CN111733291A - 数字pcr检测新型冠状病毒核酸的方法及试剂盒 - Google Patents

数字pcr检测新型冠状病毒核酸的方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了新型冠状病毒的数字PCR检测方法及试剂盒，具体地本发明针对新型冠状病毒ORF1ab基因和N基因设计了双重数字PCR检测体系，实验结果表明本发明的双重数字PCR检测体系具有极高的灵敏度和准确性。

Description

数字PCR检测新型冠状病毒核酸的方法及试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及利用数字PCR技术检测新型冠状病毒核酸的方法及试剂盒。
背景技术
2019新型冠状病毒(2019-noval Coronavirus,SARS-CoV-2)具有较强的传染性，主要通过呼吸道飞沫传播，亦可通过接触传播，其感染的临床症状主要是发热，可合并干咳、乏力、呼吸不畅等症状，流涕、咳痰等其他症状少见，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征(Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS)、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出现凝血功能障碍，严重危害人类的健康。
目前，新型冠状病毒核酸常用的检测方法包括荧光PCR、高通量测序法、恒温扩增等，荧光PCR技术存在灵敏度不佳，检测低浓度样本稳定性差等缺点，高通量测序技术虽然可对未知序列进行检测，但存在检测周期长、成本高昂且操作复杂、数据解读难等问题，而恒温扩增技术虽然检测时间短，但设计难度较大且假阳性较高等问题。
因此，本领域技术人员致力于开发灵敏度更高、准确性更佳的新型冠状病毒检测技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种数字PCR检测新型冠状病毒核酸的方法及试剂盒。
在本发明的第一方面，提供了一种用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2) 核酸的引物对集，所述引物对集包括：
第一引物对，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.:1所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.:2所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：
第二引物对，所述第二引物对组包括如SEQ ID NO.:3所示的正向引物；和，如SEQID NO.:4所示的反向引物。
在另一优选例中，所述引物对集还包括：
第三引物对，所述第三引物对组包括如SEQ ID NO.:5所示的正向引物；和，如SEQID NO.:6所示的反向引物。
本发明的第二方面，提供了一种检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸的探针集，所述探针集包括：SEQ ID NO.7所示的第一探针。
在另一优选例中，所述探针集还包括：SEQ ID NO.8所示的第二探针。
在另一优选例中，所述探针集还包括：SEQ ID NO.9所示的第三探针。
在另一优选例中，所述第一探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述第一探针的3’端包含有荧光淬灭基团。
在另一优选例中，所述第二探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述第二探针的3’端包含有荧光淬灭基团。
在另一优选例中，所述第三探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述第三探针的3’端包含有荧光淬灭基团。
在另一优选例中，所述第一探针标记的荧光报告基团不同于所述第三探针标记的荧光报告基团。
在另一优选例中，所述第二探针标记的荧光报告基团不同于所述第三探针标记的荧光报告基团。
本发明的第三方面，提供了一种用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对集。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针集。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含第一引物探针混合液，所述第一引物探针混合液中包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO.:2、 SEQ ID NO.:5、SEQID NO.:6、SEQ ID NO.:7、SEQ ID NO.:9所示的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述试剂盒包括第二容器，所述第二容器内包含第二引物探针混合液，所述第二引物探针混合液中包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO.:4、 SEQ ID NO.:5、SEQID NO.:6、SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO.:9所示的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含PCR 反应预混液。优选地，所述PCR反应预混液包含选自下组的一种或多种组分：热启动Taq酶、逆转录酶、dNTPs、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含阳性对照。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括第五容器，所述第五容器内包含阴性对照。优选地，所述阴性对照为纯水。
本发明的第四方面，提供了一种检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸的方法，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测对象的核酸样本；
(2)制备dPCR反应体系并进行dPCR检测：
其中，所述dPCR反应体系包括：步骤(1)提供的所述核酸样本、本发明第一方面所述的引物对集、和本发明第二方面所述的探针集。
在另一优选例中，所述dPCR反应体系包括ORF1ab基因反应体系，所述ORF1ab基因反应体系包括步骤(1)提供的所述核酸样本和第一引物探针混合液，所述第一引物探针混合液包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO.:2、SEQ ID NO.:5、 SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:7、SEQID NO.:9所示的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述dPCR反应体系包括N基因反应体系，所述N基因反应体系包括步骤(1)提供的所述核酸样本和第二引物探针混合液，所述第二引物探针混合液包含SEQID NO：3、SEQ ID NO.:4、SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:6、SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO.:9所示的多核苷酸序列。
在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的检测方法。
在另一优选例中，所述PCR反应体系还包括阳性质控品，和/或阴性质控品。
在另一优选例中，所述核酸样本可来自咽拭子样本、肺泡灌洗液样本、血液样本、痰液样本、粪便样本或环境样本。
本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对集、和/或本发明第二方面所述的探针集的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1：本发明检测新型冠状病毒ORF1ab基因阴性对照的dPCR结果示意图；
图2：本发明检测新型冠状病毒ORF1ab基因阳性对照的dPCR结果示意图；
图3：本发明检测新型冠状病毒N基因阴性对照的dPCR结果示意图；
图4：本发明检测新型冠状病毒N基因阳性对照的dPCR结果示意图；
图5：本发明内标基因阴性对照的dPCR结果示意图；
图6：本发明内标基因阳性对照的dPCR结果示意图；
图7：本发明引物探针组合体系多重荧光PCR检测结果示意图；
图8：本发明检测新型冠状病毒N基因对照引物对和探针组1的dPCR结果示意图；
图9：本发明检测新型冠状病毒N基因对照引物对和探针组2的dPCR结果示意图；
图10：本发明检测新型冠状病毒ORF1ab基因对照引物对和探针组1的dPCR 结果示意图；
图11：本发明检测新型冠状病毒ORF1ab基因对照引物对和探针组2的dPCR 结果示意图。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，针对新型冠状病毒ORF1ab基因、N基因和内标RNase P基因设计了多重数字PCR检测体系，实验结果表明本发明的多重数字PCR检测体系具有极高的灵敏度和准确性。
具体地，本发明多重数字PCR检测体系目标涵盖SARS-CoV-2病毒核酸检测的2个主要靶标基因OFR1ab基因和N基因，灵敏度可达到200copies/mL，具有极高的灵敏度。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、 99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
数字PCR(digital PCR，dPCR)
数字PCR(digital PCR，dPCR)，dPCR能实现核酸分子的绝对定量，在检测新型冠状病毒核酸时具有较高的灵敏度、特异性及准确度。其通过物理或化学分割的方式，将一个荧光PCR反应体系分配到上万个微小的反应器中，在每个微反应器中包含或不包含1个或多个拷贝的目标核酸分子，进行“单分子模板PCR扩增”。扩增结束后，通过阳性反应单元的数目和统计学方法计算原始样本中靶基因的拷贝数。该方法具有灵敏度高，抗干扰能力强，检测结果稳定，不依赖标准曲线进行绝对定量等优点。
利用数字PCR技术针对新型冠状病毒ORF1ab基因和N基因进行检测，同时以人类管家基因RNase P为内参，该方法具有较高的灵敏度，检测低浓度样本结果较为稳定，同时能直接对核酸进行定量，检测结果更为直观可靠。
利用数字PCR技术针对新型冠状病毒进行检测，具有较高的灵敏度，非常有利于疫情防控。但是，由于数字PCR的灵敏度极高，因此对检测体系中引物探针组合的特异性要求很高，引物探针组合的设计难度较大。
多重PCR
多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR 反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。
影响多重PCR反应的因素有很多，比如：
(1)反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是 DNA聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。
(2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。
(3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。
(4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。
虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。
在一个优选地实施方式中，本发明提供了一种基于管内芯片式数字PCR平台，定量检测疑似新型冠状病毒肺炎患者鼻咽拭子、咽拭子、痰液或肺泡冠洗液等样本中SARS-CoV-2 OFR1ab、N基因及人源内标基因RNase P的方法、引物、探针及其试剂盒，具有检测操作简单、绝对定量、灵敏度高、特异性强及重复性好等优点。
在一个优选地实施方式中，本发明提供技术方案如下：
一种基于管内芯片式数字PCR平台的鼻咽拭子、咽拭子、痰液或肺泡冠洗液等样本SARS-CoV-2 OFR1ab、N基因及人源内标基因RNase P检测的方法、引物、探针及其试剂盒。提供了用于检测SARS-CoV-2 OFR1ab、N基因检测所需的特异性引物、探针及试剂盒预混液。
本发明公开了一种可检测疑似新型冠状病毒肺炎患者鼻咽拭子、咽拭子、痰液或肺泡冠洗液样本中SARS-CoV-2 OFR1ab、N基因及人源内标基因RNase P 的引物、和探针：
引物包括检测针对SARS-CoV-2OFR1ab、N基因及人源内标基因RNase P 的引物：检测针对SARS-CoV-2OFR1ab基因的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO： 1所示，检测针对SARS-CoV-2OFR1ab基因的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，检测针对SARS-CoV-2N基因的上游引物序列如SEQ ID NO：3所示，检测针对SARS-CoV-2N基因的下游引物序列如SEQ ID NO：4所示，检测针对人管家基因RNase P的上游引物序列如SEQ ID NO：5所示，检测针对人管家基因RNase P的下游引物序列如SEQ ID NO：6所示；
探针包括检测针对SARS-CoV-2OFR1ab、N基因及人源内标基因RNase P 的探针：检测针对SARS-CoV-2OFR1ab基因的荧光探针核苷酸序列如SEQ ID NO： 7所示，检测针对SARS-CoV-2N基因的荧光探针序列如SEQ ID NO：8所示，检测针对人管家基因RNase P的荧光探针序列如SEQ ID NO：9所示。
进一步，SEQ ID NO：7核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有MGB， SEQ ID NO：8核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有BHQ1，SEQ ID NO： 9核苷酸序列的5’端标记有VIC、3’端标记有BHQ2。
优选地，上游引物在反应体系中的终浓度为1μmol/L，下游引物在反应体系中的终浓度为1μmol/L，突变型探针在反应体系中的终浓度为0.2 μmol/L，野生型探针在反应体系中的终浓度为0.2μmol/L；
检测针对SARS-CoV-2OFR1ab、N基因及人源内标基因RNase P的引物探针核苷酸序列信息如下：
Figure BDA0002592265850000071
特异性引物和探针，能够准确检测人是否感染新型冠状病毒，可以直接检出病毒核酸拷贝数。同时对SARS-CoV-2ORF1ab和N基因进行检测，对检测结果进行双重确认，以人管家基因RNase P为内标，对核酸质量进行监控，在确定样本质量合格的情况下对新型冠状病毒疑似感染者进行检测确诊。
上述特异性引物和探针所制备的试剂盒，基于管内芯片式数字PCR平台可检测SARS-CoV-2ORF1ab和N基因，为患者的及时确诊及隔离治疗提供确诊依据。
在本发明的一个优选地实施方式中，本发明还公开了一种人鼻咽拭子、咽拭子、痰液或肺泡冠洗液样本核酸SARS-CoV-2核酸检测试剂盒，包括用于配制dPCR反应的引探混合物、5×RNA buffer、热启动Taq酶和逆转录酶、ClarityTM JN Solution(20×)、对照样本和RNase-free水，其中，引物探针混合液包括如下成分，如表1，
表1.引物探针混合液
Figure BDA0002592265850000081
其中，用于检测ORF1ab基因和内标的引物与探针分别如下：
检测ORF1ab基因和内标的引物：检测针对SARS-CoV-2OFR1ab基因的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，检测针对PSARS-CoV-2OFR1ab基因的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，检测针对人管家基因RNase P的上游引物序列如SEQ ID NO：5所示，检测针对人管家基因RNase P的下游引物序列如SEQ ID NO：6所示；
检测ORF1ab基因和内标的探针：检测针对SARS-CoV-2OFR1ab基因的荧光探针核苷酸序列如SEQ ID NO：7，其5’端标记有FAM荧光报告基团，3’端标记有MGB，检测针对人管家基因RNase P的荧光探针序列如SEQ ID NO：9 所示；其5’端标记有VIC荧光报告基团，3’端标记有BHQ2荧光淬灭基团。
用于检测N基因和内标的引物与探针分别如下：
检测N基因和内标的引物：检测针对SARS-CoV-2N基因的上游引物序列如SEQ IDNO：3所示，检测针对SARS-CoV-2N基因的下游引物序列如SEQ ID NO：4所示，检测针对人管家基因RNase P的上游引物序列如SEQ ID NO：5 所示，检测针对人管家基因RNase P的下游引物序列如SEQ ID NO：6所示；
检测N基因和内标的探针：检测针对SARS-CoV-2N基因的荧光探针序列如SEQ IDNO：8所示，其5’端标记有FAM荧光报告基团，3’端标记有BHQ1 荧光淬灭基团，检测针对人管家基因RNase P的荧光探针序列如SEQ ID NO： 9所示；其5’端标记有VIC荧光报告基团，3’端标记有BHQ2荧光淬灭基团。
检测SARS-CoV-2时，OFR1ab基因上下游引物和探针，分别与所扩增的目的片段，分别释放FAM荧光信号；N基因上下游引物和探针，分别与所扩增的目的片段，分别释放FAM荧光信号；内控引物与探针是根据人管家基因保守片段设计并合成的，用于样本和实验过程的监控；
PCR反应液的5×RNA buffer包括如下成分，如表2，
表2. 5×RNA buffer
编号 组分 组分中的主要成分
1 5×RNA buffer (NH4)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>、KCl、Tris-HCl、MgCl<sub>2</sub>、DTT
对照品包括如下成分，如表3，
表3.对照样本
编号 组分 组分中的主要成分
1 阴性对照 DEPC水
2 阳性对照 人工制备病毒样颗粒
阳性对照的为人工制备的SARS-CoV-2OFR1ab基因、N基因及内标基因病毒样颗粒，阴性对照样本为DEPC水。
本发明试剂盒适用样本为人鼻咽拭子、咽拭子、痰液或肺泡冠洗液样本。
本发明试剂盒用于判定检测有效性的标准为：每次检测均设置阴性对照组和阳性对照组，当检测结果的阳性对照组为阳性，且阴性对照组均为阴性时，表明实验结果有效。
在本发明一个优选地实施方式中，本发明还公开了一种SARS-CoV-2病毒核酸定量检测的方法，具体步骤包括：
1.处理待测样本并提取核酸样本，可以是人鼻咽拭子、咽拭子、痰液或肺泡冠洗液样本优选地，待测样本为鼻咽拭子、咽拭子。
2.配制PCR反应体系，将特异性引物和探针、5×RNA buffer、热启动Taq 酶和逆转录酶，加入提取的核酸6μL，制备得到ORF1ab基因dPCR反应液和 N基因dPCR反应液；dPCR反应液构成分别如表4和表5。
表4.ORF1ab基因dPCR反应液
检测ORF1ab基因和内标的引探混合液A1 1μL
核酸 7μL
5×RNA buffer 3μL
热启动Taq酶+逆转录酶 3μL
Clarity<sup>TM</sup> JN Solution(20×) 0.75μL
DEPC水 0.25μL
表5.N基因dPCR反应液
检测N基因和内标的引探混合液A2 1μL
核酸 7μL
5×RNA buffer 3μL
热启动Taq酶+逆转录酶 3μL
Clarity<sup>TM</sup> JN Solution(20×) 0.75μL
DEPC水 0.25μL
3.打开DAAN Starry SKY样本前处理系统，从芯片盒中取出八联管芯片及样本前处理辅助器；
4.打开八联管芯片的盖子，将样本前处理辅助器中的梳样平板插入到八连管芯片中，然后固定至DAAN Starry SKY样本前处理系统微反应制备模块；
5.将样本前处理辅助器中的推样器安置在DAAN Starry SKY样本前处理系统微反应制备模块上，关紧闩锁；
6.吸取15μL PCR反应混合液至推样器的三角形尖端，注意避免产生气泡；
7.按“开始”按钮使推样器将PCR反应混合液轻轻推至芯片上；
8.松开闩锁，取下推样器和梳样平板，取出芯片，观察并确认PCR反应液是否已均匀的涂抹在八联管中的芯片上；
9.打开DAAN Starry SKY样本前处理系统封闭模块，将制备的载有PCR反应液的八联管芯片插入DAAN Starry SKY样本前处理封闭模块卡槽中，关闭DAAN Starry SKY样本前处理系统封闭模块仓门，按“开始”按钮使残留在芯片表面的PCR反应混合液完全进入微反应室中，完成芯片的制备；
10.芯片制备完成后，取出八联管芯片，观察芯片表面是否存在液体残留，若存在残留重复9一次；
11.将制备的芯片取出加入235μL封闭液，盖紧管盖，置入PCR仪中进行扩增。
12.按以下程序设置PCR扩增同时热盖温度设定为：100℃，体积为50μL。条件：
Figure BDA0002592265850000111
13.用DAAN Starry SKY阅读仪和软件进行结果分析，并基于泊松分布统计原理计算出各样本中靶标分子的拷贝数。
本申请采用dPCR检测原理如下：dPCR技术是把单个PCR管中的反应试剂划分成约上万个微反应，每个微反应中或不含待检核酸靶标分子，或含有1个至数个待检核酸靶分子，且每个微反应都作为一个独立的PCR反应单元。PCR 过程结束后，对微反应逐个进行荧光检测，识别出阴/阳性反应。含有不同DNA 模板的微反应释放出不同荧光信号，没有模板的微反应则不产生荧光信号。最后，根据泊松分布统计原理及阳性微反应的比例计算出待检靶标分子拷贝数。由于dPCR结果的判读仅判断有无扩增，不依赖Ct值，对PCR反应抑制剂的耐受能力大大提高，不需要参考品和标准曲线就可以精确定量，为本专利提供了一种全新的技术思路与手段。
本发明的主要优点在于：
(1)使用本发明提供的特异性引物与探针，能够快速、高灵敏且稳定地检测疑似感染者是否感染新型冠状病毒。本发明能最低能检测出的病毒拷贝数为 200copies/mL，具有较高的灵敏度。；
(2)本发明提供的新型冠状病毒的数字PCR检测方法及试剂盒操作过程简单、所需样本浓度低、性能稳定高效、高准确性、高特异性等优点，能对新型冠状病毒进行定量检测，分辨出单个拷贝的差异，实现真正意义上的绝对定量，数据分析适合自动化完成，结果更为直观可靠。
(3)本发明适用于对疑似新型冠状病毒肺炎者进行SARS-CoV-2核酸检测，对患者进行确诊，辅助指导临床医生开展治疗工作。本方法同时可对患者 SARS-CoV-2核酸进行定量，用于治疗效果的动态监测，从而早期识别耐药或疾病进展，从而指导干预治疗。这是探索新型冠状病毒肺炎早期诊断与高效治疗的一条可行途径，值得推广应用。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1试剂盒及其使用方法
本实施例提供的新型冠状病毒核酸测试剂盒的组成成分、包装及数量(24 反应/盒)，如表6：
表6.试剂盒的组成成分、包装及数量
Figure BDA0002592265850000121
Figure BDA0002592265850000131
使用本实施例试剂盒的具体步骤如下：
步骤一、待测样本DNA模板提取
采集人咽拭子样本置于拭子头浸入含采样液管中，做好标记确保标签信息无误后，4℃保存。12h内取200μL液态样本及试剂盒中的阴性和阳性对照进行核酸提取，使用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂盒(磁珠法)粤穗械备20170583号和粤穗械备20150302号；也可使用其他的商业化产品；提取的模板核酸可直接用于后续实验或置于-80℃保存备用，避免反复冻融。
步骤二、dPCR体系的制备
dPCR体系配制前准备：取出试剂盒中的ORF1ab反应液A、N反应液A、PCR 反应预混液B等，室温融化，涡旋震荡混匀后离心10秒，配制dPCR体系；dPCR 体系构成如表6：
表7.SARS-CoV-2dPCR体系
Figure BDA0002592265850000132
所述引物探针的核苷酸序列信息分别如下：
表8.检测SARS-CoV-2核酸引物探针核苷酸序列信息
Figure BDA0002592265850000133
Figure BDA0002592265850000141
步骤三、加样
取步骤一所制备的样本核酸模板及对照样本各7μL，加样至步骤二配制的dPCR反应体系的八连管中，使每管dPCR反应液的总体积为15μL；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒，用于制备微反应；所述试剂盒的对照样本如表7：
表7试剂盒的对照样本
编号 组分 组分中的主要成分
1 阴性对照 DEPC水
2 阳性对照 人工制备的病毒样颗粒
所述阳性对照样本为分别含有SARS-CoV-2ORF1ab基因、N基因及内标 RNase P基因的人工制备的病毒样颗粒样本的混合物；阴性对照样本为DEPC水。
步骤四、制备微反应和PCR扩增
取15μL配制的dPCR反应液，借助DAAN StarryTM SKY 10K样本前处理系统将其自动、均匀地细分成10000个纳升级的反应单元并直接PCR反应扩增。 PCR扩增的反应条件：
Figure BDA0002592265850000151
步骤五、结果读取及分析
结果检测完成后，查看关于有效分区数量、总分区数量、有效分区与总分区数量之比、计算得到的每个样本的拷贝数/μL和阈值(Th)，通过阳性质控品和阴性质控品的参照及荧光信号的分布，可调节通道阈值。
实施例2：灵敏度检测及最低检出率实验
无阳性模板对照样本为含内标基因的核酸来源于Caco2细胞株；灵敏度参考品1-3由不同浓度梯度的含有SARS-CoV-2ORF1ab基因病毒样颗粒、N基因病毒样颗粒及内标基因病毒样颗粒混合物的样本组成，各混合液浓度分别为 1000copies/mL、500copies/mL、200copies/mL；阴性对照为DEPC水；
提取无阳性模板对照、阴性对照、灵敏度参考品核酸，各取7μL，加样至配制的dPCR反应体系的八连管中，每个样本每个体系做2个重复，使每管dPCR 反应液总体积为15μL；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒，用于微反应制备；
取15μL配制的dPCR反应液，借助DAAN StarryTM SKY 10K样本前处理系统将其自动、均匀地细分成10000个纳升级的反应单元并直接PCR反应扩增。 PCR扩增的反应条件：
Figure BDA0002592265850000161
将八连管芯片用“生物芯片阅读仪”软件对扩增结果进行检测，对实验命名、荧光染料和基因名称和样品名称等信息进行设置。结果检测完成后，在软件界面内打开“分析”对结果进行分析，查看FAM通道和VIC通道荧光信号的值；通过阴性对照样本、阳性对照样本及无模板对照样本的参照及荧光信号的分布，可调节微反应信号阈值；
用dPCR系统对本发明的灵敏度和最低检出率进行检测，当上述阳性对照样本混合液理论浓度分别为1000copies/mL、500copies/mL、200copies/mL 时，实际测得的1000copies/mL、500copies/mL、200copies/mL如表9所示，
表9.灵敏度检测结果
Figure BDA0002592265850000162
Figure BDA0002592265850000171
试剂盒的灵敏度检测结果与理论值相符，表明引物与探针具有较好的特异性，灵敏度检测良好；检测200copies/mL参考品时，dPCR系统可稳定检测为阳性，因此，本发明的可检出200copies/mL的样本。
实施例3：准确性检测
制备准确性参考品：将含有SARS-CoV-2ORF1ab基因病毒样颗粒、N基因病毒样颗粒及内标基因病毒样颗粒按一定比例进行混合，制得浓度为5000 copies/mL的混合液；
提取准确性参考品、阴性对照及阳性对照核酸；取7μL加样至所配制的 dPCR反应体系的八连管中，ORF1ab和N基因检测体系各3次重复，使得dPCR 反应液的总体积为15μL；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒，用于微反应制备；
取15μL配制的dPCR反应液，借助DAAN StarryTM SKY 10K样本前处理系统将其自动、均匀地细分成10000个纳升级的反应单元并直接PCR反应扩增。 PCR扩增的反应条件：
Figure BDA0002592265850000172
结果检测完成后，在软件界面内打开“分析”对结果进行分析，查看FAM 通道和VIC通道荧光信号的值；通过参照阴性对照样本和阳性对照样本荧光信号的分布，可调节微反应信号阈值；
用dPCR系统对本发明试剂盒的准确性进行检测，得到结果如表10，
表10：准确性检测结果
Figure BDA0002592265850000173
Figure BDA0002592265850000181
根据上表所述结果，各质控品准确性的检测结果阳性率为100％，符合理论要求。
实施例4：临床应用实验
采集50例疑似新型冠状病毒肺炎患者咽拭子样本、阴性对照及阳性对照，将拭子头浸入含采样液管中，做好样本标记并确保标签信息无误，4℃保存。使用中山大学达安基因股份有限公司生产的核酸提取或纯化试剂盒(磁珠法) 粤穗械备20170583号和粤穗械备20150302号；也可使用其他的商业化产品；按照试剂盒说明书进行核酸提取；模板核酸可直接用于后续实验或置于-80℃保存备用，避免反复冻融。
取核酸各7μL，加样至步骤二配制的dPCR反应体系的八连管中，使每管 dPCR反应液的总体积为15μL；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒，用于微反应制备；
取15μL配制的dPCR反应液，借助DAAN StarryTM SKY 10K样本前处理系统将其自动、均匀地细分成10000个纳升级的反应单元并直接PCR反应扩增。 PCR扩增的反应条件：
Figure BDA0002592265850000182
结果检测完成后，在软件界面内打开“分析”对结果进行分析，查看FAM 通道和VIC通道荧光信号的值；通过参照阴性对照样本、阳性对照样本对照样本的荧光信号的分布，可调节微反应信号阈值；
检测结果为：50例样本中，7例样本呈为SARS-CoV-2阳性，其余样本为阴性，所检结果与标准荧光PCR检测结果一致性为100％。
实施例5：多重荧光PCR检测
使用本发明的上述引物探针组合组成引物探针混合液(含SEQ ID NO.:1-9)，其中，检测SARS-CoV-2OFR1ab基因的荧光探针核苷酸序列SEQ ID NO：7的5’端标记有FAM荧光报告基团，检测SARS-CoV-2N基因的荧光探针核苷酸序列SEQ ID NO：8的5’端标记有VIC荧光报告基团，检测内标基因的荧光探针核苷酸序列SEQ ID NO：9的5’端标记有CY5荧光报告基团。
使用荧光定量PCR仪进行检测，检测步骤如下：
PCR反应液构成如表11：
表11 PCR反应液构成表
检测ORF1ab、N基因和内标的引探混合液 1μL
核酸 5μL
5×RNA buffer 5μL
热启动Taq酶+逆转录酶 3μL
DEPC水 11μL
将PCR反应管放入荧光定量PCR仪样品槽内，打开“Setup”窗口，按样本对应顺序设置阴性质控品、阳性质控品以及未知样本，并在“Sample Name”一栏中设置样本名称；探针检测模式设置为：Reporter 1：FAM，Quencher 1： NONE；Reporter 2：VIC，Quencher 2：NONE；Reporter 3：CY5，Quencher 3： NONE。
打开“instrument”窗口，设置循环条件如下：
Figure BDA0002592265850000191
设置完成后，保存文件，运行程序。
检测结果如图7，使用本发明引物探针组合的体系于荧光定量PCR仪上进行验证，ORF1ab、N及内标基因均能够正常检出，且扩增曲线正常。
上述结果表明，本发明筛选出的引物探针组合，能够进行三个靶基因同时检测，因此有助于检测效率的进一步提高。
对比例1
由于数字PCR的灵敏度极高，因此对检测体系中引物探针组合的性能要求很高，引物和探针组合的设计难度较大。在试剂盒开发过程中，本发明人针对新型冠状病毒N基因和ORF1ab基因设计并筛选了大量PCR引物和探针，并进行了效果测试，最终获得了灵敏度和特异性能够满足临床检测需求，且能够进行多重检测的引物、探针组合。
例举部分典型引物和探针序列如下：
N基因对照引物对和探针组1：
上游引物：GAATAAGCATATTGACGCATACA(SEQ ID NO.:10)
下游引物：CTGCGGTAAGGCTTGAGTT(SEQ ID NO.:11)
探针：FAM-AAGAAGAAGGCTGATGAAACT-MGB(SEQ ID NO.:12)
N基因对照引物对和探针组2：
上游引物：GGACCAGGAACTAATCAGACAAG(SEQ ID NO.:13)
下游引物：AGGTGTGACTTCCATGCCA(SEQ ID NO.:14)
探针：FAM-ACATTCCGAAGAACGCTGA-MGB(SEQ ID NO.:15)
ORF1ab基因对照引物对和探针组1：
上游引物：GCAACATTACCTAAAGGCATA(SEQ ID NO.:16)
下游引物：TTATCAGAACCAGCACCAAA(SEQ ID NO.:17)
探针：FAM-TATTTTGCGACATTCATCATT-MGB(SEQ ID NO.:18)
ORF1ab基因对照引物对和探针组2：
上游引物：GCTGGTTCTGATAAAGGAGTTG(SEQ ID NO.:19)
下游引物：CATTAAGATCTGAATCGACAAGC(SEQ ID NO.:20)
探针：FAM-TACCCGTAGGCAACCACT-MGB(SEQ ID NO.:21)
上述各对照引物对和探针组在单重检测的情况下，均能够正常检测出靶基因。分别将上述N基因对照引物对和探针组1、N基因对照引物对和探针组2 和本发明的靶向内标基因的引物探针组成双重检测体系进行数字PCR检测，检测步骤、检测条件同上。
如图8，使用N基因对照引物对和探针组1的检测体系进行检出限验证， N基因未检出。
如图9，使用N基因对照引物对和探针组2的检测体系进行检出限验证。N 基因检测的灵敏度显著降低，检出限降低到了1000copies/mL。
结果表明，在该双重检测体系中，使用N基因对照引物对和探针组1的检测体系，无法检测出N基因；使用N基因对照引物对和探针组2的检测体系，针对N基因的灵敏度显著降低，检出限降低到了1000copies/mL。
分别将上述ORF1ab基因对照引物对和探针组1、ORF1ab基因对照引物对和探针组2和本发明的靶向内标基因的引物探针组成双重检测体系进行数字 PCR检测，检测步骤、检测条件同上。
如图10，使用ORF1ab基因对照引物对和探针组1的检测体系进行检出限验证。
如图11，使用ORF1ab基因对照引物对和探针组2的检测体系进行检出限验证。
结果表明，在该双重检测体系中，使用ORF1ab基因对照引物对和探针组1 的检测体系，针对ORF1ab基因的灵敏度仅有2000copies/μL，针对内标基因的灵敏度仅有1000copies/μL；使用ORF1ab基因对照引物对和探针组2的检测体系，针对ORF基因的灵敏度仅有1000copies/μL，内标基因未检出。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中山大学达安基因股份有限公司
<120> 数字PCR检测新型冠状病毒核酸的方法及试剂盒
<130> 000064
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
caaagaatgc tattagaaaa gtgtg 25
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
cgacattcat cattatgcct t 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
accaggaact aatcagacaa gga 23
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
ggtgtgactt ccatgccaat 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
agatttggac ctgcgagc 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
actgaatagc caaggtgagc 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
aaattatggt gatagtgcaa ca 22
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
cacaatttgc ccccagcgct 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
tccacaagtc cgcgcagagc 20
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
gaataagcat attgacgcat aca 23
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
ctgcggtaag gcttgagtt 19
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
aagaagaagg ctgatgaaac t 21
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 13
ggaccaggaa ctaatcagac aag 23
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 14
aggtgtgact tccatgcca 19
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 15
acattccgaa gaacgctga 19
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 16
gcaacattac ctaaaggcat a 21
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 17
ttatcagaac cagcaccaaa 20
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 18
tattttgcga cattcatcat t 21
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 19
gctggttctg ataaaggagt tg 22
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 20
cattaagatc tgaatcgaca agc 23
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 21
tacccgtagg caaccact 18

Claims (10)

1.一种用于检测新型冠状病毒核酸的引物对集，其特征在于，所述引物对集包括：
第一引物对，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.:1所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.:2所示的反向引物。
2.如权利要求1所述的引物对集，其特征在于，所述引物对集还包括：
第二引物对，所述第二引物对组包括如SEQ ID NO.:4所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.:5所示的反向引物。
3.一种检测新型冠状病毒核酸的探针集，其特征在于，所述探针集包括：SEQ ID NO.3所示的第一探针。
4.如权利要求3所述的探针集，其特征在于，所述探针集还包括：SEQ ID NO.6所示的第二探针。
5.如权利要求4所述的探针集，其特征在于，所述第一探针的5’端包含有荧光报告基团；所述第一探针的3’端包含有荧光淬灭基团；
所述第二探针的5’端包含有荧光报告基团；所述第二探针的3’端包含有荧光淬灭基团。
并且，所述第一探针标记的荧光报告基团不同于所述第二探针标记的荧光报告基团。
6.一种用于检测新型冠状病毒核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对集。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括权利要求3所述的探针集。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含SEQ ID NO：1、2、5、6、7、9所示的多核苷酸序列。
9.一种检测新型冠状病毒核酸的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
(1)提供待检测对象的核酸样本；
(2)制备dPCR反应体系并进行dPCR检测：
其中，所述dPCR反应体系包括：步骤(1)提供的所述核酸样本、权利要求1所述的引物对集、和权利要求3所述的探针集。
10.权利要求1所述的引物对集、和/或权利要求3所述的探针集的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测新型冠状病毒核酸。
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