述DNA片段6组成。
所述内参引物组具体可由若干个特异引物对乙组成。在本发明的一个实施例中，所述内参引物组具体可由14个特异引物对乙组成。
上述任一所述试剂盒具体可由SARS-CoV-2引物组和所述内参引物组组成。
所述外参引物组可包括若干个特异引物对丙；每个特异引物对丙由上游特异引物丙和下游特异引物丙组成；
上游特异引物丙从5’末端到3’末端依次可包括DNA片段1和DNA片段7；
下游特异引物丙从5’末端到3’末端依次可包括DNA片段2和DNA片段8；
DNA片段7和DNA片段8分别与特异DNA的两个区段相同或互补；
每个特异引物对丙的DNA片段7和DNA片段8的核苷酸序列不同，可结合至特异DNA上的不同位置；每个特异引物对丙检测的靶区域长度为300-400bp(如300-350bp、350-400bp、300bp、350bp或400bp)；所有特异引物对丙的靶区域拼接后可以完全或部分覆盖特异DNA；所述特异DNA的核苷酸序列已知。
所述上游特异引物丙具体可由所述DNA片段1和所述DNA片段7组成。
所述下游特异引物丙具体可由所述DNA片段2和所述DNA片段8组成。
所述外参引物组具体可由若干个特异引物对丙组成。在本发明的一个实施例中，所述外参引物组具体可由10个特异引物对丙组成。
上述任一所述试剂盒具体可由SARS-CoV-2引物组和所述外参引物组组成。
上述任一所述试剂盒具体可由SARS-CoV-2引物组、所述内参引物组和所述外参引物组组成。
上述任一所述试剂盒还可包括通用引物和/或标签引物；
所述通用引物可包括DNA片段乙；DNA片段1可为DNA片段乙3’末端的一部分；
所述标签引物从5’末端到3’末端可包括DNA片段丙和DNA片段丁；DNA片段2可为DNA片段丁3’末端的一部分。
所述通用引物还可包括DNA片段甲，位于DNA片段乙的5’端。
所述DNA片段甲或所述DNA片段丙可为测序接头序列。
所述通用引物具体可由所述DNA片段乙组成。
所述通用引物具体可由所述DNA片段甲和所述DNA片段乙组成。
所述标签引物具体可由所述DNA片段丙和所述DNA片段丁组成。
所述标签引物还可包括DNA片段戊；DNA片段戊位于DNA片段丙和DNA片段丁之间；DNA片段戊可为标签序列(如barcode序列)，可用于区分不同的样本。
所述标签引物具体可由所述DNA片段丙、所述DNA片段戊和所述DNA片段丁组成。
上述任一所述试剂盒具体可由SARS-CoV-2引物组、所述内参引物组、所述外参引物组、所述通用引物和所述标签引物组成。
上述任一所述人内参基因具体可为GAPDH基因。
上述任一所述特异DNA可为lambdaDNA。lambdaDNA为噬菌体的遗传物质，大小48kb，与SARS-CoV-2大小相似。
上述任一所述SARS-CoV-2引物组可包括113个特异引物对甲；113个上游特异引物甲的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：25至SEQ ID NO：137所示；与之对应的下游特异引物甲的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：162至SEQ ID NO：274所示。
上述任一所述SARS-CoV-2引物组具体可由上述113个特异引物对甲组成。
上述任一所述内参引物组可包括14个特异引物对乙；14个上游特异引物乙的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：14所示；与之对应的下游特异引物乙的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：138至SEQ ID NO：151所示。
上述任一所述内参引物组具体可由上述14个特异引物对乙组成。
上述任一所述外参引物组可包括10个特异引物对丙；10个上游特异引物丙的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：15至SEQ ID NO：24所示；与之对应的下游特异引物丙的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：152至SEQ ID NO：161所示。
上述任一所述外参引物组具体可由上述10个特异引物对丙组成。
上述任一所述SARS-CoV-2引物组、上述任一所述内参引物组和/或上述任一所述外参引物组在检测SARS-CoV-2中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明还保护一种获得待测样本中SARS-CoV-2的基因组序列和/或变异信息的方法，包括如下步骤：
(1)将待测样本的核酸和上述任一所述SARS-CoV-2引物组混合，之后进行逆转录和PCR扩增，得到PCR扩增产物1；
(2)以PCR扩增产物1为模板，采用上述任一所述通用引物和上述任一所述标签引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物2；
(3)取PCR扩增产物2，测序；根据测序结果，获得待测样本中SARS-CoV-2的基因组序列和/或变异信息。
上述方法中，进行步骤(1)时，还可以加入上述任一所述内参引物组、上述任一所述外参引物组和/或已知分子数的外参一起混合。
上述方法中，完成步骤(1)后、进行步骤(2)之前，还可包括将PCR扩增产物1进行纯化的步骤。
上述方法中，完成步骤(2)后、进行步骤(3)之前，还可包括将PCR扩增产物2进行纯化的步骤。
所述步骤(1)中，进行逆转录和PCR扩增的反应程序具体可为：50℃ 20min；95℃2min；95℃ 10s，62℃ 2min，72℃ 30s，20个循环；72℃ 5min。
所述步骤(2)中，进行PCR扩增的反应程序具体可为：95℃ 2min；95℃ 10s，62℃2min，72℃ 30s，20个循环；72℃ 5min。
所述步骤(1)中，进行逆转录和PCR扩增在同一个反应体系中先后进行。在同一个反应体系中进行逆转录和PCR扩增，实验流程简化，操作过程可大大减少污染。
本发明的第二个目的为对SARS-CoV-2进行定量，即判断获取的SARS-CoV-2含量。
本发明保护一种检测待测样本中SARS-CoV-2分子数(即SARS-CoV-2含量)的方法，依次可包括如下步骤：
(1)将待测样本的核酸、已知分子数的外参、上述任一所述SARS-CoV-2引物组和上述任一所述外参引物组混合，之后进行逆转录和PCR扩增，得到PCR扩增产物甲；
(2)以PCR扩增产物甲为模板，采用上述任一所述通用引物和上述任一所述标签引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物乙；
(3)取PCR扩增产物乙，测序；根据测序数据，获得SARS-CoV-2的reads数Cs和外参的reads数Cec；
(4)根据公式1获得待测样本中SARS-CoV-2分子数Ns；
Figure BDA0002503546760000041
Nec为外参的起始分子数，Eec为外参扩增的效率，Es为SARS-CoV-2扩增的效率，m为扩增的循环数。
上述方法中，进行步骤(1)时，还可以加入上述任一所述内参引物组一起混合。
上述方法中，完成步骤(1)后、进行步骤(2)之前，还可包括将PCR扩增产物甲进行纯化的步骤。
上述方法中，完成步骤(2)后、进行步骤(3)之前，还可包括将PCR扩增产物乙进行纯化的步骤。
所述步骤(1)中，进行逆转录和PCR扩增的反应程序具体可为：50℃ 20min；95℃2min；95℃ 10s，62℃ 2min，72℃ 30s，20个循环；72℃ 5min。
所述步骤(2)中，进行PCR扩增的反应程序具体可为：95℃ 2min；95℃ 10s，62℃2min，72℃ 30s，20个循环；72℃ 5min。
上述方法中，进行逆转录和PCR扩增在同一个反应体系中先后进行。在同一个反应体系中进行逆转录和PCR扩增，实验流程简化，操作过程可大大减少污染。
本发明的第三个目的为获得SARS-CoV-2相对于细胞的浓度，从而用于区分不同样本SARS-CoV-2的强弱。
本发明还保护一种检测待测样本中SARS-CoV-2浓度的方法，依次可包括如下步骤：
(1)将待测样本的核酸、已知分子数的外参、上述任一所述SARS-CoV-2引物组、上述任一所述内参引物组和上述任一所述外参引物组混合，之后进行逆转录和PCR扩增，得到PCR扩增产物a；
(2)以PCR扩增产物a为模板，采用上述任一所述通用引物和上述任一所述标签引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物b；
(3)取PCR扩增产物b，测序；根据测序数据，获得SARS-CoV-2的reads数Cs、外参的reads数Cec和内参的reads数Cic；
(4)根据公式1获得待测样本中SARS-CoV-2分子数Ns；
Figure BDA0002503546760000051
Nec为外参的起始分子数，Eec为外参扩增的效率，Es为SARS-CoV-2扩增的效率，m为扩增的循环数；
(5)根据公式2获得待测样本中SARS-CoV-2浓度Ns/Nic，
Figure BDA0002503546760000052
Nic为内参的起始分子数，Eic为内参扩增的效率，Es为SARS-CoV-2扩增的效率，m为扩增的循环数，Ns为待测样本中SARS-CoV-2分子数。
待测样本中SARS-CoV-2浓度Ns/Nic即SARS-CoV-2相对于细胞的浓度。SARS-CoV-2相对于细胞的浓度的浓度越高，则样本SARS-CoV-2中SARS-CoV-2越强。
上述方法中，完成步骤(1)后、进行步骤(2)之前，还可包括将PCR扩增产物a进行纯化的步骤。
上述方法中，完成步骤(2)后、进行步骤(3)之前，还可包括将PCR扩增产物b进行纯化的步骤。
所述步骤(1)中，进行逆转录和PCR扩增的反应程序具体可为：50℃ 20min；95℃2min；95℃ 10s，62℃ 2min，72℃ 30s，20个循环；72℃ 5min。
所述步骤(2)中，进行PCR扩增的反应程序具体可为：95℃ 2min；95℃ 10s，62℃2min，72℃ 30s，20个循环；72℃ 5min。
上述方法中，进行逆转录和PCR扩增在同一个反应体系中先后进行。在同一个反应体系中进行逆转录和PCR扩增，实验流程简化，操作过程可大大减少污染。
上文中，Eec、Es和Eic均可通过qPCR测定获得。在本发明的一个实施例中，Eec＝1.96，Es＝1.96，Eic＝1.97。
上述任一所述测序可采用SE400进行测序，采用的是MGI DNBSEQ测序平台。本发明不局限与MGI DNBSEQ测序平台，也可以采用illumina和proton等其它平台。
本发明采用多重PCR加NGS测序技术，对SARS-CoV-2分析进行百万倍富集，并通过设置已知拷贝数的外参和内参，来达到既能够灵敏的检测SARS-CoV-2的有无，也能够对SARS-CoV-2的浓度进行判断(相对定量)；还可以获得SARS-CoV-2的全长数据，对SARS-CoV-2进化和变异进行研究，具有极高的灵敏度、特异性和准确性。同时本发明将逆转录和多重PCR技术合并成一步，减少SARS-CoV-2RNA降解的风险。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为实施例1中步骤1中(1)-(3)的引物设计示意图。在发明的实施例中，具体设计并合成了113个用于扩增SARS-CoV-2的引物对、14个用于扩增GAPDH基因的引物对和10个用于扩增lambdaDNA的引物对，共计274个引物；后续274个引物在一管中进行扩增。
图2为实施例1中步骤3和步骤4的流程示意图。具体为：向抽提得到的核酸加入一定已知数量的人工合成DNA，然后一步法进行逆转录和第一轮PCR，最后进行第二轮PCR，得到高通量测序文库。
图3为实施例2中样本稀释梯度的相关性。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
AMV逆转录酶为NEB公司的产品，货号为M0277S。QIAGEN Multiplex PCR Kit为QIAGEN公司的产品，Cat No.为206143。2×PCR反应酶和RNA抑制剂均为QIAGEN MultiplexPCR Kit中的组件。Agencourt AMPure XP磁珠为beckman公司的产品，货号为A63881。
实施例1、高通量测序检测SARS-CoV-2的方法的建立
本发明的发明人经过大量实验，建立了高通量测序检测SARS-CoV-2的方法，该方法既能灵敏检测SARS-CoV-2的有无(定性)，也能判断SARS-CoV-2浓度(定量)。具体步骤如下：
1、正向引物池和反向引物池的获得
(1)获得多个SARS-CoV-2毒株的全基因组序列，之后采用交叉设计的方法设计用于扩增SARS-CoV-2的引物对(其中，在高变异区设计兼并引物)；每个引物对检测的靶区域长度为300-400bp；所有用于扩增SARS-CoV-2的引物对的靶区域拼接后可以覆盖SARS-CoV-2的全基因。
(2)根据人类基因组中GAPDH基因的核苷酸序列，采用交叉设计的方法设计用于扩增GAPDH基因的引物对，作为内参；每个引物对检测的靶区域长度为300-400bp；所有用于扩增GAPDH基因的引物对的靶区域拼接后可以覆盖GAPDH基因。
设置内参的目的，一方面可以质检样本核酸抽提过程是否成功，另一方面可以对人体细胞中SARS-CoV-2相对于看家基因的浓度进行定量。
(3)选择外参DNA，外参DNA可以是人工合成的序列，也可以是自然界存在的已知序列(如质粒)。具体在本发明，选择的是与SARS-CoV-2大小相似的lambdaDNA(噬菌体的遗传物质，大小48kb)。根据lambdaDNA的核苷酸序列，设计用于扩增lambdaDNA不同区域的引物对(用于获得lambdaDNA信息)，作为外参。每个引物对检测的靶区域长度为300-400bp。
设置外参的目的，一方面可以质检整个建库过程是否成功，另一方面可以对SARS-CoV-2相对于外参的病毒分子数进行定量。
步骤(1)-(3)的引物设计示意图见图1。
共设计113个用于扩增SARS-CoV-2的引物对、14个用于扩增GAPDH基因的引物对和10个用于扩增lambdaDNA的引物对。
(4)人工合成步骤(1)-(3)设计的各个引物对的引物。每个引物对的上游引物见表1(表1中每个引物自5’末端起第1至21位为通用引物3’末端的一部分)，相应的下游引物见表2(表2中每个引物自5’末端起第1至17位为标签引物3’末端的一部分)。表1和表2的引物名称中，倒数第4位至倒数第2位所示的数字相同即为一个引物对；含有“GAPDH”即为用于扩增GAPDH基因的引物；含有“lambda”即为用于扩增lambdaDNA的引物；含有“SARS-CoV-2”即为用于扩增SARS-CoV-2的引物。例如：GAPDH001F和GAPDH001R即为用于扩增GAPDH基因的一个引物对。
表1
Figure BDA0002503546760000071
Figure BDA0002503546760000081
Figure BDA0002503546760000091
Figure BDA0002503546760000101
表2
Figure BDA0002503546760000111
Figure BDA0002503546760000121
Figure BDA0002503546760000131
Figure BDA0002503546760000141
(5)将表1所示的各个引物的水溶液混合，得到正向引物池。正向引物池中，各个引物的浓度均为10μM。将表2所示的各个引物的水溶液混合，得到反向引物池。反向引物池中，各个引物的浓度均为10μM。
2、获取待测者咽拭子、喉拭子、肛拭子、鼻拭子或其它可以获得病毒的样本类型，核酸抽提，得到待测者核酸。
3、向步骤2得到的待测者核酸中加入已知拷贝数的lambdaDNA，得到待测样本；之后将待测样本进行逆转录和第一步PCR(在同一个管中进行)，得到PCR扩增产物1，完成富集。进行第一步PCR的引物采用步骤1得到的正向引物池和反向引物池。
4、以步骤3得到的PCR扩增产物1为模板，采用通用引物和标签引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物2。
通用引物为：5’-Phos-GAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3’；Phos表示5’端磷酸化、用于MGI平台的环化。
标签引物为：
Figure BDA0002503546760000151
(双下划线为标签序列(N为A、T、C和G中的任一种)、用于区分不同的样本)。
PCR扩增产物2即为制备的高通量文库。
步骤3和步骤4的流程示意图见图2。
5、将PCR扩增产物2进行测序；得到下机数据。
6、根据下机数据，获得待测者携带的SARS-CoV-2的基因组的序列，进一步可获得变异信息；还可以获得SARS-CoV-2相对于外参的病毒分子数，用于对获取的SARS-CoV-2进行定量；还可以获得SARS-CoV-2相对于内参(GAPDH)的浓度，即定量SARS-CoV-2在人体中的相对浓度(内参直接确定人体细胞的数量，然后计算出平均每个细胞的病毒数量，用于区分不同待测者SARS-CoV-2在细胞中的强弱)。
具体如下：
对于每个扩增子，其测序获得的数据量等于其扩增子的分子数量(即测到多少reads代表测到多少DNA分子，C＝M)，正比于其投入量和扩增的效率(即PCR最终的分子数正比于起始投入的分子数和扩增的效率)，所以M＝N(E)m；也就是C＝N(E)m。
C为测序获得的reads数；M为扩增得到的分子数；N为起始的分子数；E为扩增的效率，通过qPCR测定获得，Eec＝1.96，Es＝1.96，Eic＝1.97；m扩增的循环数，固定值m＝40。
假设样本中的初始分子数，内参为Nic；外参为Nec；病毒样本为Ns；经过一定的循环数m，其分子总数为M，可得经过测序Cs＝Ns(Es)m，Cec＝Nec(Eec)m，Cic＝Nic(Eic)m。
根据公式1得到SARS-CoV-2相对于外参的病毒分子数(SARS-CoV-2相对于外参的病毒分子数是绝对的，也就是通过已知的外参得到病毒的绝对数)；
Figure BDA0002503546760000152
根据公式2得到SARS-CoV-2相对于内参的浓度(SARS-CoV-2相对于内参的浓度是相对的，细胞中的GAPDH基因表达是恒定的，SARS-CoV-2相对于细胞的浓度等于SARS-CoV-2相对于GAPDH的浓度)；
Figure BDA0002503546760000153
实施例2、实施例1建立的方法的准确性验证
采用实施例1建立的方法检测不同浓度SARS-CoV-2，从而评价实施例1建立的方法的准确性。具体步骤如下：
一、样本1—样本5的制备
1、取感染SARS-CoV-2患者的咽拭子，提取核酸。
2、完成步骤1后，取所述核酸，用水稀释至10倍，得到稀释度为10-1的核酸稀释液1；之后继续稀释，得到稀释度为10-2的核酸稀释液2、稀释度为10-3的核酸稀释液3、稀释度为10-4的核酸稀释液4和稀释度为10-5的核酸稀释液5。
3、完成步骤2后，采用qPCR分别检测核酸稀释液1—核酸稀释液5的绝对拷贝数。
结果表明，核酸稀释液1的绝对拷贝数的范围为1000-10000，核酸稀释液2的绝对拷贝数的范围为100-1000，核酸稀释液3的绝对拷贝数的范围为10-100，核酸稀释液4的绝对拷贝数的范围为1-10，核酸稀释液5的绝对拷贝数的范围为0-1。
4、完成步骤3后，分别向核酸稀释液1—核酸稀释液5中加入180个拷贝当量的lambdaDNA分子，依次得到样本1—样本5。
二、逆转录+第一步PCR
1、制备正向引物池和反向引物池。
将表1所示的各个引物的水溶液混合，得到正向引物池。正向引物池中，各个引物的浓度均为10μM。
将表2所示的各个引物的水溶液混合，得到反向引物池。反向引物池中，各个引物的浓度均为10μM。
2、制备反应体系1。反应体系1为30μL，由10μL样本(样本1、样本2、样本3、样本4或样本5)、15μL 2×PCR反应酶、2μL正向引物池、2μL反向引物池、0.5μLAMV逆转录酶和0.5μLRNA抑制剂组成。
3、完成步骤2后，取所述反应体系1，进行逆转录和PCR扩增，得到PCR扩增产物1。
反应程序为：50℃ 20min；95℃ 2min；95℃ 10s，62℃ 2min，72℃ 30s，20个循环；72℃ 5min。
4、完成步骤3后，取所述PCR扩增产物1，先加入80μL Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化，然后用20μL TE缓冲液溶解，得到纯化产物1。
三、第二步PCR
1、制备反应体系2。反应体系2为30μL，由10μL纯化产物1、15μL 2×PCR反应酶、2.5μL通用引物的水溶液和2.5μL标签引物的水溶液组成。反应体系2中，通用引物的浓度为10nM，标签引物的浓度为10nM。
通用引物为：5’-Phos-GAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3’；，Phos表示5’端磷酸化、用于MGI平台的环化。
标签引物为：
Figure BDA0002503546760000161
(双下划线为标签序列(N为A、T、C和G中的任一种)、用于区分不同的样本)。
2、完成步骤1后，取所述反应体系2，进行PCR扩增，得到PCR扩增产物2。
反应程序为：95℃ 2min；95℃ 10s，62℃ 2min，72℃ 30s，20个循环；72℃ 5min。
3、完成步骤2后，取所述PCR扩增产物2，先加入80μL Agencourt AMPure XP磁珠进行纯化，然后用20μL TE缓冲液溶解，得到纯化产物2。
纯化产物2即为制备的高通量文库。
四、文库质检
取10μL步骤二制备的高通量文库，进行1％琼脂糖凝胶电泳。
结果表明，文库中的DNA片段均在300-400bp之间。
五、上机测序和数据分析
1、分别将样本一的高通量文库—样本五的高通量文库进行标准化，然后等量混合，得到混合文库。
2、完成步骤1后，将所述混合文库进行平行测序，得到测序结果。测序平台为MGISEQ-2000，测序类型为SE400。
3、完成步骤2后，取所述测序结果，经过过滤等步骤，得到下机数据。
4、完成步骤3后，将下机数据分别与SARS-CoV-2基因组、外参基因组和内参基因组进行对比，分别统计比对到上述3个基因组的read总数；并得到比对到3个基因组扩增子的平均reads数(总reads数/扩增子数目)；将比对到SARS-CoV-2的序列进行全基因组组装，获得基因的覆盖度和变异情况。进一步按照实施例1中步骤6的方法，还可以获得SARS-CoV-2相对于外参的病毒分子数，用于判断获取的SARS-CoV-2绝对含量，还可以获得SARS-CoV-2相对于内参(GAPDH)的浓度(用于区分不同待测者SARS-CoV-2在细胞中的强弱)。
将步骤二的样本替换为水，作为阴性对照。
比对到上述3个基因组的read总数、比对到3个基因组扩增子的平均reads数、SARS-CoV-2相对于外参的病毒分子数和SARS-CoV-2相对于内参的浓度的统计结果见表3。
结果表明，SARS-CoV-2相对于外参的病毒分子数中，阴性对照得到的拷贝数为0.05，样本五得到的拷贝数为0.4，两者具有显著差异；换算成浓度可以得到样本五的浓度为40copies/mL(0.4copy/10μL)；样本稀释梯度的相关性见图3，R2＝0.99，由此可见，该方法得到的模板梯度浓度和理论模板稀释梯度具有一致性，该方法可以通过外参基因进行准确定量。SARS-CoV-2相对于内参的浓度中，各个样本和阴性对照(平均方差±6.9，变异系数CV为0.07)的拷贝数均无显著差异；因为SARS-CoV-2为感染SARS-CoV-2患者的咽拭子提取得到的，SARS-CoV-2相对于细胞浓度应该是一个恒定值，因此SARS-CoV-2对于内参的浓度也应该为定值。由此可见，统计结果具有较高的准确性。
表3-1
Figure BDA0002503546760000171
表3-2
Figure BDA0002503546760000172
Figure BDA0002503546760000181
样本一至样本五均可以获得SARS-CoV-2的全长数据，覆盖度依次为99.9％、99.9％、99.8％、99.4％和75.1％。相对于参考基因组MN908947.3，各个样本的变异情况见表4。经过sanger验证，这两个位点相对于参考基因组MN908947.3均为真实突变位点。其中，orflab、S、ORF3a、E、M、ORF6、ORF7a、ORF8、N、ORF10是SARS-CoV-2中开放读码框和蛋白的通称。
表4-1
5UTR orf1ab S ORF3a E M
样本一 0 0 2 0 0 0
样本二 0 0 2 0 0 0
样本三 0 0 2 0 0 0
样本四 0 0 2 0 0 0
样本五 0 0 2 0 0 0
表4-2
ORF6 ORF7a ORF8 N ORF10 3UTR
样本一 0 0 0 0 0 0
样本二 0 0 0 0 0 0
样本三 0 0 0 0 0 0
样本四 0 0 0 0 0 0
样本五 0 0 0 0 0 0
<110>深圳华大智造科技有限公司
<120> SARS-CoV-2的高通量检测试剂盒
<160>274
<170>PatentIn version 3.5
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<211>51
<212>DNA
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gacatggcta cgatccgact tctggttgaa tgcgaacaaa cttatactta g 51
<210>64
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<212>DNA
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gacatggcta cgatccgact tacattctat gcaaaattgt gtacttaagc ttaag 55
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gacatggcta cgatccgact tctaataaag cactacccaa tatggtacgt c 51
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gacatggcta cgatccgact ttttagatat gtgtgcttca ttaaaagaat tactgc 56
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gacatggcta cgatccgact tgaaatggct tgatctaaag cattaccata at 52
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gacatggcta cgatccgact tacacttatg aatgtcttga cactcgttta taa 53
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gacatggcta cgatccgact tgtagtatct ttagctaaga gaatgtcatt gtgtaa 56
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<211>50
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gacatggcta cgatccgact tagatgtaaa gtgcacatca gtagtcttac 50
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<212>DNA
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gacatggcta cgatccgact tttatagtct ggtatgacaa ccattagttt gg 52
<210>72
<211>51
<212>DNA
<213>Artificial sequence
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gacatggcta cgatccgact tgttgtgttc ccttgaacat aatacctctt a 51
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gacatggcta cgatccgact ttgcattacc agcttgtaga cgtac 45
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<212>DNA
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gacatggcta cgatccgact tttaaaggat taaacaacct aaatagaggt atggta 56
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gacatggcta cgatccgact tgtagatgtc aaaagccctg tatacgac 48
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gacatggcta cgatccgact tcaatcgttt ttaaacgggt ttgcg 45
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gacatggcta cgatccgact tataccagtt accattgaga tcttgattat ctaatg 56
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gacatggcta cgatccgact tttgtagaaa acccagatat attacgcgta ta 52
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gacatggcta cgatccgact tcacaagtaa ttccttaaaa ctaagtctag agctat 56
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<212>DNA
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gacatggcta cgatccgact tctagtgaga aaaatatttg ttgatggtgt tcc 53
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<211>52
<212>DNA
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gacatggcta cgatccgact tatgacatta cgttttgtat atgcgaaaag tg 52
<210>82
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<212>DNA
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gacatggcta cgatccgact ttagacttta ttatgattca atgagttatg aggatc 56
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<212>DNA
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gacatggcta cgatccgact ttaaattgcg gacatactta tcggcaat 48
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gacatggcta cgatccgact taatgttaat gcacttttat ctactgatgg taac 54
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<211>55
<212>DNA
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gacatggcta cgatccgact taataccttg aagtgttatc attagtaagc ataac 55
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<211>56
<212>DNA
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gacatggcta cgatccgact tgctgatgtc tttcatttgt acttacaata cataag 56
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<212>DNA
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gacatggcta cgatccgact tgtacagtag caataccata agacagttta aatg 54
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<212>DNA
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gacatggcta cgatccgact tattttagct aacacctgta ctgaaagact c 51
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gacatggcta cgatccgact ttttgaattt atcaaaacac tctacacgag c 51
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<212>DNA
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gacatggcta cgatccgact tcctatagat aaatgtagta gaattatacc tgcacg 56
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<212>DNA
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gacatggcta cgatccgact tctacagcat tctgtgaatt ataaggtgaa ataaag 56
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gacatggcta cgatccgact tgtaagagaa ttccttacac gtaaccct 48
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gacatggcta cgatccgact tatgacaccc ctcgacatcg aa 42
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gacatggcta cgatccgact tctaacatgt ttatcacccg cgaaga 46
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gacatggcta cgatccgact taattatagg atattcaata gtccagtcaa cacg 54
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gacatggcta cgatccgact ttagctagtt gtgatgcaat catgactag 49
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gacatggcta cgatccgact tcaccaccta aattgcaacg tgttatac 48
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gacatggcta cgatccgact tatatagatt atgtaccact aaagtctgct acg 53
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gacatggcta cgatccgact ttatatctac tattggtgtt tgttctatga ctgac 55
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gacatggcta cgatccgact ttgggatttt attatttcaa caaaatcatc aagtaa 56
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gacatggcta cgatccgact tagtacagtt aaaaactatt tcataacaga tgcg 54
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gacatggcta cgatccgact ttttgtaaca tttttagtct tagggtcgta ca 52
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gacatggcta cgatccgact tgtacataca gctaataaat gggatctcat tattag 56
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gacatggcta cgatccgact tcaataaaac aagaaaaaca aacattgttc gtttag 56
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gacatggcta cgatccgact tgtagactta taattagaga aaacaacaga gttgtt 56
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gacatggcta cgatccgact tccatcaata ttcttaaaca caaattccct aagatt 56
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gacatggcta cgatccgact tgagttcaga gtttattcta gtgcgaataa ttg 53
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gacatggcta cgatccgact tgaaaatgat gcggaattat ataggacaga ataatc 56
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gacatggcta cgatccgact tccaacagaa tctattgtta gatttcctaa tattac 56
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gacatggcta cgatccgact tttaaccaaa ttagtagact ttttaggtcc acaa 54
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gacatggcta cgatccgact tatacagagt agtagtactt tcttttgaac ttctac 56
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gacatggcta cgatccgact tgtaaaattt gtgggtatgg caatagagtt attag 55
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gacatggcta cgatccgact ttagttatca gactcagact aattctcctc g 51
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gacatggcta cgatccgact tccagaagtg attgtacccg ctaac 45
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gacatggcta cgatccgact tgtgcacaaa agtttaacgg ccttac 46
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gacatggcta cgatccgact tctgactgag ggaaggacat aagatgata 49
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gacatggcta cgatccgact tctactaaaa tgtcagagtg tgtacttgga c 51
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gacatggcta cgatccgact tcataattgt caccattact atggcaatca ag 52
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<211>52
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gacatggcta cgatccgact tagaatttaa atgaatctct catcgatctc ca 52
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<212>DNA
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gacatggcta cgatccgact tcttacaaag tttatactct gcaagaagta gacta 55
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<212>DNA
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gacatggcta cgatccgact tgttgttgtt tgtaacagtt tactcacacc 50
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<212>DNA
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gacatggcta cgatccgact tcgctagtag tcgtcgtcgg tt 42
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gacatggcta cgatccgact ttccaaattc acacaatcga cggtt 45
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<211>45
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gacatggcta cgatccgact tcctacaaga caagccattg cgata 45
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gacatggcta cgatccgact tctgtttaca gaataaattg gatcaccgg 49
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gacatggcta cgatccgact ttttaattat gaggtttatg atgtaatcaa gattcc 56
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<211>56
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gacatggcta cgatccgact tagcagagat attactaatt attatgagga ctttta 56
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gacatggcta cgatccgact tacaagaaat ttcatgttcg tttaggcg 48
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<211>56
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gacatggcta cgatccgact taattatgct tattatcttt tggttctcac ttgaac 56
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<211>41
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gacatggcta cgatccgact tcgacgttgt tttgatcgcg c 41
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gacatggcta cgatccgact tgaaatgcac cccgcattac gt 42
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gacatggcta cgatccgact tctttaccag acattttgct ctcaagc 47
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<211>42
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gacatggcta cgatccgact tgttcctcat cacgtagtcg ca 42
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gacatggcta cgatccgact ttgcaattgt ttggagaaat catccaaatc 50
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gacatggcta cgatccgact ttgatgaaac tcaagcctta ccgc 44
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gacatggcta cgatccgact ttgtcattct cctaagaagc 40
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cgcttggcct ccgacttgaa ctcacccgtt gactccg 37
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cgcttggcct ccgacttgag aataatctag gaaaagcatc acccg 45
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cgcttggcct ccgacttgtc cttcctagct cttttccaga aatc 44
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cgcttggcct ccgacttggt taaatatagc tgctgacctt tctgta 46
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cgcttggcct ccgacttgta tatggtaacc ttgtgtccct caatatg 47
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cgcttggcct ccgacttctc cccaccttga aaggaaatta tg 42
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cgcttggcct ccgacttctc ccacctttct catccaagac t 41
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cgcttggcct ccgacttttg ctgtagccaa attcgttgtc ata 43
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cgcttggcct ccgactttta aaaagtgcag ggtctggcg 39
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<211>38
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cgcttggcct ccgacttgcc gttatccgta tcctgagc 38
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cgcttggcct ccgacttagt acgtggaaaa cggcg 35
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<211>45
<212>DNA
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cgcttggcct ccgacttctg atactgtcat cagcattacg tcatc 45
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cgcttggcct ccgacttaga agcatgccgg agcaaa 36
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<211>36
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cgcttggcct ccgacttgtc gatgcggcga ccaaat 36
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cgcttggcct ccgacttgat ttgaatcctc cggctcc 37
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cgcttggcct ccgacttatt attatcacga gtacggtgga aa 42
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cgcttggcct ccgactttcc ctgcctgaac atgaga 36
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<211>35
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cgcttggcct ccgacttcat gcaacaaact gcccg 35
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cgcttggcct ccgactttga acttccgtta atcatcgaac 40
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cgcttggcct ccgacttatt aaaggtttat accttcccag 40
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cgcttggcct ccgacttcag ttcgagcatc cgaacgttt 39
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cgcttggcct ccgactttta gtagaagttg aaaaaggcgt tttgc 45
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cgcttggcct ccgacttttc atagctcttt tcagaacgtt ccg 43
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cgcttggcct ccgacttctt tattgacact aagaggggtg tatactg 47
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<211>41
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cgcttggcct ccgactttac aacctatgtt agcgctagca c 41
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cgcttggcct ccgacttggc ttgaaaacca ttcttcgtaa gg 42
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cgcttggcct ccgactttac aactagattg ttagtagcca aatcagatg 49
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cgcttggcct ccgacttcta taacaatact agatggaatt tcacagtatt c 51
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cgcttggcct ccgacttctt cactagtagg ttgttctaat ggttgtaaat 50
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cgcttggcct ccgactttct aaaagcccca aaagaaatta tcttcttaga 50
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cgcttggcct ccgacttttt accttggtaa tcatcttcag taccatac 48
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cgcttggcct ccgacttcta cttatttgat gagtctggtg agtttaaatt g 51
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cgcttggcct ccgacttctt tgttaacatt tgggccgaca ac 42
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cgcttggcct ccgacttaag ttgaatctga tgattacata gctactaatg g 51
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cgcttggcct ccgacttctc ttgaacaaca tcacccacta tatatgg 47
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<213>Artificial sequence
<400>178
cgcttggcct ccgacttcag aaaacttgtt actttatatt gacattaatg gc 52
<210>179
<211>44
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>179
cgcttggcct ccgacttcac tttgagagat ctcatatacc gagc 44
<210>180
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>180
cgcttggcct ccgacttcgt cacttatcaa cacacttaac gatcta 46
<210>181
<211>50
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>181
cgcttggcct ccgactttat ttccactttt tagtgtgatt taatgctgac 50
<210>182
<211>49
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>182
cgcttggcct ccgactttta tgttttacct aatgatgaca ctctacgtg 49
<210>183
<211>52
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>183
cgcttggcct ccgacttaag tttctttaga agttatatgt ttatagtgac ca 52
<210>184
<211>47
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>184
cgcttggcct ccgacttaac ttaagcatgg tacatttact tgtgcta 47
<210>185
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>185
cgcttggcct ccgacttacg tatacaccag gtatttggtt tatacg 46
<210>186
<211>51
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>186
cgcttggcct ccgacttaag gagctaaatt gttacataaa cctattgttt g 51
<210>187
<211>50
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>187
cgcttggcct ccgacttcac tcttaacagt attctttgct atagtagtcg 50
<210>188
<211>52
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>188
cgcttggcct ccgacttctt tattgctaca attgtgtact tttactagaa gt 52
<210>189
<211>47
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>189
cgcttggcct ccgacttaga tgtacattct aaccatagct gaaatcg 47
<210>190
<211>51
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>190
cgcttggcct ccgactttct tggcttatgt ggttaataat taatcttgta c 51
<210>191
<211>48
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>191
cgcttggcct ccgacttcta atgcctgatc tagtaacagt ataggttg 48
<210>192
<211>52
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>192
cgcttggcct ccgacttgtt tttgatggta aatcaaaatg tgaagaatca tc 52
<210>193
<211>52
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>193
cgcttggcct ccgacttaat tattaacaat tttaccaccc ttaagtgcta tc 52
<210>194
<211>43
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>194
cgcttggcct ccgacttcaa ctacgaaaac aaatacgtag tgc 43
<210>195
<211>50
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>195
cgcttggcct ccgacttctt accagaagca tctttaaaaa ttgtacattc 50
<210>196
<211>50
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>196
cgcttggcct ccgacttatc tgttacacac catcaaaact tatagagtac 50
<210>197
<211>52
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>197
cgcttggcct ccgacttgag tacagtgaat gacataagga atagtaaagt at 52
<210>198
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>198
cgcttggcct ccgactttat agtagctggt ggtattgtag ctatcg 46
<210>199
<211>47
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>199
cgcttggcct ccgactttta cttgtaccat acaaccctca actttac 47
<210>200
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>200
cgcttggcct ccgactttaa ctcaggttct gatgttcttt accaac 46
<210>201
<211>49
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>201
cgcttggcct ccgactttaa aacattaact gtaatagttg tgtccgtac 49
<210>202
<211>49
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>202
cgcttggcct ccgacttaga cttagaaggt aacttttatg gaccttttg 49
<210>203
<211>50
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>203
cgcttggcct ccgacttgca tatagaccat attaaaataa gctacagtgg 50
<210>204
<211>48
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>204
cgcttggcct ccgacttgcc tttttacctt ttgctatggg tattattg 48
<210>205
<211>52
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>205
cgcttggcct ccgacttata tatctaaact cctgtgtaga aactaagtaa tc 52
<210>206
<211>52
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>206
cgcttggcct ccgacttggt aatacacttc agtgtataat gctagtttat tg 52
<210>207
<211>51
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>207
cgcttggcct ccgacttact tcttcaactt tttaagaaca acttcagaat c 51
<210>208
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>208
cgcttggcct ccgacttctc agagtttagt tcccttccat catatg 46
<210>209
<211>44
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>209
cgcttggcct ccgacttctt tgttgtgttg tagtaagcta acgc 44
<210>210
<211>48
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>210
cgcttggcct ccgacttgct gtcaaattac agaataatga gcttagtc 48
<210>211
<211>52
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>211
cgcttggcct ccgactttag gtatttgtac atacttacct tttaagtcac aa 52
<210>212
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>212
cgcttggcct ccgacttgtc aggcaataac agttacaccg g 41
<210>213
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>213
cgcttggcct ccgacttcat tgtgtattta gtaagacgtt gacgtg 46
<210>214
<211>50
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>214
cgcttggcct ccgacttcta aacatgactt ctttaagttt agaatagacg 50
<210>215
<211>50
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>215
cgcttggcct ccgacttgta tgtctgatcc caatatttaa aataacggtc 50
<210>216
<211>50
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>216
cgcttggcct ccgacttatt aagtgggatt tgttaaaata tgacttcacg 50
<210>217
<211>47
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>217
cgcttggcct ccgacttata acgatagtag tcataatcgc tgatagc 47
<210>218
<211>45
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>218
cgcttggcct ccgacttctt ttcaaactgt caaacccggt aattt 45
<210>219
<211>49
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>219
cgcttggcct ccgacttcta tcacatttag gataatccca acccataag 49
<210>220
<211>51
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>220
cgcttggcct ccgacttcac aacatgttaa aaactgttta tagtgatgta g 51
<210>221
<211>48
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>221
cgcttggcct ccgacttggt acacataatc atcaccctgt ttaactag 48
<210>222
<211>52
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>222
cgcttggcct ccgactttct ttattatcaa aacaatgttt ttatgtctga ag 52
<210>223
<211>51
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>223
cgcttggcct ccgacttgtg gtttatgtga tttacaataa tagctcatac c 51
<210>224
<211>50
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>224
cgcttggcct ccgacttaca taaattagtc ttgtctgtta atccgtatgt 50
<210>225
<211>49
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>225
cgcttggcct ccgacttgta taagccagta attctaacat agtgctctt 49
<210>226
<211>50
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>226
cgcttggcct ccgacttcaa attaaatgtt ggtgattatt ttgtgctgac 50
<210>227
<211>49
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>227
cgcttggcct ccgacttcat gtctggacct atagttttca taagtctac 49
<210>228
<211>42
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>228
cgcttggcct ccgactttaa gcactatgtg tacattggcg ac 42
<210>229
<211>52
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>229
cgcttggcct ccgacttatt accttactac aatctttaaa gagtcctgtt ac 52
<210>230
<211>47
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>230
cgcttggcct ccgacttatt tacaagtctt gaaattccac gtaggaa 47
<210>231
<211>51
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>231
cgcttggcct ccgacttgtc ctattttcac aaaatacttc atagatgtca a 51
<210>232
<211>47
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>232
cgcttggcct ccgacttcac ttaaaaatct ctctgacaga gtcgtat 47
<210>233
<211>49
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>233
cgcttggcct ccgactttac aaacaatgga attagcagga tatctatcg 49
<210>234
<211>52
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>234
cgcttggcct ccgacttgct tataaaatag aagaattatt ctattcttat gc 52
<210>235
<211>52
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>235
cgcttggcct ccgacttact tttgtgtaaa cagtgttatt aatgatagaa ac 52
<210>236
<211>50
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>236
cgcttggcct ccgacttttt taatgttgta aataagggac actttgatgg 50
<210>237
<211>52
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>237
cgcttggcct ccgactttaa tttataccgt tcaatgaatt catccatagc ta 52
<210>238
<211>51
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>238
cgcttggcct ccgacttaat tattataaga aagttgatgg tgttgtccaa c 51
<210>239
<211>51
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>239
cgcttggcct ccgactttta aatattgaca cagttgagta tattttgcga c 51
<210>240
<211>51
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>240
cgcttggcct ccgacttcta ttagaaaagt gtgaccttca aaattatggt g 51
<210>241
<211>41
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>241
cgcttggcct ccgacttata accatctatt tgttcgcgtg g 41
<210>242
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>242
cgcttggcct ccgacttctt tgttactaat gtgaatgcgt catcat 46
<210>243
<211>49
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>243
cgcttggcct ccgactttac caaaaatcca gcctcttatt atgttagac 49
<210>244
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>244
cgcttggcct ccgacttgga ccaatggtac taagaggttt gataac 46
<210>245
<211>51
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>245
cgcttggcct ccgacttttt taatagaaaa gtcctaggtt gaagataacc c 51
<210>246
<211>50
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>246
cgcttggcct ccgacttttt acatagaagt tatttgactc ctggtgattc 50
<210>247
<211>51
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>247
cgcttggcct ccgacttcta tacaggtaat tataattacc accaacctta g 51
<210>248
<211>44
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>248
cgcttggcct ccgacttaga tgattttaca ggctgcgtta tagc 44
<210>249
<211>44
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>249
cgcttggcct ccgacttaac ctgtagaata aacacgccaa gtag 44
<210>250
<211>48
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>250
cgcttggcct ccgacttgtt ataacaccag gaacaaatac ttctaacc 48
<210>251
<211>52
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>251
cgcttggcct ccgacttttg tgaaaaatta aaaccaccaa aatctttaat tg 52
<210>252
<211>47
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>252
cgcttggcct ccgacttagt ttttgtacac aattaaaccg tgcttta 47
<210>253
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>253
cgcttggcct ccgacttgag ctaagttgtt taacaagcgt gtttaa 46
<210>254
<211>50
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>254
cgcttggcct ccgacttatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc 50
<210>255
<211>52
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>255
cgcttggcct ccgacttaat atttatctaa ctcctccttg aatgagtcta at 52
<210>256
<211>52
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>256
cgcttggcct ccgacttcaa aggaattttt atgaaccaca aatcattact ac 52
<210>257
<211>40
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>257
cgcttggcct ccgacttgag tgaggcttgt atcggtatcg 40
<210>258
<211>50
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>258
cgcttggcct ccgacttagt caaattacat tacacataaa cgaacttatg 50
<210>259
<211>50
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>259
cgcttggcct ccgacttctt ttactccaga ttcccatttt tcagtataac 50
<210>260
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>260
cgcttggcct ccgacttttt gctggcatac taattgttac gactat 46
<210>261
<211>52
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>261
cgcttggcct ccgacttaaa cagaaaaact aatataatat ttagttcgtt ta 52
<210>262
<211>50
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>262
cgcttggcct ccgacttgag tcttgtaaaa ccttcttttt acgtttactc 50
<210>263
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>263
cgcttggcct ccgacttcca atttgtaata agaaagcgtt cgtgat 46
<210>264
<211>40
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>264
cgcttggcct ccgactttag aaagtgaact cgtaatcgga 40
<210>265
<211>42
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>265
cgcttggcct ccgactttaa ctgatagacg tgttttacgc cg 42
<210>266
<211>47
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>266
cgcttggcct ccgacttaat tcaccatttc atcctctagc tgataac 47
<210>267
<211>46
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>267
cgcttggcct ccgacttaac aggaaactgt ataattaccg atatcg 46
<210>268
<211>52
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>268
cgcttggcct ccgactttca cttctattct aaatggtata ttagagtagg ag 52
<210>269
<211>38
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>269
cgcttggcct ccgacttgtt gcaacccata tgatgccg 38
<210>270
<211>47
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>270
cgcttggcct ccgactttcc aagatggtat ttctactacc taggaac 47
<210>271
<211>38
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>271
cgcttggcct ccgacttatt ccgaagaacg ctgaagcg 38
<210>272
<211>42
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>272
cgcttggcct ccgacttgat tacaaacatt ggccgcaaat tg 42
<210>273
<211>43
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>273
cgcttggcct ccgacttatt gttcactgta cactcgatcg tac 43
<210>274
<211>35
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>274
cgcttggcct ccgactttca tgcagaccac acaag 35

Claims (10)

1.一种检测SARS-CoV-2的试剂盒，包括SARS-CoV-2引物组；
所述SARS-CoV-2引物组包括若干个特异引物对甲；每个特异引物对甲由上游特异引物甲和下游特异引物甲组成；
上游特异引物甲从5’末端到3’末端依次包括DNA片段1和DNA片段3；
下游特异引物甲从5’末端到3’末端依次包括DNA片段2和DNA片段4；
DNA片段3和DNA片段4分别与SARS-CoV-2的基因组上的两个区段相同或互补；
每个特异引物对甲的DNA片段3和DNA片段4的核苷酸序列不同，可结合至SARS-CoV-2的基因组上的不同位置；每个特异引物对甲检测的靶区域长度为300-400bp；所有特异引物对甲的靶区域拼接后可以覆盖SARS-CoV-2的基因组。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括内参引物组和/或外参引物组；
所述内参引物组包括若干个特异引物对乙；每个特异引物对乙由上游特异引物乙和下游特异引物乙组成；
上游特异引物乙从5’末端到3’末端依次包括DNA片段1和DNA片段5；
下游特异引物乙从5’末端到3’末端依次包括DNA片段2和DNA片段6；
DNA片段5和DNA片段6分别与人内参基因上的两个区段相同或互补；
每个特异引物对乙的DNA片段5和DNA片段6的核苷酸序列不同，可结合至人内参基因上的不同位置；每个特异引物对乙检测的靶区域长度为300-400bp；所有特异引物对乙的靶区域拼接后可以完全或部分覆盖人内参基因；
所述外参引物组包括若干个特异引物对丙；每个特异引物对丙由上游特异引物丙和下游特异引物丙组成；
上游特异引物丙从5’末端到3’末端依次包括DNA片段1和DNA片段7；
下游特异引物丙从5’末端到3’末端依次包括DNA片段2和DNA片段8；
DNA片段7和DNA片段8分别与特异DNA的两个区段相同或互补；
每个特异引物对丙的DNA片段7和DNA片段8的核苷酸序列不同，可结合至特异DNA上的不同位置；每个特异引物对丙检测的靶区域长度为300-400bp；所有特异引物对丙的靶区域拼接后可以完全或部分覆盖特异DNA；
所述特异DNA的核苷酸序列已知。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括通用引物和/或标签引物；
所述通用引物包括DNA片段乙；DNA片段1为DNA片段乙3’末端的一部分；
所述标签引物从5’末端到3’末端包括DNA片段丙和DNA片段丁；DNA片段2为DNA片段丁3’末端的一部分。
4.如权利要求1至3任一所述的试剂盒，其特征在于：所述人内参基因为GAPDH基因；所述特异DNA为lambdaDNA。
5.如权利要求1至4任一所述的试剂盒，其特征在于：所述SARS-CoV-2引物组包括113个特异引物对甲；所述内参引物组包括14个特异引物对乙；所述外参引物组包括10个特异引物对丙；
14个上游特异引物乙的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：14所示；
与之对应的下游特异引物乙的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：138至SEQ ID NO：151所示；
10个上游特异引物丙的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：15至SEQ ID NO：24所示；
与之对应的下游特异引物丙的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：152至SEQ ID NO：161所示；
113个上游特异引物甲的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：25至SEQ ID NO：137所示；
与之对应的下游特异引物甲的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：162至SEQ ID NO：274所示。
6.权利要求1至5中任一所述SARS-CoV-2引物组、内参引物组和/或外参引物组在检测SARS-CoV-2中的应用。
7.一种获得待测样本中SARS-CoV-2的基因组序列和/或变异信息的方法，包括如下步骤：
(1)将待测样本的核酸和权利要求1或5中所述SARS-CoV-2引物组混合，之后进行逆转录和PCR扩增，得到PCR扩增产物1；
(2)以PCR扩增产物1为模板，采用权利要求3中所述通用引物和所述标签引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物2；
(3)取PCR扩增产物2，测序；根据测序结果，获得待测样本中SARS-CoV-2的基因组序列和/或变异信息。
8.一种检测待测样本中SARS-CoV-2分子数的方法，依次包括如下步骤：
(1)将待测样本的核酸、已知分子数的外参、权利要求1或5中所述SARS-CoV-2引物组和权利要求2或4中所述外参引物组混合，之后进行逆转录和PCR扩增，得到PCR扩增产物甲；
(2)以PCR扩增产物甲为模板，采用权利要求3中所述通用引物和所述标签引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物乙；
(3)取PCR扩增产物乙，测序；根据测序数据，获得SARS-CoV-2的reads数Cs和外参的reads数Cec；
(4)根据公式1获得待测样本中SARS-CoV-2分子数Ns；
Figure FDA0002503546750000021
Nec为外参的起始分子数，Eec为外参扩增的效率，Es为SARS-CoV-2扩增的效率，m为扩增的循环数。
9.一种检测待测样本中SARS-CoV-2浓度的方法，依次包括如下步骤：
(1)将待测样本的核酸、已知分子数的外参、权利要求1或5中所述SARS-CoV-2引物组、权利要求2或4中所述内参引物组和所述外参引物组混合，之后进行逆转录和PCR扩增，得到PCR扩增产物a；
(2)以PCR扩增产物a为模板，采用权利要求3中所述通用引物和所述标签引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物b；
(3)取PCR扩增产物b，测序；根据测序数据，获得SARS-CoV-2的reads数Cs、外参的reads数Cec和内参的reads数Cic；
(4)根据公式1获得待测样本中SARS-CoV-2分子数Ns；
Figure FDA0002503546750000022
Nec为外参的起始分子数，Eec为外参扩增的效率，Es为SARS-CoV-2扩增的效率，m为扩增的循环数；
(5)根据公式2获得待测样本中SARS-CoV-2浓度Ns/Nic，
Figure FDA0002503546750000031
Nic为内参的起始分子数，Eic为内参扩增的效率，Es为SARS-CoV-2扩增的效率，m为扩增的循环数，Ns为待测样本中SARS-CoV-2分子数。
10.如权利要求7至9任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，进行逆转录和PCR扩增在同一个反应体系中先后进行。
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