CN107383176A

CN107383176A - 用于对汉滩病毒和汉城病毒引起的肾综合征出血热分型的多肽

Info

Publication number: CN107383176A
Application number: CN201710325673.8A
Authority: CN
Inventors: 于学杰; 李文骞
Original assignee: Xuejie Yu
Current assignee: Xuejie Yu
Priority date: 2017-05-10
Filing date: 2017-05-10
Publication date: 2017-11-24

Abstract

本发明公开了一种用于对汉滩病毒和汉城病毒引起的肾综合征出血热分型的多肽，所述多肽选自具有如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列的多肽。本发明还公开了采用上述多肽为有效成分制备的用于对汉滩病毒和汉城病毒引起的肾综合征出血热进行分型的试剂盒。采用本发明的多肽能够有效的实现临床上对HTNV和SEOV出血热分型的检测，与Western‑blot相比，对患者血清中的抗体阳性率高，检测的灵敏度更高。

Description

用于对汉滩病毒和汉城病毒引起的肾综合征出血热分型的多肽

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种用于对汉滩病毒和汉城病毒引起的肾综合征出血热分型的多肽。

背景技术

肾综合征出血热(HFRS)是由汉坦病毒引起的世界范围内流行的自然疫源性疾病。我国是世界上受其危害最为严重的国家，年发病人数占世界总数的90％以上，近10年来年发病人数仍保持在4～6万，居高不下，严重危害人民的生命健康。在我国肾综合症出血热主要由汉滩病毒(HTNV)和汉城病毒(SEOV)两种类型病毒引起，HTNV和SEOV病毒的动物宿主、流行特点和所引起的临床疾病轻重明显不同，由HTNV感染引起的肾综合征出血热的症状比SEOV感染引起的严重的多，HTNV感染的病死率约为5-10％，而SEO病毒的病死率约为1％，所以对这两种病毒引起的临床感染和监测进行分型检测非常重要。

自20世纪70年代中期成功分离HTNV后，对该属病毒或血清标本的分型检测一直依赖空斑减少中和试验(PRNT)，但由于HTNV在体外传代细胞中生长缓慢，PRNT不仅需时长(通常需要10天以上时间)，而且对实验材料的要求较高，普通医疗单位难以开展。

90年代中期发展了HTNV的反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)和测序分型技术，但上述方法的敏感性差，操作复杂，实验成本较高，不适合在临床实验室和流行病学现场常规使用。

国内多年来广泛采用的血凝抑制试验虽然具有简便快速的优点，但进行分型检测时，相当数量的HTNV或SEOV型病毒感染者(或实验动物)的血清标本血抑效价非常接近，难以进行准确分型。

综上，HTNV和SEOV病毒感染的HFRS临床症状类似，但病情和结局不同，HTNV感染病死率高，SEOV感染的病死率低。目前我国和世界上对这两种病毒的分型仅限于实验室研究，临床上无法对两种疾病进行分型，无法对病人的预后和治疗进行早期预测。因此，有必要为临床上对HTNV和SEOV出血热分型提供新的分型试剂。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于对汉滩病毒和汉城病毒引起的肾综合征出血热分型的多肽。

本发明通过筛选得到HTNV和SEOV病毒的核衣壳蛋白(NP)，膜蛋白前体(Gn和Gc)氨基酸序列的特异性多肽，测试它们与HTNV病人和SEOV病人血清的反应性，为临床上对HTNV和SEOV出血热分型提供一个简短可靠的抗原试剂。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种用于对汉滩病毒和汉城病毒引起的肾综合征出血热分型的多肽，所述多肽选自具有如下氨基酸序列的多肽：

HNP1：SDRIEQWL SAPCKLLPDTA-AVSLHGGPATNRDNLRQRQVALGNMETKESKAIRQHAESAGCSMIED；(SEQ ID NO.1)

SNP1:TSRIEEWL GAPCKFMAESPIAGSLSGNP-VNRDYIRQRQGALAGMEPKEFQALRQHAKDAGCTLVEH；(SEQ ID NO.2)

HVGnGc1:IWKWLVMASLVWPVLTLRNVYDMKIECPHTVSFGGNSVIGYVELPPVPLA DTAQM；(SEQID NO.3)

SVGnGc1:MWSLLLLAALVGQGFALKNVFDMRIQCPHSVKFGETSVSGYTELPPLSLQ EAEQL；(SEQID NO.4)

HVGnGc2:NTITKYTQVSWRGKADQSQSSQNSFETVSTEVDLKGTCVLKHK；(SEQ I D NO.5)

SVGnGc2:STINKLTKVIWRKKANQESANQNSFEILESEVSFKGLCMLKHR；(SEQ ID NO.6)

HVGnGc3:QSVVSIIKHGIFDIASVHIVCFFVAVKGNTYKIFEQVKKSFESTCNDTEN；

(SEQ ID NO.7)

SVGnGc3:KAVVSALKRGMYAIASIETICFFIHQKGNKYKIVTAITSAMGSKCNNTDT；(SEQ IDNO.8)。

本发明的第二方面，提供上述多肽在制备对汉滩病毒和汉城病毒引起的肾综合征出血热进行分型的试剂、试剂盒或芯片中的应用。

本发明的第三方面，提供一种用于对汉滩病毒和汉城病毒引起的肾综合征出血热进行分型的试剂盒，所述试剂盒以上述的多肽为有效成分。

优选的，所述试剂盒中含有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5或SEQ IDNO.7所示的多肽中的至少一种；和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6或SEQ I DNO.8所示的多肽中的至少一种。

更为优选的，所述试剂盒中含有SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7所示的多肽中的至少一种；和SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示的多肽中的至少一种。

进一步的，所述试剂盒中还包含：PVDF膜、一抗和二抗。

所述一抗为HFRS病人血清，以1:200TBST稀释。

所述二抗为HRP标记的山羊抗人，以1:5000TBST稀释。

本发明的第四方面，提供一种对汉滩病毒和汉城病毒引起的肾综合征出血热分型的方法，步骤如下：

将上述多肽与HFRS患者血清进行斑点免疫印迹反应，若血清只和来自HTNV的多肽反应，说明为HTNV型；若血清只和来自SEOV的多肽反应，说明为SEOV型；若血清既可以和HTNV的多肽反应，也可以和SEOV的多肽反应，说明先后感染过HTNV和SEOV。

上述方法不用于疾病的诊断和治疗。

本发明的有益效果：

采用本发明的多肽能够有效的实现临床上对HTNV和SEOV出血热分型的检测，与Western-blot相比，对患者血清中的抗体阳性率高，检测的灵敏度更高。

RT-PCR检测HTNV和SEOV是通过检测血清中的RNA，运用特异性多肽是通过检测血清中的抗体，抗体与抗原发生特异性结合，病毒在免疫功能正常的人体内不能长期存在，所以RT-PCR在检测患者的血清中HTNV或者SEOV的灵敏度会比较低。与RT-PCR检测相比，采用本发明的多肽对HTNV和SEOV进行检测的灵敏度也更高。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，HTNV和SEOV病毒感染的HFRS临床症状类似，但病情和结局不同，HTNV感染病死率高，SEOV感染的病死率低。目前我国和世界上对这两种病毒的分型仅限于实验室研究，临床上无法对两种疾病进行分型，无法对病人的预后和治疗进行早期预测，基于此，本申请提出了一种用于对汉滩病毒和汉城病毒引起的肾综合征出血热分型的多肽。

在本申请的一种实施方案中，提供了一种用于对汉滩病毒和汉城病毒引起的肾综合征出血热分型的多肽，所述多肽选自具有如下氨基酸序列的多肽：

HVGnGc1:IWKWLVMASLVWPVLTLRNVYDMKIECPHTVSFGGNSVIGYVELPPVPLA DTAQM；(SEQID NO.3)

SVGnGc1:MWSLLLLAALVGQGFALKNVFDMRIQCPHSVKFGETSVSGYTELPPLSLQ EAEQL；(SEQID NO.4)

HVGnGc2:NTITKYTQVSWRGKADQSQSSQNSFETVSTEVDLKGTCVLKHK；(SEQ I D NO.5)

SVGnGc2:STINKLTKVIWRKKANQESANQNSFEILESEVSFKGLCMLKHR；(SEQ ID NO.6)

HVGnGc3:QSVVSIIKHGIFDIASVHIVCFFVAVKGNTYKIFEQVKKSFESTCNDTEN；

(SEQ ID NO.7)

SVGnGc3:KAVVSALKRGMYAIASIETICFFIHQKGNKYKIVTAITSAMGSKCNNTDT；(SEQ IDNO.8)。

上述多肽可以从HTNV和SEOV病毒的核衣壳蛋白(NP)和膜蛋白前体(Gn和Gc)中分离纯化得到；或者通过常规的蛋白合成方法进行合成。

在本申请的另一种实施方式中，提供了一种用于对汉滩病毒和汉城病毒引起的肾综合征出血热进行分型的试剂盒，该试剂盒以上述四对多肽为有效成分，与HFRS患者血清进行斑点免疫印迹反应，通过多肽与血清中抗体的特异性结合来进行分型。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：用于对汉滩病毒和汉城病毒引起的肾综合征出血热分型的多肽

用于对汉滩病毒和汉城病毒引起的肾综合征出血热分型的多肽，及多肽序列的比对结果如表1所示：

表1：

实施例2：采用上述多肽对汉滩病毒和汉城病毒引起的肾综合征出血热进行分型

用Dot-blot分别将多肽(实施例1的表1所示)与HFRS患者血清以及正常人血清进行斑点免疫印迹反应(多肽分别点在PVDF膜的不同位置，多肽用量相同：1μL的1mol/L多肽)，一抗：HFRS病人血清以1:200TBST稀释，二抗：加入HRP标记的山羊抗人二抗(1:5000TBST稀释)，若来自HTNV/SEOV的多肽能与血清中的抗体特异性结合，说明患者曾经感染过HTNV/SEOV。

51份的HFRS患者血清中(该51位HFRS患者感染的病毒类型已确诊，病史明确)，有13份血清只和来自HTNV的多肽反应，说明这些病人感染了HTNV，同时有另外13份血清可以和来自SEOV的多肽反应，说明这些病人感染了SEOV，有2份血清既可以和HTNV的多肽反应，也可以和SEOV的多肽反应，说明这两个病人先后感染过HTNV和SEOV。

78份的正常人血清中，和来自HTNV的多肽以及来自SEOV的多肽均不反应，结果均为阴性。

结果表明：采用本发明的上述多肽对上述51份的HFRS患者血清的检测结果与确诊结果一致，无假阳性或假阴性的检测结果。

对于正常人血清均没有阳性反应，说明采用本发明的多肽进行检测的特异性和准确性高。

对比例1：

(1)原核表达HTNV的NP和纯化HNP

将质粒19T-HTN-NP转化入DH 5α感受态细胞，挑取单个白色菌落，摇菌24h，提取质粒，用上游引物(5′-ATAAGAAGGCGGCCGCATGGCAACTATGGAGGAACT-3′)和下游引物(5′-CCGCTCGAGTTACTACAGTTTTAAAGGCTCTTGGT-3′)扩增出HTNV的核蛋白基因(HNP)片段，电泳鉴定，回收目的片段，将目的片段分别连入19T simple载体，挑取单个白色菌落，摇菌24h，提取质粒，用NotI/XhoI酶切，回收目的片段，连入酶切过后空载体pET32a，构建重组质粒pET32a-HNP，pET32a转化BL21大肠肝菌感受态细胞，IPTG诱导表达HNP蛋白，Western-blot鉴定HNP蛋白，蛋白纯化用Ni-NTA Superflow纯化柱(货号为30761，生产商美国QIAGEN公司)

(2)用Western-blot将重组蛋白HNP与51位HFRS患者的血清(同实施例2中的血清)进行免疫印迹，一抗：HFRS病人血清以1:200TBST稀释，二抗：加入HRP标记的山羊抗人二抗(1:5000TBST稀释)，若重组蛋白HNP能与血清中的抗体特异性结合，说明患者曾经感染过汉坦病毒，实验结果显示，51份病人血清中，有25份能与HNP发生特异性结合。

对比例2：

提取51份病人血清RNA，通过RT-PCR检测只有三份RNA阳性，检测出的三份经过测序都是HTNV。

对于上述同样的51份病人血清，采用实施例2、对比例1和对比例2的检测结果如表2所示：

表2：检测患者血清中HTNV和SEOV的抗体

由表2可以看出，Western-blot结果显示(即采用对比例1的方法)，用HNP检测患者血清中的抗体阳性率是49.02％(25/51)，Dot-blot结果显示(即采用实施例2的方法)，多肽检测患者血清中的抗体阳性率是54.90％(28/51)。而且其中有26份血清只和HTNV或者SEOV中的多肽反应，有2份与HTNV和SEOV的多肽都反应。通过这个结果我们可以看出来，特异性多肽的灵敏度比HNP的灵敏度更高，而且特异性多肽可以很好的区分出患者感染的是HTNV或者SEOV。

RT-PCR检测(对比例2)阳性率很低，因为很多病人在感染早期一般只会出现发热和头疼的症状，在病情进展到需要就医时，体内的病毒已经被人体产生的中和抗体中和。所以用RT-PCR对于出血热分型诊断效率低下且实验操作复杂，实验成本高。

在实施例1表1的四对多肽中，GnGc2和GnGc3有着较高的阳性率，而NP和GnGc1阳性率较低。在15位感染了HTNV的患者中，有14份患者血清中的抗体可以和HGnGc2和HGnGc3特异性结合。15位感染了SEOV的患者，血清中的抗体全部都可以和SGnGc2和SGnGc3发生特异性结合。结果如表3所示。

表3：患者血清中抗体与多肽特异性结合的阳性率

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 于学杰

<120> 用于对汉滩病毒和汉城病毒引起的肾综合征出血热分型的多肽

<130> 2017

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 66

<212> PRT

<213> HNP1

<400> 1

Ser Asp Arg Ile Glu Gln Trp Leu Ser Ala Pro Cys Lys Leu Leu Pro

1 5 10 15

Asp Thr Ala Ala Val Ser Leu His Gly Gly Pro Ala Thr Asn Arg Asp

20 25 30

Asn Leu Arg Gln Arg Gln Val Ala Leu Gly Asn Met Glu Thr Lys Glu

35 40 45

Ser Lys Ala Ile Arg Gln His Ala Glu Ser Ala Gly Cys Ser Met Ile

50 55 60

Glu Asp

65

<210> 2

<211> 66

<212> PRT

<213> SNP1

<400> 2

Thr Ser Arg Ile Glu Glu Trp Leu Gly Ala Pro Cys Lys Phe Met Ala

1 5 10 15

Glu Ser Pro Ile Ala Gly Ser Leu Ser Gly Asn Pro Val Asn Arg Asp

20 25 30

Tyr Ile Arg Gln Arg Gln Gly Ala Leu Ala Gly Met Glu Pro Lys Glu

35 40 45

Phe Gln Ala Leu Arg Gln His Ala Lys Asp Ala Gly Cys Thr Leu Val

50 55 60

Glu His

65

<210> 3

<211> 55

<212> PRT

<213> HVGnGc1

<400> 3

Ile Trp Lys Trp Leu Val Met Ala Ser Leu Val Trp Pro Val Leu Thr

1 5 10 15

Leu Arg Asn Val Tyr Asp Met Lys Ile Glu Cys Pro His Thr Val Ser

20 25 30

Phe Gly Gly Asn Ser Val Ile Gly Tyr Val Glu Leu Pro Pro Val Pro

35 40 45

Leu Ala Asp Thr Ala Gln Met

50 55

<210> 4

<211> 55

<212> PRT

<213> SVGNGC1

<400> 4

Met Trp Ser Leu Leu Leu Leu Ala Ala Leu Val Gly Gln Gly Phe Ala

1 5 10 15

Leu Lys Asn Val Phe Asp Met Arg Ile Gln Cys Pro His Ser Val Lys

20 25 30

Phe Gly Glu Thr Ser Val Ser Gly Tyr Thr Glu Leu Pro Pro Leu Ser

35 40 45

Leu Gln Glu Ala Glu Gln Leu

50 55

<210> 5

<211> 43

<212> PRT

<213> HVGnGc2

<400> 5

Asn Thr Ile Thr Lys Tyr Thr Gln Val Ser Trp Arg Gly Lys Ala Asp

1 5 10 15

Gln Ser Gln Ser Ser Gln Asn Ser Phe Glu Thr Val Ser Thr Glu Val

20 25 30

Asp Leu Lys Gly Thr Cys Val Leu Lys His Lys

35 40

<210> 6

<211> 43

<212> PRT

<213> SVGnGc2

<400> 6

Ser Thr Ile Asn Lys Leu Thr Lys Val Ile Trp Arg Lys Lys Ala Asn

1 5 10 15

Gln Glu Ser Ala Asn Gln Asn Ser Phe Glu Ile Leu Glu Ser Glu Val

20 25 30

Ser Phe Lys Gly Leu Cys Met Leu Lys His Arg

35 40

<210> 7

<211> 50

<212> PRT

<213> HVGnGc3

<400> 7

Gln Ser Val Val Ser Ile Ile Lys His Gly Ile Phe Asp Ile Ala Ser

1 5 10 15

Val His Ile Val Cys Phe Phe Val Ala Val Lys Gly Asn Thr Tyr Lys

20 25 30

Ile Phe Glu Gln Val Lys Lys Ser Phe Glu Ser Thr Cys Asn Asp Thr

35 40 45

Glu Asn

50

<210> 8

<211> 50

<212> PRT

<213> SVGnGc3

<400> 8

Lys Ala Val Val Ser Ala Leu Lys Arg Gly Met Tyr Ala Ile Ala Ser

1 5 10 15

Ile Glu Thr Ile Cys Phe Phe Ile His Gln Lys Gly Asn Lys Tyr Lys

20 25 30

Ile Val Thr Ala Ile Thr Ser Ala Met Gly Ser Lys Cys Asn Asn Thr

35 40 45

Asp Thr

50

Claims

1.一种用于对汉滩病毒和汉城病毒引起的肾综合征出血热分型的多肽，所述多肽选自具有如下氨基酸序列的多肽：

HVGnGc1:IWKWLVMASLVWPVLTLRNVYDMKIECPHTVSFGGNSVIGYVELPPVPLADTAQM；(SEQ IDNO.3)

SVGnGc1:MWSLLLLAALVGQGFALKNVFDMRIQCPHSVKFGETSVSGYTELPPLSLQEAEQL；(SEQ IDNO.4)

HVGnGc2:NTITKYTQVSWRGKADQSQSSQNSFETVSTEVDLKGTCVLKHK；(SEQ ID NO.5)

SVGnGc2:STINKLTKVIWRKKANQESANQNSFEILESEVSFKGLCMLKHR；(SEQ ID NO.6)

HVGnGc3:QSVVSIIKHGIFDIASVHIVCFFVAVKGNTYKIFEQVKKSFESTCNDTEN；

(SEQ ID NO.7)

SVGnGc3:KAVVSALKRGMYAIASIETICFFIHQKGNKYKIVTAITSAMGSKCNNTDT；(SEQ ID NO.8)。

2.权利要求1所述的多肽在制备对汉滩病毒和汉城病毒引起的肾综合征出血热进行分型的试剂、试剂盒或芯片中的应用。

3.一种用于对汉滩病毒和汉城病毒引起的肾综合征出血热进行分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒以权利要求1所述的多肽为有效成分。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7所示的多肽中的至少一种；和SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示的多肽中的至少一种。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有SEQ ID NO.5或SEQ IDNO.7所示的多肽中的至少一种；和SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示的多肽中的至少一种。

6.如权利要求3-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含：PVDF膜、一抗和二抗。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述一抗为HFRS病人血清，以1:200TBST稀释。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述二抗为HRP标记的山羊抗人，以1:5000TBST稀释。

9.一种对汉滩病毒和汉城病毒引起的肾综合征出血热分型的方法，其特征在于，步骤如下：

将权利要求1所述的多肽与HFRS患者血清进行斑点免疫印迹反应，若血清只和来自HTNV的多肽反应，说明为HTNV型；若血清只和来自SEOV的多肽反应，说明为SEOV型；若血清既可以和HTNV的多肽反应，也可以和SEOV的多肽反应，说明先后感染过HTNV和SEOV。