CN112225781A - 一种高效表达新型冠状病毒n蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于免疫技术领域，具体涉及一种高效表达新型冠状病毒N蛋白的方法。本发明按照2.0％‑3.0％的接种量将种子液接种至发酵培养基中，培养温度为35‑37℃，pH值维持在7.3‑7.5，维持溶氧水平在30％左右；当初始碳源耗尽后，根据溶氧反馈补料策略，溶氧水平升至50％‑60％时补加50％‑80％甘油溶液；溶氧水平降至20％‑30％时停止补加，如此反复；当细菌浓度达到1.0‑3.0时，加入0.3‑1mM IPTG进行诱导，且继续培养2h后，再次加入0.3mM IPTG进行二次诱导，总诱导为6‑8h。可以实现新冠病毒截短N蛋白的可溶性高效表达，能满足大规模生产可溶性新冠病毒N蛋白的需求。
Description
技术领域：
本发明属于免疫技术领域，具体涉及一种高效表达新型冠状病毒N蛋白的方法。
背景技术：
目前，“早发现早隔离”仍是应对新型冠状病毒感染的最有效措施，则这对检测技术提出了较高要求。目前临床主要通过肺部CT、样本核酸进行检测。肺部 CT只能确定病人疑似感染和病人肺部感染进程，核酸检测耗时较长，且易出现假阴性；同时，这些方法对检测人员和仪器要求高，不适宜早期诊断和大面积筛查。基于新型冠状病毒特异蛋白建立的血清学检测方法和抗原抗体检测方法，不仅具有成本低、速度快、灵敏度高等特点，而且可大幅降低漏诊率，也不需要昂贵的仪器和专业技术人员，适合早期大规模筛查。
N蛋白(Nucleocapsid Protein)是病毒的核衣壳蛋白，它具有两个RNA结合结构域起到保护基因组的作用。同时，N蛋白相对保守，在病毒的结构蛋白中所占比例最大，感染早期机体就能产生抗N蛋白的高水平抗体，可以利用N蛋白建立快速检测COVID-19血清抗体的方法。在我们前期研究中，通过新型冠状病毒N蛋白与SARS、MERS在内的另外6个感染人的冠状病毒及流感病毒等呼吸道感染病毒的基因序列分析及蛋白质同源性分析，得到新型冠状病毒截短的N 蛋白；该蛋白检测COVID-19具有敏感性高、特异性好，假阳性率明显降低等优点，其中，敏感性较全长N蛋白高出约60～100％，特异性达到98.57％。因此，提高该蛋白的表达水平对COVID-19检测试剂盒制备和COVID-19的大范围检测具有重要意义。
发明内容：
为了解决上述技术问题，本发明将提供一种高效表达截短N蛋白的发酵培养基及诱导表达方法，可以实现新冠病毒截短N蛋白的可溶性高效表达，能满足大规模生产可溶性新冠病毒N蛋白的需求。
所述截短的N蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；
编码所述截短的N蛋白的核酸分子如序列表SEQ ID NO.2所示；
所述的发酵培养基组成如下：葡萄糖3.0-7.0g/L、甘油5.0-15.0g/L、酵母粉7.5-12.5g/L、蛋白胨4.0-6.0g/L、KH2PO42.0-4.9g/L、(NH4)2SO43.0-5.0g/L、MgSO4 1.0-2.0g/L、FeSO4 0.1-0.2g/L、柠檬酸钠1.0-2.0g/L、VB110.0-15.0mg/L、VH3.0-5.0 mg/L、三甲基甘氨酸2.0-5.0g/L；pH7.3-7.5。
优选地，发酵培养基组成如下：葡萄糖5.0g/L、甘油10.0g/L、酵母粉10 g/L、蛋白胨5g/L、KH2PO4 3.0g/L、(NH4)2SO4 4.0g/L、MgSO4 1.5g/L、FeSO4 0.15g/L、柠檬酸钠2.0g/L、VB1 12.0mg/L、VH 5.0mg/L、三甲基甘氨酸3.0g/L； pH 7.5。
所述诱导表达方法具体为：
按照2.0％-3.0％的接种量将表达上述截短N蛋白菌种的种子液接种至发酵培养基中，培养温度为35-37℃，pH值维持在7.3-7.5，维持溶氧水平在30％左右；当初始碳源耗尽后，根据溶氧反馈补料策略，溶氧水平升至50％-60％时补加 50％-80％(w/v)甘油溶液；溶氧水平降至20％-30％时停止补加，如此反复；当细菌浓度达到1.0-3.0(OD600)时，加入0.3-1mmol/L IPTG进行诱导，且继续培养2h后，再次加入0.3mmol/L IPTG进行二次诱导，总诱导为6-8h。
优选地，按照2.0％的接种量将种子液接种至发酵培养基中，培养温度为37℃，利用25％氨水将pH值维持在7.5，调节搅拌转速和通气量维持溶氧水平在30％左右；当初始碳源耗尽后，根据溶氧反馈补料策略，溶氧水平升至50％时补加 50％(w/v)甘油溶液；溶氧水平降至20％时停止补加，如此反复；当细菌浓度达到2.0(OD600)时，加入0.3mmol/L IPTG进行诱导，且继续培养2h后，再次加入0.3mmol/L IPTG进行二次诱导，总诱导为6h。
有益效果：
本发明提供的用于检测COVID-19的重组N蛋白为血清学检测COVID-19 提供了一种新的选择，采用SEQ ID NO.1所示的截短N蛋白检测COVID-19具有敏感性高、特异性好，假阳性率明显降低等优点，其中，敏感性较全长N蛋白高出约60～100％，特异性达到98.57％，应用前景广泛。
采用本发明提供的诱导和表达方法，可溶性N蛋白表达水平较初始表达工艺提高了10倍以上。本发明可以实现新冠病毒N蛋白的可溶性高效表达，在50 L发酵罐中大规模培养后，细菌浓度、单位菌体N蛋白浓度以及N蛋白表达水平分别为14.32g/L、18.12mg/g、259.48mg/L，能满足大规模生产可溶性新冠病毒N蛋白的需求。
附图说明：
图1E.coli BL21-N菌株的双酶切鉴定
其中，M：DNA Marker，1：质粒，2：双酶切产物；
图2不同培养基种类对细菌浓度及N蛋白表达水平的影响；
图3补加碳源种类对细菌浓度及N蛋白表达水平的影响；
图4三甲基甘氨酸添加浓度对细菌浓度及N蛋白表达水平的影响；
图5诱导剂种类对细菌浓度及N蛋白表达水平的影响；
图6IPTG浓度对细菌浓度及N蛋白表达水平的影响；
图7诱导时间对细菌浓度及N蛋白表达水平的影响；
图8二次诱导时间对细菌浓度及N蛋白表达水平的影响；
图9应用本发明工艺与初始工艺进行N蛋白表达；
其中，图2-9中，(a)细菌湿重，(b)单位菌体可溶性N蛋白浓度，(c)单位体积可溶性N蛋白浓度。
图10不同浓度洗脱液洗脱N蛋白效果及浓缩后N蛋白鉴定其中，(a)M：蛋白Marker，1：纯化前，2：穿透液，3：50mM咪唑洗杂，4： 80mM咪唑洗杂，5：100mM咪唑洗脱(第一次)，6：100mM咪唑洗脱(第二次)，7：100mM咪唑洗脱(第三次)，8：150mM咪唑洗脱(第一次)，9：150mM咪唑洗脱(第二次)，10：150mM咪唑洗脱(第三次)，11：200mM咪唑洗脱(第一次)，12：200mM咪唑洗脱(第二次)；
(b)：M：蛋白Marker，1：浓缩后N蛋白。
具体实施方式：
为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。本发明所涉及的截短N蛋白，可根据氨基酸序列人工合成获得，也可通过基因工程的手段构建重组菌进行表达、分离和纯化获得。
SEQ ID NO.1所示的截短N蛋白，全长241个氨基酸，序列如下：
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTA SWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRGGGGSGGGGS GGGGSMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEA SGGGGSGGGGSGGGGSKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQAL PQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA。
实施例涉及的部分测定和实验方法如下：
(1)细菌浓度测定：取发酵液稀释一定倍数后，利用分光光度计在600nm 处测定吸光值，其吸光值在0.2-0.9之间；然后，将吸光值诚意稀释倍数得到细菌浓度。
(2)细菌湿重测定：取50mL发酵液5000rpm离心10min，收集菌体，利用灭菌后生理盐水洗涤2次后，经5000rpm离心10min，收集菌体并称重，计算单位体积细菌湿重(g/L)。
(3)细菌破碎：取5.0g菌泥(湿重)溶于50.0mL灭菌的PBS溶液中混匀，利用细胞破碎仪6Hz破碎30min。
(4)可溶性N蛋白浓度测定：收集细菌破碎后上清液，使用His亲和层析 Ni柱，利用不同浓度咪唑PBS缓冲液进行进行纯化；收集纯化后N蛋白，利用 NANODROP 2000测定A280值，得出单位菌泥N蛋白浓度(mg/g)、单位体积 N蛋白浓度(mg/L)。
以下将通过具体实施方式对本发明作进一步的解释说明。
实施例1：N蛋白表达菌株E.coli BL21-N的构建
1、N蛋白编码基因的设计
本研究对新冠病毒关键基因N蛋白编码基因(NCBI编号YP_009724397.2) 与包括SARS、MERS在内的另外6个感染人的冠状病毒及流感病毒等呼吸道感染病毒做了基因及蛋白质同源性分析，新冠病毒N蛋白与SARS N蛋白的同源性为91.2％，与MERS N蛋白的同源性为47.6％，与其它病毒N蛋白的同源性在8.8％-33.5％之间。我们裁剪了新冠病毒N蛋白基因与其它病毒特别是不发病、或只导致轻微感冒病毒N基因的同源序列，取特异性序列多段拼接的新冠病毒的N蛋白编码基因，优化后的新冠病毒N蛋白提高了抗体反应特异性。
裁剪部分同源序列多段拼接后的N蛋白氨基酸序列为：
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASW FTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRGGGGSGGGGSGG GGSMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASG GGGSGGGGSGGGGSKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQ RQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA。
2、质粒pET28a-N的构建及其转化
将SEQ ID NO.2所示的截短的N蛋白编码基因与质粒pET28a连接，连接产物克隆转化得到重组质粒pET28a-N。把pET28a-N加入装有E.coli BL21感受态细胞的EP管中，冰浴30min，42℃热击90s，再冰浴2min，然后加入700μL无抗性LB液体培养基，37℃摇床培养45min1小时，涂布卡那霉素抗性平板，置 37℃培养箱过夜培养。
3、表达菌株E.coli BL21-N的鉴定
挑取卡那霉素抗性平板上单菌落，加入LB液体培养基，置37℃摇床180rpm 过夜培养；利用OMEGA质粒提取试剂盒，按照说明书步骤提取质粒；然后，对提取的质粒进行酶切鉴定(酶切条件：XhoI-HF 0.8μL，ApaI-HF 0.8μL，N DNA 4μL，Cut smart 2μL，dH2O 12.4μL。加好后置37℃水浴30min)。
对双酶切产物进行琼脂糖电泳鉴定，结果如图1所示。由图1可知，双酶切产物片段大小约为1787bp，与理论值一致，则说明成功构建得到用于重组N蛋白表达的菌株E.coliBL21-N。
实施例2：本发明新型冠状病毒截短N蛋白表达培养基的筛选
1.材料
1.1菌株：新型冠状病毒N蛋白表达菌株E.coli BL21-N；
1.2培养基
1.2.1种子培养基：LB培养基(酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 10g/L)； pH值利用4mmol/L NaOH溶液调节至7.5。
1.2.2发酵培养基
(1)培养基I：酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L；pH值利用4mmol/LNaOH溶液调节至7.5。
(2)培养基II：葡萄糖5.0g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨5g/L、KH2PO4 3.0 g/L、(NH4)2SO4 4.0g/L、MgSO4 1.5g/L、FeSO4 0.15g/L；pH值利用4mmol/L NaOH溶液调节至7.5。
(3)培养基III：葡萄糖5.0g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨5g/L、KH2PO4 3.0 g/L、(NH4)2SO4 4.0g/L、MgSO4 1.5g/L、FeSO4 0.15g/L、柠檬酸钠2.0g/L、VB1 12.0mg/L；pH值利用4mmol/L NaOH溶液调节至7.5。
(4)培养基IV：葡萄糖5.0g/L、甘油10.0g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨5 g/L、KH2PO43.0g/L、(NH4)2SO4 4.0g/L、MgSO4 1.5g/L、FeSO4 0.15g/L、柠檬酸钠2.0g/L、VB1 12.0mg/L、VH 5.0mg/L、三甲基甘氨酸2.0g/L；pH值利用4 mmol/L NaOH溶液调节至7.5。
2.方法
2.1种子培养：挑取E.coli BL21-N单菌落，接种至装有200mL种子培养基的1000mL三角瓶中，37℃、180rpm，培养10h。
2.2发酵培养：按照2.0％接种量将种子液接种至装有6L发酵培养及的10L发酵罐中，培养温度为37℃，利用25％氨水将pH值维持在7.5，调节搅拌转速和通气量维持溶氧水平在30％左右；当初始碳源耗尽后，根据溶氧反馈补料策略，溶氧水平升至50％时补加50％(w/v)葡萄糖溶液；溶氧水平降至20％时停止补加，如此反复。当细菌浓度达到1.0(OD600)左右时，加入0.5mmol/L IPTG进行诱导，诱导6h。
3.结果
3.1培养基种类的筛选
分别采用四种发酵培养基进行新冠病毒N蛋白表达，细菌浓度及N蛋白表达水平如图2所示。
由图2可知，不同培养基组分影响细菌浓度及N蛋白的表达水平。利用培养基I时，细菌浓度、单位菌体N蛋白浓度及N蛋白表达水平分别为3.45g/L、 5.72mg/g、19.73mg/L；利用培养基IV时，细菌浓度及N蛋白表达水平均最高，细菌浓度、单位菌体N蛋白浓度及N蛋白表达水平分别为9.31g/L、9.53mg/g、 88.72mg/L。
3.2补料碳源种类筛选
在发酵过程中，当培养基中初始碳源耗尽后，根据溶氧反馈控制补料策略，溶氧水平升至50％时分别补加50％(w/v)葡萄糖或甘油溶液；溶氧水平降至20％时停止补加，如此反复；进行N蛋白表达，细菌浓度及N蛋白表达水平如图3 所示。
由图3可知，在N蛋白表达过程中，补加甘油的细菌浓度及N蛋白表达水平均高于补加葡萄糖的。补加葡萄糖时，细菌浓度、单位菌体N蛋白浓度及N 蛋白表达水平分别为9.45g/L、9.67mg/g、91.38mg/L；补加甘油时，细菌浓度、单位菌体N蛋白浓度及N蛋白表达水平分别为10.78g/L、11.23mg/g、121.06 mg/L。
3.3三甲基甘氨酸添加浓度的筛选
分别向发酵培养基中添加1.0g/L、2.0g/L、3.0g/L以及5.0g/L三甲基甘氨酸进行N蛋白表达，细菌浓度及N蛋白表达水平如图4所示。
由图4可知，随着三甲基甘氨酸添加浓度增加，细菌浓度及N蛋白表达水平升高；且三甲基甘氨酸添加浓度为3.0g/L和5.0g/L时，细菌浓度和N蛋白表达水平无显著差异，则选用三甲基甘氨酸添加浓度为3.0g/L进行N蛋白表达为宜。当三甲基甘氨酸添加浓度为3.0g/L时，细菌浓度、单位菌体N蛋白浓度及 N蛋白表达水平分别为12.32g/L、13.26mg/g、163.36mg/L。
4.结论
通过不同培养基组分筛选，本发明中培养基IV利于新冠病毒N蛋白可溶性表达，且在发酵过程中根据溶氧反馈控制补料策略，溶氧水平升至50％时补加 50％(w/v)甘油溶液；溶氧水平降至20％时停止补加，如此反复补加甘油，并将三甲基甘氨酸的添加浓度调整为2.0-5.0g/L(优选3.0g/L)。
实施例3：新型冠状病毒N蛋白表达诱导策略的筛选
1.材料
1.1菌株：新型冠状病毒N蛋白表达菌株E.coli BL21-N。
1.2本实验所用培养基
1.2.1种子培养基：LB培养基(酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 10g/L)；pH值利用4mmol/L NaOH溶液调节至7.5。
1.2.2发酵培养基：葡萄糖5.0g/L、甘油10.0g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨5g/L、KH2PO4 3.0g/L、(NH4)2SO4 4.0g/L、MgSO4 1.5g/L、FeSO4 0.15g/L、柠檬酸钠2.0 g/L、VB112.0mg/L、VH 5.0mg/L、三甲基甘氨酸3.0g/L；pH值利用4mmol/L NaOH溶液调节至7.5。
2.方法
2.1种子培养：挑取E.coli BL21-N单菌落，接种至装有200mL种子培养基的1000mL三角瓶中，37℃、180rpm，培养10h。
2.2发酵培养：按照2.0％接种量将种子液接种至装有6L发酵培养及的10L发酵罐中，培养温度为37℃，利用25％氨水将pH值维持在7.5，调节搅拌转速和通气量维持溶氧水平在30％左右；当初始碳源耗尽后，根据溶氧反馈补料策略溶氧水平升至50％时补加50％(w/v)甘油溶液；溶氧水平降至20％时停止补加，如此反复。根据不同的诱导策略，在不同培养时间添加一定的诱导剂诱导N蛋白表达，并测定此过程中的细菌浓度、湿重、及可溶性N蛋白浓度。
3.结果
3.1诱导剂种类的筛选
在细菌浓度生长至1.0时，分别加入IPTG(0.5mmol/L)和乳糖(10.0g/L) 诱导N蛋白表达，诱导6h时细菌浓度和N蛋白表达水平如图5所示。
由图5可知，利用IPTG诱导时的细菌浓度低于利用利用乳糖诱导时，单位菌体N蛋白浓度及N蛋白表达水平均高于利用乳糖时。利用IPTG诱导时，细菌浓度、单位菌体N蛋白浓度及N蛋白表达水平分别为12.36g/L、13.29mg/g、 164.26mg/L；利用乳糖诱导时，细菌浓度、单位菌体N蛋白浓度及N蛋白表达水平分别为14.53g/L、8.47mg/g、123.07mg/L。因此，采用IPTG诱导N蛋白表达更为适宜。
3.2 IPTG添加浓度筛选
在细菌浓度生长至1.0时，分别加入0.1mmol/L、0.3mmol/L、0.5mmol/L 以及1.0mmol/L IPTG诱导N蛋白表达，诱导6h时细菌浓度和N蛋白表达水平如图6所示。
由图6可知，采用不同浓度IPTG诱导N蛋白表达时，对细菌浓度无明显影响；当ITPG添加浓度高于0.3mmol/L时，单位菌体N蛋白浓度及N蛋白表达水平无显著增加，则确定IPTG的添加浓度为0.3-1mmol/L。当采用0.3mmol/L IPTG诱导N蛋白表达时，细菌浓度、单位菌体N蛋白浓度及N蛋白表达水平分别为12.45g/L、13.32mg/g、165.83mg/L。
3.3诱导时间的选择
当细菌浓度(OD600)生长至0.5、1.0、2.0及3.0时，分别加入0.3mmol/L IPTG 诱导N蛋白表达，诱导6h时细菌浓度和N蛋白表达水平如图7所示。
由图7可知，IPTG添加时间影响细菌浓度和N蛋白表达水平。选择细菌浓度生长至1-3时添加IPTG诱导N蛋白表达。当细菌浓度生长至2.0诱导时，细菌浓度、单位菌体N蛋白浓度及N蛋白表达水平均最高，分别为14.26g/L、13.48 mg/g、192.23mg/L。
3.4二次诱导时间的选择
在细菌浓度生至2.0时，加入0.3mmol/L IPTG后，分别在以后的1h、2h 以及3h再次加入0.3mmol/L IPTG进行二次诱导，细菌浓度和N蛋白表达水平如图8所示。
由图8可知，继第一次添加IPTG后，再次添加IPTG进行二次诱导时，会提高单位菌体N蛋白浓度和N蛋白表达水平，但二次诱导对细菌浓度没有显著影响。第二次添加IPTG的时间影响N蛋白表达水平。在第一次诱导后2h时，再次添加IPTG诱导的细菌浓度、单位菌体N蛋白浓度以及N蛋白表达水平均最高，分别为14.38g/L、18.16mg/g、261.14mg/L。
4.结论
在优化N蛋白表达培养基的基础上，通过N蛋白表达诱导策略筛选，确定在细菌浓度达到1.0-3.0(优选2.0)时添加0.3-1mmol/L(优选0.3mmol/L)IPTG 进行诱导，且在第一次添加IPTG后2h时再次添加0.3mmol/L IPTG。在优选条件下，细菌浓度、单位菌体N蛋白浓度以及N蛋白表达水平分别为14.38g/L、 18.16mg/g、261.14mg/L。
实施例4：新型冠状病毒N蛋白高效表达工艺放大及与初始表达工艺比较
1.材料
1.1菌株：新型冠状病毒N蛋白表达菌株E.coli BL21-N。
1.2培养基
1.2.1种子培养基：LB培养基(酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 10g/L)； pH值利用4mmol/L NaOH溶液调节至7.5。
1.2.2发酵培养基
(1)本发明所用培养基：葡萄糖5.0g/L、甘油10.0g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨5g/L、KH2PO4 3.0g/L、(NH4)2SO4 4.0g/L、MgSO4 1.5g/L、FeSO4 0.15 g/L、柠檬酸钠2.0g/L、VB112.0mg/L、VH 5.0mg/L、三甲基甘氨酸3.0g/L；pH值利用4mmol/L NaOH溶液调节至7.5。
(2)初始生产工艺所用培养基：酵母粉5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0 g/L；pH值利用4mmol/L NaOH溶液调节至7.5。
2.方法
2.1种子培养：挑取E.coli BL21-N单菌落，接种至装有200mL种子培养基的1000mL三角瓶中，37℃、180rpm，培养10h。
2.2发酵培养
(1)本发明表达工艺：按照2.0％接种量将种子液接种至装有6L种子培养基的10L发酵罐中，37℃、pH值维持在7.5，溶氧水平控制在30％左右；培养 6h，作为二级种子。按照2.0％的接种量将二级种子液接种至装有40L发酵培养基的50L发酵罐中，培养温度为37℃，利用25％氨水将pH值维持在7.5，调节搅拌转速和通气量维持溶氧水平在30％左右；当初始碳源耗尽后，根据溶氧反馈补料策略，溶氧水平升至50％时补加50％(w/v)甘油溶液；溶氧水平降至20％-30％时停止补加，如此反复。当细菌浓度达到2.0(OD600)时，加入0.3mmol/LIPTG 进行诱导，且继续培养2h后，再次加入0.3mmol/L IPTG进行二次诱导，总诱导为6h。
(2)初始表达工艺：按照2.0％接种量将种子液接种至装有6L种子培养基的10L发酵罐中，37℃、pH值维持在7.5，溶氧水平控制在30％左右；培养6h，作为二级种子。按照2.0％的接种量将二级种子液接种至装有40L发酵培养基的 50L发酵罐中，培养温度为37℃，利用25％氨水将pH值维持在7.5，调节搅拌转速和通气量维持溶氧水平在30％左右；当初始碳源耗尽后，根据溶氧反馈补料策略补加50％(w/v)葡萄糖溶液。当细菌浓度达到1.0(OD600)左右时，加入 0.5mmol/L IPTG进行诱导，诱导6h。
3.结果
采用本发明N蛋白表达工艺和初始表达工艺在50L发酵罐上进行N蛋白表达，细菌浓度和N蛋白表达水平如图9所示。
由图9可知，经本发明得到的N蛋白高效表达工艺可在50L发酵罐上成功规模化放大，且细菌浓度、单位菌体N蛋白浓度及N蛋白表达水平较初始表达工艺均有大幅提高。利用本发明专利表达工艺，细菌浓度、单位菌体N蛋白浓度以及N蛋白表达水平分别为14.32g/L、18.12mg/g、259.48mg/L，这分别是初始表达工艺的4.07倍、3.15倍、12.79倍。
4.结论
通过培养基组分和诱导策略筛选，利用含有3.0g/L三甲基甘氨酸的发酵培养基IV，在发酵过程中补加甘油；且细菌浓度为2.0时添加0.3mmol/L IPTG，并在第一添加IPTG后2h时再次添加0.3mmol/L IPTG进行二次诱导，实现了N 蛋白高效表达。同时，该可溶性新冠病毒N蛋白高效表达工艺可在50L发酵罐上成功规模化应用，并与初始表达工艺相比，可溶性N蛋白的表达水平提高了 10倍以上。
实施例5：纯化后N蛋白用于新型冠状病毒肺炎抗体检测
1、可溶性N蛋白的纯化及浓缩
收集诱导表达后的菌泥，利用超声破碎后，取破碎后上清，截短N蛋白上有His标签，使用His亲和层析Ni柱进行纯化。使用5mM咪唑PBS缓冲液进行平衡，依次用50mM和80mM咪唑PBS缓冲液洗杂；然后，依次用100mM、 150mM和200mM咪唑PBS缓冲液洗脱，各收集3个柱体积的洗脱液。
利用SDS-PAGE凝胶电泳测定不同浓度洗脱液下N蛋白洗脱效果(图10(a))；并测定洗脱液中N蛋白浓度，收集含有高纯度N蛋白的洗脱液进行浓缩，且测定浓缩后N蛋白纯度(图10(b))。
由图10(a)可知，采用100mM咪唑洗脱(第一次)、100mM咪唑洗脱(第二次)、100mM咪唑洗脱(第三次)、150mM咪唑洗脱(第一次)洗脱N蛋白的效果较好，且其浓度分别为0.773mg/mL、0.975mg/mL、0.807mg/mL、1.166 mg/mL。
收集以上4管洗脱液进行浓缩，N蛋白浓度浓缩至1.50mg/mL，并经分析，浓缩后N蛋白纯度达到90％以上(图10(b))。
2、检测新冠病毒病人血清，做敏感性分析
将收集的截短N蛋白进行稀释，分别采用0.2μg/mL的截短N蛋白和全长 N蛋白包被酶标板，采用间接ELISA检测新冠病人血清。
具体操作步骤为：含0.05％吐温20的磷酸缓冲液10倍稀释血清样本后加样 100微升，37℃避光反应30分钟后，用含0.05％吐温20的磷酸缓冲液洗涤5次，每次30秒，加入100μL用含0.05％吐温20的磷酸缓冲液5000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG，37℃避光反应30分钟后，用含0.05％吐温20的磷酸缓冲液洗涤5次，每次30秒，加入100μl单组份TMB显色液避光反应10min，加入100μL浓度为1mol/L的硫酸终止反应，于酶标仪读取450nm和630nm 波长OD值。
按临界值为2.1倍的阴性样本平均值标准设定临界值为OD值0.15，OD值小于0.15的血清样本为阴性，OD值大于等于0.15的血清样本为阳性，表1为新冠病人血清的ELISA检测OD值，分析敏感性及检出率。
表1新冠病人血清的ELISA检测OD值
检测数据显示，截短N蛋白敏感性明显高于全长N蛋白，依截短N蛋白检出OD值减去全长N蛋白检出OD值比上全长N蛋白检出OD值标准，统计得敏感性高约60～100％，但检出率较全长N蛋白低，截短N蛋白10份病人样本检出6份，检出率60％，全长N蛋白10份病人样本检出8份，检出率80％，分析截断N蛋白删减部分同源性位点影响了新冠病人样本的检出率。
3、检测正常人血清，做特异性分析
将收集的截短N蛋白进行稀释，分别采用0.2μg/mL的截短N蛋白和全长 N蛋白包被酶标板，采用间接ELISA检测正常人血清。
具体操作步骤为：用含0.05％吐温20的磷酸缓冲液10倍稀释血清样本后加样100微升，37℃避光反应30分钟后，用含0.05％吐温20的磷酸缓冲液洗涤5 次，每次30秒，加入100μl用含0.05％吐温20的磷酸缓冲液5000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG，37℃避光反应30分钟后，用含0.05％吐温 20的磷酸缓冲液洗涤5次每次30秒，加入100μl单组份TMB显色液避光反应10分钟，加入100μl浓度为1摩尔的硫酸终止反应，于酶标仪读取450nm 和630nm波长OD值。
按临界值为2.1倍的阴性样本平均值标准设定临界值为OD值0.15，OD值小于0.15的血清样本为阴性，OD值大于等于0.15的血清样本为阳性，正常人血清的ELISA检测OD值如表2所示，分析敏感性及检出率。
表2正常人血清的ELISA检测OD值
检测数据显示，截短N蛋白特异性明显高于全长N蛋白，检测正常人血清 350份，全长N蛋白检出31份假阳性，特异性91.14％，截短N蛋白检出5份假阳性，特异性98.57％，且数值分析显示截短N蛋白检出均为弱阳性，大都可通过优化调试避免掉，而全长N蛋白存在大量强阳性或中阳性，很难有效避免。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。
序列表
<110> 清源生物（深圳）有限公司
山东省滨州畜牧兽医研究院
滨州医学院附属医院
清源之光（武汉）生物科技有限公司
<120> 一种高效表达新型冠状病毒N蛋白的方法
<130> 1
<141> 2020-09-03
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 1
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
20 25 30
Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
35 40 45
Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu
50 55 60
Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro
65 70 75 80
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Gly Gly Gly Gly
85 90 95
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Gly Asn Gly
100 105 110
Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu
115 120 125
Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val
130 135 140
Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Asp Gln Val Ile Leu Leu Asn
165 170 175
Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro Lys Lys
180 185 190
Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln Arg Gln
195 200 205
Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu Asp Asp
210 215 220
Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser Thr Gln
225 230 235 240
Ala
<210> 2
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
atgagtgata acggtccgca gaatcagcgt aatgccccgc gtattacctt tggtggtccg 60
agtgatagta ccggtagtaa tcagaatggc gaacgtagtg gtgcccgtag caaacagcgc 120
cgtccgcagg gtctgccgaa taataccgca tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180
aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240
gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagaggcg gcggcggtag tggtggcggt 300
ggtagtggcg gtggcggctc aatggcaggt aatggtggcg atgcagccct ggccctgctg 360
ctgctggatc gtctgaatca gctggaaagc aaaatgagtg gtaaaggtca gcagcagcag 420
ggtcagaccg tgaccaaaaa atcagccgcc gaagcaagcg gtggtggcgg tagcggcggt 480
ggtggtagtg gtggtggtgg cagtaaagat caggttattc tgctgaataa gcatattgat 540
gcctataaaa ccttcccgcc gaccgaaccg aaaaaagata aaaagaaaaa ggccgatgag 600
acccaggcac tgccgcagcg ccagaaaaaa cagcagaccg tgacactgct gccggcagca 660
gatctggatg attttagcaa acagctgcag cagagtatga gtagcgcaga tagtacccag 720
gcc 723
Claims (5)
1.一种高效表达截短N蛋白的方法，其特征在于，所述截短的N蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的一种高效表达截短N蛋白的方法，其特征在于，采用的发酵培养基组成如下：葡萄糖3.0-7.0g/L、甘油5.0-15.0g/L、酵母粉7.5-12.5g/L、蛋白胨4.0-6.0g/L、KH2PO42.0-4.9g/L、(NH4)2SO43.0-5.0g/L、MgSO4 1.0-2.0g/L、FeSO4 0.1-0.2g/L、柠檬酸钠1.0-2.0g/L、VB110.0-15.0mg/L、VH3.0-5.0mg/L、三甲基甘氨酸2.0-5.0g/L；pH7.3-7.5。
3.如权利要求2所述的一种高效表达截短N蛋白的方法，其特征在于，采用的发酵培养基组成如下：葡萄糖5.0g/L、甘油10.0g/L、酵母粉10g/L、蛋白胨5g/L、KH2PO4 3.0g/L、(NH4)2SO4 4.0g/L、MgSO4 1.5g/L、FeSO4 0.15g/L、柠檬酸钠2.0g/L、VB1 12.0mg/L、VH5.0mg/L、三甲基甘氨酸3.0g/L；pH 7.5。
4.如权利要求2所述的一种高效表达截短N蛋白的方法，其特征在于，所采用的诱导培养方法为：按照2.0％-3.0％的接种量将表达权利要求1所述截短N蛋白的菌种的种子液接种至发酵培养基中，培养温度为35-37℃，pH值维持在7.3-7.5，维持溶氧水平在30％左右；当初始碳源耗尽后，根据溶氧反馈补料策略，溶氧水平升至50％-60％时补加50％-80％甘油溶液；溶氧水平降至20％-30％时停止补加，如此反复；当细菌浓度达到OD600为1.0-3.0时，加入0.3-1mmol/L IPTG进行诱导，且继续培养2h后，再次加入0.3mmol/L IPTG进行二次诱导，总诱导为6-8h。
5.如权利要求4所述的一种高效表达截短N蛋白的方法，其特征在于，所采用的诱导培养方法为：按照2.0％的接种量将种子液接种至发酵培养基中，培养温度为37℃，利用25％氨水将pH值维持在7.5，调节搅拌转速和通气量维持溶氧水平在30％左右；当初始碳源耗尽后，根据溶氧反馈补料策略，溶氧水平升至50％时补加50％甘油溶液；溶氧水平降至20％时停止补加，如此反复；当细菌浓度达到OD600为2.0时，加入0.3mmol/L IPTG进行诱导，且继续培养2h后，再次加入0.3mmol/L IPTG进行二次诱导，总诱导为6h。
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