CN111910020A - 一种汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光rt-pcr检测引物、探针、试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光RT‑PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法，涉及生物技术应用领域，该方法灵敏度高、特异性强，能实现临床及宿主动物样本中汉滩病毒和汉城病毒的快速检测和准确检测。所述检测引物和检测探针的核苷酸序列如下：F1：5'‑GACAACAAAGGGACTAGA‑3'；R1：5'‑GTGCATTGGGTAGAGATA‑3'；F2：5'‑TGGCTTCAAAAACTGTGG‑3'；R2：5'‑GTCCAGTTGTATTCCCAT‑3'；P1：5'‑ATTCGGTTCAAGGATGATAGC‑3'；P2：5'‑TGATTGTGTGCGTCTGAGGT‑3'。

Description

一种汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光RT-PCR检测引物、探 针、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术应用领域，具体为一种汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光RT-PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法。

背景技术

汉坦病毒（Hantavirus，HV）为布尼亚病毒科汉坦病毒属的RNA病毒，可引起肾综合征出血热（HFRS）和汉坦病毒肺综合征。已发现的 HV 至少可分为40 种血清型或基因型，我国从宿主动物中发现的HV有许多种，其中汉滩病毒（HTNV）和汉城病毒（SEOV）是我国最主要流行的也是目前被证实可引起我国人类的HFRS的HV。HFRS起病急，进展快，病死率高。中国是受肾综合征出血热危害最大的国家，全世界90%以上的HFRS病例发生在中国。

典型的HFRS病例具有发热、休克、出血和肾损害，或有5期经过，诊断难度不大；然而对不典型的临床表现患者，或在发热早期欲明确诊断非常困难。

实时荧光PCR法在病毒性传染病早期诊断中运用非常广泛，但目前HV的实时荧光RT-PCR方法多针HV的单一型别，无法满足全国大部分省市HFRS HTNV和SEOV混合疫区的需要。因此，研发同时能检测HTNV和SEOV两种汉坦病毒的荧光RT-PCR方法对HFRS早期诊断、流行病学调查有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光RT-PCR检测引物、探针、试剂盒及检测方法，该方法灵敏度高、特异性强，能实现临床及宿主动物样本中汉滩病毒和汉城病毒的快速检测和准确检测。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光RT-PCR检测引物和检测探针，所述检测引物和检测探针的核苷酸序列如下：

F1：5'-GACAACAAAGGGACTAGA-3'；

R1：5'-GTGCATTGGGTAGAGATA-3'；

F2：5'-TGGCTTCAAAAACTGTGG-3'；

R2：5'-GTCCAGTTGTATTCCCAT-3'；

P1：5'-ATTCGGTTCAAGGATGATAGC-3'；

P2：5'-TGATTGTGTGCGTCTGAGGT-3'。

优选的，所述检测探针中序列5'端标记的荧光基团包含但不限于FAM、HEX、VIC、CY5、JOE中一种；

所述检测探针中序列3'端标记的淬灭基团包含但不限于TAMRA、MGB、BHQ中一种；

所述检测探针P1和P2的5'端标记的荧光基团不相同。

一种汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光RT-PCR检测试剂盒，所述的检测试剂盒中含有双重实时荧光RT-PCR检测引物。

一种汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光RT-PCR检测试剂盒，所述的检测试剂盒中含有双重实时荧光RT-PCR检测探针。

一种汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法，包括如下步骤：

S1：从样品中提取病毒RNA；

S2：以提取的病毒RNA为模板，用引物F1、R1、F2和R2以及探针P1和P2进行荧光RT-PCR扩增；

S3：根据扩增曲线来判断样品中的病毒类型。

优选的，所述S2中荧光RT-PCR扩增反应体系为：

RT-PCR buffer 12.5μL；

Enzyme Mix 1μL；

25μM 引物F1 0.5μL；

25μM 引物R1 0.5μL；

25μM 引物F2 0.5μL；

25μM 引物R2 0.5μL；

25μM 探针P1 0.5μL；

25μM 探针P2 0.5μL；

ddH2O 3.5μL；

RNA模板 5μL；

总体积 25μL。

优选的，所述S2中荧光RT-PCR扩增反应条件为：

45℃ 10min；

95℃ 10min；

95℃ 15s；

55℃ 45s（采集荧光）。

优选的，所述荧光RT-PCR扩增反应条件中95℃条件下扩增反应15s与55℃条件下扩增反应45s进行45个循环。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、该发明中，先从样品中提取病毒RNA，以提取的病毒RNA为模板，用引物对F1：5'-GACAACAAAGGGACTAGA-3'/R1：5'-GTGCATTGGGTAGAGATA-3'和F2：5'-TGGCTTCAAAAACTGTGG-3'/R2：5'-GTCCAGTTGTATTCCCAT-3'以及探针P1：5'-ATTCGGTTCAAGGATGATAGC-3'和P2：5'-TGATTGTGTGCGTCTGAGGT-3'进行荧光RT-PCR扩增，根据扩增曲线来判断样品中的病毒类型，该方法操作简单，只需一个反应即可实现汉滩病毒和汉城病毒检测，全部操作过程不需3小时，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用；

2、该发明中采用的汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法特异性好、灵敏度较高，以HTNV和SEOV重组质粒作为标准品，最低可以检测10 copies/μL重组阳性质粒，能实现临床及宿主动物样本中汉滩病毒和汉城病毒的快速检测和准确检测。

附图说明

图1为本发明的SEOV 标准品荧光检测扩增曲线图；

图2为本发明的HTNV 标准品荧光检测扩增曲线图；

图3为本发明的建立方法的特异性检测图；

图4为本发明的10份肾综合征出血热病例血清样本检测图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1 汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法及使用

1-1 引物和探针

经过对所设计的大量引物和探针进行筛选后，发现引物对F1/R1、F2/R2以及探针P1和P2同时检测汉滩病毒和汉城病毒的效果最好，其碱基序列如下所示：

F1：5'-GACAACAAAGGGACTAGA-3'；

R1：5'-GTGCATTGGGTAGAGATA-3'；

F2：5'-TGGCTTCAAAAACTGTGG-3'；

R2：5'-GTCCAGTTGTATTCCCAT-3'；

P1：5'-ATTCGGTTCAAGGATGATAGC-3'；

P2：5'-TGATTGTGTGCGTCTGAGGT-3'。

探针P1 5'端标记的荧光基团为FAM，3'端标记的淬灭基团为BHQ1；

探针P2 5'端标记的荧光基团为VIC，3'端标记的淬灭基团为BHQ2。

1-2 病毒核酸提取

所用到的病毒核酸提取试剂为QIAamp Viral RNA Mini Kit（QIAGEN,提取方法和试剂按说明书进行）。

1-3 采用Thermo fisher Scientific公司AgPath-ID TMOne-step RT-PCR Kit（商品化HTN/SEOV实时荧光RT-PCR试剂盒价格较高，每份样品检测的试剂成本就高达100元人民币左右，难以适应中国国情在全国普及和推广；Thermo fisher Scientific公司AgPath-ID TMOne-step RT-PCR Kit目前的价格约为15元/人份，每份样品探针、引物的费用约为5元，因此本试剂盒每份样品检测的试剂成本仅为20元人民币左右，粗略估算本方法的试剂成本仅为商品化的荧光RT-PCR试剂盒的1/5左右，检测成本低廉，可大幅度节省检测费用，非常适合大批量检测）。

在PCR反应管加入反应预混液（RT-PCR buffer）和酶（Enzyme Mix）再加入探针和引物，具体反应体系为：

RT-PCR buffer 12.5μL；

Enzyme Mix 1μL；

25μM 引物F1 0.5μL；

25μM 引物R1 0.5μL；

25μM 引物F2 0.5μL；

25μM 引物R 2 0.5μL；

25μM 探针P1 0.5μL；

25μM 探针P2 0.5μL；

ddH2O 3.5μL；

RNA模板 5μL；

总体积 25μL。

1-4 荧光RT-PCR扩增反应条件为：

45℃ 10min；

95℃ 10min；

95℃ 15s；

55℃ 45s（采集荧光）；

95℃15s和55℃45s循环45次。

1-5 质控标准

阴性对照无Ct值且无扩增曲线；

阳性对照的Ct值≤30.0并出现典型扩增曲线时。

1-6 结果表述及判定

Ct值≤35.0的样品判为阳性，表示样品中存在汉滩病毒/汉城病毒；

无Ct值且无扩增曲线的样品判为阴性，表示样品中无汉滩病毒/汉城病毒；

Ct值在35～40之间的样品须重做，重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。

1-7 时间优势

核酸提取需要40min左右(自动核酸提取仪只需30min)，一步法实时荧光RT-PCR需要100min左右，因此从收到样品到得到检验结果的时间仅为2.5～3h，大大节省了检测时间。

实施例2 灵敏度实验

2-1 阳性标准品：将SEOV和HTNV S基因(目的片段长度1311bp)克隆至pGEM®-T(promega公司) 载体，制备重组质粒作为阳性对照。

2-2纯化SEOV和HTNV 的阳性质粒，通过BioDrop超微量蛋白核酸分析仪紫外分光光度仪测得浓度，然后根据阿伏伽德罗常数计算其拷贝数，并将阳性质粒分别稀释至1.0×10⁷ copies/μL、1.0×10⁶ copies/μL、1.0×10⁵ copies/μL、1.0×10⁴ copies/μL、1.0×10³copies/μL、1.0×10² copies/μL、1.0×10¹ copies/μL、1.0×10⁰copies/μL、1.0×10^{- 1}copies/μL，对经梯度稀释的阳性标准品按实施例1进行检测，验证所建立方法的灵敏度，结果如图1和图2所示。

2-3 结论

由图1和图2可见，本发明检测方法随着核酸浓度的降低呈现明显的下降的荧光信号，9个浓度质粒中（10⁷-10^-1），有7个出现扩增曲线（10⁷-10）。可检测到的HTNV和SEOV最低浓度均为10copies/μL。

实施例3 特异性实验

3-1 以本实验室保存的甲型流感病毒、登革热病毒、新布尼亚病毒、寨卡病毒、新冠病毒阳性核酸为模板，同时设阳性对照（阳性质粒）和阴性对照，使用实施例1的方法进行检测，验证所建立方法的特异性，结果如图3所示。

3-2 结论

由图3可见阳性对照出现扩增曲线，其他5份病毒核酸样本及阴性对照均未见扩增曲线，说明该检测方法特异性好。

实施例4 肾综合征出血热病例血清样本的检测

4-1 选取2017年收集并冻存于-70℃的10份肾综合征出血热病例血清样本，按实施例1方法进行汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光RT-PCR检测，同时设置阳性对照和阴性对照。

4-2 结论

结果见图4，其中阴性对照未出现扩增曲线，阳性对照出现扩增曲线。10份肾综合征出血热病例血清样本9份为HTNV型（9份HTNV病毒基因序列GenBank 登录为：MT782310-MT782318），1份为SEOV型（未获得基因序列）。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

Claims (8)

1.一种汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光RT-PCR检测引物和检测探针，其特征在于，所述检测引物和检测探针的核苷酸序列如下：

F1：5'-GACAACAAAGGGACTAGA-3'；

R1：5'-GTGCATTGGGTAGAGATA-3'；

F2：5'-TGGCTTCAAAAACTGTGG-3'；

R2：5'-GTCCAGTTGTATTCCCAT-3'；

P1：5'-ATTCGGTTCAAGGATGATAGC-3'；

P2：5'-TGATTGTGTGCGTCTGAGGT-3'。

2.根据权利要求1所述的一种汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光RT-PCR检测引物和检测探针，其特征在于：所述检测探针中序列5'端标记的荧光基团包含但不限于FAM、HEX、VIC、CY5、JOE中一种；

所述检测探针中序列3'端标记的淬灭基团包含但不限于TAMRA、MGB、BHQ中一种；

所述检测探针P1和P2的5'端标记的荧光基团不相同。

3.一种汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光RT-PCR检测试剂盒，基于权利要求1中一种汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光RT-PCR检测引物和检测探针实现，其特征在于，所述的检测试剂盒中含有双重实时荧光RT-PCR检测引物。

4.一种汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光RT-PCR检测试剂盒，基于权利要求1中一种汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光RT-PCR检测引物和检测探针实现，其特征在于，所述的检测试剂盒中含有双重实时荧光RT-PCR检测探针。

5.一种汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：从样品中提取病毒RNA；

S2：以提取的病毒RNA为模板，用引物F1、R1、F2和R2以及探针P1和P2进行荧光RT-PCR扩增；

S3：根据扩增曲线来判断样品中的病毒类型。

6.根据权利要求5所述的一种汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法，其特征在于，所述S2中荧光RT-PCR扩增反应体系为：

RT-PCR buffer 12.5μL；

Enzyme Mix 1μL；

25μM 引物F1 0.5μL；

25μM 引物R1 0.5μL；

25μM 引物F2 0.5μL；

25μM 引物R2 0.5μL；

25μM 探针P1 0.5μL；

25μM 探针P2 0.5μL；

ddH2O 3.5μL；

RNA模板 5μL；

总体积 25μL。

7.根据权利要求5所述的一种汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法，其特征在于，所述S2中荧光RT-PCR扩增反应条件为：

45℃ 10min；

95℃ 10min；

95℃ 15s；

55℃ 45s（采集荧光）。

8.根据权利要求7所述的一种汉滩病毒和汉城病毒双重实时荧光RT-PCR检测方法，其特征在于：所述荧光RT-PCR扩增反应条件中95℃条件下扩增反应15s与55℃条件下扩增反应45s进行45个循环。

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