CN111647055A

CN111647055A - 一种用于新型冠状病毒检测的n蛋白及其制备与应用

Info

Publication number: CN111647055A
Application number: CN202010602999.2A
Authority: CN
Inventors: 程立坤; 赵修报; 杨秀艳; 杨光; 吴峰; 王静; 董艳凯; 宋征; 王景超; 沈志强
Original assignee: Seventh Affiliated Hospital Of Sun Yat Sen University Shenzhen; Shandong Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy; Qingyuan Biological Shenzhen Co ltd; Binzhou Medical University Hospital
Current assignee: Qingyuan biological (Shenzhen) Co.,Ltd.; Seventh Affiliated Hospital of Sun Yat sen University (Shenzhen); SHANDONG BINZHOU ANIMAL SCIENCE & VETERINARY MEDICINE ACADEMY; Shenzhen Mingde Biotechnology Co.,Ltd.; Binzhou Medical University Hospital
Priority date: 2020-06-29
Filing date: 2020-06-29
Publication date: 2020-09-11
Anticipated expiration: 2040-06-29
Also published as: CN111647055B

Abstract

本发明属于免疫技术领域，具体涉及一种用于新型冠状病毒COVID‑19检测的重组抗原及其制备与应用。用于检测COVID‑19的重组抗原具体为一种截短的N蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。本发明提供的用于检测COVID‑19的重组N蛋白为血清学检测COVID‑19提供了一种新的选择，采用SEQ ID NO.1所示的截短N蛋白检测COVID‑19具有敏感性高、特异性好，假阳性率明显降低等优点，其中，敏感性较全长N蛋白高出约60～100％，特异性达到98.57％，应用前景广泛。

Description

一种用于新型冠状病毒检测的N蛋白及其制备与应用

技术领域：

本发明属于免疫技术领域，具体涉及一种用于新型冠状病毒COVID-19检测的N蛋白及其制备与应用。

背景技术：

2019新型冠状病毒病(COVID-19，即Corona Virus Disease 2019)，因2019年发现病毒性肺炎病例，2020年1月12日被世界卫生组织暂命名为“2019-nCoV”。2月11日世卫组织总干事谭德塞将新型冠状病毒(2019-nCoV)引发的疾病正式命名为：2019冠状病毒病(COVID-19，即Corona Virus Disease 2019)。其病原微生物是一种新型冠状病毒，根据流感及相关疾病监测，发现多起病毒性肺炎病例，均诊断为病毒性肺炎/肺部感染。新型肺炎存在人传人现象，国家卫生健康委决定将新型冠状病毒感染的肺炎纳入法定传染病乙类管理，采取甲类传染病的预防、控制措施。2020年3月11日，世界卫生组织总干事谭德赛宣布，新型冠状病毒已构成全球大流行。新型冠状病毒主要的传播途径为呼吸道飞沫传播和接触传播，气溶胶和粪-口等传播途径尚待进一步明确。通过流行病学调查显示，病例多追踪到与确诊的病例有过近距离密切接触的情况。

截至北京时间2020年4月21日17:00全球累计确诊2416526例；死亡166638例；累计治愈588884例；中国累计确诊84278例；现有确诊1621例，境外输入累计1608例，死亡4642例，治愈78015例；海外疫情：美国确诊已逾79万例；西班牙累计确诊突破20万例。海内外疫情数据均来自各国官方通报和权威媒体报道。

目前针对COVID-19研制的检测方法主要有核酸检测和血清学检测。

核酸检测能够检测到处于窗口期的患者，及早发现感染者，是新型冠状病毒检测的“金标准”，但是对检测设备或平台要求较高，高灵敏度的RT-PCR仪价格昂贵，对实验室的洁净度和操作人员要求也较高。此外，核酸检测耗时较长，考虑到样本运输、样本积压的情况，通常最快24小时才可以报告结果。

血清学检测方法基于特异性抗原抗体相互反应。抗体血清学检测的血液标本更易获取且标本质量有保证、操作简单快捷、很大程度上降低了医护人员在标本采集和检测过程中被感染的风险、更易于基层实验室展开筛查工作。血清学检测的就是患者血液中被刺激产生的抗体，是间接证据，对临床有提示作用。当核酸检测阴性时，将血清学检测增加进去，可以弥补核酸检测容易造成漏诊的缺陷。

核衣壳蛋白(N蛋白)是冠状病毒最丰富的蛋白。在病毒粒子装配过程中，N蛋白与病毒RNA结合，导致螺旋状核衣壳的形成。核衣壳蛋白是一种高度免疫原性的磷蛋白，也参与病毒基因组复制和调节细胞信号通路。同时，N蛋白相对保守，在病毒的结构蛋白中所占比例最大，感染早期机体就能产生抗N蛋白的高水平抗体，可以利用N蛋白建立快速检测COVID-19血清抗体的方法，也可以进一步制备单抗或开展解析该蛋白结构等研究。

本发明制备的截短N蛋白，相对于市面常用的全长N蛋白具有敏感性高、特异性好，假阳性率明显降低等优点。

发明内容：

为了丰富COVID-19的血清学检测方法，并克服目前检测方法在敏感度、特异性及准确率上存在的问题，本发明提供一种截短的N蛋白，可作为血清学检测方法的关键原料，用于ELISA试剂盒、胶体金检测卡、化学发光试剂盒、量子点检测卡等血清学检测方法中。

所述截短的N蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；

本发明还提供与所述截短的N蛋白相关的生物材料，具体为以下任意一种：

(1)编码所述截短的N蛋白的核酸分子；

(2)含有(1)所述核酸分子的表达盒；

(3)含有(1)所述核酸分子，或(2)所述表达盒的重组载体；

(4)含有(1)所述核酸分子，或(2)所述表达盒，或(3)所述重组载体的重组菌株；

优选地，编码所述截短的N蛋白的核酸分子如序列表SEQ ID NO.2所示；

优选地，所述重组载体的表达载体包括但不限于pET28a；

优选地，所述重组菌株的宿主细胞包括但不限于E.coli BL21；

本发明还提供所述截短的N蛋白或与其相关的生物材料在检测COVID-19或制备COVID-19检测产品中的应用；

优选地，所述截短的N蛋白抗体为IgM、IgG或IgA；

优选地，所述检测产品包括但不限于试剂盒、检测卡、试纸；

优选地，所述检测产品以血清、全血、血浆、唾液或乳液为待检样品。

有益效果：

本发明提供的用于检测COVID-19的重组N蛋白为血清学检测COVID-19提供了一种新的选择，采用SEQ ID NO.1所示的截短N蛋白检测COVID-19具有敏感性高、特异性好，假阳性率明显降低等优点，其中，敏感性较全长N蛋白高出约60～100％，特异性达到98.57％，应用前景广泛。

附图说明：

图1E.coli BL21-N菌株的双酶切鉴定

其中，M：DNA Marker，1：质粒，2：双酶切产物；

图2N蛋白诱导表达的SDS-PAGE鉴定

其中，(a)M：蛋白Marker，1为诱导前发酵液样品，2、3、4为三个单菌落诱导6h发酵液样品；

(b)M：蛋白Marker，1：诱导4h时菌体破碎后上清，2：诱导4h时菌体破碎后沉淀，3：诱导6h时菌体破碎后上清，4：诱导6h时菌体破碎后沉淀。

图3不同浓度洗脱液洗脱N蛋白效果及浓缩后N蛋白鉴定其中，(a)M：蛋白Marker，1：纯化前，2：穿透液，3：50mM咪唑洗杂，4：80mM咪唑洗杂，5：100mM咪唑洗脱(第一次)，6：100mM咪唑洗脱(第二次)，7：100mM咪唑洗脱(第三次)，8：150mM咪唑洗脱(第一次)，9：150mM咪唑洗脱(第二次)，10：150mM咪唑洗脱(第三次)，11：200mM咪唑洗脱(第一次)，12：200mM咪唑洗脱(第二次)；

(b)：M：蛋白Marker，1：浓缩后N蛋白。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

本发明所涉及的截短N蛋白，可根据氨基酸序列人工合成获得，也可通过基因工程的手段构建重组菌进行表达、分离和纯化获得，表达宿主包括并不限于E.coli BL21等；表达载体包括并不限于质粒pET28a等；限制性内切酶包括并不限于XhoI，ApaI等，以下实施例将通过基因工程手段对蛋白表达和制备及应用进行示例性的说明。

本发明提供的截短N蛋白是一种COVID-19重组抗原，可与新冠病毒感染病人血清发生特异性免疫学反应，适用于COVID-19病毒的各种免疫学的特异性检测方法，从而实现对COVID-19抗体的检测，例如：应用于双抗原夹心法检测总抗体，间接法检测抗体IgG、IgA和IgM,捕获法检测IgM等检测方法，可适用于ELISA检测、胶体金现场快速检测、量子点荧光免疫层析现场快速检测、化学发光检测等技术。

与本发明提供的截短N蛋白相关的生物材料，如核酸分子、重组载体、重组菌株等均含有抗原相关信息的生物模块，可用于重组抗原的生产和制备，获取重组抗原，用于COVID-19的检测或相关产品的制备。

本发明所述的截短N蛋白可以是SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，也可以是其多肽变体或融合多肽。此处的“多肽变体”与SEQ ID NO.1所示序列的区别仅在于保守型替代和/或修饰、而仍保留了多肽的免疫原性的多肽，所述变体与SEQ ID NO.1所示序列有至少80％以上的同源性，优选地具有90％以上同源性，更优选地具有95％以上同源性。此处的“融合多肽”是指含有SEQ ID NO.1截短N蛋白或其变体的多肽。

SEQ ID NO.1所示的截短N蛋白，全长241个氨基酸，序列如下：

MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRGGGGSGGGGSGGGGSMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASGGGGSGGGGSGGGGSKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA。

以下将通过具体实施方式对本发明作进一步的解释说明。

实施例1：N蛋白表达菌株E.coli BL21-N的构建

1、N蛋白编码基因的设计

本研究对新冠病毒关键基因N蛋白编码基因(NCBI编号YP_009724397.2)与包括SARS、MERS在内的另外6个感染人的冠状病毒及流感病毒等呼吸道感染病毒做了基因及蛋白质同源性分析，新冠病毒N蛋白与SARS N蛋白的同源性为91.2％，与MERS N蛋白的同源性为47.6％，与其它病毒N蛋白的同源性在8.8％-33.5％之间。我们裁剪了新冠病毒N蛋白基因与其它病毒特别是不发病、或只导致轻微感冒病毒N基因的同源序列，取特异性序列多段拼接的新冠病毒的N蛋白编码基因，优化后的新冠病毒N蛋白提高了抗体反应特异性。

裁剪部分同源序列多段拼接后的N蛋白氨基酸序列为：

2、质粒pET28a-N的构建及其转化

将SEQ ID NO.2所示的截短的N蛋白编码基因与质粒pET28a连接，连接产物克隆转化得到重组质粒pET28a-N。把pET28a-N加入装有E.coli BL21感受态细胞的EP管中，冰浴30min，42℃热击90s，再冰浴2min，然后加入700μL无抗性LB液体培养基，37℃摇床培养45min1小时，涂布卡那霉素抗性平板，置37℃培养箱过夜培养。

3、表达菌株E.coli BL21-N的鉴定

挑取卡那霉素抗性平板上单菌落，加入LB液体培养基，置37℃摇床180rpm过夜培养；利用OMEGA质粒提取试剂盒，按照说明书步骤提取质粒；然后，对提取的质粒进行酶切鉴定(酶切条件：XhoI-HF 0.8μL，ApaI-HF 0.8μL，N DNA 4μL，Cut smart 2μL，dH₂O 12.4μL。加好后置37℃水浴30min)。

对双酶切产物进行琼脂糖电泳鉴定，结果如图1所示。由图1可知，双酶切产物片段大小约为1787bp，与理论值一致，则说明成功构建得到用于重组N蛋白表达的菌株E.coliBL21-N。

实施例2：N蛋白表达及纯化

1、菌株E.coli BL21-N活化及培养

挑取实施例1获得的E.coli BL21-N三个单菌落，分别加入装有5mL LB液体培养基的30mL摇菌瓶，按照50mg/L浓度加入卡那霉素，置于摇床中，37℃180rpm培养10h；然后，按照1％接种量，加入装有300mL LB液体培养基的500mL三角瓶中，并按照50mg/L浓度加入卡那霉素，至于摇床中37℃180rpm培养。

2、N蛋白诱导表达及鉴定

E.coli BL21-N培养至OD₆₀₀为0.6-0.8时，加入1mM IPTG进行诱导，诱导6h后，收集发酵液，检测N蛋白是否表达；并超声破碎菌体，确定N蛋白表达形式，结果如图2所示。

由图2(a)可知，在35kDa左右有目的条带，构建得到的E.coli BL21-N可实现新型冠状病毒重组N蛋白的表达；由图2(b)可知，菌体破碎后的上清在35kDa左右有较粗目的条带，菌株E.coli BL21-N表达的N蛋白以可溶性表达为主。

3、可溶性N蛋白的纯化及浓缩

收集诱导表达后的菌泥，利用超声破碎后，取破碎后上清，截短N蛋白上有His标签，使用His亲和层析Ni柱进行纯化。使用5mM咪唑PBS缓冲液进行平衡，依次用50mM和80mM咪唑PBS缓冲液洗杂；然后，依次用100mM、150mM和200mM咪唑PBS缓冲液洗脱，各收集3个柱体积的洗脱液。

利用SDS-PAGE凝胶电泳测定不同浓度洗脱液下N蛋白洗脱效果(图3(a))；并测定洗脱液中N蛋白浓度，收集含有高纯度N蛋白的洗脱液进行浓缩，且测定浓缩后N蛋白纯度(图3(b))。

由图3(a)可知，采用100mM咪唑洗脱(第一次)、100mM咪唑洗脱(第二次)、100mM咪唑洗脱(第三次)、150mM咪唑洗脱(第一次)洗脱N蛋白的效果较好，且其浓度分别为0.773mg/mL、0.975mg/mL、0.807mg/mL、1.166mg/mL。

收集以上4管洗脱液进行浓缩，N蛋白浓度浓缩至1.50mg/mL，并经分析，浓缩后N蛋白纯度达到90％以上(图3(b))。

实施例3：纯化后N蛋白用于新型冠状病毒肺炎抗体检测

1、检测新冠病毒病人血清，做敏感性分析

将实施例2收集的截短N蛋白进行稀释，分别采用0.2μg/mL的截短N蛋白和全长N蛋白包被酶标板，采用间接ELISA检测新冠病人血清。

具体操作步骤为：含0.05％吐温20的磷酸缓冲液10倍稀释血清样本后加样100微升，37℃避光反应30分钟后，用含0.05％吐温20的磷酸缓冲液洗涤5次，每次30秒，加入100μL用含0.05％吐温20的磷酸缓冲液5000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG，37℃避光反应30分钟后，用含0.05％吐温20的磷酸缓冲液洗涤5次，每次30秒，加入100μl单组份TMB显色液避光反应10min，加入100μL浓度为1mol/L的硫酸终止反应，于酶标仪读取450nm和630nm波长OD值。

按临界值为2.1倍的阴性样本平均值标准设定临界值为OD值0.15，OD值小于0.15的血清样本为阴性，OD值大于等于0.15的血清样本为阳性，表1为新冠病人血清的ELISA检测OD值，分析敏感性及检出率。

表1新冠病人血清的ELISA检测OD值

检测数据显示，截短N蛋白敏感性明显高于全长N蛋白，依截短N蛋白检出OD值减去全长N蛋白检出OD值比上全长N蛋白检出OD值标准，统计得敏感性高约60～100％，但检出率较全长N蛋白低，截短N蛋白10份病人样本检出6份，检出率60％，全长N蛋白10份病人样本检出8份，检出率80％，分析截断N蛋白删减部分同源性位点影响了新冠病人样本的检出率。

2、检测正常人血清，做特异性分析

将实施例2收集的截短N蛋白进行稀释，分别采用0.2μg/mL的截短N蛋白和全长N蛋白包被酶标板，采用间接ELISA检测正常人血清。

具体操作步骤为：用含0.05％吐温20的磷酸缓冲液10倍稀释血清样本后加样100微升，37℃避光反应30分钟后，用含0.05％吐温20的磷酸缓冲液洗涤5次，每次30秒，加入100μl用含0.05％吐温20的磷酸缓冲液5000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG，37℃避光反应30分钟后，用含0.05％吐温20的磷酸缓冲液洗涤5次每次30秒，加入100μl单组份TMB显色液避光反应10分钟，加入100μl浓度为1摩尔的硫酸终止反应，于酶标仪读取450nm和630nm波长OD值。

按临界值为2.1倍的阴性样本平均值标准设定临界值为OD值0.15，OD值小于0.15的血清样本为阴性，OD值大于等于0.15的血清样本为阳性，正常人血清的ELISA检测OD值如表2所示，分析敏感性及检出率。

表2正常人血清的ELISA检测OD值

检测数据显示，截短N蛋白特异性明显高于全长N蛋白，检测正常人血清350份，全长N蛋白检出31份假阳性，特异性91.14％，截短N蛋白检出5份假阳性，特异性98.57％，且数值分析显示截短N蛋白检出均为弱阳性，大都可通过优化调试避免掉，而全长N蛋白存在大量强阳性或中阳性，很难有效避免。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 清源生物（深圳）有限公司

山东省滨州畜牧兽医研究院、

中山大学附属第七医院（深圳）

滨州医学院附属医院

<120> 一种用于新型冠状病毒检测的N蛋白及其制备与应用

<130> 1

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr

1 5 10 15

Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg

20 25 30

Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

35 40 45

Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu

50 55 60

Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro

65 70 75 80

Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Gly Gly Gly Gly

85 90 95

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Gly Asn Gly

100 105 110

Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu

115 120 125

Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val

130 135 140

Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

145 150 155 160

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn

165 170 175

Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys

180 185 190

Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln Arg Gln

195 200 205

Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp

210 215 220

Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser Thr Gln

225 230 235 240

Ala

<210> 2

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgagtgata acggtccgca gaatcagcgt aatgccccgc gtattacctt tggtggtccg 60

agtgatagta ccggtagtaa tcagaatggc gaacgtagtg gtgcccgtag caaacagcgc 120

cgtccgcagg gtctgccgaa taataccgca tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180

aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240

gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagaggcg gcggcggtag tggtggcggt 300

ggtagtggcg gtggcggctc aatggcaggt aatggtggcg atgcagccct ggccctgctg 360

ctgctggatc gtctgaatca gctggaaagc aaaatgagtg gtaaaggtca gcagcagcag 420

ggtcagaccg tgaccaaaaa atcagccgcc gaagcaagcg gtggtggcgg tagcggcggt 480

ggtggtagtg gtggtggtgg cagtaaagat caggttattc tgctgaataa gcatattgat 540

gcctataaaa ccttcccgcc gaccgaaccg aaaaaagata aaaagaaaaa ggccgatgag 600

acccaggcac tgccgcagcg ccagaaaaaa cagcagaccg tgacactgct gccggcagca 660

gatctggatg attttagcaa acagctgcag cagagtatga gtagcgcaga tagtacccag 720

gcc 723

Claims

1.一种COVID-19重组抗原，其特征在于，具体为一种截短的N蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

2.与权利要求1所述的重组抗原相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为如下任一种：

(1)编码所述截短的N蛋白的核酸分子；

(2)含有(1)所述核酸分子的表达盒；

(3)含有(1)所述核酸分子，或(2)所述表达盒的重组载体；

(4)含有(1)所述核酸分子，或(2)所述表达盒，或(3)所述重组载体的重组菌株。

3.如权利要求2所述的生物材料，其特征在于，编码所述截短的N蛋白的核酸分子如序列表SEQ ID NO.2所示。

4.如权利要求2所述的生物材料，其特征在于，所述重组载体的表达载体包括但不限于pET28a。

5.如权利要求2所述的生物材料，其特征在于，所述重组菌株的宿主细胞包括但不限于E.coli BL21。

6.权利要求1所述截短的N蛋白在检测COVID-19或制备COVID-19检测产品中的应用。

7.权利要求2所述生物材料在检测COVID-19或制备COVID-19检测产品中的应用。

8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述检测产品包括但不限于试剂盒、检测卡、试纸。

9.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述检测产品以血清、全血、血浆、唾液或乳液为待检样品。

10.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，截短的N蛋白的检测抗体为IgG、IgM或IgA。