CN104086657B - 用于联合检测EB病毒Rta蛋白抗体与EB病毒早期抗原EA抗体的人工抗原及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术、医学免疫学与体外血清学诊断技术领域，尤其涉及一种用于联合检测EB病毒Rta蛋白抗体与EB病毒早期抗原EA抗体的人工抗原及试剂盒。本发明提供的人工抗原，能够准确、高效、灵敏、特异地检出待测样品中存在的EB病毒Rta蛋白抗体与早期抗原EA抗体。采用所述人工抗原制成的试剂盒，与传统的检测方法相比，提高了鼻咽癌诊断的灵敏度和特异性，缩短了检测时间，使患者能得到及时的治疗，减轻痛苦。

Description

用于联合检测EB病毒Rta蛋白抗体与EB病毒早期抗原EA抗体 的人工抗原及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术、医学免疫学与体外血清学诊断技术领域，尤其涉及一种用于联合检测EB病毒Rta蛋白抗体与EB病毒早期抗原EA抗体的人工抗原及试剂盒。

背景技术

EB病毒是Epstein和Barr于1964年首次成功地将Burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养而建株，并在建株细胞涂片中用电镜观察到的疱疹病毒颗粒。该病毒是多种恶性肿瘤(如鼻咽癌)的病因之一，它主要感染人类口咽部的上皮细胞和B淋巴细胞。在中国南方鼻咽癌患病人群中大多都检测到有EB病毒基因组存在。鼻咽癌(nasopharygealcarcinoma,NPC)是指发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤，多发于东南亚地区，在我国南方各种恶性肿瘤中占第一位。

经多年研究发现，鼻咽癌与EB病毒关系最为密切，EB病毒被激活感染鼻咽部细胞，由潜伏期进入裂解复制状态时，导致鼻咽部细胞发生异常分裂增生造成癌变。鼻咽癌患者血清中具有针对多种EB病毒抗原的抗体谱，一般通过检测血清EB病毒抗体来评估患鼻咽癌的危险度，为鼻咽癌的诊断提供了有效的检测指标。申请号为200610113403的发明专利申请公开了Rta是EB病毒刚刚进入裂解复制状态时就表达的立即早期基因BRLF1的编码转录激活蛋白，是EB病毒进入裂解复制状态必需的激活元件而且仅在鼻咽癌发生时表达，对诊断鼻咽癌具有极高的特异性。现在临床用于诊断鼻咽癌的主要指标为：EB病毒衣壳抗原(VCA)、早期抗原(EA)，且主要是检测其IgA抗体，用于鼻咽癌患者的诊断和预警。经大量临床实验证实EB病毒VCA-IgA抗体用于鼻咽癌诊断虽然灵敏度高，但是特异性差，在健康人群中有很高的检出率；EB病毒EA-IgA抗体用于鼻咽癌诊断特异性好，但灵敏度差，鼻咽癌漏检率较高。而EB病毒Rta-IgA抗体用于鼻咽癌诊断特异性非常好。

发明内容

本发明针对上述领域存在的问题，提供一种用于联合检测EB病毒Rta蛋白抗体与EB病毒早期抗原(EA)抗体的人工抗原及试剂盒。

本发明请求保护的技术方案如下：

一种用于联合检测EB病毒Rta蛋白抗体与EB病毒早期抗原EA抗体的人工抗原，其氨基酸序列的结构为N-R1-R2-C或N-R2-R1-C，其中R1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；R2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一种含有EB病毒Rta蛋白与早期抗原EA的抗原决定簇的抗原蛋白，包含SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

编码上述人工抗原的基因。

上述人工抗原的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。

含有任一上述人工抗原的基因的重组质粒。

所述重组质粒，是以表达载体pET32a(+)为骨架载体，以SEQ ID NO:3所示的基因为外源基因的重组质粒pET32a-Rta-EA。

一种用于联合检测EB病毒Rta蛋白抗体与EB病毒早期抗原EA抗体的试剂盒，其特征在于：以上述人工抗原为检测抗原。

所述试剂盒包括酶标板和酶标记的抗人IgA、校准品溶液、阳性对照溶液、阴性对照溶液、底物显色液、终止液、样品稀释液及浓缩洗涤液，所述人工抗原包被于所述酶标板的反应孔中。

所述酶标记的抗人IgA在酶标记中所用的标记酶为辣根过氧化物酶，所述显色液由显色A液和显色B液组成，显色A液为过氧化氢或过氧化脲，显色B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1～2mol/L硫酸或者盐酸溶液，所述辣根过氧化物酶标记的抗人IgA的工作稀释度为1：5000～1:80000；

或者所述标记酶为碱性磷酸酯酶，显色液为硝基磷酸盐缓冲液，终止液为1～2mol/L氢氧化钠溶液。

所述校准品溶液为含人EBV-Rta-EA-IgA阳性血清的pH7.4磷酸盐缓冲液，所述阳性对照溶液为含人EBV-Rta-EA-IgA阳性血清的pH7.4磷酸盐缓冲液，所述阴性对照溶液为含人EBV-Rta-EA-IgA阴性血清的pH7.4磷酸盐缓冲液，所述样品稀释液为含有0.3M NaCl的50mM的磷酸盐缓冲液，所述浓缩洗涤液为含有0.02～0.05％(v/v)Proclin300和1.0～2.0％(v/v)吐温-20的pH值为7.2～8.5的0.01～0.03mol/L的磷酸盐缓冲液。

任一上述试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

1)制备酶标板：

用包被缓冲液将权利要求1所述的人工抗原稀释至100ng/ml，然后加入到酶标板孔中，每孔100μl，进行反应；所述包被缓冲液为pH值9.0～9.6的0.1mol/L的碳酸盐缓冲液；

甩掉包被液后，拍干，每孔加入200μl的封闭液，反应，甩掉封闭液，拍干，保存；所述封闭液为含有1～10％(m/m)牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；

2)配制酶标记的抗人IgA：

亲和层析纯化HRP标记的抗人IgA，纯度大于95％，效价不低于1:2000；

3)配制校准品溶液、阳性对照溶液、阴性对照溶液、底物显色液、终止液、样品稀释液及浓缩洗涤液。

本发明所述的抗原蛋白为经优化后的串联表达的EB病毒早期抗原EA和Rta蛋白。具体地，在NCBI网站查找EB病毒EA抗原(Protein Id：CAA24844.1)、Rta蛋白的氨基酸(Protein Id：CAA24813.1)序列(GenBank:V01555.2)，对两个蛋白所具有的抗原表位进行分析，选择抗原表位比较集中且不影响蛋白空间结构的片段，然后对两个蛋白中选择保留的多肽片段的氨基酸序列信息进行连接得到人工抗原的氨基酸序列，如SEQ ID NO:5或SEQID NO:6所示；并对编码该人工抗原的核苷酸密码子进行优化，根据优化的基因序列进行人工抗原的基因合成，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。

利用PCR技术扩增上述合成的人工基因片段，构建至原核表达载体，并在大肠杆菌中表达该重组蛋白，将纯化后的重组蛋白通过ELISA方法检测EB病毒抗体，用于辅助鼻咽癌的临床筛查与诊断。实验数据表明，本发明的人工抗原蛋白在鼻咽癌的临床诊断中，对EB病毒Rta-IgA抗体和EA-IgA抗体的联合检测能够弥补单独检测EA-IgA抗体时灵敏度差这一缺点，同时增强检测的特异性，为鼻咽癌的诊断提供了有效的检测指标。用本发明的人工抗原以一定浓度包被酶标板，制成的ELISA检测试剂盒能够准确、高效、灵敏、特异地检测样品中存在的EB病毒Rta蛋白与早期抗原(EA)的抗体。在鼻咽癌病人血清样本和健康人血清样本的检测中，鼻咽癌病人的阳性检出率，即灵敏度为91.4％；健康人群检测的阴性率为96.4％，均高于目前常规使用的单独的EA、VCA抗体的检测，有利于临床鼻咽癌筛查，使患者得到及时、恰当的治疗。

本发明提供的人工抗原的制成的试剂盒形式不限于包被酶标板，只要是基于ELISA原理的检测载体，只要采用了本发明的人工抗原，都包括在本发明请求保护的范围内。

本发明所用的表达载体不限于特定的表达载体，只要它能与所述抗原蛋白的DNA片段重组，形成适合蛋白表达的表达质粒即可。

本发明还提供一种用于联合检测EB病毒Rta蛋白抗体与EB病毒早期抗原(EA)抗体的试剂盒，其特征在于包括一个以本发明的人工抗原作为包被抗原的酶标板。

本发明制备的优选试剂盒中，主要试剂采用工作液形式，成本低廉，操作简便，简化了传统检测方法的步骤，缩短了检测时间，同时能实现多样本处理，提高了检测效率，使医生能够迅速了解患者的病情，及时提出合适的治疗方案。

本发明的试剂盒采用板式酶标板，能够适应国内普及的检测设备，并且能保证检测的灵敏度高、特异性好、准确度高、稳定性好。

综上，本发明提供的人工抗原，能够准确、高效、灵敏、特异地检出待测样品中存在的EB病毒Rta蛋白抗体与早期抗原EA抗体。采用所述人工抗原制成的试剂盒，与传统的检测方法相比，提高了鼻咽癌诊断的灵敏度和特异性，缩短了检测时间，使患者能得到及时的治疗，减轻痛苦。

附图说明

图1 pET32a-Rta-EA重组质粒图谱

图2 BCA-100蛋白质定量试剂盒标准蛋白曲线

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制。任何人在本发明的启示下或是将本发明与其它现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

本发明所用试剂来源及规格如下：

实验所用载体、限制性内切酶、T4DNA连接酶、pMD18-T和pET32a购自TaKaRa公司；

序列合成、引物合成、测序由上海生物工程公司完成；

辣根过氧化物酶购于SIGMA，批号为9003-99-0；

过氧化氢购于SIGMA，批号为7722-84-1；

过氧化脲购于SIGMA，批号为U1753；

邻苯二胺或四甲基联苯胺购于SIGMA，批号为T2885；

1—2mol/L硫酸购于北京化工厂，批号为7647-02-0；

盐酸溶液购于北京化工厂，批号为7647-01-0；

1—2mol/L氢氧化钠溶液购于北京化工厂，批号为1310-73-2。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为本领域技术人员熟知的常规实验方法。

实施例1 EB病毒Rta蛋白、EA抗原在大肠杆菌中的串联表达

在NCBI网站查找EB病毒Rta蛋白、EA抗原的氨基酸序列(见序列表SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)，采用http://www.imtech.res.in/raghava/bcepred/bcepred_submission.html对其抗原表位进行分析，对其抗原表位进行选择，获得优化的EB病毒Rta蛋白片段(Seq ID No：1)和优化的EB病毒EA抗原(Seq ID No：2)，并对密码子进行优化。将优化后的Rta、EA抗原基因序列组合并合成，用Primer5.0引物设计软件设计引物，

上游引物P1：5’-CCTCGAGATGGCTTCTTCTAACCGT-3’,

下游引物P2：5’-CTGGATCCTTTGGTTTTGAAACGCAG-3’。

Pl、P2引物中分别含有Xho I、BarmH I酶切位点。

利用PCR技术扩增上述合成基因。

PCR反应体系：

PCR反应参数：94℃预变性5min，94℃变性60S，54℃退火60S，72℃延伸60S，共30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经凝胶电泳后回收大小为1155bp的DNA条带，如Seq IDNo.3所示，为人工抗原基因序列。

将回收后的目的片段与pMD18-T载体连接，转化(具体操作按照《分子克隆指南》进行)，将经PCR、酶切鉴定的阳性质粒pMD18-Rta-EA进行测序验证，合格后将pMD18-Rta-EA及表达载体pET32a(+)分别进行Xho I/BarmH I双酶切，回收后进行连接，转化后所得阳性质粒命名为pET32a-Rta-EA，经测序合格后，将其转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取转化子，接种于含100mg/L卡那抗生素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜。

将培养物按l％比例接种于含卡那抗生素的新鲜LB培养基中，37℃振荡培养至D_600nm为0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mmol/L，37℃诱导培养4h，按常规方法离心收集菌体，将采用超声波破碎的细菌上清、沉淀及细菌总蛋白进行SDS-PAGE电泳分析。结果在64KD附近出现明显的蛋白条带，大小与预期融合蛋白的分子量一致，用BandScan软件分析，表达的融合蛋白约占菌体总蛋白的52.3％。按照BCA-100蛋白质定量试剂盒(北京赛驰生物，产品货号300001-B)操作说明书进行试验，为表达的蛋白进行定量测定，具体为根据BCA-100蛋白质定量试剂盒标准蛋白所测平均OD值为纵坐标，各孔的蛋白质浓度(mg/m1)为横坐标制作标准蛋白曲线，经线性回归拟合得回归方程，将样本的OD值代入，计算出EB病毒pET32a-Rta-EA蛋白浓度为1.78mg/ml。

实施例2 用于联合检测EB病毒Rta蛋白抗体与早期抗原EA抗体的试剂盒的制备

(一)试剂盒的组成

1、包被有Rta-EA抗原的酶标板：包被蛋白为高纯度基因重组Rta-EA蛋白，包被浓度可以为0.05-0.25μg/ml；

2、HRP标记的羊抗人IgA，其工作稀释度可以为1：5000—1:80000；

3、校准品溶液、阳性对照溶液、阴性对照溶液，各1瓶，1ml/瓶；

4、样品稀释液：为含0.3M NaCL的50mM的磷酸盐缓冲液，25ml/瓶，2瓶；

5、底物显色液：由A液和B液组成，底物显色液A液为过氧化脲，7ml/瓶，1瓶；底物显色液B液为四甲基联苯胺，7ml/瓶，1瓶；

6、终止液：2mol/l硫酸；

7、浓缩洗涤液：pH值为7.4，含有终浓度为0.05％的Proclin300、终浓度为2.0％的吐温-20、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液，40ml/瓶，1瓶。

(二)试剂盒的制备

1、包被有高纯度基因重组Rta-EA抗原的酶标板的制备

(1)包被蛋白为实施例1制备的高纯度基因重组Rta-EA抗原。

(2)抗原包被酶标板的制备：

用包被缓冲液(pH值为9.6、0.1mol/L碳酸盐缓冲液)将以上EB病毒Rta-EA抗原进行1：10000稀释，加入到酶标板孔中，每孔100μl，37℃反应2小时，甩掉包被液后，拍干，每孔加入200μl的封闭液(含终浓度为2％牛血清白蛋白磷酸盐缓冲液)，37℃反应2小时，甩掉封闭液，拍干，干燥，用铝箔袋真空包装保存。

2、工作浓度酶溶液的配制

HRP标记羊抗人IgA需经亲和层析纯化，种属特异性强，纯度大于95％，效价不低于1:2000。选择商品化酶联物稀释液，由biopanda诊断试剂公司生产。

3、校准品、阳性对照、阴性对照的配制

校准品、阳性对照用经检测HIV抗体、HCV抗体和HBsAg均为阴性，用本发明试剂盒检测EBV Rta-EA-IgA为阳性的血清样本，用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释为相应浓度。

阴性对照用经检测HIV抗体、HCV抗体和HBsAg均为阴性，用本发明试剂盒检测EBVRta-EA-IgA为阴性的血清样本，用pH7.4的磷酸盐缓冲液稀释为相应浓度。

(三)试剂盒的使用方法

1、检测

向包被高纯度基因重组Rta-EA蛋白的酶标板中加入样本稀释液100μl，每孔加样本10μl，并在预留的孔中加入EBV Rta-IgG校准品溶液、阴性对照、阳性对照各100μl，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应30分钟，洗板5次，拍干；每孔中各加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgA100μl，用盖板膜封板，37℃恒温箱中反应20分钟，甩干孔内液体，洗板5次，拍干；每孔加入底物显色液A液过氧化脲50μl，底物显色液B液四甲基联苯胺(TMB)50μl，轻轻振荡混匀，37℃恒温箱避光显色10分钟，每孔加入2mol/L硫酸终止液50μl，轻轻振荡混匀，将酶标仪波长设定在450/630nm处，测定每孔吸光值(OD值)。

2、检测结果分析

以校准品的吸光度值作为临界值，检测结果高于临界值的样本为阳性，低于临界值的样本为阴性。

实施例3 本发明试剂盒的临床试验评价

用本发明制备的试剂盒对55例正常人样本和58例确诊鼻咽癌的病人样本进行检测，检测程序和结果判断严格按照实施例2提供的试剂盒的使用方法进行，同时选用VCA抗体检测试剂盒和EA抗体检测试剂盒(均商购自中国预防医学病毒学研究所)进行平行检测，具体操作按照试剂盒说明书进行。检测结果如表1所示。

表1 检测结果比较

由以上结果可以看出，本发明提供的试剂盒在鼻咽癌的诊断和筛查中性能极好，灵敏度为91.4％，特异性为96.4％，可用于临床使用。

Claims (11)

1.一种用于联合检测EB病毒Rta蛋白抗体与EB病毒早期抗原EA抗体的人工抗原，其氨基酸序列的结构为N-R1-R2-C或N-R2-R1-C，其中R1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；R2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；N表示氨基端方向，C表示羧基端方向。

2.一种含有EB病毒Rta蛋白与早期抗原EA的抗原决定簇的抗原蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6所示。

3.编码权利要求1所述的人工抗原的基因。

4.根据权利要求3所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。

5.含有权利要求3或4所述的基因的重组质粒。

6.根据权利要求5所述的重组质粒，是以表达载体pET32a(+)为骨架载体，以SEQ IDNO:3所示的基因为外源基因的重组质粒pET32a-Rta-EA。

7.一种用于联合检测EB病毒Rta蛋白抗体与EB病毒早期抗原EA抗体的试剂盒，其特征在于：以权利要求1所述的人工抗原为检测抗原。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，包括酶标板和酶标记的抗人IgA、校准品溶液、阳性对照溶液、阴性对照溶液、底物显色液、终止液、样品稀释液及浓缩洗涤液，所述人工抗原包被于所述酶标板的反应孔中。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述酶标记的抗人IgA在酶标记中所用的标记酶为辣根过氧化物酶，所述显色液由显色A液和显色B液组成，显色A液为过氧化氢或过氧化脲，显色B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1～2mol/L硫酸或者盐酸溶液，所述辣根过氧化物酶标记的抗人IgA的工作稀释度为1：5000～1:80000；

或者所述标记酶为碱性磷酸酯酶，显色液为硝基磷酸盐缓冲液，终止液为1～2mol/L氢氧化钠溶液。

10.根据权利要求8所述的试剂盒，所述校准品溶液为含人EBV-Rta-EA-IgA阳性血清的pH7.4磷酸盐缓冲液，所述阳性对照溶液为含人EBV-Rta-EA-IgA阳性血清的pH7.4磷酸盐缓冲液，所述阴性对照溶液为含人EBV-Rta-EA-IgA阴性血清的pH7.4磷酸盐缓冲液，所述样品稀释液为含有0.3M NaCl的50mM的磷酸盐缓冲液，所述浓缩洗涤液为含有0.02～0.05％(v/v)Proclin300和1.0～2.0％(v/v)吐温-20的pH值为7.2～8.5的0.01～0.03mol/L的磷酸盐缓冲液。

11.权利要求7～10任一所述的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

1)制备酶标板：

用包被缓冲液将权利要求1所述的人工抗原稀释至100ng/ml，然后加入到酶标板孔中，每孔100μl，进行反应；所述包被缓冲液为pH值9.0～9.6的0.1mol/L的碳酸盐缓冲液；

甩掉包被液后，拍干，每孔加入200μl的封闭液，反应，甩掉封闭液，拍干，保存；所述封闭液为含有1～10％(m/m)牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液；

2)配制酶标记的抗人IgA：

亲和层析纯化HRP标记的抗人IgA，纯度大于95％，效价不低于1:2000；

3)配制校准品溶液、阳性对照溶液、阴性对照溶液、底物显色液、终止液、样品稀释液及浓缩洗涤液。