CN110790825B - 用于鼻咽癌筛查的npct8多肽、试剂盒及其应用 - Google Patents

用于鼻咽癌筛查的npct8多肽、试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110790825B
CN110790825B CN202010004082.2A CN202010004082A CN110790825B CN 110790825 B CN110790825 B CN 110790825B CN 202010004082 A CN202010004082 A CN 202010004082A CN 110790825 B CN110790825 B CN 110790825B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ser
leu
pro
nasopharyngeal carcinoma
kit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010004082.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110790825A (zh
Inventor
张建珍
李全
焦守恕
吴凡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tarcine BioMed Inc
Original Assignee
Tarcine BioMed Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tarcine BioMed Inc filed Critical Tarcine BioMed Inc
Priority to CN202010004082.2A priority Critical patent/CN110790825B/zh
Publication of CN110790825A publication Critical patent/CN110790825A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110790825B publication Critical patent/CN110790825B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及鼻咽癌筛查，具体涉及一种用于鼻咽癌筛查的NPCT8多肽、试剂盒及其应用。本发明提供的用于鼻咽癌筛查的抗原表位肽NPCT8，其氨基酸序列如序列1所示。将所述抗原表位肽NPCT8与序列2所示的抗原蛋白联合用于鼻咽癌筛查，灵敏度为95%，特异性为95%，进一步提高了鼻咽癌患者的早期诊断率。

Description

用于鼻咽癌筛查的NPCT8多肽、试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及鼻咽癌筛查，具体涉及一种与鼻咽癌患者血清抗体特异性结合的NPCT8多肽、利用该多肽制备的ELISA试剂盒，以及该多肽和试剂盒在鼻咽癌早期筛查中的应用。
背景技术
鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma, NPC）是发生在鼻咽部的恶性肿瘤，原发于鼻咽粘膜上皮，具有原发部位隐蔽，不易被早期发现，病理分化差，恶性程度高，易呈浸润性生长及早期转移的特点。鼻咽癌占头颈部恶性肿瘤的78.08%。占上呼吸道癌肿的92.99%。鼻咽癌常见于青壮年男性，好发年龄在35-50岁之间，占发病人数60％。2015年9月9日，国家卫生计生委发布了其联合16部门制定的《中国癌症防治三年行动计划（2015-2017年）》，将鼻咽癌列入中国八大癌，要求大力开展鼻咽癌风险筛查及预防。
EB病毒是鼻咽癌的主要诱因。鼻咽部细胞分裂发生癌变时，EB病毒立即早期基因BRLF1突变表达Rta蛋白。这种在正常人体并不存在的蛋白，具有很强的抗原性，刺激人体淋巴免疫系统产生针对这些Rta抗原的抗体，分布于血液之中。EBV-Rta抗体主要分为IgA和IgG两类，这两类抗体对鼻咽癌侦测的效率有所不同，通常IgA类抗体对检测样本的特异性较IgG类抗体高但灵敏度偏低。
现有的Rta-IgG抗体检测试剂盒虽然具有较高的灵敏度（平均87.8%）和特异性（平均92.8%），但是仍然存在较高的漏诊率。如何在不降低特异性的基础上提高鼻咽癌筛查的灵敏度，是科研工作者一直努力的方向。
噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。将展示不同多肽的噬菌体文库与固定在平板或小珠上的靶分子孵育，先洗去未结合的噬菌体，而后洗脱特异性结合的噬菌体。扩增洗脱下的噬菌体。重复上述结合扩增过程，使与靶分子结合的多肽序列的噬菌体得到富集。噬菌体展示技术不需要天然的自身抗原信息，可用于筛选与抗体结合的抗原表位，是用于体外诊断试剂开发的新型技术。
发明内容
为了进一步提高鼻咽癌检测的灵敏度，本发明利用噬菌体展示技术，筛选Rta-IgG阴性的鼻咽癌患者血清中的优势抗原表位。化学合成筛选到的表位肽，通过ELISA检测与患者血清的反应情况，筛选能特异地与患者血清发生反应，而不与健康人血清反应的表位肽。发明人最终筛选到一种与鼻咽癌患者血清抗体特异性结合的表位肽，命名为NPCT8。
本发明提供的用于鼻咽癌筛查的抗原表位肽NPCT8，其氨基酸序列如序列1所示。
本发明还提供用于鼻咽癌筛查的抗原组合物，其包含所述抗原表位肽。
在本发明的优选实施例中，所述抗原组合物还包含氨基酸序列如序列2所示的抗原蛋白。
本发明还提供用于鼻咽癌筛查的试剂盒，其包含所述抗原表位肽或所述抗原组合物。
在本发明的优选实施例中，所述试剂盒还包含酶标板；所述酶标板上包被有所述抗原表位肽和所述抗原蛋白。
在本发明的优选实施例中，所述抗原表位肽与所述抗原蛋白的包被比例为1:20-20:1质量比。
在本发明的优选实施例中，所述抗原表位肽与所述抗原蛋白的包被比例为1:10-1:1质量比。
在本发明的优选实施例中，所述抗原表位肽与所述抗原蛋白的包被总量为0.2μg/孔。
在本发明的优选实施例中，所述试剂盒还包含封闭液、洗涤液、标记的二抗、显色底物和终止液。
所述抗原表位肽、所述抗原组合物以及任一所述的试剂盒在鼻咽癌筛查中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明筛选的NPCT8多肽，由12个氨基酸组成，序列为LeuSer His Pro Ser ProArgArg His Leu Asp Glu。优选将NPCT8多肽与Rta蛋白或Rta蛋白片段（例如，Rta蛋白的171～356位氨基酸）按一定比例混合，然后包被酶标板，用于鼻咽癌检测。检测时，向酶标板中加入血清或血浆样品，酶标板上包被的多肽和蛋白与血清或血浆样品中的抗体结合，再加入HRP标记的羊抗人IgG与之结合，然后加入TMB底物显色，再用终止液（10% H2SO4）终止反应。通过酶标仪检测450nm吸光度（A值），结果高于阴性对照的3倍判定为阳性。利用本发明的试剂盒检测鼻咽癌，灵敏度可以达到95%，特异性达到95%，性能优于现有的鼻咽癌检测试剂盒，进一步提高了鼻咽癌患者的早期诊断率，为鼻咽癌患者争取最佳的治疗时机。
附图说明
图1. 利用噬菌体展示肽库筛选的与鼻咽癌血清抗体结合的表位肽的ELISA检测结果。
图2. 本发明NPCT8肽段的特异性检测结果；其中，NPC代表鼻咽癌患者血清，normal代表健康人血清。
图3. Rta蛋白541-552肽段与本发明NPCT8肽段的灵敏度检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明，需要理解的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。
实验试剂
NPCheck™ EB病毒Rta-IgG检测试剂盒：同昕生物技术（北京）有限公司，产品编号A-0496。
Protein A亲和介质层析柱购自美国赛默飞公司（Thermo Scientific），货号20356。
Ph.D.-12 噬菌体展示肽库试剂盒购自New England Biolabs（NEB）公司，货号#E8110S。
酶标板购自深圳市金灿华实业有限公司，货号106-002。
牛血清白蛋白（BSA）购自sigma公司。
HRP-羊抗人IgG购自北京索莱宝科技有限公司，货号SE101，浓度4mg/ml。
TMB底物购自北京索莱宝科技有限公司，货号PR1200。
辛酸和硫酸铵购自国药集团化学试剂有限公司。
0.06M醋酸盐缓冲液（pH4.8）：取醋酸钠5.4g，加水50ml使之溶解，用冰醋酸调节pH值至4.8，再加水稀释至100ml。
0.1M Gly-HCl（pH2.7）：称取2.2521g Gly，溶解后，加入HCl调节pH值到2.7，再加水稀释至300ml。
0.5M Tris-Cl（pH8.0）：121gTris碱，加800ml纯水，溶解后，用浓盐酸调节pH值到8.0，然后再定容到2L。
PBS缓冲液（0.01M，pH7.2）：称取7.9g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH2PO4和1.8gK2HPO4，溶于800 ml 蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH 值至7.2，最后加蒸馏水定容至1 L。保存于4℃冰箱中即可。
CB缓冲液（0.05M，pH 10.0）：取3.34克无水碳酸氢钠和1克无水碳酸钠，加蒸馏水充分搅拌，定容至1000ml即可。
终止液：10% H2SO4。
洗涤液：含体积百分比0.05%Tween20的0.01M pH 7.2 PBS缓冲液。
以下实验所使用的正常人血清样本和鼻咽癌患者血清样本由广西梧州市肿瘤防治研究所提供。
本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂，可按照本领域常规方法配制而得或商购获得；未特别说明的实验方法，均为本领域常规方法，可参考相关实验手册或制造厂商说明书。
实施例1：利用噬菌体展示肽库筛选与鼻咽癌血清抗体结合的表位肽
1、鼻咽癌患者血清IgG抗体制备
使用EB病毒Rta-IgG检测试剂盒（同昕生物技术（北京）有限公司，产品编号A-0496）检测70例鼻咽癌患者血清样本，检测步骤按试剂盒说明书操作。得到Rta-IgG阳性血清样本62例，Rta-IgG阴性血清样本8例。
将8例Rta-IgG阴性血清样本混合后，用2倍体积的醋酸盐缓冲液（0.06M，pH4.8）稀释后，按33μl/ml血清加入辛酸，搅拌后离心收集上清液。按0.277g/mL上清液加入硫酸铵，放置于4℃过夜，离心，倒掉上清。加入PBS缓冲液（0.01M，pH7.2）溶解沉淀，使用透析袋（北京索莱宝科技有限公司，产品货号MD25，分子量8000-14000），透析4次。备用。
透析后的蛋白加入平衡好的Protein A亲和介质层析柱（Thermo Scientific，货号20356）中，然后用PBS缓冲液（0.01M，pH7.2）洗脱杂蛋白。在柱床上加入抗体洗脱液（0.1MGly-HCl，pH2.7），迅速顺次分管承接洗脱的液体，并用中和液（0.5M Tris-Cl，pH8.0）中和。收集到的纯化抗体溶液使用透析袋（北京索莱宝科技有限公司，产品货号MD25，分子量8000-14000）透析，然后保存于-20℃。
2、表位肽筛选
Ph.D.-12 噬菌体展示肽库试剂盒（NEB公司产品，货号#E8110S），含有2.7×109个转化子。滴度为1.5×1013/μl，宿主菌为E.coil ER2537。筛选过程参见试剂盒使用说明书。使用步骤1中纯化后的抗体包被微孔板，每孔的包被量为10μg。每孔加入1×1011噬菌体。经过三轮筛选，挑取阳性克隆。共挑选21个克隆。将这21个克隆放入由步骤1纯化的抗体包被的孔中进行ELISA检测，将OD450nm值大于对照的克隆判定为阳性克隆，检测结果如图1所示。从图中可以看出有19个为阳性克隆。委托生工生物工程上海（股份）有限公司对这19个阳性克隆进行测序，得到19条序列。排除掉重复性高的序列后共得到8条肽段，分别命名为NPCT1-NPCT8，其氨基酸序列如下：
NPCT1：LeuSer His LeuSer Pro Arg Pro GlyLeuArgTrp（序列3）；
NPCT2：LeuSer His AlnSer Pro Arg Lys His LeuAsnGln（序列4）；
NPCT3：Gly Val Ser Met Thr Val ValArgThr Pro GluPhe（序列5）；
NPCT4：GluArg His Lys SerLeuPheArgPhe Val Asp Thr（序列6）；
NPCT5：LeuSer His AlaSer Pro Leu Val His Met Ile Arg（序列7）；
NPCT6：Thr Asp SerAlaThr Val ValGlyThrAsn Pro Leu（序列8）；
NPCT7：LeuGly His Pro Ser Pro GluThr Asp Leu Asp Ser（序列9）；
NPCT8：LeuSer His Pro Ser Pro ArgArg His Leu ASP Glu（序列1）。
3、NPCT1-8结合肽段的特异性检验
委托生工生物工程上海（股份）有限公司将NPCT1-NPCT8这8条肽段全部合成。合成后的肽段分别用CB缓冲液溶解，包被在96孔酶标板中，包被总量为0.2μg/孔，37℃孵育4小时。倒掉包被液，加入5%的牛血清白蛋白缓冲液（封闭液），37℃孵育2小时。倒掉封闭液，晾干备用。分别将鼻咽癌患者血清（30例）和健康人血清（30例）用PBS缓冲液（0.01M，pH7.2）按照1:10的体积比稀释后加入酶标板中，37℃孵育2小时，使用洗涤液（0.05% Tween20，0.01MpH 7.2 PBS缓冲液）洗板5次。加入1:1000稀释的HRP-羊抗人IgG（北京索莱宝，货号SE101，浓度4mg/ml），37℃孵育1小时，使用洗涤液（0.05% Tween20，0.01M pH 7.2 PBS缓冲液）洗板5次。加入TMB底物（北京索莱宝，货号PR1200）100μl，室温放置10分钟，加入终止液（10%H2SO4）后测定450nm处吸光度值。将大于阴性血清OD450nm平均值的三倍作为阳性判定值。8条肽段的检测结果见表1。
表1. NPCT1- NPCT8肽段筛选结果
Figure 549420DEST_PATH_IMAGE002
注：表中“鼻咽癌”代表鼻咽癌患者血清，“健康”代表健康人血清。
其中，NPCT8鼻咽癌患者的血清的OD450nm值的平均值为0.662，非鼻咽癌患者血清OD450nm值的平均值为0.127。T检验发现两者间有显著性差异（P<0.01）。说明该肽段特异性较好，能够较好区分鼻咽癌患者和正常人群。使用GraphPad Prim 8.0.1软件作图，NPCT8的具体结果见图2。
将NPCT8肽段在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）网站上通过BLAST系统进行比对，发现该肽段与EB病毒BRLF1基因（GenBank号gi：94734074）编码的Rta蛋白（GenBank号gi：94734074）的氨基酸序列的541-552肽段的相似度达到83.3%。该541-552肽段的氨基酸序列为LeuSer His Pro ProProArgGly His Leu Asp Glu（序列10）。委托生工生物工程上海（股份）有限公司对Rta蛋白的该541-552肽段人工合成，然后包被在酶标板中，包被总量为0.2μg/孔，37℃孵育4小时。倒掉包被液，加入5%的牛血清白蛋白缓冲液（封闭液），37℃孵育2小时。倒掉封闭液，晾干备用。将鼻咽癌患者血清样本和正常人血清样本分别用PBS缓冲液（0.01M，pH7.2）按照1:10的体积比稀释后加入酶标板中，37℃孵育2小时，使用洗涤液（0.05% Tween20，0.01M pH 7.2 PBS缓冲液）洗板5次。加入1:1000稀释的HRP-羊抗人IgG（北京索莱宝，产品货号SE101，浓度4mg/ml），37℃孵育1小时，使用洗涤液（0.05% Tween20，0.01M pH 7.2 PBS缓冲液）洗板5次。加入TMB底物（北京索莱宝，货号PR1200）100μl，室温放置10分钟，加入终止液（10% H2SO4）后测定450nm处吸光度值。同时用NPCT8肽段包被的酶标板检测同一批鼻咽癌患者血清样本和正常人血清样本（各19例）。使用GraphPad Prim8.0.1软件作图，该541-552肽段与NPCT8片段检测鼻咽癌患者血清样本的检测结果见图3。
541-552肽段检测鼻咽癌患者血清的OD450nm平均值为0.261，检测正常人血清的OD450nm平均值为0.179，将大于阴性血清OD450nm平均值的三倍作为阳性判定值，结果表明541-552肽段对鼻咽癌样本的检出率为5%。NPCT8检测鼻咽癌患者血清的OD450nm平均值为0.739，检测正常人血清的OD450nm平均值为0.152，将大于阴性血清OD450nm平均值的三倍作为阳性判定值，结果表明NPCT8对鼻咽癌样本的检出率为38%。由此可见，Rta蛋白541-552肽段检测鼻咽癌的灵敏度低于本发明筛选出的NPCT8肽段的灵敏度。
实施例2：鼻咽癌检测试剂盒制备
1、R185蛋白的制备
Rta蛋白（GenBank号gi：94734074）全长605aa，其氨基酸序列如序列11所示。选择其中171～356位氨基酸的片段进行制备，命名为R185蛋白，其氨基酸序列如序列2所示。R185蛋白的制备方法参见中国专利号为ZL200610113403.2，发明名称为“用于鼻咽癌筛查、诊断和治疗效果预测的ELISA试剂盒”的专利授权文本的说明书记载的实施例1和2（说明书第8页［0098］段至第15页［0202］段），其中的主要步骤包括BRLF1基因（GenBank号gi：94734074）的获得、重组质粒pGST-R185的获得、GST-R185蛋白的制备与纯化，纯化得到的GST-R185蛋白即为R185蛋白。在此通过引用将该专利的全文并入本文中。
2、试剂盒组装
将本实施例步骤1制备的R185蛋白、实施例1制备的NPCT8肽段、酶标板、封闭液（5%牛血清白蛋白缓冲液）、HRP标记的羊抗人IgG（北京索莱宝）、TMB底物（北京索莱宝）、终止液（10% H2SO4）分别包装后，全部装入试剂盒中，并贴上试剂盒标签。
试剂盒操作步骤如下：
（1）将NPCT8肽段和R185蛋白分别用CB缓冲液溶解，然后分别按照NPCT8：R185＝1:40、1:20、1:10、1:5、1:1、5:1、10:1、20:1、40:1的质量比混合，得到9种包被液；将9种包被液分别加入96孔酶标板的不同孔中，包被总量为0.2μg/孔，4℃过夜。
（2）倒掉包被液，加入封闭液（5%的牛血清白蛋白缓冲液），37℃孵育2小时。倒掉封闭液，晾干备用。
（3）将10μl血清样本，90μl稀释液（0.01M pH 7.2 PBS缓冲液），加入包被好的酶标板孔中，37℃孵育1h。
（4）用洗涤液（0.05% Tween20，0.01M pH 7.2 PBS缓冲液）洗板5次。
（5）二抗为1:1000稀释的HRP-羊抗人IgG，每孔加入100μl，37℃孵育1h。
（6）用洗涤液（0.05% Tween20，0.01M PH 7.2 PBS缓冲液）洗板5次。
（7）加入TMB底物（北京索莱宝）100μl，室温放置10分钟。
（8）加入终止液（10% H2SO4）100μl。使用酶标仪测450nm处吸收值。将大于阴性血清OD450nm平均值的三倍作为阳性判定值。
应用上述试剂盒的制备方法，在包被总量0.2μg/孔不变的情况下，改变包被比例（NPCT8和R185蛋白的质量比），制备不同包被比例的试剂盒，检测鼻咽癌筛查的性能，鼻咽癌血清50例，正常人血清100例。表2为不同比例混合包被的检测结果。从该表中可以看出NPCT8和R185蛋白的包被比例在1:20-20:1质量比范围内的试剂盒性能较好，其中NPCT8：R185蛋白＝1:10-1:1（质量比）的性能最优。
表2
Figure 528877DEST_PATH_IMAGE004
实施例3：鼻咽癌检测试剂盒的灵敏度和特异性检测
收集鼻咽癌患者血清56例，正常人血清100例。分别用实施例2的鼻咽癌检测试剂盒（其酶标板上NPCT8和R185蛋白的包被比例为1:1质量比）和对照试剂盒（EB病毒Rta-IgG检测试剂盒，同昕生物，产品编号A-0496）进行检测。检测步骤分别参照各试剂盒说明书中的操作步骤。
检测结果如下表3所示。本发明的试剂盒特异性为95%，敏感度为95%。对照试剂盒的特异性为93%，灵敏度为89%。
表3
Figure 105352DEST_PATH_IMAGE006
序列表
<110> 同昕生物技术（北京）有限公司
<120> 用于鼻咽癌筛查的NPCT8多肽、试剂盒及其应用
<141> 2019-12-25
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Leu Ser His Pro Ser Pro Arg Arg His Leu Asp Glu
1 5 10
<210> 2
<211> 185
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Val Val Glu His Leu Asn Arg Met Glu Lys Glu Gly Leu Leu Ser Ser
1 5 10 15
Lys Phe Lys Ala Phe Cys Lys Trp Val Phe Thr Tyr Pro Val Leu Glu
20 25 30
Glu Met Phe Gln Thr Met Val Ser Ser Lys Thr Gly His Leu Thr Asp
35 40 45
Asp Val Lys Asp Val Arg Ala Leu Ile Lys Thr Leu Pro Arg Ala Ser
50 55 60
Tyr Ser Ser His Ala Gly Gln Arg Ser Tyr Val Ser Gly Val Leu Pro
65 70 75 80
Ala Cys Leu Leu Ser Thr Lys Ser Lys Ala Val Glu Thr Pro Ile Leu
85 90 95
Val Ser Gly Ala Asp Arg Met Asp Glu Glu Leu Met Gly Asn Asp Gly
100 105 110
Gly Ala Ser His Thr Glu Ala Arg Tyr Ser Glu Ser Gly Gln Phe His
115 120 125
Ala Phe Thr Asp Glu Leu Glu Ser Leu Pro Ser Pro Thr Met Pro Leu
130 135 140
Lys Pro Gly Ala Gln Ser Ala Asp Cys Gly Asp Ser Ser Ser Ser Ser
145 150 155 160
Ser Asp Ser Gly Asn Ser Asp Thr Glu Gln Ser Glu Arg Glu Glu Ala
165 170 175
Arg Ala Glu Ala Pro Arg Leu Arg Ala
180 185
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Leu Ser His Leu Ser Pro Arg Pro Gly Leu Arg Trp
1 5 10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Leu Ser His Ala Ser Pro Arg Lys His Leu Asn Gln
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Val Ser Met Thr Val Val Arg Thr Pro Glu Phe
1 5 10
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Glu Arg His Lys Ser Leu Phe Arg Phe Val Asp Thr
1 5 10
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Leu Ser His Ala Ser Pro Leu Val His Met Ile Arg
1 5 10
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Thr Asp Ser Ala Thr Val Val Gly Thr Asn Pro Leu
1 5 10
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Leu Gly His Pro Ser Pro Glu Thr Asp Leu Asp Ser
1 5 10
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Leu Ser His Pro Pro Pro Arg Gly His Leu Asp Glu
1 5 10
<210> 11
<211> 605
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Arg Pro Lys Lys Asp Gly Leu Glu Asp Phe Leu Arg Leu Thr Pro
1 5 10 15
Glu Ile Lys Lys Gln Leu Gly Ser Leu Val Ser Asp Tyr Cys Asn Val
20 25 30
Leu Asn Lys Glu Phe Thr Ala Gly Ser Val Glu Ile Thr Leu Arg Ser
35 40 45
Tyr Lys Ile Cys Lys Ala Phe Ile Asn Glu Ala Lys Ala His Gly Arg
50 55 60
Glu Trp Gly Gly Leu Met Ala Thr Leu Asn Ile Cys Asn Phe Trp Ala
65 70 75 80
Ile Leu Arg Asn Asn Arg Val Arg Arg Arg Ala Glu Asn Ala Gly Asn
85 90 95
Asp Ala Cys Ser Ile Ala Cys Pro Ile Val Met Arg Tyr Val Leu Asp
100 105 110
His Leu Ile Val Val Thr Asp Arg Phe Phe Ile Gln Ala Pro Ser Asn
115 120 125
Arg Val Met Ile Pro Ala Thr Ile Gly Thr Ala Met Tyr Lys Leu Leu
130 135 140
Lys His Ser Arg Val Arg Ala Tyr Thr Tyr Ser Lys Val Leu Gly Val
145 150 155 160
Asp Arg Ala Ala Ile Met Ala Ser Gly Lys Gln Val Val Glu His Leu
165 170 175
Asn Arg Met Glu Lys Glu Gly Leu Leu Ser Ser Lys Phe Lys Ala Phe
180 185 190
Cys Lys Trp Val Phe Thr Tyr Pro Val Leu Glu Glu Met Phe Gln Thr
195 200 205
Met Val Ser Ser Lys Thr Gly His Leu Thr Asp Asp Val Lys Asp Val
210 215 220
Arg Ala Leu Ile Lys Thr Leu Pro Arg Ala Ser Tyr Ser Ser His Ala
225 230 235 240
Gly Gln Arg Ser Tyr Val Ser Gly Val Leu Pro Ala Cys Leu Leu Ser
245 250 255
Thr Lys Ser Lys Ala Val Glu Thr Pro Ile Leu Val Ser Gly Ala Asp
260 265 270
Arg Met Asp Glu Glu Leu Met Gly Asn Asp Gly Gly Ala Ser His Thr
275 280 285
Glu Ala Arg Tyr Ser Glu Ser Gly Gln Phe His Ala Phe Thr Asp Glu
290 295 300
Leu Glu Ser Leu Pro Ser Pro Thr Met Pro Leu Lys Pro Gly Ala Gln
305 310 315 320
Ser Ala Asp Cys Gly Asp Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Gly Asn
325 330 335
Ser Asp Thr Glu Gln Ser Glu Arg Glu Glu Ala Arg Ala Glu Ala Pro
340 345 350
Arg Leu Arg Ala Pro Lys Ser Arg Arg Thr Ser Arg Pro Asn Arg Gly
355 360 365
Gln Thr Pro Cys Pro Ser Asn Ala Ala Glu Pro Glu Gln Pro Trp Ile
370 375 380
Ala Ala Val His Gln Glu Ser Asp Glu Arg Pro Ile Phe Pro His Pro
385 390 395 400
Ser Lys Pro Thr Phe Leu Pro Pro Val Lys Arg Lys Lys Gly Leu Arg
405 410 415
Asp Ser Arg Glu Gly Met Phe Leu Pro Lys Pro Glu Ala Gly Ser Ala
420 425 430
Ile Ser Asp Val Phe Glu Gly Arg Glu Val Cys Gln Pro Lys Arg Ile
435 440 445
Arg Pro Phe His Pro Pro Gly Ser Pro Trp Ala Asn Arg Pro Leu Pro
450 455 460
Ala Ser Leu Ala Pro Thr Pro Thr Gly Pro Val His Glu Pro Val Gly
465 470 475 480
Ser Leu Thr Pro Ala Pro Val Pro Gln Pro Leu Asp Pro Ala Pro Ala
485 490 495
Val Thr Pro Glu Ala Ser His Leu Leu Glu Asp Pro Asp Glu Glu Thr
500 505 510
Ser Gln Ala Val Lys Ala Leu Arg Glu Met Ala Asp Thr Val Ile Pro
515 520 525
Gln Lys Glu Glu Ala Ala Ile Cys Gly Gln Met Asp Leu Ser His Pro
530 535 540
Pro Pro Arg Gly His Leu Asp Glu Leu Thr Thr Thr Leu Glu Ser Met
545 550 555 560
Thr Glu Asp Leu Asn Leu Asp Ser Pro Leu Thr Pro Glu Leu Asn Glu
565 570 575
Ile Leu Asp Thr Phe Leu Asn Asp Glu Cys Leu Leu His Ala Met His
580 585 590
Ile Ser Thr Gly Leu Ser Ile Phe Asp Thr Ser Leu Phe
595 600 605

Claims (9)

1.用于鼻咽癌筛查的抗原表位肽，其氨基酸序列如序列1所示。
2.用于鼻咽癌筛查的抗原组合物，其包含权利要求1所述的抗原表位肽。
3.根据权利要求2所述的抗原组合物，其特征在于，还包含氨基酸序列如序列2所示的抗原蛋白。
4.用于鼻咽癌筛查的试剂盒，其包含权利要求1所述的抗原表位肽或权利要求3所述的抗原组合物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，还包含酶标板；所述酶标板上包被有所述抗原表位肽或所述抗原组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标板上包被有所述抗原组合物；所述抗原组合物中，所述抗原表位肽与所述抗原蛋白的质量比为1:20-20:1。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原组合物中，所述抗原表位肽与所述抗原蛋白的质量比为1:10-1:1。
8.根据权利要求5-7任一所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原组合物的包被总量为0.2μg/孔。
9.根据权利要求5-7任一所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含封闭液、洗涤液、标记的二抗、显色液和终止液。
CN202010004082.2A 2020-01-03 2020-01-03 用于鼻咽癌筛查的npct8多肽、试剂盒及其应用 Active CN110790825B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010004082.2A CN110790825B (zh) 2020-01-03 2020-01-03 用于鼻咽癌筛查的npct8多肽、试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010004082.2A CN110790825B (zh) 2020-01-03 2020-01-03 用于鼻咽癌筛查的npct8多肽、试剂盒及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110790825A CN110790825A (zh) 2020-02-14
CN110790825B true CN110790825B (zh) 2020-04-07

Family

ID=69448676

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010004082.2A Active CN110790825B (zh) 2020-01-03 2020-01-03 用于鼻咽癌筛查的npct8多肽、试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110790825B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104086657A (zh) * 2014-07-07 2014-10-08 同昕生物技术（北京）有限公司 用于联合检测EB病毒Rta蛋白抗体与EB病毒早期抗原EA抗体的人工抗原及试剂盒
CA2919473A1 (en) * 2013-07-24 2015-01-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Anti-galectin-1 monoclonal antibodies and fragments thereof
CN105044355A (zh) * 2015-07-08 2015-11-11 同昕生物技术（北京）有限公司 用于检测EB病毒Rta/IgG抗体的化学发光试剂盒及其应用
WO2018204764A1 (en) * 2017-05-05 2018-11-08 Camp4 Therapeutics Corporation Identification and targeted modulation of gene signaling networks

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102703502A (zh) * 2012-02-27 2012-10-03 同昕生物技术（北京）有限公司 Rta蛋白的制备方法及其在鼻咽癌检测试剂中的应用
CN108490177B (zh) * 2018-02-08 2020-12-29 深圳市新产业生物医学工程股份有限公司 鼻咽癌抗体检测试剂、其制备方法及鼻咽癌检测试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2919473A1 (en) * 2013-07-24 2015-01-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Anti-galectin-1 monoclonal antibodies and fragments thereof
CN104086657A (zh) * 2014-07-07 2014-10-08 同昕生物技术（北京）有限公司 用于联合检测EB病毒Rta蛋白抗体与EB病毒早期抗原EA抗体的人工抗原及试剂盒
CN105044355A (zh) * 2015-07-08 2015-11-11 同昕生物技术（北京）有限公司 用于检测EB病毒Rta/IgG抗体的化学发光试剂盒及其应用
WO2018204764A1 (en) * 2017-05-05 2018-11-08 Camp4 Therapeutics Corporation Identification and targeted modulation of gene signaling networks

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EB病毒Rta蛋白抗体IgG在鼻咽癌诊断中的应用;朱文良等;《中国癌症防治杂志》;20090930;第1卷(第3期);211-213 *
Target Capture and Whole Genome sequencing of EBV from Primary nasopharygeal Carcinoma Biopsy;Xiao，K.;《Genbank：BAQ20168.1》;20150114;全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110790825A (zh) 2020-02-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111196857B (zh) 一种新型冠状病毒多表位重组抗原及其制备方法
CN108084255B (zh) 一种重组犬c反应蛋白及其单克隆抗体的制备
CN104991077A (zh) 肌钙蛋白i竞争比浊法检测试剂盒
CN116751285A (zh) 一种特异性识别重组猴痘病毒a35r蛋白的纳米抗体
CN110790825B (zh) 用于鼻咽癌筛查的npct8多肽、试剂盒及其应用
US20170138958A1 (en) Method for measuring anti-wt1 antibody
EP3988564A1 (en) Leptin immunogen, hybridoma cell, monoclonal antibody, polyclonal antibody and use thereof
JP5712513B2 (ja) ヒトサイトメガロウイルス感染の検出方法
JP2009525725A (ja) 血小板抗原特異抗体の結合を中和するペプチドアプタマー並びにそれを含む診断及び治療への応用
CN113683684B (zh) 抗乙肝病毒表面抗原抗体、抗体对、含有其的检测试剂及试剂盒
CN113621079B (zh) Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白及其制备方法
US20100221742A1 (en) Novel cancer associated antibodies and their use in cancer diagnosis
CN110468108B (zh) 分泌人铁蛋白轻链单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
US20220220163A1 (en) Recombinant deamidated gliadin polypeptide antigen, recombinant antigen-expressing gene, recombinant expression vector, and preparation method and application thereof
CN107163131B (zh) 肿瘤抑制因子p16的抗原多肽和其应用
JP4592641B2 (ja) Ｗｔ１関連疾患の検査方法
CN111269310B (zh) C-p串联表达重组蛋白及其基因、制备方法、应用、c肽检测试剂盒
CN116444677A (zh) 一种FoxM1蛋白Y575磷酸化的多克隆抗体及其制备方法和应用
WO2001029079A1 (en) IMMUNO-INTERACTIVE FRAGMENTS OF THE αC SUBUNIT OF INHIBIN
CN116023464A (zh) 一种nrf1d蛋白的抗原肽及其抗体和试剂盒
CN115112893A (zh) 抗前列腺特异性蛋白抗体检测试剂盒及其应用
CN114839364A (zh) 抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体检测试剂盒及其应用
CN112410374A (zh) 利用hek293细胞制备新型冠状病毒核衣壳蛋白的方法
CN118005797A (zh) 一种抗人碱性磷酸酶单克隆抗体及其在免疫类诊断试剂阻断剂制备中的应用
CN116731171A (zh) rT3重组单克隆抗体制备方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant