CN118005797A - 一种抗人碱性磷酸酶单克隆抗体及其在免疫类诊断试剂阻断剂制备中的应用 - Google Patents
一种抗人碱性磷酸酶单克隆抗体及其在免疫类诊断试剂阻断剂制备中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118005797A CN118005797A CN202410308995.1A CN202410308995A CN118005797A CN 118005797 A CN118005797 A CN 118005797A CN 202410308995 A CN202410308995 A CN 202410308995A CN 118005797 A CN118005797 A CN 118005797A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- monoclonal antibody
- amino acid
- acid sequence
- cdr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 title claims abstract description 58
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 title claims abstract description 58
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 35
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 title abstract description 9
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 52
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 17
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 17
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 15
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 10
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 5
- 101000688206 Bos taurus Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 abstract description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 101100537532 Rattus norvegicus Tnni3 gene Proteins 0.000 description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 3
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 17-β-hydroxy-5-α-Androstan-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 2
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 2
- 102100033620 Calponin-1 Human genes 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000945318 Homo sapiens Calponin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000652736 Homo sapiens Transgelin Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- XYIPYISRNJUPBA-UHFFFAOYSA-N [3-(3'-methoxyspiro[adamantane-2,4'-dioxetane]-3'-yl)phenyl] dihydrogen phosphate Chemical compound O1OC2(C3CC4CC(C3)CC2C4)C1(OC)C1=CC=CC(OP(O)(O)=O)=C1 XYIPYISRNJUPBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N phenyl 10-methylacridin-10-ium-9-carboxylate Chemical compound C12=CC=CC=C2[N+](C)=C2C=CC=CC2=C1C(=O)OC1=CC=CC=C1 RXNXLAHQOVLMIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002088 tosyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1C([H])([H])[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于抗体技术领域，涉及一种抗人碱性磷酸酶单克隆抗体及其在免疫类诊断试剂阻断剂制备中的应用。本发明提供了一种与人血液中内源性碱性磷酸酶特异性结合的单克隆抗体，所述单克隆抗体Fab段抗原结合部位的轻链可变区包括CDR‑L1、CDR‑L2和CDR‑L3，所述单克隆抗体Fab段抗原结合部位的重链可变区包括CDR‑H1、CDR‑H2和CDR‑H3。本发明提供的抗人碱性磷酸酶单克隆抗体能够与人血液中内源性碱性磷酸酶特异性结合，而同牛小肠来源碱性磷酸酶无结合，可作为免疫类诊断试剂的特异性阻断剂。
Description
技术领域
本发明属于抗体技术领域，具体涉及一种抗人碱性磷酸酶单克隆抗体及其在免疫类诊断试剂阻断剂制备中的应用。
背景技术
基于碱性磷酸酶为标记物的免疫类诊断试剂在临床应用中具有广泛的价值，但多种非特异性干扰因素会影响其准确性。其中，人血液中的碱性磷酸酶是一个重要的干扰因素，因为该干扰物同样具备底物催化能力，从而造成假性升高的信号。为了解决这一问题，开发一种能够特异性阻断内源性碱性磷酸酶活性而不影响标记物碱性磷酸酶活性的阻断剂是当前研究的重点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗人碱性磷酸酶单克隆抗体及其在免疫类诊断试剂阻断剂制备中的应用。本发明提供的抗人碱性磷酸酶单克隆抗体能够与人血液中内源性碱性磷酸酶特异性结合，而同牛小肠来源碱性磷酸酶无结合，可作为免疫类诊断试剂的特异性阻断剂。
本发明提供了一种与人血液中内源性碱性磷酸酶特异性结合的单克隆抗体，所述单克隆抗体Fab段抗原结合部位的轻链可变区包括CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述单克隆抗体Fab段抗原结合部位的重链可变区包括CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；所述CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选的是，所述单克隆抗体还包括轻链可变区框架区FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4，以及重链可变区框架区FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4；所述FR-L1的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示，所述FR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述FR-L3的氨基酸序列如SEQ IDNO.9所示，所述FR-L4的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述FR-H1的氨基酸序列如SEQID NO.11所示，所述FR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述FR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述FR-H4的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
优选的是，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
优选的是，所述单克隆抗体还包括抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区的全部或者部分。
本发明还提供了一种核酸分子，所述核酸分子为编码上述技术方案所述单克隆抗体的核酸分子。
本发明还提供了一种载体，所述载体包括上述技术方案所述的核酸分子。
本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括上述技术方案所述的核酸分子或上述技术方案所述的载体。
本发明还提供了一种试剂盒，包含上述技术方案所述的单克隆抗体、或基于上述技术方案所述的核酸分子、上述技术方案所述的载体或上述技术方案所述的宿主细胞制备得到的单克隆抗体，以及检测中可接受的助剂。
本发明还提供了上述技术方案所述单克隆抗体或基于上述技术方案所述的核酸分子、上述技术方案所述的载体或上述技术方案所述的宿主细胞制备得到的单克隆抗体在制备免疫类诊断试剂的特异性阻断剂中的应用；所述免疫类诊断试剂包括基于碱性磷酸酶标记物类免疫类诊断试剂。
本发明还提供了一种免疫原在制备与人血液中内源性碱性磷酸酶特异性结合的单克隆抗体中的应用，所述免疫原的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
本发明提供了一种抗人碱性磷酸酶单克隆抗体及其在免疫类诊断试剂阻断剂制备中的应用。本发明提供的抗人碱性磷酸酶单克隆抗体能够与人血液中内源性碱性磷酸酶特异性结合，而同牛小肠来源碱性磷酸酶无结合，可作为免疫类诊断试剂的特异性阻断剂。具体的，本发明所述单克隆抗体具有以下有益效果：
1）特异性高：本发明的抗人碱性磷酸酶抗体特异性识别人内源性碱性磷酸酶，而同小牛肠来源的碱性磷酸酶没有结合，在达到阻断效果的同时，不影响试剂酶标记物的活性。
2）应用广泛：本发明的抗人碱性磷酸酶抗体可广泛应用于各种基于碱性磷酸酶偶联的免疫类诊断试剂中，为临床诊断提供更加准确的结果。
3）制备简便：本发明的制备方法简单易行，可实现大规模生产，为实际应用提供充足的阻断剂来源。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明提供的检测原理图。
具体实施方式
本发明提供了一种与人血液中内源性碱性磷酸酶特异性结合的单克隆抗体（抗人碱性磷酸酶抗体），所述单克隆抗体Fab段抗原结合部位的轻链可变区包括CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述单克隆抗体Fab段抗原结合部位的重链可变区包括CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；所述CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：RSSQSLVKSSGTYLQ，所述CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：KRSNGRFS，所述CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：SQITHVPFT，所述CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：TSGMGVG，所述CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示：QIWWGNDKYYNTALKS，所述CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示：VGGITTGNFDV。在本发明中，所述单克隆抗体还包括轻链可变区框架区FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4，以及重链可变区框架区FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4；所述FR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示：DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISC，所述FR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示：WYFQRPGQSPKLLIY，所述FR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示：GVPDRISGSGSGTDFTLKIRRVEAEDLGVYFC，所述FR-L4的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示：FGSGTKLEIKRA，所述FR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示：QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLS，所述FR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示：WIRQPSGKGLEWLA，所述FR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示：RLTISKDTSKNQVFLKIASVDTADSATYYCAR，所述FR-H4的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示：WGTGTTVTVSS。在本发明中，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示：DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVKSSGTYLQWYFQRPGQSPKLLIYKRSNGRFSGVPDRISGSGSGTDFTLKIRRVEAEDLGVYFCSQITHVPFTFGSGTKLEIKRA，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示：QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLAQIWWGNDKYYNTALKSRLTISKDTSKNQVFLKIASVDTADSATYYCARVGGITTGNFDVWGTGTTVTVSS。本发明所述单克隆抗体能够特异性结合人血液中内源性碱性磷酸酶，而同牛小肠来源碱性磷酸酶无结合，可用于免疫类诊断试剂的特异性阻断剂。
在本发明中，所述单克隆抗体还包括抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区的全部或者部分。本发明抗体可以是完整抗体，或者抗体片段形式，有效减少内源性碱性磷酸酶带来的干扰，提高免疫类诊断试剂的特异性。
本发明还提供了一种核酸分子，所述核酸分子为编码上述技术方案所述单克隆抗体的核酸分子。在本发明中，编码重链可变区的核酸分子的核苷酸序列优选如SEQ IDNO.21所示：CAAGTCACACTGAAAGAGTCTGGACCGGGAATCCTGCAGCCTAGCCAGACCCTGTCTCTCACCTGTAGCTTTTCCGGCTTCAGCCTGAGCACCAGCGGCATGGGCGTGGGCTGGATCCGGCAGCCCAGCGGCAAGGGCCTCGAGTGGCTGGCCCAGATCTGGTGGGGTAACGACAAGTACTATAACACCGCCCTGAAGTCTCGCCTTACCATCAGCAAGGACACCAGCAAGAATCAGGTGTTCCTGAAGATCGCCAGCGTGGACACAGCTGATAGCGCGACCTACTACTGCGCCAGAGTGGGAGGGATTACCACCGGCAACTTCGACGTGTGGGGCACGGGCACTACAGTCACCGTGTCCTCC。在本发明中，编码轻链可变区的核酸分子的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.22所示：GACGTGGTGATGACGCAGACCCCTCTGAGCCTGCCTGTGTCCCTCGGCGACCAGGCCAGCATCAGCTGTCGCTCCTCTCAGTCCCTGGTCAAGAGCTCCGGCACCTACCTGCAGTGGTATTTTCAACGTCCAGGCCAGAGCCCCAAGCTGTTGATCTACAAGAGAAGTAACGGCAGATTCAGCGGGGTCCCGGATCGCATTTCCGGATCTGGCTCTGGCACCGACTTCACACTGAAGATCCGGAGAGTGGAAGCCGAGGACCTGGGCGTGTACTTCTGCAGTCAGATCACCCACGTGCCCTTTACCTTCGGCAGCGGTACTAAACTAGAGATCAAGCGGGCT。
本发明单克隆抗体的制备方法优选包括以下步骤：将上述轻链和重链基因分别克隆到pcDNA3.4载体，并采用商品化的ExpiCHO表达系统进行重组抗体的瞬时转染表达，并采用ProteinA纯化获得目的抗体。
本发明还提供了一种载体，所述载体包括上述技术方案所述的核酸分子。
本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括上述技术方案所述的核酸分子或上述技术方案所述的载体。
本发明还提供了一种试剂盒，包含上述技术方案所述的单克隆抗体、或基于上述技术方案所述的核酸分子、上述技术方案所述的载体或上述技术方案所述的宿主细胞制备得到的单克隆抗体，以及检测中可接受的助剂。
本发明还提供了上述技术方案所述单克隆抗体或基于上述技术方案所述的核酸分子、上述技术方案所述的载体或上述技术方案所述的宿主细胞制备得到的单克隆抗体在制备免疫类诊断试剂的特异性阻断剂中的应用；所述免疫类诊断试剂包括基于碱性磷酸酶标记物类免疫类诊断试剂。本发明所述单克隆抗体通过提前存在于试剂组分中反应，作为特异性阻断剂，同内源性碱性磷酸酶反应形成免疫复合物，阻止其在固相表面的吸附，有效减少内源性碱性磷酸酶带来的假性信号升高，提高基于碱性磷酸酶标记物类免疫类诊断试剂的特异性。试验结果表明，使用生化试剂检测筛选出碱性磷酸酶高值样本，使用本发明阻断剂加入，测试诊断效果，可降低假阳性，排除内源性干扰。
本发明还提供了一种免疫原在制备与人血液中内源性碱性磷酸酶特异性结合的单克隆抗体中的应用，所述免疫原的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示：DTWKSFKPRYKHSHFI。本发明所述免疫原的N端优选进行半胱氨酸修饰，半胱氨酸修饰用于多肽同载体蛋白的偶联。当使用所述免疫原制备上述抗人碱性磷酸酶抗体时，制备方法优选包括以下步骤：（1）获取人体液中碱性磷酸酶和小牛肠碱性磷酸酶的序列信息；（2）根据差异序列，设计和合成免疫原；（3）动物免疫；（4）筛选和纯化抗人碱性磷酸酶抗体。本发明对动物免疫和抗体筛选和纯化的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规方法即可。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种抗人碱性磷酸酶单克隆抗体及其在免疫类诊断试剂阻断剂制备中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.获取人血液中碱性磷酸酶和牛小肠碱性磷酸酶的序列信息；
对比人组织非特异性ALP（Uniprot：P05186）和牛小肠碱性磷酸酶序列，
成熟人组织非特异性ALP氨基酸序列如SEQ ID NO.18：
LVPEKEKDPKYWRDQAQETLKYALELQKLNTNVAKNVIMFLGDGMGVSTVTAARILKGQLHHNPGEETRLEMDKFPFVALSKTYNTNAQVPDSAGTATAYLCGVKANEGTVGVSAATERSRCNTTQGNEVTSILRWAKDAGKSVGIVTTTRVNHATPSAAYAHSADRDWYSDNEMPPEALSQGCKDIAYQLMHNIRDIDVIMGGGRKYMYPKNKTDVEYESDEKARGTRLDGLDLVDTWKSFKPRYKHSHFIWNRTELLTLDPHNVDYLLGLFEPGDMQYELNRNNVTDPSLSEMVVVAIQILRKNPKGFFLLVEGGRIDHGHHEGKAKQALHEAVEMDRAIGQAGSLTSSEDTLTVVTADHSHVFTFGGYTPRGNSIFGLAPMLSDTDKKPFTAILYGNGPGYKVVGGERENVSMVDYAHNNYQAQSAVPLRHETHGGEDVAVFSKGPMAHLLHGVHEQNYVPHVMAYAACIGANLGHCAPASSAGSLAAGPLLLALALYPLSVLF。
成熟牛小肠碱性磷酸酶序列如SEQ ID NO.19：
LIPAEEENPAFWNRQAAQALDVAKKLQPIQTAAKNVILFLGDGMGVPTVTATRILKGQMNGKLGPETPLAMDQFPYVALSKTYNVDRQVPDSAGTATAYLCGVKGNYRTIGVSAAARYNQCNTTRGNEVTSVINRAKKAGKAVGVVTTTRVQHASPAGAYAHTVNRNWYSDADLPADAQKNGCQDIAAQLVYNMDIDVILGGGRMYMFPEGTPDPEYPDDASVNGVRKDKQNLVQEWQAKHQGAQYVWNRTALLQAADDSSVTHLMGLFEPADMKYNVQQDHTKDPTLAEMTEAALQVLSRNPRGFYLFVEGGRIDHGHHDGKAYMALTEAIMFDNAIAKANELTSELDTLILVTADHSHVFSFGGYTLRGTSIFGLAPGKALDSKSYTSLLYGNGPGYALGGGSRPDVNGSTSEEPSYRQQAAVPLASETHGGEDVAVFARGPQAHLVHGVQEETFVAHIMAFAGCVEPYTDCNLPAPA。
2.根据活性位置信息对比分析，设计和合成抗原；
对人非组织非特异性ALP和牛小肠ALP进行序列比对，找到2个蛋白差异性多肽，确定选取的多肽（序列Cys-DTWKSFKPRYKHSHFI，SEQ ID NO.20），其中N端的半胱氨酸是额外添加的用于多肽同载体蛋白的偶联。多肽由武汉天德生物公司进行固相合成。
称取10mg BSA溶解在0.1M PB pH7.3缓冲液中，加入2mg SMCC，室温震荡反应30min，并采用G25脱盐到0.1M PB pH7.3，2~8℃保存待用；
称取5mg多肽溶解在1mL DMSO溶液中，加入到上述的BSA缓冲液中，室温震荡反应60min。
采用7KD透析袋，2~8℃下对PBS透析4次，用PBS调整蛋白浓度到1mg/mL -20℃保存。
3.免疫动物；
免疫周期按照：首次免疫采用弗式完全佐剂后，每两周进行一次免疫，均采用弗式不完全佐剂，免疫三次。首次免疫取1mL（含1mg）免疫原加入1mL弗式完全佐剂，乳化后按照每只小鼠100ug腹腔免疫。后续的免疫均取1mL（含1mg）免疫原加入1mL弗式不完全佐剂，乳化后按照每只小鼠100ug腹腔免疫。最后一次免疫后三天采血进行效价测定。
4.筛选抗人碱性磷酸酶抗体；
选取同包被抗原反应良好的克隆，进一步评估对不同类型碱性磷酸酶的反应性，结果如表1所示。
表1 测定不同克隆对牛重组ALP，牛天然ALP，人碱性磷酸酶的反应性
选择对重组人碱性磷酸酶和人高值碱性磷酸酶血清反应性最优，且同其他几种不同来源牛碱性磷酸酶均无反应性的克隆7H11作为阻断抗体。
5.重组抗体的制备
将抗体的轻重链分别克隆到pcDNA3.4-H载体，载体上自带信号肽序列，质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞2×106 cells/ml于离心管中，采用商品化的ExpiCHO瞬时转染表达系统进行重组抗体的表达制备，37℃ 5%CO2，摇床培养6天后，收集细胞上清。细胞上清经ProteinA纯化，透析到PBS中，-20℃保存。
6.将纯化的抗体作为非特异性阻断剂加入免疫类诊断试剂中进行性能评估（检测原理图详见图1）。
在磁微粒化学发光法hs-cTnI试剂中评估制备的抗人碱性磷酸酶7H11抗体的性能。
磁微粒化学发光法hs-cTnI浓度检测方法的建立。
1）50mg Dynal beads M280 Tosyl磁珠，稀释在2mL 50mM BB pH8.0缓冲液中，加入1mg cTnI抗体05（来自北京德奥平），混匀后，37℃震荡反应8h。
2）磁吸去除上清，加入TBST（50mM Tris 0.9%Nacl 0.1%TW20 pH7.4）37℃反应12h。
3）磁吸去除上清，加入TBST，稀释到0.4mg/mL，命名为磁微粒工作液，2~8℃保存待用。
4）1mg ALP（罗氏，碱性磷酸酶 货号03137031103）溶解在1mL PBS中，加入0.5mgcTnI抗体04（来自北京德奥平），加入10ul 25%的戊二醛溶液，2~8℃静置反应过夜。透析到PBS中，用50mM MES 0.9%Nacl 5mg/mL BSA 1mM Mgcl2 pH6.7稀释到1ug/mL，命名为酶标工作液。
5）反应程序：50ul样本+50ul磁微粒液工作液+50ul 酶标工作液，37℃孵育反应5min，清洗，加入AMPPD发光液显色。
采用含1mg/ml BSA的PBS配置不同浓度的cTnI的校准品S1~S5（0ng/mL、0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.2ng/mL和1ng/mL），和4例临床血清样本（血清1，血清2，血清3，血清4），上述样本均采用abbott hs-cTnI测定和北京丹大的碱性磷酸酶生化法，以及本发明构建的含7H11和不含7H11的hs-cTnI试剂测定。结果如表2所示：
表2 测定结果
雅培的hs-cTnI试剂是基于吖啶酯原理，所以不会受内源性碱性磷酸酶的影响。血清1和血清2样本含有非常高浓度的内源性碱性磷酸酶活性，使用含7H11阻断剂的AP原理发光试剂中测试时得信号值明显低于不含7H11阻断剂得测试值，表明含有阻断剂的试剂能够显著降低内源性高碱性磷酸酶的影响。
血清3和血清4样本含有比较低的内源性碱性磷酸酶活性，试剂中添加7H11阻断剂后，信号值没有差异，说明对原本的抗原抗体反应没有显著的影响，进一步说明该阻断抗体并不会结合试剂酶标中的牛碱性磷酸酶。
目前并没有很好的方案能够解决内源性碱性磷酸酶的干扰，本发明能够解决内源性碱性磷酸酶的干扰，显著改善测定的准确性。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性劳动的前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (10)
1.一种与人血液中内源性碱性磷酸酶特异性结合的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体Fab段抗原结合部位的轻链可变区包括CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，所述单克隆抗体Fab段抗原结合部位的重链可变区包括CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；所述CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体还包括轻链可变区框架区FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4，以及重链可变区框架区FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4；所述FR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述FR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述FR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述FR-L4的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述FR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述FR-H2的氨基酸序列如SEQ IDNO.12所示，所述FR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述FR-H4的氨基酸序列如SEQID NO.14所示。
3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体还包括抗体重链恒定区和/或抗体轻链恒定区的全部或者部分。
5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为编码权利要求1~4任一项所述单克隆抗体的核酸分子。
6.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求5所述的核酸分子。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的载体。
8.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求1~4任一项所述的单克隆抗体、或基于权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的载体或权利要求7所述的宿主细胞制备得到的单克隆抗体，以及检测中可接受的助剂。
9.权利要求1~4任一项所述单克隆抗体或基于权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的载体或权利要求7所述的宿主细胞制备得到的单克隆抗体在制备免疫类诊断试剂的特异性阻断剂中的应用；所述免疫类诊断试剂包括基于碱性磷酸酶标记物类免疫类诊断试剂。
10.一种免疫原在制备与人血液中内源性碱性磷酸酶特异性结合的单克隆抗体中的应用，所述免疫原的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410308995.1A CN118005797A (zh) | 2024-03-19 | 2024-03-19 | 一种抗人碱性磷酸酶单克隆抗体及其在免疫类诊断试剂阻断剂制备中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410308995.1A CN118005797A (zh) | 2024-03-19 | 2024-03-19 | 一种抗人碱性磷酸酶单克隆抗体及其在免疫类诊断试剂阻断剂制备中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118005797A true CN118005797A (zh) | 2024-05-10 |
Family
ID=90960217
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410308995.1A Pending CN118005797A (zh) | 2024-03-19 | 2024-03-19 | 一种抗人碱性磷酸酶单克隆抗体及其在免疫类诊断试剂阻断剂制备中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118005797A (zh) |
-
2024
- 2024-03-19 CN CN202410308995.1A patent/CN118005797A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102549704B1 (ko) | Pivka-ii의 측정 방법, 및 pivka-ii 면역측정 시약 또는 키트의 제조 방법 | |
| GB2074727A (en) | Immunological diagnostic method | |
| US5296354A (en) | Kit for the specific assay of angiotensin II | |
| EP0741144B1 (en) | Antiannexin-v monoclonal antibody, process for producing the same, and use therof | |
| CN112679605B (zh) | 针对新型冠状病毒核衣壳蛋白的抗体或其抗原结合片段及其应用 | |
| CN103940986A (zh) | 肌钙蛋白i 特定位点抗体制备及其检测试剂盒 | |
| CN113004412B (zh) | 胃蛋白酶原i单克隆抗体及其应用 | |
| AU715797B2 (en) | Methods for determining the presence of brain protein S-100 | |
| JP5618831B2 (ja) | 修飾抗ヘパリン／ｐｆ４複合体抗体及びｈｉｔ抗体標準品 | |
| US9116152B2 (en) | Monoclonal antibodies which specifically recognize human liver-carboxylesterase 1, hybridoma cell lines which produce monoclonal antibodies, and uses thereof | |
| CN113832132B (zh) | 一种烙铁头svmp蛋白特异性短肽、抗烙铁头svmp蛋白抗体和蛇伤检测试剂盒 | |
| CN118005797A (zh) | 一种抗人碱性磷酸酶单克隆抗体及其在免疫类诊断试剂阻断剂制备中的应用 | |
| CA1334176C (en) | Monoclonal antibody recognizing gamma atrial natriuretic polypeptide | |
| CN111458522A (zh) | 一种用于检测血浆白细胞介素6天然抗体的检测试剂、试剂盒及其应用 | |
| JPS58149700A (ja) | ペルオキシダ−ゼ含有複合体，その製造法および試薬 | |
| AU600261B2 (en) | Reagent for and procedure in the determination of C3a by immunochemical assay | |
| WO1997008549A1 (fr) | Procede de detection d'affections renales, produit et kit de diagnostic appropries | |
| JPH07313186A (ja) | 抗ｐｉｖｋａ−ｉｉモノクロナ−ル抗体 | |
| JP4028925B2 (ja) | モノクローナル抗体 | |
| CN117054657B (zh) | 一种联合阻断剂及其在胶乳免疫比浊法检测中的应用 | |
| Endo et al. | A Novel Epitope (Pentapeptide) in the Human Hemoglobin β Chain | |
| JP2648855B2 (ja) | ペプチド、その抗体およびエンドセリンの定量 | |
| CN116023464A (zh) | 一种nrf1d蛋白的抗原肽及其抗体和试剂盒 | |
| CN114609394A (zh) | 抗缪勒氏管激素检测试剂盒、单克隆抗体、杂交瘤细胞株 | |
| FI104376B (fi) | Hb A1c:lle spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |