CN112981007A - 一种检测汉滩型汉坦病毒的试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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- C12Q1/6851—Quantitative amplification
Abstract
本发明涉及一种检测汉滩型汉坦病毒的试剂盒及其检测方法，所述试剂盒含有一种用于汉滩型汉坦病毒检测和分型的引物，其针对汉滩型L基因片段、汉滩型S基因片段、汉滩型M基因片段设计引物，每种型涉及两个靶点探针组和一个内标探针组。
Description
技术领域
本发明属于医药生物领域，涉及一种检测病毒的检测，特别涉及汉滩型汉坦病毒的检测和鉴定。
背景技术
汉坦病毒(Hantavirus,HV)属布尼亚病毒科汉坦病毒属，是一种分节段的、单股、负链RNA病毒，其基因组由S(small)、M(medium)和L(large)三个片段组成。到目前为止，全世界已确定有23种汉坦病毒的血清型存在，且不同的汉坦病毒在致病性、疾病谱以及自然携带宿主上都各不相同。该病毒在临床上主要引起欧亚地区的肾综合征出血热(Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome,HFRS)和美洲的汉坦病毒肺综合征(Hantavirus Pulmonary Syndrome,HPS)。
我国是肾综合征出血热的高发国家，每年报告发病人数在2-5万，占世界该病总数的90％以上。长期以来，汉滩型(Hantaan,HTNV)和汉城型(Seoul,SEOV)病毒是存在于我国的两个主要血清型，其宿主分别为黑线姬鼠(Apodemusagrarius)和褐家鼠(Rattusnorvegicus)。至2003年，在东北棕背
中发现普马拉型汉坦病毒的存在；2007年，证实我国东北地区大林姬鼠携带Amur汉坦病毒，中国检科院于2009年亦在长白口岸鼠类证实Amur汉坦病毒的存在。
2019年我国北部重点口岸监测的鼠类动物自然感染病原体检测中，从葫芦岛口岸捕获的褐家鼠中检出肾综合征出血热病原体汉坦病毒核酸阳性4例(4/31)，均为汉城型病毒，带毒率为12.90％；从长白口岸的大林姬鼠肺组织检测出汉坦病毒核酸阳性5例(5/54)，为Amur型汉坦病毒，在大林姬鼠中汉坦病毒的带毒率为9.26％。
葫芦岛口岸2017、2018和2019年均从褐家鼠体内检测到汉城型汉坦病毒阳性。而病毒可通过宿主动物的血液、唾液、尿液及粪便排出，传播途径广泛，除加强鼠类密度监测外，还应对鼠携带病原体进行精准分型检测，以降低肾综合征出血热的传播风险。
目前汉坦病毒的检测方法主要有血清学检测方法(抗原检测、抗体检测)和核酸检测检测方法，包括免疫荧光法(IFA)、酶联免疫法(ELISA)、胶体金法、实时荧光RT-PCR法等。
免疫荧光法(IFA)是现行监测方案中推荐的宿主动物中汉坦病毒监测的方法，操作简便，但结果判断易受主观性因素影响，且存在不能用于高通量检测等问题；酶联免疫法具有较高的灵敏度，操作简单，适合高通量检测，便于临床日常检测与大规模的血清学流行病调查，但是其对汉坦病毒型别的判定存在不足；胶体金法具有简便、廉价等优点，适于基层单位和现场检测，但灵敏度低，只能定性，不能定量检测；RT-PCR法，具有高特异性、高灵敏度的优点，可以进行定量检测，并可进行型别判断，但其分析结果严重依赖循环阈值(Ct值)，无法准确检测低丰度样本。
本发明采用的数字PCR技术不依赖标准曲线和扩增循环阈值，可直接定量检测核酸，属于终点检测，某些程度上，扩增不会造成定量的偏倚，对PCR抑制剂更为耐受，在改善定量分析准确性和变异性上有较大优势；对于核酸含量极低的样品，检测灵敏度更高；并且通过微滴阅读和数据分析软件，可使微滴质控实现可视化，与RT-PCR法相比，更容易判断并剔除假阳性，提高了检测的准确性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于汉滩型汉坦病毒检测和分型的引物。针对汉滩型L基因片段、汉滩型S基因片段、汉滩型M基因片段设计引物，每种型涉及两个靶点探针组和一个内标探针组。
本发明的目的在于提供一种用于汉滩型汉坦病毒检测和分型的引物，包括以下引物组：
优选的，本发明所述的用于汉滩型汉坦病毒检测的引物和探针，分别为：
本发明的另一个目的在于提供上述引物和探针在制备汉滩型汉坦病毒检测和基因分型试剂盒中的应用。
本发明的另一个目的在于提供一种用于汉滩型汉坦病毒检测的试剂盒，包含上述的引物。
本发明的另一个目的在于提供一种用于汉滩型汉坦病毒的检测方法，用于非诊断的目的，包括以下步骤：
1、提取待测样本RNA，提取方法属于现有技术，使用商品化提取试剂盒，提取组织、细胞或血样中的RNA，-80℃储存备用。
2、本方法以待测样本RNA和cDNA为模板均可，检测所用特异性引物和荧光探针序列如下：
不同模板反应体系组成及配制方法如下：
(1)以待测样本RNA为模板反应体系如下：
| 试剂名称 | 加入体积(μL)1× |
| qScript<sup>TM</sup>XLT One-Step RT-qPCR ToughMix | 12.5 |
| Fluorescein sodium salt(1μM) | 2.5 |
| HAN-L Assay(25×)FAM | 2 |
| HAN-M Assay(25×)HEX | 1 |
| β-actin Assay(25×)CY5 | 1 |
| H<sub>2</sub>O和待测RAN模板 | 6 |
| 总体积 | 25μL |
(2)以待测样本cDNA为模板反应体系如下：
| 试剂名称 | 加入体积(μL)1× |
| PerfeCTa Multiplex qPCR ToughMix,5× | 5 |
| Fluorescein sodium salt(1μM) | 2.5 |
| HAN-L Assay(25×)FAM | 2 |
| HAN-M Assay(25×)HEX | 1 |
| β-actin Assay(25×)CY5 | 1 |
| H<sub>2</sub>O和待测cDNA样本 | 13.5 |
| 总体积 | 25μL |
(3)上述体系配制完成后，加入Sapphire Chip中，每孔25μL，将芯片放入CrystalDigital PCR System中进行PCR扩增，反应条件如下：
(4)PCR反应完成后，将芯片取出，放置于NaicaTM prism微滴阅读分析系统扫描芯片、分析数据。
本研究建立汉坦病毒汉滩型数字PCR基因分型检测技术，分为四个步骤：首先进行引物设计，汉坦病毒-汉滩型特异性引物，针对汉滩型L基因片段、汉滩型S基因片段、汉滩型M基因片段设计引物，每个靶标基因设计2-3对引物，用染料法qPCR验证其特异性，选出后续试验用引物；然后根据选出的引物设计检测用探针，并进行引物探针组合特异性验证及条件优化，用已知的阳性样本和阴性样本测试特异性，每种型涉及两个靶点引物探针组和一个内标引物探针组；进而设计数字PCR方法体系，包含单重、双重和三重组合型干扰性验证、拷贝数浓度对比验证等三重探针组合型验证及条件优化；最后对50个未知样本进行检测。最终建立起汉滩型汉坦病毒数字PCR基因分型检测技术。
本发明的检测方法或者试剂盒相对于现有方法，具有以下优点：
本发明的试剂盒和检测方法对于检测汉坦病毒(汉滩型)具有非常好的灵敏度和准确性。数字PCR技术通过将一个标准PCR反应分配到大量微小的反应器(微滴)中，在每个微反应器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子，实现了单分子模板PCR扩增，对于核酸含量极低的样品，检测灵敏度更高；通过微滴阅读和数据分析软件进行数据自动化分析，使微滴质控实现可视化，与RT-PCR法相比，检测结果准确性高；数字PCR技术不依赖标准曲线和扩增循环阈值，可直接定量检测核酸，属于终点检测，某些程度上，扩增不会造成定量的偏倚，对PCR抑制剂更为耐受，在改善定量分析准确性和变异性上有较大优势。
附图说明
图1、引物对HAN-S-1F/R检测阳性样本(A为扩增曲线，B为溶解曲线)
图2、引物对HAN-S-2F/R检测阳性样本(A为扩增曲线，B为溶解曲线)
图3、引物对HAN-M-2F/R检测阳性样本(A为扩增曲线，B为溶解曲线)
图4、引物对HAN-M-3F/R检测阳性样本(A为扩增曲线，B为溶解曲线)
图5、引物对HAN-M-4F/R检测阳性样本YSFH-F-28(A是扩增曲线，B是溶解曲线)
图6、引物对HAN-M-5F/R检测阳性样本YSFH-F-28(A是扩增曲线，B是溶解曲线)
图7、引物对HAN-L-2F/R检测阳性样本YSFH-F-28(A为扩增曲线，B为溶解曲线)
图8、引物对HAN-L-3F/R检测阳性样本YSFH-F-28(A为扩增曲线，B为溶解曲线)
图9、引物对HAN-S-1F/R阴、阳性样本检测图(A为扩增曲线，B为溶解曲线)
图10、引物对HAN-M-4F/R阴、阳性样本检测图(A为扩增曲线，B为溶解曲线)
图11、引物对HAN-L-2F/R阴、阳性样本检测图(A为扩增曲线，B为溶解曲线)
图12、引物探针组合HAN-L-2-F/R/P探针法检测扩增曲线
图13、引物探针组合HAN-M-4F/R/P探针法检测扩增曲线
图14、汉滩型探针组合检测样品SYFH-F-24(cDNA)一维图(A：汉滩L，B:汉滩M，C：动物源)
图15、汉滩型探针组合检测样品SYFH-F-28(cDNA)一维图(A：汉滩L，B：汉滩M，C:动物源)
图16、汉滩型探针组合检测样品HLDF-10(cDNA)一维图(A：汉滩L，B：汉滩M，C:动物源)
注：阈值线以上是阳性微滴，即含有靶基因的微滴；阈值线以下是阴性微滴，即不含有靶基因的微滴。
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为本发明的限制。
实施例1、汉坦病毒(汉滩型)引物设计及特异性验证
(一)目的
对所涉及汉坦病毒汉滩型引物组进行设计，并利用染料法qPCR检测其特异性。
(二)材料、试剂与仪器
1.主要仪器设备
| 仪器名称 | 厂家 |
| CFX96<sup>TM</sup>Real-Time System | Bio-Rad |
2.主要试剂
3.实验材料(随机挑选两个RNA样本测试)
| 名称 | 来源 | 类型 | A260 | A260/A280 | 浓度(ng/μL) |
| YSFH-F-5 | 鼠肺组织 | RNA | 6.68 | 2.12 | 267.1 |
| YSFHF28 | 鼠肺组织 | RNA | 5.17 | 2.23 | 206.71 |
4.引物合成
(三)实验流程
1.cDNA合成体系和流程
2.cDNA样本处理
将上述20μL cDNA模板补水至100μL，并分装备用。
3.PCR体系和流程：
将退火温度调至60℃，选择YSFHF05和2017YSFHF28号样本进行测试)
(四)检测结果
1.针对汉滩型S片段检测结果
(1)Ct值
| 引物组合 | 样品名称 | Ct值(Mean) |
| HAN-S-1F/R | YSFH-F-5 | 32.08 |
| HAN-S-1F/R | YSFH-F-28 | 27.76 |
| HAN-S-2F/R | YSFH-F-5 | 31.27 |
| HAN-S-2F/R | YSFH-F-28 | 28.61 |
(2)扩增曲线和溶解曲线
参见图1、2。
2.针对汉滩型M片段检测结果
(1)Ct值
| 引物组合 | 样品名称 | Ct值(Mean) |
| HAN-M-2F/R | YSFH-F-5 | 30.15 |
| HAN-M-2F/R | YSFH-F-28 | 32.66 |
| HAN-M-3F/R | YSFH-F-5 | 31.12 |
| HAN-M-3F/R | YSFH-F-28 | 34.64 |
| HAN-M-4F/R | YSFH-F-28 | 34.40 |
| HAN-M-5F/R | YSFH-F-28 | 39.58 |
(2)扩增曲线和溶解曲线
参见图3—6。
3.针对汉滩型L片段检测结果
(1)Ct值
| 引物组合 | 样品名称 | Ct值(Mean) |
| HAN-L-2F/R | YSFH-F-5 | 29.28 |
| HAN-L-2F/R | YSFH-F-28 | 28.18 |
| HAN-L-3F/R | YSFH-F-5 | 32.09 |
| HAN-L-3F/R | YSFH-F-28 | 31.13 |
(2)扩增曲线和溶解曲线
参见图7、8。
(五)结果描述与结论
1.针对汉滩型S片段，引物对HAN-S-1F/R和HAN-S-2F/R在阳性样本YSFH-F-28和YSFH-F-5中均有扩增，样本YSFH-F-28溶解曲线均为单峰，但引物对HAN-S-2F/R在样本YSFH-F-5中溶解曲线异常，因此HAN-S-1F/R可用于后续实验。
2.针对汉滩型M片段，引物对HAN-M-5F/R未能在阳性样本YSFH-F-28检出，其余引物均有扩增曲线，但引物HAN-M-2F/R、HAN-M-3F/R溶解曲线异常。引物HAN-M-4F/R能够在样本YSFH-F-28检测，且溶解曲线单峰，NTC有扩增，但是溶解曲线与样本孔不同，可能是引物二聚体。因此，HAN-M-4F/R可用于后续实验。
3.针对汉滩型L片段，引物对HAN-L-2F/R和HAN-L-3F/R均能够在样本YSFH-F-28检测，但引物HAN-L-3F/R溶解曲线异常，因此选择物对HAN-L-2F/R用于后续实验。
实施例2汉坦病毒(汉滩型)引物在阴性样本中的特异性验证
(一)目的
汉滩型引物在阴性样本中的特异性验证。
(二)材料、试剂与仪器：
1.主要仪器设备
| 仪器名称 | 厂家 |
| CFX96<sup>TM</sup>Real-Time System | Bio-Rad |
2.主要试剂
(三)实验流程
(四)检测结果
1.Ct值
| Primer名称 | 目标片段 | 待检样本 | 样本类型 | Ct值 | 备注 |
| HAN-S-1F/R | 汉滩型S片段 | HLD-F-10 | 汉滩型阴性 | 37.78 | 未检出 |
| HAN-S-1F/R | 汉滩型S片段 | YSFH-F-28 | 汉滩型阳性 | N/A | 未检出 |
| HAN-M-4F/R | 汉滩型M片段 | YSFH-24 | 汉滩型阳性 | 31.14 | 检出 |
| HAN-M-4F/R | 汉滩型M片段 | HLDF-10 | 汉滩型阴性 | 37.87 | 未检出 |
| HAN-L-2F/R | 汉滩型L片段 | HLD-F-10 | 汉滩型阴性 | 37.26 | 未检出 |
| HAN-L-2F/R | 汉滩型L片段 | YSFH-F-28 | 汉滩型阳性 | 29.94 | 检出 |
| F/R_β-actin | 动物源 | YSFH-F-28 | / | 21.70 | 检出 |
3.扩增曲线和溶解曲线
参见图9、10、11。
(五)结果描述
1.对于引物HAN-S-1F/R在阳性和阴性样本中均有扩增曲线，Ct值在36-40之间，但溶解曲线异常。对该引物和样本重新检测，重复检测结果如下所示，在阳性样本中Ct值为39.34。可能是样本降解，或其他原因。
| Primer名称 | 病毒基因型 | 待检样本 | 样本类型 | Ct值 | 备注 |
| HAN-S-1F/R | 汉滩型S片段 | 空白 | NTC | N/A | 未检出 |
| HAN-S-1F/R | 汉滩型S片段 | HLD-F-10 | 汉滩型阴性 | N/A | 未检出 |
| HAN-S-1F/R | 汉滩型S片段 | YSFH-F-28 | 汉滩型阳性 | 39.34 | 未检出 |
2.针对引物HAN-M-4F/R的结果可知，引物特异，其在阳性样本中溶解曲线单峰，Ct值为31.14；而阴性样本中溶解曲线可能为引物二聚体。
3.对于引物HAN-L-2F/R，仅在阳性样本样本中检出，溶解曲线单峰，表明该引物特异，可用于后续探针的合成。
综合以上结果，选择引物HAN-M-4F/R、HAN-L-2F/R设计探针，用于后续检测实验。
实施例3汉坦病毒(汉滩型)探针设计及特异性验证-测试阳性和阴性样本
(一)目的
设计、合成探针HAN-L-2p、HAN-M-4p，并用qPCR方法进行引物探针组合特异性验证。
(二)材料、试剂与仪器：
1.主要仪器设备
| 仪器名称 | 厂家 |
| CFX96<sup>TM</sup>Real-Time System | Bio-Rad |
2.主要试剂
| 名称 | 货号 | 厂家 |
| PerfeCTa qPCR ToughMix UNG | 95138 | Quantabio |
3.探针合成
| 引物/探针名称 | 序列(5'-3') | 荧光标记 | 目标基因 |
| HAN-L-2p | AATTGCGACAGCCACATGGTT | 5'FAM,3'BHQ1 | 汉滩型L片段 |
| HAN-M-4P | CGGCTGCGGTATGATTCTTCCAC | 5'HEX,3'BHQ1 | 汉滩型M片段 |
| P_β-actin | TACTCCTGCTTGCTGATCCACATC | 5'CY5,3'BHQ2 | 动物源 |
(三)实验流程
(四)检测结果
1.Ct值
3.扩增曲线和溶解曲线
参见图12、13。
(五)结果描述
1.对于引物探针组合HAN-L-2-F/R,2P由探针法检测，NTC无扩增，在阳性样本YSFH-F-23和24中有扩增，但YSFH-F-23的Ct值为36，浓度较低。表明针对汉滩型设计的引物和探HAN-M-4F/R/P特异，可用于后续检测实验。
2.对于引物探针组合HAN-M-4F/R/P在阳性样本YSFH-F-24中检出，阴性和NTC中未检出，表明针对汉滩型设计的引物和探HAN-M-4F/R/P特异，可用于后续检测实验。
实施例4、汉坦病毒(汉滩型)数字PCR方法的建立
(一)目的
汉坦病毒(汉滩型)数字PCR方法的验证。
(二)材料、试剂与仪器：
1.主要仪器设备：
| 仪器名称 | 厂家 |
| Naica<sup>TM</sup> Crystal Digital PCR System | Stilla |
2.主要试剂：
| 名称 | 货号 | 厂家 |
| PerfeCTa Multiplex qPCR ToughMix,5× | 95147 | Quantabio |
| Fluorescein sodium salt | AK200000 | Apexbio |
| Sapphire Chip | C14012 | Stilla Technologies |
3.实验材料
| 名称 | 来源 | 类型 | 含病毒类型 |
| HLD-F-10 | 鼠肺组织 | cDNA | 汉城型 |
| YSFH-F-24 | 鼠肺组织 | cDNA | 汉滩型 |
| YSFH-F-28 | 鼠肺组织 | cDNA | 汉滩型 |
(三)实验流程
(四)检测结果
1.数字PCR检测结果：
2.数字PCR检测一维图展示
参见图14、15、16。
(五)结果描述与结论
汉滩型引物探针组合(L和M)仅在汉滩型阳性样本中SYFH-F-24和SYFH-F-28(cDNA)检出，在阴性样本HLD-F-10(cDNA)未被检出，表明汉滩型引物探针组合特异，能够准确检测到汉城型病毒。
序列表
<110> 中国检验检疫科学研究院
<120> 一种检测汉滩型汉坦病毒的试剂盒及其检测方法
<160> 12
<210> 1
<211> 核苷酸19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（19）
<223> 上游引物
<400>1
CAGGTTGTTAGCTTTAAAC
<210> 2
<211> 核苷酸19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（19）
<223> 下游引物
<400>2
GGTCTTCTGTGTAGTATTG
<210> 3
<211> 核苷酸21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（21）
<223> 特异性探针
<400>3
FAM-AATTGCGACAGCCACATGGTT-BHQ1
<210> 4
<211> 核苷酸80
<212> DNA
<213> 汉滩病毒（Hantaan virus）
<220>
<222> 核苷酸序列（1732）...（1811）
<223> 目的片段
<400>4
1 caggttgtta gctttaaaca tagcctttga aaaggcttta attgcgacag ccacatggtt
61 tcaatactac acagaagacc
<210> 5
<211> 核苷酸18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（18）
<223> 上游引物
<400>5
GTGTCTACTGAAGTTGAC
<210> 6
<211> 核苷酸19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（19）
<223> 下游引物
<400>6
AGGTCATAACAGGTTATTG
<210> 7
<211> 核苷酸23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（23）
<223> 特异性探针
<400>7
HEX-CGGCTGCGGTATGATTCTTCCAC-BHQ1
<210> 8
<211> 核苷酸98
<212> DNA
<213> 汉城病毒（Seol virus）
<220>
<222> 核苷酸序列（335）...（432）
<223> 目的片段
<400>8
1 gtgtctactg aagttgactt gaaaggaaca tgtgttttaa agcataagat ggtggaagaa
61 tcataccgca gccggaagtc aataacctgt tatgacct
<210> 9
<211> 核苷酸17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（17）
<223> 上游引物
<400>9
CCTCACTGTCCACCTTC
<210> 10
<211> 核苷酸17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（17）
<223> 下游引物
<400>10
AACGCAGCTCAGTAACA
<210> 11
<211> 核苷酸24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<222> 核苷酸序列（1）...（24）
<223> 特异性探针
<400>11
CY5-TACTCCTGCTTGCTGATCCACATC-BHQ2
<210> 12
<211> 核苷酸112
<212> DNA
<213> 鼠属（Mus）
<220>
<222> 核苷酸序列（1154）...（1265）
<223> 目的片段
<400>12
1 cctcactgtc caccttccag cagatgtgga tcagcaagca ggagtacgat gagtccggcc
61 cctccatcgt gcaccgcaag tgcttctagg cggactgtta ctgagctgcg tt
Claims (7)
1.一种用于汉滩型汉坦病毒检测的引物，其特征在于，包括以下引物组：
2.一种用于汉滩型汉坦病毒检测的引物，其特征在于，包括以下引物组：
。
3.权利要求1所述的引物在制备汉滩型汉坦病毒检测和基因分型试剂盒中的应用。
4.一种用于汉滩型汉坦病毒检测的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的引物。
5.一种用于汉滩型汉坦病毒检测的PCR试剂，其特征在于，所述PCR试剂包括如权利要求1或2所述的引物。
6.根据权利要求5所述的PCR试剂，其特征在于，包括以下成分：
7.一种用于汉滩型汉坦病毒的检测方法，用于非诊断的目的，其特征在于，包括以下步骤：
1)、提取待测样本RNA，使用商品化提取试剂盒，提取组织、细胞或血样中的RNA，-80℃储存备用，
2)、以待测样本RNA和cDNA为模板均可，检测所用特异性引物和荧光探针序列如下：
不同模板反应体系组成及配制方法如下：
(1)以待测样本RNA为模板反应体系如下：
(2)以待测样本cDNA为模板反应体系如下：
(3)上述体系配制完成后，加入Sapphire Chip中，每孔25μL，将芯片放入CrystalDigital PCR System中进行PCR扩增，反应条件如下：
(4)PCR反应完成后，将芯片取出，放置于NaicaTM prism微滴阅读分析系统扫描芯片、分析数据。
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