CN113943354A - 一种重组猫疱疹病毒gB蛋白抗原及其在抗体诊断和疫苗制备中的应用 - Google Patents

一种重组猫疱疹病毒gB蛋白抗原及其在抗体诊断和疫苗制备中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种重组猫疱疹病毒gB蛋白抗原及其在抗体诊断和疫苗制备中的应用。使用原核表达载体，将猫疱疹病毒gB蛋白的优势抗原表位进行串联表达。将表达的重组蛋白纯化并作为包被抗原，用于检测猫疱疹病毒抗体。且本发明的抗原处理方便，且缩短了试验时间，操作步骤更简单。本发明建立间接ELISA方法，用以检测猫血清中猫疱疹病毒的抗体水平，具有重复性好、特异性高的特点，可用于猫疱疹病毒血清学调查。因此，本发明提供的基于gB蛋白优势抗原串联表达的猫疱疹病毒间接ELISA检测试剂盒非常适合临床大样本的检测，适合大规模推广。

Description

一种重组猫疱疹病毒gB蛋白抗原及其在抗体诊断和疫苗制备 中的应用
技术领域
本发明属于生物疫苗和微生物的检测与诊断领域，更具体的涉及一种重组猫疱疹病毒gB蛋白抗原及其在抗体诊断和疫苗制备中的应用，及其将其用于检测FHV-1体的间接ELISA方法。本发明还涉及所述的重组猫疱疹病毒gB蛋白在制备猫疱疹病毒gB疫苗以及在制备诊断或检测猫疱疹病毒感染的试剂中的应用。
背景技术
猫疱疹病毒(Feline herpesvirus type 1，FHV-1是疱疹病毒科，α-疱疹病毒亚科引起的猫的一种急性、高度接触性上呼吸道疾病，以 2～6 月龄幼猫最易感，发病率为100%，病死率可达到 20%～50%，是目前已知最重要的猫呼吸道疾病之一。HV-1 感染后主要侵害猫的上呼吸道与眼部，严重感染可造成小叶性肺炎，眼周皮肤溃疡。FHV-1 感染猫康复后，病毒仍可潜伏于三叉神经、视神经、扁桃体等部位造成终身带毒。该病于 1958年被美国科学者Crandell和Maurer首次从患病幼猫气管内分离到该病毒后，欧、美一些国家和地区相继报道该病的发生，国内20 1 0年首次报道了猫疱疹病毒 1型的分离。FHV-1 呈世界性流行，老虎、猎豹等野生猫科动物感染 FHV-1 的报道也逐年增加，对宠物及野生猫科动物的健康造成了威胁。因此急需要建立一种方便快捷的FHV-1检测方法。
FHV-1为有囊膜的双链DNA病毒，直径约为128 nm～168 nm;其基因组GC含量约50％，大小约为1 2 6 kb~1 34 kbp，由一个99kbp的长独特区(Unique Long，UL)和一个27kbp的短片段组成，US两侧的末端重复序列（Terminal repeat short ，TRs）与反向重复序列（Inverted repeat short，TRs）组成。US区包含gG、gD、gI和gE等基因，UL区包含gC、gH和gB基因。gB、gD、gH糖蛋白是病毒复制与感染所必需的，为必需糖蛋白；gC、gE、gG、gI是病毒复制非必需的，为非必需糖蛋白。其中gB、gC、gD、gE、gG、gH 和 gI 7 种糖蛋白已得到鉴定，他们在病毒识别、侵入、导致感染，在细胞间传播和感染释放中发挥着重要作用。
gB 由UL27基因编码的948 个氨基酸编码，氮端含有 10 个糖基化位点，序列中含有 10 个高度保守的半胱氨酸残基，是 FHV-1囊膜表面的重要组成部分，也是病毒的主要免疫原性蛋白，在病毒感染过程中起着决定性作用。在哺乳动物细胞中的表达，引起细胞融合和多核体形成，是病毒复制必需的；此外，gB 蛋白还可以刺激机体产生高水平的中和抗体。
目前，我国宠物产业在不断地发展，FHV-1在我国广泛流行，严重制约着猫宠物业的发展。FHV-1引起的疾病发病率和传染性较高，对FHV-1的防控工作带来巨大的困难。 而抗体水平是评价FHV-1疫苗效果的最重要参数，抗体水平过低则不能保护需要及时补打疫苗。目前临床监测FHV-1的抗体水平常用的方法免疫荧光试验，敏感性低，仅能诊断急性感染的猫。因此，免疫荧光试验在临床诊断中具有一定的局限性。而中和试验一般用于检测FHV-1 的抗体效价，且该方法操作复杂、成本高昂且故仅限于专业实验室操作。因此，需要建立一种价格低廉、快速、敏感且能简便检测血清样本的FHV-1抗体的方法。
理论上对于FHV-1抗体检测可用全病毒包被的形式建立间接ELISA检测方法；也可以用针对gB重组蛋白建立的间接ELISA方法。但全病毒包被需大量病毒，成本高且存在散毒风险。而gB蛋白的全长分子量为130kd 左右，不论是原核还是真核表达效率都不高，更难进行大量纯化，因此针对该蛋白的抗体检测方法一直没有成功建立。
由于FHV-1的gB蛋白是该病毒是病毒的最主要免疫原性蛋白，在病毒感染过程中起着决定性作用，而不同毒株的序列之间存在差异，因此采用表达gB蛋白保守且具有抗原性的区域代替全病毒以及全长的gB，理论上可用于检测FHV-1特异性抗体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性好，灵敏度高的重组抗原，该抗原是由猫疱疹病毒gB蛋白两段优势抗原表位串联表达后获得，所示氨基酸序列为SEQ ID NO .1所示，其对应的核苷酸序列为SEQ ID NO .2。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
选用本实验室分离的WX株并从 NCBI 基因库选取 30 株不同国家、地区、不同年份的 FHV-1 毒株，采用 DNAStar 软件对其基因同源性、氨基酸保守性、蛋白结构域及抗原性等参数进行分析，并根据文献参考同一个科的猪伪狂犬病毒中选择的gB优势抗原表位区域，筛选出 FHV-1 gB 蛋白2段高度保守的优势抗原表位区域，使用Linker序列（GGGGSGGGGS）将2段序列串联起来。假如一条mRNA有很多成簇的稀有密码子，这会对核糖体的运动速度造成负面影响，大大降低蛋白表达水平。所以为了提高在大肠杆菌中表达所述重组蛋白表达效率，我们对此序列按照大肠杆菌密码子偏爱性进行密码子优化，命名为△FHV-1 gB 。序列为SEQ ID NO .2所示，通过 BamHI 限制性酶切位点和 EcoRI 限制性酶切位点嵌入pET-28a 载体，成功构建pET-28a △FHV-1 gB原核表达质粒，并将pET-28a △FHV-1 gB质粒转化至E .coli BL21(DE3)感受态中，使其在E .coliBL21(DE3)菌株中高效表达并纯化，最后获得纯化的△FHV-1 gB重组蛋白。
同时也有类似的利用gB-gD优势抗原区域重组蛋白建立双抗原夹心金标法检测条，但该方法中选取的优势抗原表位区域仅通过一株FHV-1进行蛋白的亲疏水性分析获得具有明显的局限性，且仅可用于定性判断不能进行定量判断，使得抗体的检测结果不具有临床指导价值。而本发明选取30株具有代表性的FHV-1毒株，对同源性、氨基酸保守性、蛋白结构域及抗原性等参数均进行分析，并且参考了疱疹病毒科的其他病毒的抗体检测方法，最终选取了优势抗原区域。因此本发明针对FHV-1的抗体检测更具有广谱性、特异性、敏感性，更适合临床样品的检测。
进一步的，本发明提供所述改造后的重组猫疱疹病毒gB重组抗原在制备预防猫疱疹病药物以及在制备检测或诊断猫疱疹病毒抗体试剂，特别是ELISA检测试剂中的应用。
本发明的另一个目的在于提供一种包含上述抗原的间接ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒主要为猫病毒抗体的检测，用于猫抗体水平的监测。
具体的，所述的利用表达的gB蛋白开发了相应的ELISA检测方法，该方法敏感性好、特异性高。通过对ELISA方法中的各个参数进行优化分析，最终确认所述方法当抗原浓度为 0.5 ug/mL，待检血清 1:1000 稀释时，P/N 值最大，阴性临界值（X+3SD）值为 0.289。
优选的，最佳抗原包被浓度为0.5 ug/ml、最佳一抗血清稀释倍数为1：1000、最佳包被时间4℃过夜、最佳一抗孵育时间37℃ 60min、最佳二抗稀释倍数的确定1：10000、最佳二抗孵育时间的为37℃ 60min、最佳显色时间是37℃15min。
进一步的，本发明提供一种间接ELISA抗体检测试剂盒，鉴定猫是否感染非猫疱疹病毒或者检测猫血清中是否含有猫疱疹病毒抗体。截短的FHV-1 gB重组蛋白作为包被抗原，通过条件优化，建立了检测FHV-1间接ELISA抗体检测方法。
所述试剂盒包括：包被液的组分为碳酸钠 1.58g、碳酸氢钠 2.93g 加去离子水定容至1L，调节PH值为9.6。PBST 缓冲液为含终浓度 0.01%，Tween-20 的 PBS 缓冲液 。2M的硫酸溶液组分22.2mL 98%的H2SO4 加177.2mL的去离子水定容至200mL。检测抗体为上海地区收集的45份猫血清。酶标二抗为山羊抗猫IgG-HRP购自上海拓然生物有限公司。阳性对照为使用FHV-1疫苗六免后获得，阴性血清为本实验室保存。PBS缓冲液干粉购自北京索莱宝科技有限公司。封闭液为5%的脱脂奶粉。
进一步，本申请提供一种可以预防和/或治疗猫疱疹病毒的疫苗，所述疫苗为DNA疫苗或亚单位疫苗所述疫苗的活性成分为，氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示的蛋白片段和/或核苷酸序列为SEQ ID NO .2所示的核苷酸。
有益效果
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明使用的抗原为猫疱疹病毒蛋白gB截短蛋白，嵌入到原核载体pET-28a的重组抗原pET-28a △FHV-1 gB，该抗原经诱导表达纯化后，具有灵敏度高，特异性好以及纯度高等特点。同时，pET-28a △FHV-1 gB具有免疫原性，因此是可作为检测试剂盒的包被抗原。
截短后gB蛋白表达于沉淀且表达量高以及临床实用性强。本发明制备的ELISA抗体检测试剂盒能够准确检测样品中是否含有猫疱疹病毒抗体。本发明基于优势抗原表位串联表达包被的重组蛋白ELISA试剂盒的特异性与gB蛋白全长相当，且灵敏度高，阳性率高，操作简便。
而本发明使用的截短的gB重组蛋白表达量高且易于纯化进行大量制备，可以实现ELISA检测的包被抗原的大规模使用。
本发明选取FHV-1 gB的两段优势抗原表位区域，并使用Linker序列（GGGGSGGGGS）串联起来。利用本发明的蛋白抗原制备出的ELISA试剂盒，灵敏度高，阳性率高，操作简便，检测时间短，与现有的利用FHV-1全病毒建立的间接ELISA检测方法相比，具有明显的优势。
附图说明
图1为△FHV-1 gB基因PCR扩增示意图。
图2为重组质粒pET-28a △FHV-1 gB基因酶切鉴定结果。
图3为FHV-1 gB截短重组蛋白SDS-PAGE电泳结果
图4为FHV-1 gB截短重组蛋白纯化后SDS-PAGE电泳结果
图5为表达目的蛋白纯化后的western blot结果，其中M为蛋白Maker，1为阴性对照 2为重组蛋白。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
实施例 1
根据所选择的gB优势抗原表位区域，使用一个柔性linker序列将不同区域串联起来，并在序列两端引入 BamHI 限制性酶切位点和 EcoRI限制性酶切位点，得到重组 DNA。相应的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码重组 DNA 的序列为 SEQ ID No.2 所示。
2）阳性重组质粒 pET-28a △FHV-1 gB 的构建
将所需的B细胞抗原表位区域用Linker连接，经过密码子优化后在公司进行合成，通过BamHI和EcoRI 限制性酶切位点合成至原核表达载体 pET-28a中，合成所得的原核表达质粒PCR鉴定后其PCR扩增如图1所示，送上海生物工程有限公司进行序列测定。测序鉴定为阳性的重组质粒即为阳性重组质粒 pET-28a △FHV-1 gB。提取质粒进行双酶切鉴定如图2所示。
3）目的蛋白的表达
将鉴定的阳性重组质粒pET-28a △FHV-1 gB小提质粒后转化入BL21 大肠杆菌感受态细胞中，挑取单个菌落接种 LB 培养基，培养过夜。取 100μL 菌液加入到 5mL LB 培养基中震荡培养至 OD 值为0.7（0.6-0.8 左右）时，加入 IPTG 37℃诱导6h，表达产物超声裂解后进行 SDS-PAGE。结果如图 3 所示 。
4）表达产物的纯化
按照步骤 3）中优化的条件进行大规模培养，按照 His 蛋白纯化说明书进行纯化。纯化后同样进行 SDS-PAGE。结果如图 4 所示。
5）纯化蛋白的 Western blot 分析
将纯化的蛋白进行 Western blot 分析，一抗为 His Mab（1:1000），酶标二抗为羊抗鼠 IgG/ 辣根酶（HRP）（1:10000），按常规步骤做 Western-blot，用DAB 显色观察结果。结果如图 5所示。
实施例2 ELISA 方法的建立
用纯化后的重组蛋白为包被抗原制备ELISA 平板，检测猫血清中FHV-1 抗体水平，并对影响实验的各种条件进行优化选择。具体而言：
a) 抗原包被浓度与血清最佳稀释度
采用矩阵滴定法，横排选择抗体稀释度（1:100、1:200、1:400、1:800、1：1000、1：1200、1：1400、1：1600），纵排选择抗原浓度（0.25 ug/mL 、0.5 ug/mL 1ug/mL、2 ug/mL、），每个稀释度重复 3 次，取平均值。结果，当抗原浓度为 1 ug/mL，待检血清 1:1000 稀释时，P/N 值最大，因此，最佳抗原包被浓度为 0.5 ug/mL，抗体最佳稀释度为 1:1000如表1所示。
表 1 最适抗原包被浓度与血清稀释度的确定
Figure 214910DEST_PATH_IMAGE001
b) 抗原包被时间的确定
用最佳抗原浓度包被酶标板，包被条件为室温作用1h再4℃过夜、室温作用 2h再4℃过夜、37℃作用1h再4℃过夜、37℃作用 2h再4℃过夜、直接4℃作用过夜，结果 4℃作用过夜包被效果最好如表2所示。
表 2 最适包被条件的确定
Figure 481944DEST_PATH_IMAGE002
c) 血清最佳反应时间加入血清后，反应时间为30min、60min、90min，进行ELISA检测，结果作用 60min 效果最好如表3所示。
表3血清最佳反应时间的确定
Figure 680844DEST_PATH_IMAGE003
d) 酶标二抗最佳反应时间
加入酶标二抗后，反应时间为30min、60min、90min，进行ELISA 检测，结果作用60min 效果最好如表4所示。
表4酶标二抗最佳反应时间确定
Figure 818564DEST_PATH_IMAGE004
e) 底物最佳反应时间的确定
加入底物（TMB）后，反应时间为10min、15min、20min ，进行 ELISA 检测，结果作用15min 效果最好,如表5所示。
表5 底物最佳反应时间的确定
Figure 811928DEST_PATH_IMAGE005
通过上述优化的步骤筛选，最终确定利用本申请所述的融合抗原所获得的ELISA检测优选步骤具体为
(1)包被 ：将纯化后的重组蛋白，用抗原包被液稀释至含重组蛋白0.5ug/mL 的终浓度，每个 ELISA 孔加入 100uL，4℃包被过夜，PBST 缓冲液洗涤 5min，重复三次 ；
(2)封闭 ：每孔加入 5% 脱脂奶粉的PBST 封闭液 100uL，37℃作用 2h，PBST 缓冲液洗涤 5min，重复四次 ；
(3)加待检血清 ：每孔加入 100uL 用PBS稀释 1:1000 倍稀释的猫血清，37℃作用 1h， PBST 缓冲液洗涤 5min，重复四次 ；
(4)加酶标二抗 ：每孔加入100uL 用PBS稀释 1:10000 稀释的兔抗猫IgG/ 辣根酶，37℃作用 1h，PBST 缓冲液洗涤 5min，重复四次 ；
(5)加显色液 ：每孔加入 100uL TMB显色液，37℃作用 15min ；
(6)加终止液 ：每孔加入50uL 终止液，用酶标仪测定OD450 值 ,所述终止液为2M的硫酸溶液 。
f) 最佳 ELISA 临界值的确定
在最佳工作浓度条件下，对收集的 16 份 FHV-1 抗体阴性的猫血清进行间接ELISA 方法检测，确定阴性临界值（X+3SD）值为 0.289如表6所示。
表6最佳 ELISA 临界值的确定
Figure 566257DEST_PATH_IMAGE007
g) 间接 ELISA 的特异性实验
利用所表达的白作为诊断抗原包被 ELISA 方法检测猫细小病毒（FPV）阳性血清、猫杯状病毒（FCV）阳性血清，所检测 OD450 值均小于 0.289，检测结果均为阴性如表7所示，证明所建立的方法与上述病毒无交叉反应，特异性好。
表7特异性实验
Figure 303269DEST_PATH_IMAGE008
h) 间接 ELISA 的重复性试验
对四份血清进行测定，计算组内、组间的变异系数，结果均在 5% 以内如表8、9所示，表明所建立的间接 ELISA 方法有较好的重复性。
表 8 批内重复性试验
Figure 826654DEST_PATH_IMAGE010
表 9 批间重复性试验
Figure 725340DEST_PATH_IMAGE012
i) 临床样品的检测
利用 a）-h）步骤所优化好的条件包被 ELISA 平板，并对 48 份采自上海地区采集的猫血清进行检测，结果可见，27 份未免疫猫血清检测 OD450 值均小于 0.289，可用于FHV-1 的临床检测。
j）与全长gB蛋白的平行比较
将全长gB蛋白表达纯化后包被ELISA板子，对同样48份猫血清进行检测，结果表明：与gB抗原优势区密码子优化后的重组蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法结果符合率为100%。但单位菌液量两种包被抗原的产量相差2个数量级，表明本发明中的gB抗原优势区重组蛋白可以完全代替gB全长蛋白，且更易大量获得包被抗原。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
〈110〉 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）
<120>一种重组猫疱疹病毒gB蛋白抗原及其在抗体诊断和疫苗制备中的应用
<160>2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211>462
<212> PRT
<213>重组猫疱疹病毒gB蛋白抗原
WIVLFLVGPRPVEGQSGSTSEQPRRTVATPEVGGTPPKPTTDPTDMSDMREALRASQIEANGPSTFYMCPPPSGSTVVRLEPPRACPDYKLGKNFTEGIAVIFKENIAPYKFKANIYYKNIIMTTVWSGSSYAVTTNRYTDRVPVKVQEITDLIDRRGMCLSKADYVRNNYQFTAFDRDEDPRELPLKPSKFNTPESRGWHTTNETYTKIGAAGFHHSGTSVNCIVEEVDARSVYPYDSFAGGGGSGGGGSEFAMLQFAYDYIQAHVNEMLSRIATAWCTLQNREHVLWTETLKLNPGGVVSMALERRVSARLLGDAVAVTQCVNISSGHVYIQNSMRVTGSSTTCYSRPLVSFRALNDSEYIEGQLGENNELLVERKLIEPCTVNNKRYFKFGADYVYFEDYAYVRKVPLSEIELISAYVDLNLTLLEDREFLPLEVYTRAELEDTGLLDYSEIQRRNQLH
<210> 2
<211>1386
<212> DNA
<213>重组猫疱疹病毒gB蛋白抗原的编码序列
TGGATCGTTCTGTTTCTGGTTGGCCCACGTCCGGTTGAAGGTCAATCCGGCAGCACCAGCGAACAACCACGTCGTACCGTTGCAACTCCAGAAGTTGGCGGCACCCCACCGAAACCAACCACTGATCCGACGGACATGTCTGACATGCGCGAAGCACTGCGTGCTTCTCAGATCGAAGCCAACGGCCCGTCCACCTTCTACATGTGTCCGCCGCCGAGCGGTTCTACTGTTGTTCGTCTGGAGCCTCCGCGTGCGTGTCCAGATTACAAGCTGGGCAAAAACTTCACCGAGGGCATCGCAGTTATCTTCAAAGAAAACATCGCACCGTACAAATTCAAAGCAAACATCTACTATAAAAACATTATTATGACTACCGTCTGGTCCGGTTCTTCCTACGCTGTAACTACCAACCGTTACACCGACCGTGTTCCGGTCAAAGTACAGGAGATTACCGATCTGATCGATCGTCGTGGCATGTGCCTGTCTAAAGCGGATTACGTTCGCAACAATTACCAGTTCACCGCGTTCGACCGTGATGAAGATCCGCGTGAACTGCCGCTGAAACCGTCTAAATTCAACACCCCTGAATCTCGTGGCTGGCATACTACCAACGAAACCTACACCAAGATCGGCGCTGCTGGCTTCCACCACTCTGGTACTTCTGTCAACTGCATCGTCGAGGAAGTCGATGCTCGTTCTGTCTATCCGTACGATTCTTTTGCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGCTCCGAATTCGCGATGCTGCAGTTCGCTTATGACTACATCCAGGCTCATGTAAACGAAATGCTGAGCCGTATCGCCACCGCCTGGTGTACCCTGCAAAACCGTGAACACGTTCTGTGGACCGAAACGCTGAAACTGAACCCTGGTGGTGTAGTGTCTATGGCCCTGGAACGTCGTGTTTCTGCCCGTCTGCTGGGTGATGCAGTAGCAGTTACTCAGTGTGTTAACATTAGCTCCGGTCACGTTTACATTCAGAATTCCATGCGTGTCACGGGCTCTAGCACTACCTGTTACAGCCGTCCGCTGGTGTCCTTTCGTGCACTGAACGATAGCGAATACATTGAGGGCCAACTGGGTGAAAACAACGAACTGCTGGTTGAACGTAAACTGATCGAACCGTGTACCGTAAACAATAAACGTTACTTCAAATTCGGTGCTGATTACGTTTACTTCGAAGACTATGCGTACGTCCGTAAAGTGCCGCTGTCCGAAATCGAACTGATCTCTGCGTACGTAGACCTGAACCTGACCCTGCTGGAAGACCGCGAGTTCCTGCCGCTGGAGGTTTACACCCGTGCAGAACTGGAGGACACCGGTCTGCTGGACTACTCTGAGATCCAACGCCGTAACCAGCTGCAC

Claims (8)

1.一种猫疱疹病毒gB 抗原表位重组蛋白，其特征在于所述抗原表位重组蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID No.1 所示。
2.如权利要求 1 所述重组蛋白的制备方法，其特征在于步骤为 ：
1）获得一种重组 DNA，该重组 DNA 编码如SEQ ID No.1 所示的蛋白质；
2）将步骤 1）的重组 DNA 利用基因工程重组技术构建能够表达 gB 蛋白2段抗原优势抗区域的基因工程质粒 pET-28a △FHV-1 gB；
3）将质粒 pET-28a △FHV-1 gB 转入宿主大肠杆菌 BL21 成为基因工程菌 BLpET-28a △FHV-1 gB，将 BLpET-28a △FHV-1 gB 在LB 培养基中培养，利用 IPTG 诱导表达并进行条件优化，所表达的蛋白经分析该重组蛋白在沉淀表达；
4）将重组蛋白通过亲和层析柱进行纯化。
3.如权利要求 2 所述的制备方法，其中步骤1中所述重组 DNA的获得为根据已有文献报道并参考伪狂犬病毒的抗体检测方法所选择的区域，再结合序列分析选择gB蛋白中2段抗原优势区域进行串联表达，2段序列之间加入一个柔性linker序列GGGGSGGGGS,构建成一个串联表达盒，在序列中引入 BamHI限制性酶切位点和 EcoRI限制性酶切位点。
4.如权利要求1 所述的一种猫疱疹病毒gB 抗原表位重组蛋白的应用，所述应用为检测FHV-1抗体的间接 ELISA 方法。
5.一种测定猫疱疹病毒抗体的 ELISA 方法，其特征在于所述ELISA 方法的具体测定步骤为 ：
a、包被 ：将纯化后的重组蛋白，用抗原包被液稀释至含重组蛋白0.5 ug/mL 的终浓度，每个 ELISA 孔加入 100uL，4℃包被过夜，PBST 缓冲液洗涤 5min，重复三次 ；所述的抗原包被液为 0.05mol/L，pH9.6 的碳酸盐缓冲液 ；所述 BPST 缓冲液为含终浓度0.01%，Tween-20 的 PBS 缓冲液 ；
b、封闭 ：每孔加入 5% 脱脂奶粉的PBST 封闭液 100uL，37℃作用 2h，PBST 缓冲液洗涤 5min，重复四次 ；
c、加待检血清 ：每孔加入 100uL 用PBS稀释 1:1000 倍稀释的猫血清，37℃作用 1h，PBST 缓冲液洗涤 5min，重复四次 ；
d、加酶标二抗 ：每孔加入100uL 用PBS稀释 1:10000 稀释的兔抗猫IgG/ 辣根酶，37℃作用 1h，PBST 缓冲液洗涤 5min，重复四次 ；
e、加显色液 ：每孔加入 100uL TMB显色液，37℃作用 15min ；
f、加终止液 ：每孔加入50uL 终止液，用酶标仪测定OD450 值 ；所述终止液为2mol/L的硫酸溶液 ；
g、结果判定 ：待检血清 OD450 值≧ 0.289 时，判定为 FHV-1 抗体阳性 ；待检血清OD450 值﹤ 0.289，判定为 FHV-1抗体阴性。
6.如权利要求5所述的一种测定猫疱疹病毒抗体的 ELISA 方法，其中所述的重组蛋白为权利要求1所述的一种猫疱疹病毒gB 抗原表位重组蛋白。
7.一种测定猫疱疹病毒抗体的试剂盒，所述试剂盒包括：包被液的组分为碳酸钠1.58g、碳酸氢钠 2.93g 加去离子水定容至1L，调节PH值为9.6；
PBST 缓冲液为含终浓度 0.01%，Tween-20 的 PBS 缓冲液；
2M 的硫酸溶液组分22.2mL 98%的H2SO4 加177.2mL的去离子水定容至200mL。
8.一种可以预防和/或治疗猫疱疹病毒的疫苗，所述疫苗为DNA疫苗或亚单位疫苗，所述疫苗的活性成分为，包含氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示的蛋白片段和/或核苷酸序列为SEQ ID NO .2所示的核苷酸的生物材料。
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