CN102352416A

CN102352416A - 用于检测小鼠汉坦病毒的引物、探针及其试剂盒

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Publication number: CN102352416A
Application number: CN201110340729XA
Authority: CN
Inventors: 谭淑萍; 李萃; 王刚; 蒋立新; 周志文
Original assignee: Staidson Beijing Biopharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Staidson Beijing Biopharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2011-11-02
Filing date: 2011-11-02
Publication date: 2012-02-15
Anticipated expiration: 2031-11-02
Also published as: CN102352416B

Abstract

本发明公开了一种用于检测小鼠汉坦病毒的引物、探针及其方法。使用含所述引物、探针的试剂盒检测小鼠汉坦病毒简单方便、灵敏度高且检测时间短。尤其在进行汉滩病毒、汉城病毒和普马拉病毒三种汉坦病毒联合检测时，大大节省了时间，更经济省力，解决了现有检测手段复杂费时，周期长，且对操作的实验室有一定要求的不足，具有很好的应用前景。

Description

用于检测小鼠汉坦病毒的引物、探针及其试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别是涉及一种用于检测小鼠汉坦病毒的实时荧光PCR引物、探针及其试剂盒。

背景技术

自然感染实验动物的病毒很多，根据对人类的危害性，可将其分为三类；一类为人兽共患病病毒，能够感染人与灵长类动物；二类目前尚无迹象表明感染人，但能在体外培养的人、猿和猴源性细胞中进行复制，对人类有潜在危险性；三类病毒在自然条件下仅感染动物本身，目前尚无迹象表明能够感染人，因此对人类威胁不大。

现今，小鼠作为单克隆抗体、蛋白类药物等生物制品的一个主要来源，具有潜在的病毒污染。在《中华人民共和国药典(2010年版)》三部中，规定了鼠源性生物制品需质检的8种鼠源病毒，其中鼠源RNA病毒有6种，分别为小鼠肺炎病毒(Pneumonia Virus of Mice，PVM)、汉坦病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(Lymphocytic ChoriomeningitisVirus，LCMV)、呼肠孤病毒III型(Reovirus 3，Reo3)、仙台病毒(Sendaivirus，SEV)、小鼠白血病病毒(Murine leukemia virus，简称MuLV或MLV)，这些病毒属于一类或二类，为人畜共患病毒或对人类有潜在危险性。鼠源性病毒检测标准的制定对客观评价生物制品质量，确保人民健康必将起到积极的作用。

其中，汉坦病毒归属布尼亚病毒科，是一种有包膜分节段的负链RNA病毒，基因级为单负链RNA，分3个节断，由核衣壳包绕，有包膜。病毒增殖时，以负链RNA为模板产生正链RNA和mRNA，由正链RNA复制子代病毒基因级，出芽释放获得包膜。基因组包括L、M、S3个片段，分别编码L聚合酶蛋白、G1和G2糖蛋白、核蛋白。汉坦病毒包括引起肾综合征出血热(HFRS)的汉滩病毒(Hantaan virus，HTNV)、汉城病毒(Seoul virus，SEOV)、普马拉病毒(Puumala virus，PUUV)、多不拉伐病毒(Dobrava virus，DOBV)及引起汉坦病毒肺综合征(HPS)的无名病毒(SinNombre virus，SNV)、纽约病毒(New York virus，NYV)等。

在国内常见的是肾综合征出血热(HFRS)，引起肾综合征出血热的汉坦病毒包括汉坦病毒(HTNV)，汉城病毒(SEOV)和普马拉病毒(PUUV)，分别引起重度，中度和轻度的临床症状。肾综合征出血热具有明显的地区性和季节性，以10～12月份为多见，与鼠类的分布与活动有关。携带病毒的鼠(如黑线姬鼠)，通过唾液、尿、粪污染环境。人经呼吸道、消化道或直接接触等方式被传染。病毒导致全身毛细血管内皮细胞和小血管损伤，引起高热、出血、肾脏损害和免疫功能紊乱等临床表现。

药典规定的鼠源病毒检测方法有：细胞试验、动物抗体产生实验和鸡胚感染实验。这些方法从生物效应角度来检测鼠源病毒的潜在污染，检测手段复杂费时，周期长，且对操作的实验室有一定要求，不宜作为一种常规的指导生产的质控手段。

而目前发展十分成熟的实时荧光PCR技术(Real-time FluorencePolymerase Chain Reaction简称Real Time PCR)检测灵敏度高，简单方便，且对实验室要求也很低。Real Time PCR于1996年由美国Appliedbiosystems公司推出，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(or cDNA)的起始浓度进行定性定量分析的方法。该方法自产生以来，不断发展完善，特别是随着Taqman荧光探针的广泛应用，到目前为止该技术已经非常成熟。Taqman荧光探针的PCR检测是指进行PCR扩增时，在反应体系中加入一对引物的同时还加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基因和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，报告基因所发射的荧光信号被淬灭基因吸收，扩增时随着Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5’-3’外切核酸酶活性将探针酶切降解，报告荧光基团与淬灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可以监测到荧光信号，模板每复制一次，就有一个探针被切断伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一关系，所以信号累积与PCR产物完全同步。整个反应结束后，便可得到一条扩增曲线，由已知浓度标准样品的扩增曲线可以得到一条标准曲线，根据该标准曲线以及样品中的扩增曲线可对样品进行定性定量分析。

实时荧光PCR技术不仅实现了对DNA/RNA模板的定性或定量，而且具有灵敏度和特异性高、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该已被广泛用于免疫分析、细菌、病毒检测等多个领域。经基因序列比较得知，HTNV、SEOV、DOBV间的Ns基因同源率较低，使用实时荧光PCR技术分别对HTNV、SEOV、DOBV进行检测或对这3种病毒同时进行检测方面还未见有报道。

发明内容

为了解决现有小鼠汉坦病毒检测方法的不足，本发明提供了一种实时荧光PCR检测小鼠汉坦病毒的引物、探针、试剂盒及其方法，使用含所述引物、探针的试剂盒检测简单方便、灵敏度高且检测时间短。尤其在进行联合检测时，大大节省了时间，更经济省力。

本发明的一个目的是提供一种用于检测小鼠汉坦病毒的实时荧光PCR引物，其中，所述引物选自特异性地扩增汉滩病毒、汉城病毒和普马拉病毒的专用引物中的至少一对，

其中，

特异性地扩增汉滩病毒的专用引物是由具有序列表中的SEQ IDNO：1的上游引物与具有序列表中的SEQ ID NO：2的下游引物组成的一对寡核苷酸；

特异性地扩增汉城病毒的专用引物是由具有序列表中的SEQ IDNO：3的上游引物与具有序列表中的SEQ ID NO：4的下游引物组成的一对寡核苷酸；

特异性地扩增普马拉病毒的专用引物是由具有序列表中的SEQ IDNO：5的上游引物与具有序列表中的SEQ ID NO：6的下游引物组成的一对寡核苷酸。

本发明的另一个目的是提供一种可与上述提及引物配合使用的探针，其中，所述探针选自特异性地扩增汉滩病毒、汉城病毒和普马拉病毒的专用探针中的至少一种，

其中，

特异性地扩增汉滩病毒的专用探针具有序列表中的SEQ ID NO：7核苷酸序列；

特异性地扩增汉城病毒的专用探针具有序列表中的SEQ ID NO：8核苷酸序列；

特异性地扩增普马拉病毒的专用探针具有序列表中的SEQ ID NO：9核苷酸序列。

优选地，所述探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。

优选地，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、HEX中的任意一种，所述荧光淬灭基团选自TAMRA或Eclipse。

优选地，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为TAMRA。

本发明的又一个目的是提供一种用于检测小鼠汉坦病毒的实时荧光PCR试剂盒，其中，所述试剂盒包括上述提及的引物、探针。

优选地，所述试剂盒还包括RT-PCR扩增试剂、阳性RNA标准品、酵母tRNA稀释液、阴性质控品、空白对照。

优选地，所述RT-PCR扩增试剂为2×Taqman PCR Mix、40×TaqmanRT-Enzyme MIX。

优选地，所述阳性RNA标准品通过下述方法获得：扩增含序列表中SEQ ID NO：10所示的碱基序列的pMD18-T载体，得到445bp的DNA片段，体外转录所述DNA片段并纯化获得的RNA即标准品。

本发明的再一个目的是提供一种检测小鼠汉坦病毒的实时荧光PCR方法，其中，所述方法包括使用上述提及的引物及提及的任一所述的探针进行的实时荧光PCR检测。

优选地，所述实时荧光PCR的反应体系还包括RT-PCR扩增试剂、阳性RNA标准品、酵母tRNA稀释液、阴性质控品、空白对照。

优选地，所述实时荧光PCR的反应条件为：48℃，15min；95℃，10min；95℃，15sec，60℃，40sec，共40个循环。

优选地，所述方法还包括标准曲线的建立，方法为：扩增含序列表中SEQ ID NO：10所示的碱基同源序列的pMD18-T载体，得到445bp的DNA片段，体外转录所述DNA片段并纯化获得的RNA作为阳性RNA标准品，将其十倍稀释成不同浓度的阳性定量标准品，以所述阳性定量标准品作为模板进行实时荧光PCR检测，得到检测小鼠汉坦病毒的标准曲线。

本发明的最后一个目的是提供一种上述提及的引物、探针在检测鼠源生物制品中小鼠汉坦病毒残留时的应用。

与现有检测方法相比，本发明提供的实时荧光PCR试剂盒或方法检测小鼠汉坦病毒具有以下优点：

1、简单快速：现有的药典小鼠汉坦病毒检测方法为：细胞试验、动物抗体产生实验和鸡胚感染实验，从生物学效应角度检测生物制品中小鼠汉坦病毒的潜在感染，需时长(1～4周时间)，而本发明从核酸角度对小鼠汉坦病毒进行检测，从样品RNA提取开始到获得结果只需要6小时左右，其中本发明荧光定量PCR使用的是一步法反应体系，操作更为简便快速，只需1小时45分钟的时间。并且，本发明对操作实验室环境要求不高，规避了以前抽检产品可能产生的漏洞，可在企业实现批批检测，进一步提高了生物制品质控质量；另一方面，本发明也可对两种或两种以上的小鼠汉坦病毒进行联合检测，从而进一步节省了时间和成本，更加经济方便；

2、灵敏度高：现有检测方法是从生物学效应角度检测生物制品中小鼠汉坦病毒的潜在感染，其中因制剂在制备过程中经过了多个工艺步骤的处理，残留鼠源病毒的活病毒抗原及病毒抗体存在的可能性极小，而本发明从病毒核酸角度进行检测，相对前述药典规定方法而言，提高了检测的灵敏度。利用本发明中的实时荧光PCR试剂盒或方法无论是单独还是联合检测鼠源生物制品中小鼠汉坦病毒时，可以定性也可以准确定量，目标RNA在10²～10⁷浓度范围内，都有很好的线性关系，灵敏度高均可达到20copies/μl(100copies/reaction)；

3、重复性、准确性和特异性：本发明中的引物和探针分别根据每种小鼠汉坦病毒的基因序列设计，设计时充分考虑各引物间的退火温度，是经筛选后得到的特异性引物和探针，且与小鼠基因组无同源性，检测特异性强，重复性好；

4、准确性更高：本发明使用的是RNA标准品，更贴近病毒的天然状态；同时，在进行检测时标准品和样品都是RNA，在提取和扩增体系上具有一致性；

5、回收率高：本发明从提取步骤开始(而不只是荧光定量PCR过程)衡量了整个方法的可行性。行业内通用标准要求检测方法的回收率要达到50％以上，本发明实时荧光定量PCR方法回收率均达到了80％以上，是一种理想的可替代现有药典规定的检测方法。

附图说明

图1为汉滩病毒实时荧光定量PCR定量曲线；

图2为汉城病毒实时荧光定量PCR定量曲线；

图3为普马拉病毒实时荧光定量PCR定量曲线；

图4为汉滩病毒实时荧光定量PCR标准曲线；

图5为汉城病毒实时荧光定量PCR标准曲线；

图6为普马拉病毒实时荧光定量PCR标准曲线。

具体实施方式

以下所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的保护范围。

下述实施例中所述试剂原料除特别注明来源外，均为市售的常见原料，试剂的配制采用常规方法。实施例中未详述的方法均为本领域常规操作，详见《分子克隆》第三版。

实施例1小鼠汉坦病毒实时荧光PCR检测专用引物和探针的设计

从genbank中查到已有的三种汉坦病毒：汉滩病毒、汉城病毒及普马拉病毒的基因组序列，分别对三种病毒的序列比对找出的保守的同源序列区域，设计实时荧光PCR检测专用引物和探针序列。

其中各病毒优选的引物、探针序列如下表1所示：

表1

所述探针的5’端用荧光报告基团FAM标记，3’端用荧光淬灭基团TAMRA标记。

用设计的引物、探针进行同源性比对后发现其只对鼠源RNA病毒具有高度保守型，与小鼠基因组/EST、及其他近缘病毒不同源，其特异性较高。

使用上述汉滩病毒、汉城病毒及普马拉病毒的专用引物和探针扩增出的目的片段大小分别为83bp、109bp、163bp。

实施例2小鼠汉坦病毒实时荧光PCR检测试剂盒及其检测方法

2.1小鼠汉坦病毒实时荧光PCR检测试剂盒

该试剂盒的组分为：

三种汉坦病毒的引物探针混合液(分别命名为HTNV反应液、SEOV反应液、PUUV反应液)

40×Taqman RT-Enzyme MIX

2×Taqman RT-PCR Mix

RNase-free H₂O；

其中优选地，上述引物探针混合液中三种病毒反应液的体积比为1∶1∶1；

每种病毒反应液中，优选将浓度均为10μM的引物、探针按照上游引物：下游引物：探针体积比为1∶1∶1的比例混合成引物探针混合液。

本领域技术人员可知，上述实时荧光PCR试剂盒也可只包括上述三种病毒反应液中的任意一种或一种以上。

另外，该试剂盒还可包括：

阳性RNA标准品

稀释液(酵母tRNA)

阳性RNA标准品的浓度为2×10⁷copies/μl，同时试剂盒中还含有稀释液酵母tRNA，可将标准品稀释至所需浓度。

具体地，进行样品测定时，以总RNA为模板，进行实时荧光PCR，其中分别配制这3种病毒的反应体系：

反应体系(20μl)：

其中RNase-free H₂O作为空白对照。

上述反应体系中所用试剂可购自AB公司，也可直接使用其试剂盒Taqman RNA to C_T 1-step kit(cat#4392938)。

2.2小鼠汉坦病毒实时荧光PCR检测方法

(1)制备模板

根据使用说明，分别用Trizol/Trizol LS试剂盒(Invitrogen公司提供)提取样品RNA，具体方法如下：

1)向样品(如为组织需研磨匀浆)中加入适量TRIzol//Trizol LS，混匀，室温静置5min；

2)加入氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液200μl，用vortex剧烈混匀10s，室温放置5min，4℃15000prm离心15min；

3)取上清，加等体积异丙醇沉淀，4℃15000prm离心15min；

4)去除上清，加入预冷的75％乙醇(体积比1∶1)洗RNA沉淀，4℃15000prm离心10min；

5)去除上清，真空干燥，用50μl RNase-free水溶解沉淀；

6)加DNase I消化液，37℃孵育30min；

7)加300μl RNase-free水，加苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液400μl，用vortex剧烈混匀30s，4℃15000prm离心4min；

8)取水相，加入氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液400μl，vortex剧烈混匀30s，4℃15000prm离心4min；

9)加入3M醋酸钠(pH5.2)20μl，vortex混匀。加入预冷的无水乙醇1000μl，vortex混匀10s，4℃15000prm离心15min；

10)去除上清，加入预冷的75％乙醇500μl，4℃15000prm离心10min；

11)真空干燥，加RNase-free水100μl溶解，-80℃备用。

(2)配制实时荧光PCR反应体系

分别对每个进行检测的病毒按照实施例2.1中的反应体系配制，然后将其转至荧光PCR扩增仪中进行扩增检测。

(3)实时荧光PCR反应条件

将上述(2)中反应体系进行多重实时荧光PCR，具体反应条件为：48℃，15min；95℃，10min；95℃，15sec，60℃，40sec，共40个循环。每个循环结束后采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。

(4)结果判定标准：

阳性：标本检测结果Ct≤35，有明显指数增长期。

阴性：标本检测结果Ct≥38或无Ct。

可疑：标本检测结果35＜Ct＜38，有明显指数增长期，应进行重新检测。

实施例3小鼠汉坦病毒阳性RNA标准品的制备

首先合成含有三种汉坦病毒扩增目的片段基因的序列，构建pMD18-T载体，以其为模板扩增DNA片段，回收进行体外转录反应，反应结束后消化DNA模板并纯化RNA，紫外分光光度计定量后作为阳性RNA标准品。

3.1体外转录模板的制备

合成如SEQ ID NO：10所示的含有汉坦病毒(HTNV)，汉城病毒(SEOV)和Pumala病毒(PUUV)扩增目的片段基因的序列，将其插入pMD18-T载体(由Invitrogen公司合成)，以其为模板扩增DNA片段，用上游引物5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’和下游引物5’-CTCTCCTTGAGGTGGTC-3’进行扩增，扩增出445bp的DNA片段，琼脂糖凝胶电泳回收后，作为体外转录的模板。

3.2体外转录制备大量RNA

在RNase free的EP管中配制反应体系，具体配制比例如下所示：

37℃反应4小时。

3.3RNA标准品中DNA的去除

1)上述反应体系中加入10μl DNaseI，37℃继续反应30min；

2)加DEPC-H₂O 50μl/酚仿100μl，Vortex混匀，4℃离心，12000rpm，10min，转移上清，并重复该步骤一次；

3)加入1/10体积3M NaAc(pH5.2)和2.5倍体积无水乙醇，-20℃，30～60min；

4)4℃离心，12000rpm，10min，去上清。加1ml预冷的70％乙醇(RNase free)洗一次；

5)沉淀干燥后，溶于100μl RNase free的水；

6)以纯化后的RNA为模板，用引物PVM-589bp-F、PVM-589bp-R进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，若无扩增条带则说明

DNA消化完全，若有扩增条带则需从步骤1)开始重复。

3.4RNA的定量分装

体外转录的RNA标准品总长445bp，分子量约151.48kDa。即1ug纯化的RNA＝3.99×10¹³copies。紫外定量后，将RNA标准品用20ng/ul的酵母tRNA稀释至2×10⁷copies/ul，分装成30～40ul每管，-80℃冻存。

实施例4方法学验证

4.1标准曲线的建立及实时荧光PCR的灵敏度

将实施例3备用的阳性RNA标准品稀释至10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷copies/μl为模板，分别使用不同病毒特异性的引物和探针、使用实施例2中的试剂盒配制2.1中的反应体系，依照2.2检测方法中的反应条件进行实时荧光PCR反应，随着PCR体系的每一个循环结束后测定吸光值，就得到了以循环数为横坐标，吸光值为纵坐标的定量曲线和以标准品浓度的对数值为横坐标，Ct为纵坐标的标准曲线。其中，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。

本发明实时荧光PCR的检测低限：在40个循环内出现可信Ct值的稀释低限，当每差10倍模板量，Ct值相差3.3的Ct值被认为是可信的Ct值。

由图1～3所示的定量曲线可得出，该实时荧光PCR检测汉滩病毒、汉城病毒和普马拉病毒的灵敏度可达到20copies/μl(100copies/reaction)。

研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的阳性定量标准品作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

标准曲线如图4～6所示，标准曲线R2分别为0.991、0.998、0.996，线性相关性良好。

2、实时荧光PCR的重复性、准确性和特异性

将阳性RNA标准品分别稀释至浓度为10⁶、10⁴、10²copies/μl作为高、中、低值质控，以无病小鼠RNA为阴性对照即阴性质控品，以RNase-free H₂O为空白对照，分别加入不同汉坦病毒的引物、探针进行实时荧光PCR，使用汉滩病毒、汉城病毒和普马拉病毒的特异性扩增引物和探针得到的测量结果分别如下表2所示(其中，每行为一种病毒的检测结果数据，从上到下依次是汉滩病毒、汉城病毒、普马拉病毒)：

表2

由上述表2结果可知，

1)空白对照成立，实验结果有效；无病小鼠RNA检测结果为阴性；高中低值质控检测结果为阳性，故说明本检测方法具有很强的特异性；

2)3次实验标准偏差在15％以内，说明本发明重复性好，精密度符合要求；

3)准确度符合要求。

3、回收率实验

取4份小鼠肝脏组织(编号1～4)和4份市售苏肽生(编号4～8，溶解后的注射液)，将阳性RNA标准品稀释至浓度10⁸、10⁶、10⁴copies/μl，按下表3配比配制供试样品(模拟阳性样品)。

表3供试样品配制

按实施例2.2中的模板制备方法提取RNA，作为PCR反应的模板，然后使用汉坦病毒实时荧光PCR检测试剂盒、按实施例2的反应体系和条件进行实时荧光PCR反应，其中空白对照以RNase-free H₂O为模板，进行三次重复结果如表4所示，计算该方法的回收率，结果如下表4所示(其中，每行为一种病毒的检测结果数据，从上到下依次是汉滩病毒、汉城病毒、普马拉病毒)：

表4

由上述结果可知，

空白对照成立，阴性对照无信号，阳性样品均为阳性，本实验成立，同时本试剂盒回收率均在80％以上，比行业标准50％要高。

实施例5实时荧光定量检测试剂盒

三种汉坦病毒的引物探针混合液(分别命名为HTNV反应液、SEOV反应液、PUUV反应液)各500μl；

该试剂盒使用方法：

以按实施例2.2中提取的样品总RNA作为模板，阳性RNA标准品1×10⁷copies/l作为阳性对照模板，同时使用阴性对照、RNase-free H₂O空白对照，按照实施例2.1反应体系和实施例2.2反应条件进行实时荧光PCR，同时参照实施例4.1的方法将阳性RNA标准品稀释为不同浓度进行实时荧光PCR制作标准曲线。

结果分析，当阳性对照、阴性对照、空白对照都正常时，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.用于检测小鼠汉坦病毒的实时荧光PCR引物，其特征在于，所述引物选自特异性地扩增汉滩病毒、汉城病毒和普马拉病毒的专用引物中的至少一对，

其中，

2.与权利要求1所述引物配合使用的探针，其特征在于，所述探针选自特异性地扩增汉滩病毒、汉城病毒和普马拉病毒的专用探针中的至少一种，

其中，

3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针5’端连接有荧光报告基团，3’端连接有荧光淬灭基团。

4.根据权利要求2或3所述的探针，其特征在于，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、HEX中的任意一种，所述荧光淬灭基团选自TAMRA或Eclipse。

5.根据权利要求2～4任一所述的探针，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM，所述荧光淬灭基团为TAMRA。

6.一种用于检测小鼠汉坦病毒的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1中所述的引物及权利要求2～5任一所述的探针。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RT-PCR扩增试剂、阳性RNA标准品、酵母tRNA稀释液、阴性质控品、空白对照。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR扩增试剂为2×Taqman PCR Mix、40×Taqman RT-Enzyme MIX。

9.根据权利要求6～8任一所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性RNA标准品通过下述方法获得：扩增含序列表中SEQ ID NO：10所示的碱基序列的pMD18-T载体，得到445bp的DNA片段，体外转录所述DNA片段并纯化获得的RNA即标准品。

10.一种检测小鼠汉坦病毒的实时荧光PCR方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1中所述的引物及权利要求2～5任一所述的探针进行实时荧光PCR检测。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述实时荧光PCR的反应体系还包括RT-PCR扩增试剂、阳性RNA标准品、酵母tRNA稀释液、阴性质控品、空白对照。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述实时荧光PCR的反应条件为：48℃，15min；95℃，10min；95℃，15sec，60℃，40sec，共40个循环。

13.根据权利要求10～12任一所述的方法，其特征在于，所述方法还包括标准曲线的建立，方法为：扩增含序列表中SEQ ID NO：10所示的碱基同源序列的pMD18-T载体，得到445bp的DNA片段，体外转录所述DNA片段并纯化获得的RNA作为阳性RNA标准品，将其十倍稀释成不同浓度的阳性定量标准品，以所述阳性定量标准品作为模板进行实时荧光PCR检测，得到检测小鼠汉坦病毒的标准曲线。

14.权利要求1中所述的引物或权利要求2～5任一所述的探针在检测鼠源生物制品中小鼠汉坦病毒残留时的应用。