CN114959081A

CN114959081A - 一种LAMP-Taqman检测鸡毒支原体的引物和探针及其应用

Info

Publication number: CN114959081A
Application number: CN202210646129.4A
Authority: CN
Inventors: 董振国; 时国强; 刘昱; 焦义然; 石磊
Original assignee: Hebei Sanshi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hebei Sanshi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-06-08
Filing date: 2022-06-08
Publication date: 2022-08-30

Abstract

本发明涉及动物疫病检测技术领域，具体公开一种LAMP‑Taqman检测鸡毒支原体的引物和探针及其应用。检测鸡毒支原体的引物和探针中，内引物FIP的序列如SEQ ID NO:1，内引物BIP的序列如SEQ ID NO:2，外引物F3的序列如SEQ ID NO:3，外引物B3的序列如SEQ ID NO:4，环引物LF的序列如SEQ ID NO:5，环引物探针的序列如SEQ ID NO:6。利用本发明的引物和探针，可实现对鸡毒支原体的准确检测，且方法可避免非特异性扩增导致的假阳性结果的出现，特异性强、灵敏度高、最低检测限可达0.258fg/μL，对鸡毒支原体的早期临床检测提供了可靠保障。

Description

一种LAMP-Taqman检测鸡毒支原体的引物和探针及其应用

技术领域

本发明涉及动物疫病检测技术领域，尤其涉及一种LAMP-Taqman检测鸡毒支原体的引物和探针及其应用。

背景技术

鸡毒支原体(Mycoplasma galliscepticum，MG)是一种引起鸡呼吸道感染疾病的支原体，不同菌株的感染性和致病性不同，感染后的主要临床表现为流鼻涕、流眼泪、咳嗽，严重时表现为呼吸困难或张口呼吸，可听到湿性啰音。而且鸡感染后一般是隐性带菌，因此，早期筛查是防治的关键。目前，常用的检测鸡毒支原体的方法包括酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)，聚合酶链反应(Polymerase chainreaction，PCR)和实时荧光定量qPCR等，但是，上述检测方法均需要复杂的操作程度和昂贵的检测设备，限制了鸡毒支原体的快速筛查。

环介导等温扩增(LAMP)是2000年的一种恒温检测新方法，通常设计两对引物，即外引物(F3/B3)、内引物(FIP/BIP)，分别结合于目的片段上具有较高的特异性。同时，恒温扩增不需要变温循环，理论上一个水浴锅就可以完成实验。为了加快反应速度，还可在上下游内引物的两个组分之前设计两条环引物。因此，LAMP技术与PCR检测技术相比，具有反应快速、设备低廉、操作简单、特异性高等优点。近年来，LAMP恒温检测技术被广泛地应用于食品、微生物、病原体的检测中。

但是，LAMP检测技术依然具有制约其发展的限制条件，如：扩增片段大小不一电泳结果无法直观看到，且引物数量越多，引物错配的概率越高，越容易造成非特异性扩增，产生假阳性结果，以及检出限较高，无法对鸡毒支原体进行早期检测。因此，急需发展一种简便、高特异性、高灵敏度的鸡毒支原体的快速检测方法。

发明内容

针对现有鸡毒支原体的检测方法存在的假阳性概率高、检出限高等问题，本发明提供一种LAMP-Taqman检测鸡毒支原体的引物和探针及其应用，利用该检测鸡毒支原体的引物和探针可在62-64℃恒温条件下快速检测鸡毒支原体，且特异性好、灵敏度高，更有利于实现对鸡毒支原体的早期检测，实现疾病的早发现早治疗，有助于预防疾病的扩散。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种LAMP-Taqman检测鸡毒支原体的引物和探针，包括：

内引物FIP：5′-CCGCCATTCATACCACCACTAAAGCCTGAACCAAAACCA-3′(SEQ ID NO:1)；

内引物BIP：5′-GGAATGGATAATGCTGCTCCACACCAACTTTTTCAGTTTGACCAT-3′(SEQ IDNO:2)；

外引物F3：5′-CTGAACCAAAGCCAAATCC-3′(SEQ ID NO:3)；

外引物B3：5′-GTCTTTGATTTTTGCATAGTCAT-3′(SEQ ID NO:4)；

环引物LF：5′-GGAGGGTTTGGCATCGGATC-3′(SEQ ID NO:5)；

环引物探针LBP：5′-AGCAGCTGCTAAAACAGCTTTGA-3′(SEQ ID NO:6)。

相对于现有技术，本发明提供的LAMP-Taqman检测鸡毒支原体的引物和探针，可以特异性结合到鸡毒支原体的核酸上，准确检测出鸡毒支原体，且通过将下游环引物LB设计为环引物探针LBP，不但减少了非特异性扩增，降低了假阳性的概率，还提高了鸡毒支原体的检测效率和灵敏度。本发明提供的引物和探针，与鸡滑液囊支原体、鸡新城疫病毒、禽流感病毒H9、禽流感病毒H5等21种病原体均无交叉扩增反应，特异性显著增强；且上述引物和探针的灵敏度高，对鸡毒支原体的最低检测限为0.258fg/μL，能够实现对鸡毒支原体的早期快速诊断，同时，检测的准确度高，用时短，在63℃恒温条件下快速扩增，仅需45min就可以达到检测水平，检测时间明显缩短，且无需特殊的仪器和专业的操作人员，实现了在非实验室条件下快速检测鸡毒支原体病毒的目的，对鸡毒支原体的疫病防控具有重要意义，具有较高的实用价值。

优选的，所述环引物探针LBP的5′端标记有荧光基团，3′端标记有淬灭基团。

优选的，所述环引物探针LBP为：5′-FAM-AGCAGCTGCTAAAACAGCT TTGA-3′BHQ。

本发明还提供了上述任一项所述的引物和探针在非诊断性检测鸡毒支原体中的应用。

本发明还提供了一种用于检测鸡毒支原体中的试剂盒，包含上述任一项所述的引物和探针。

优选的，所述试剂盒还包括基础缓冲液、氯化钾溶液、硫酸铵溶液、吐温20、DNA聚合酶、甜菜碱、硫酸镁溶液、dTNPs和去离子水。

进一步优选的，所述基础缓冲液为Tris-HCl。

进一步优选的，所述DNA聚合酶包括Bst DNA polymerase large fragment和TaqDNA polymerase。

本发明还提供利用上述试剂盒检测鸡毒支原体的方法，具体操作为：提取鸡毒支原体的核酸为模板，用所述试剂盒进行LAMP扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。

若待测样品和阳性对照均能扩增出荧光信号，而阴性对照扩增不出荧光信号，则表明待测样品为鸡毒支原体阳性；若待测样品和阴性对照扩增不出荧光信号，而阳性对照能扩增出荧光信号，则表明待测样品为鸡毒支原体阴性。

上述检测鸡毒支原体的方法，耗时短、操作简单、反应结果直观，可用于鸡毒支原体的快速检测。

优选的，所述LAMP扩增的体系包括以下试剂及用量：pH8.8Tris-HCl 20mmol，KCl10mmol，(NH₄)₂SO₄ 10mmol，吐温20 0.024μL，Bst DNA polymerase large fragment 8U，Taq DNA polymerase 5U，甜菜碱1mol，MgSO₄ 8mmol，dNTPs 1.6mmol，内引物FIP 2.0μmol，内引物BIP 2.0μmol，外引物F3 0.5μmol，外引物B3 0.5μmol，环引物LF 0.5μmol，环引物探针LBP 0.5μmol，去离子水补足至24μL。

上述优选的反应条件可进一步提高鸡毒支原体的检测效率。

优选的，所述LAMP扩增的反应温度为62℃-64℃，反应时间为45-50min。

进一步优选的，所述LAMP扩增的反应温度为63℃，反应时间为45min。

优选的LAMP扩增条件，可以提高鸡毒支原体的检测效率。

附图说明

图1是本发明实施例2中LAMP-Taqman检测方法特异性测试结果图；

图2是本发明实施例3中重组质粒的结构图；

图3是本发明实施例3中LAMP-Taqman检测方法敏感性测试结果图；其中，扩增曲线由左至右顺序依次为2.575ng/μL、257.500pg/μL、25.750pg/μL、2.575pg/μL、257.500fg/μL、25.750fg/μL、2.575fg/μL和0.258fg/μL；

图4是本发明实施例4中LAMP-Taqman检测方法重复性测试结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

为了更好的说明本发明实施例提供的，下面通过实施例做进一步的举例说明。

实施例1

1.材料与方法

1.1病毒样本与试剂盒

鸡滑液囊支原体、鸡新城疫病毒、禽流感病毒H9、禽流感病毒H5、鸡毒支原体、鸡马利克氏病毒、鸡病毒性关节炎病毒、鸡痘病毒、传染性法氏囊病毒、鸡传染性支气管炎病毒、衣阿华支原体、鸡传染性喉气管炎病毒、禽脑脊髓炎病毒、副鸡嗜血杆菌、火鸡出血性肠炎病毒、鸡大肝大脾病病毒、禽类腺病毒、禽网状内皮组织增殖病病毒、禽白血病病毒、鸡源坦布苏病毒、禽白色念珠菌病均由本实验室临床检测分离鉴定后保存。

1.2引物和探针的设计

根据鸡毒支原体特异性基因vlhA的保守序列(Sequence ID:KU577585)设计引物和探针，设计得到的引物序列如表1所示，并由上海生工生化有限公司合成并标记。

表1引物和探针

1.3.DNA/RNA的提取

样品前处理：

血液、血清等液体样本可以直接进行核酸提取。

组织样本：称取50-200mg组织放于2mL无酶离心管中，加入0.3-0.8mL生理盐水或PBS缓冲液，2-4粒钢珠，于研磨仪中低温研磨0.5-2min，至无块状物存在，然后8000rpm离心1min，取上清液进行核酸提取。

分泌物样本：使用棉拭子在生理盐水中浸润后在采样部位翻转涂抹，完成采集后将拭子头掰下，放入含1mL生理盐水的离心管中涡旋30s，取200μL混匀液进行核酸提取。

按照市售DNA/RNA提取试剂盒的使用说明书分别提取DNA/RNA；将提取的DNA以及RNA病毒反转录后的cDNA保存于-20℃用于后续试验。

1.4用检测鸡毒支原体的试剂盒检测鸡毒支原体方法的建立

检测鸡毒支原体的试剂盒包括内引物FIP、内引物FIP、外引物F3、外引物B3、环引物LF、环引物探针LBP、基础缓冲液、氯化钾溶液、硫酸铵溶液、吐温20、DNA聚合酶、甜菜碱、硫酸镁溶液、dTNPs和去离子水。

提取鸡毒支原体的核酸为模板，结合上述试剂盒构建LAMP-Taqman反应体系(24μL)：pH8.8Tris-HCl 20mmol，KCl 10mmol，(NH₄₎₂SO₄ 10mmol，吐温20 0.024μL，Bst DNApolymerase large fragment 8U，Taq DNA polymerase 5U，甜菜碱1mol，MgSO₄ 8mmol，dNTPs 1.6mmol，内引物FIP 2.0μmol，内引物BIP 2.0μmol，外引物F3 0.5μmol，外引物B30.5μmol，环引物LF 0.5μmol，环引物探针LBP 0.5μmol，去离子水补足至24μL。

向含有24μL反应液的反应管中加入1μL待测核酸为模板，进行LAMP扩增，于63℃扩增45min，每分钟采集一次荧光。

实施例2

LAMP-Taqman检测鸡毒支原体的特异性试验：

按照实施例1的方法，以鸡滑液囊支原体、鸡新城疫病毒、禽流感病毒H9、禽流感病毒H5、鸡毒支原体、鸡马利克氏病毒、鸡病毒性关节炎病毒、鸡痘病毒、传染性法氏囊病毒、鸡传染性支气管炎病毒、火鸡支原体、衣阿华支原体、鸡传染性喉气管炎病毒、禽脑脊髓炎病毒、传染性鼻炎病毒、败血支原体病毒、火鸡出血性肠炎病毒、鸡大肝大脾病病毒、禽类腺病毒、网状内皮组织增殖病病毒、禽白血病病毒的21种病原体作为样品进行检测，以灭菌水作为阴性对照。

按照市售DNA/RNA提取试剂盒的使用说明书分别提取鸡滑液囊支原体、鸡马利克氏病毒、鸡毒支原体、鸡痘病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、副鸡嗜血杆菌、火鸡出血性肠炎病毒、禽类腺病毒、禽白血病病毒的DNA，以及鸡新城疫病毒、禽流感病毒H9、禽流感病毒H5、鸡病毒性关节炎病毒、传染性法氏囊病毒、衣阿华支原体、鸡传染性喉气管炎病毒、禽脑脊髓炎病毒、鸡大肝大脾病病毒、禽网状内皮组织增殖病病毒、鸡源坦布苏病毒、禽白色念珠菌病的RNA；将提取的DNA以及RNA病毒反转录后的cDNA作为模板进行LAMP扩增，于63℃扩增45min。

LAMP扩增体系：pH8.8Tris-HCl 20mmol，KCl 10mmol，(NH₄₎₂SO₄ 10mmol，吐温200.024μL，Bst DNA polymerase large fragment 8U，Taq DNA polymerase 5U，甜菜碱1mol，MgSO₄ 8mmol，dNTPs 1.6mmol，内引物FIP 2.0μmol，内引物BIP 2.0μmol，外引物F30.5μmol，外引物B3 0.5μmol，环引物LF 0.5μmol，环引物探针LBP 0.5μmol，去离子水补足至24μL。

检测结果如图1所示，从图中可以看出，只有鸡毒支原体出现典型的S型扩增曲线，而其他病原体核酸均未出现扩增，证明了本发明提供的LAMP-Taqman检测方法用于检测鸡毒支原体具有很好的特异性。

实施例3

LAMP-Taqman检测鸡毒支原体的敏感性试验：

将鸡毒支原体基因组的vlhA序列重组到PUC57质粒中，得到重组质粒，如图2所示。由上海生工合成制备含重组质粒的工程菌，经发酵后参照质粒小提试剂盒(北京天根)进行质粒提取，采用超微量紫外可见分光光度计进行质粒浓度以及纯度测定，质粒浓度为25.75ng/μL，稀释10倍(2.575ng/μL)作为测试的起始浓度。

将2.575ng/μL测试质粒依次进行7个梯度的10倍稀释，稀释至0.258fg/μL，即测试质粒的浓度分别为2.575ng/μL、257.500pg/μL、25.750pg/μL、2.575pg/μL、257.500fg/μL、25.750fg/μL、2.575fg/μL和0.258fg/μL。以上述8个梯度浓度的测试质粒作为模板进行体系性测试，空载PUC57质粒作为阴性对照，检测结果如图3所示。

结果表明，本发明提供的LAMP-Taqman检测鸡毒支原体的方法的最低检出限浓度为0.258fg/μL，相关系数R²为0.995，且没有非特异性扩增。

实施例4

LAMP-Taqman检测鸡毒支原体方法稳定性验证：

将浓度为2.575ng/μL的测试质粒作为重复性检测样本，通过本发明建立的LAMP-Taqman检测方法进行检测，结果如图4所示。

试验结果表明，重复性检测变异系数Cv值小于5％，表明本发明提供的LAMP-Taqman检测鸡毒支原体的方法重复性较好。

实施例5

临床样本检测：

取河北某养禽公司鸡鼻咽拭子30份，利用市售核酸提取试剂盒(Sanshibio，DP301)提取样本的核酸，取1μL待测核酸为模板，按照实施例1提供的LAMP-Taqman方法进行检测，并与参考检测方法(农业部发布标准检测方法NY/T 553-2015)进行比较。

结果表明，30份样本经核酸提取试剂盒提取核酸后进行LAMP-Taqman检测，检测到11份鸡毒支原体阳性样本；参考检测方法检测到11份鸡毒支原体阳性样本，检测结果一致，符合率100％。

对比例1

根据鸡毒支原体特异性基因vlhA的保守序列(Sequence ID:KU577585)设计qPCR引物：

上游引物GTF：5′-GCAACTACCCCAACTCC-3′(SEQ ID NO:7)；

下游引物GTR：5′-TCTCCGCCATTCATACC-3′(SEQ ID NO:8)；

探针GTP：5′-FAM-CCTGAACCAAAGCCAAATCCAAAGCCT-3′BHQ(SEQ ID NO:9)。

荧光定量qPCR检测的反应条件：95℃5min；95℃10s，58℃30s(荧光采集)，共40个循环。

根据上述保守序列涉及第一组LAMP引物：

内引物FIP：5′-CCGCCATTCATACCACCACTAAAGCCTGAACCAAAACCA-3′；

内引物BIP：5′-GGAATGGATAATGCTGCTCCACACCAACTTTTTCAGTTTGACCAT-3′；

外引物F3：5′-CTGAACCAAAGCCAAATCC-3′；

外引物B3：5′-GTCTTTGATTTTTGCATAGTCAT-3′。

根据上述保守序列涉及第二组LAMP引物：

内引物FIP：5′-CCGCCATTCATACCACCACTAAAGCCTGAACCAAAACCA-3′；

内引物BIP：5′-GGAATGGATAATGCTGCTCCACACCAACTTTTTCAGTTTGACCAT-3′；

外引物F3：5′-CTGAACCAAAGCCAAATCC-3′；

外引物B3：5′-GTCTTTGATTTTTGCATAGTCAT-3′；

环引物LF：5′-GGAGGGTTTGGCATCGGATC-3′；

环引物LB：5′-AGCAGCTGCTAAAACAGCTTTGA-3′。

LAMP检测的反应条件：63℃，60min。

根据上述保守序列涉及第三组LAMP引物和探针：

内引物FIP：5′-CCGCCATTCATACCACCACTAAAGCCTGAACCAAAACCA-3′；

内引物BIP：5′-GGAATGGATAATGCTGCTCCACACCAACTTTTTCAGTTTGACCAT-3′；

外引物F3：5′-CTGAACCAAAGCCAAATCC-3′；

外引物B3：5′-GTCTTTGATTTTTGCATAGTCAT-3′；

环引物探针LFB：5′-FAM-GGAGGGTTTGGCATCGGATC-3′BHQ；

环引物LB：5′-AGCAGCTGCTAAAACAGCTTTGA-3′。

LAMP检测的反应条件：63℃，60min。

根据上述保守序列涉及第四组LAMP引物和探针：

内引物FIP：5′-CCGCCATTCATACCACCACTAAAGCCTGAACCAAAACCA-3′；

内引物BIP：5′-GGAATGGATAATGCTGCTCCACACCAACTTTTTCAGTTTGACCAT-3′；

外引物F3：5′-CTGAACCAAAGCCAAATCC-3′；

外引物B3：5′-GTCTTTGATTTTTGCATAGTCAT-3′；

环引物LF：5′-GGAGGGTTTGGCATCGGATC-3′；

环引物LB：5′-AGCAGCTGCTAAAACAGCTTTGA-3′；

Taqman探针：5′-FAM-CTCCGCCATTCATACCACC-3′BHQ(SEQ ID NO:10)。

LAMP-Taqman检测的反应条件：63℃，60min。

上述四组引物和探针由上海生工合成。

以实施例3中的8个梯度浓度的测试质粒作为模板进行体系性测试，比较上述各引物和探针体系的敏感性，结果如表2所示。

表2

结果表明，本发明提供的LAMP-Taqman检测方法在鸡毒支原体的检测中，比实时荧光定量qPCR的检出限低一个数量级。

第一组LAMP法(即无LF/LB)和第二组LAMP法(即有LF/LB)阴性对照出现了非特异性扩增，出现了假阳性的问题。

第三组LAMP法(即将上游环引物设计为TAqman探针)虽然避免了出现非特异性扩增，但是检测速率明显低于本发明，且检出限也比本发明高一个数量级。

第四组LAMP法(即额外设计一条Taqman探针)，检出限高灵敏度低，线性系数R²为0.982，线性较差。

对比例2

将LAMP-Taqman的检测温度分别设置为61℃，63℃，65℃，反应时间均为45min。通过实施例1的LAMP-Taqman体系对实施例3中的8个梯度浓度的测试质粒进行检测，结果如表3所示。

表3

结果表明，在63℃恒温检测时，每个浓度测试质粒的检出时间(Ct)及梯度稀释的样本线性测试结果(R²)均显著优于61℃和65℃。

综上所述，本发明通过设计的引物和探针，建立了一种针对鸡毒支原体的LAMP-Taqman检测方法，该方法可以在63℃条件下快速扩增，于反应45min后就可达到检测水平，且方法可避免非特异性扩增导致的假阳性结果的出现，特异性强、灵敏度高、最低检测限可达0.258fg/μL，对鸡毒支原体的早期临床检测和流行病学调查提供了可靠保障，有利于在临床实践中推广应用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北三狮生物科技有限公司

<120> 一种LAMP-Taqman检测鸡毒支原体的引物和探针及其应用

<130> 2022

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccgccattca taccaccact aaagcctgaa ccaaaacca 39

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggaatggata atgctgctcc acaccaactt tttcagtttg accat 45

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctgaaccaaa gccaaatcc 19

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtctttgatt tttgcatagt cat 23

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggagggtttg gcatcggatc 20

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agcagctgct aaaacagctt tga 23

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gcaactaccc caactcc 17

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tctccgccat tcatacc 17

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cctgaaccaa agccaaatcc aaagcct 27

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ctccgccatt cataccacc 19

Claims

1.一种LAMP-Taqman检测鸡毒支原体的引物和探针，其特征在于，包括：

内引物FIP：5′-CCGCCATTCATACCACCACTAAAGCCTGAACCAAAACCA-3′；

内引物BIP：5′-GGAATGGATAATGCTGCTCCACACCAACTTTTTCAGTTTGACCAT-3′；

外引物F3：5′-CTGAACCAAAGCCAAATCC-3′；

外引物B3：5′-GTCTTTGATTTTTGCATAGTCAT-3′；

环引物LF：5′-GGAGGGTTTGGCATCGGATC-3′；

环引物探针LBP：5′-AGCAGCTGCTAAAACAGCTTTGA-3′。

2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于，所述环引物探针LBP的5′端标记有荧光基团，3′端标记有淬灭基团。

3.如权利要求2所述的引物和探针，其特征在于，所述环引物探针LBP为：5′-FAM-AGCAGCTGCTAAAACAGCTTTGA-3′BHQ。

4.权利要求1-3任一项所述的引物和探针在非诊断性检测鸡毒支原体中的应用。

5.一种用于检测鸡毒支原体的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述的引物和探针。

6.如权利要求5所述的用于检测鸡毒支原体的试剂盒，其特征在于，还包括基础缓冲液、氯化钾溶液、硫酸铵溶液、吐温20、DNA聚合酶、甜菜碱、硫酸镁溶液、dTNPs和去离子水。

7.利用权利要求5所述的试剂盒检测鸡毒支原体的方法，其特征在于，具体操作为：提取鸡毒支原体的核酸为模板，用所述试剂盒进行LAMP扩增，并在扩增过程中进行实时荧光检测。

8.如权利要求7所述的检测鸡毒支原体的方法，其特征在于：所述LAMP扩增的体系包括以下试剂及用量：pH8.8Tris-HCl 20mmol，KCl 10mmol，(NH₄₎₂SO₄ 10mmol，吐温20 0.024μL，Bst DNA polymerase large fragment 8U，Taq DNA polymerase 5U，甜菜碱1mol，MgSO₄8mmol，dNTPs 1.6mmol，内引物FIP 2.0μmol，内引物BIP 2.0μmol，外引物F3 0.5μmol，外引物B3 0.5μmol，环引物LF 0.5μmol，环引物探针LBP 0.5μmol，去离子水补足至24μL。

9.如权利要求7所述的检测鸡毒支原体的方法，其特征在于：所述LAMP扩增的反应温度为62℃-64℃，反应时间为45-50min。

10.如权利要求9所述的检测鸡毒支原体的方法，其特征在于：所述LAMP扩增的反应温度为63℃，反应时间为45min。