CN101921799B - 马血清淀粉样蛋白a1制备方法及表达载体和基因工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种可溶的基因工程马血清淀粉样蛋白A1(hoSAA1)的制备方法，及其表达载体和基因工程菌。本发明提供的表达载体为含有hoSAA1基因序列的质粒载体pET28a(+)，并且hSAA1编码序列位于pET28a(+)载体上Nde I和HindIII酶切位点之间。本发明提供的基因工程菌是大肠杆菌，为pET28a(+)-hoSAA1/Rosetta-gami，可表达可溶性目的蛋白。本发明制备方法采用镍交联亲和柱一步法，且用两次不同浓度的咪唑(imidazole)进行洗涤亲和柱，操作简便、得率高、耗时短，适于工业化大规模生产。

Description

马血清淀粉样蛋白A1制备方法及表达载体和基因工程菌

技术领域

本发明涉及利用DNA重组技术生产蛋白质或多肽的领域，更具体地，本发明涉及基因工程制备马血清淀粉样蛋白A1(serum amyloid A1，hoSAA1)的方法，还涉及有关的表达载体和工程菌。

背景技术

血清淀粉样蛋白A1(serum amyloid A，SAA1)是一种急性期反应载脂蛋白，是由同一簇基因编码的一组多形性蛋白。主要由肝细胞合成。其N端的特异性结合区与高密度脂蛋白(HDL)形成SAA1-HDL颗粒，进而调节高密度脂蛋白的代谢，以增强与巨噬细胞亲和力并输送脂质至炎症部位，SAA1是有效的中性粒细胞激活剂，增强中性粒细胞的抗菌作用、抑制霉菌感染。另外，SAA1还表现出细胞因子的相似特性，可以诱发白介素1b(IL1b)产生。同样，SAA1还上调T淋巴细胞分泌干扰素。SAA1能减少金属蛋白酶的产生，从而引导组织损伤修复。

一般在临床上，人和其他一些哺乳动物均采用CRP(C-反应蛋白)作为炎症的重要生物检测指标，但马的CRP在炎症反应的临床检测中并不是主要的检测指标，这是因为CRP在正常马血清中存在较高的浓度，同时CRP相对于感染时期存在着一定的滞后性，即当马被感染后4-6天才能在病马体内发现其有2-4倍的差异，并且在病马的恢复期，CRP也下降的很慢。

马血清淀粉样蛋白A1(hoSAA1)，分子量约12KD-14KD左右；是一个多态性蛋白，由几个相关的蛋白家族(SAA1-SAA13)组成。相对于CRP而言，hoSAA1对刺激更敏感、更准确。在细菌或病毒感染早期(一般感染后48小时)，SAA1受到白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNFα)等炎症因子刺激，在肝细胞中大量合成，在病马血清中含量有时可达正常浓度的400多倍(正常值一般小于7毫克/升)。同时hoSAA1在病马体内浓度在感染后3-4天开始快速下降，5天以后基本与正常马的血清浓度相近，其中没有反馈升高。可见，SAA1更适合作为病马炎症的生物检测指标，及时准确反应病马的感染及康复情况。因此，hoSAA1的临床应用和意义受到了极大的关注。

同样在马的一些相关疾病的诊断和治疗研究中，SAA1蛋白作为重要的生物指标也有报道，如Toru ANZAI等报道了有关赛马中肺炎引起的血清中SAA1增高(肺炎是引起赛马死亡的主要原因)；Thoefiner MB等报道的病马手术后因细菌感染引起的血清中SAA1增高；Nanni.S等报道的有关患关节炎病马血清SAA1的增高等，由于SAA1在应急反应中早期性、高度敏感性、以及其与多种疾病的相关性，因此在临床上检测马血清中的SAA1含量具有很高的诊断价值。

鉴于hoSAA1在临床治疗及诊断中的重要性，目前国外对hoSAA1的研究越来越重视。但是由于hoSAA1在体内大部分是与HDL结合形成脂结合蛋白，因此对体内的SAA1进行分离纯化有较大的难度。同时，关于hoSAA1蛋白的体外表达，国内外均没有相关文献及专利进行报道。

目前体外表达SAA1蛋白普遍使用两种表达系统：大肠杆菌和昆虫表达系统，分别用于表达重组人GST-SAA1及rSAA1蛋白。其次，对于体外重组表达及纯化SAA1，由于其蛋白的特性，比如容易体外聚集、表达量低等特性，存在表达获得的可溶性蛋白少，纯化方法复杂等缺点，这些缺点长期以来一直限制了SAA1体外研究的进一步开展。另外，通过以上两种方法获得的大多数重组SAA1蛋白均为包涵体，在纯化过程中必须使用6M尿素或盐酸胍对纯化目的蛋白采取变复性等复杂手段，由此纯化获得的重组蛋白生物活性较低，并且活性不稳定。此外，该纯化方法耗时长、得率低、成本高、不利于大量生产。

本发明克服以上技术缺陷，通过基因重组技术体外表达并纯化获得高纯度的hoSAA1蛋白。通过基因人工合成的方法，去除了hoSAA1前体蛋白的N-端的20个氨基酸，并在N-端加上多聚组氨酸(6x His)亲和肽标记，进而用大肠杆菌Rosetta-gami作为宿主菌，获得了可溶的目的蛋白。既避免纯化反应中的变复性步骤，又最大可能地还原hoSAA1蛋白在体内的折叠结构，保持其有效的生物活性。又通过使用多聚组氨酸来简化其纯化方法，且纯化得率很高。

发明内容

本发明的目的就是提供一种在大肠杆菌中表达可溶，并能通过亲和柱高效制备重组hoSAA1的方法，及其有关的表达载体和工程菌。

本发明提供一种马血清淀粉样蛋白A1(hoSAA1)的基因工程表达载体，该载体含有马血清淀粉样蛋白A1(hoSAA1)基因序列的质粒载体pET28a(+)，并且hoSAA1编码序列位于pET28a(+)载体上NdeI和HindIII酶切位点之间。

本发明还提供一种基因工程菌，它是大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta-gami，并被本发明所述的表达载体所转化，该基因工程菌为pET28a(+)-hoSAA1/Rosetta-gami。

本发明还提供一种克隆、表达、纯化马血清淀粉样蛋白A1(hoSAA1)的基因工程方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将hoSAA1基因克隆于pBluescriptII载体；

(2)hoSAA1基因的亚克隆：

①将获得的pBluescriptII-hoSAA1载体转化到DH5a宿主菌中，筛选并提取包含目的DNA片段的质粒；

②然后经双酶切并通过琼脂糖凝胶电泳分离目的DNA片段；

③用胶回收试剂盒纯化目的DNA片段后，直接定向连接到pET-28a(+)载体上；

④将连接产物转化到DH5a宿主菌中，提取质粒，用NdeI和HindIII双酶切；

⑤得到目的基因；

(3)培养和表达基因工程菌pET28a(+)-hoSAA1/Rosetta-gami；

(4)离心收集基因工程菌；

(5)融合蛋白SAA1的亲和柱纯化；

(6)透析除盐，得到可溶性目的蛋白，鉴定目的蛋白。

本发明通过基因重组技术体外表达并纯化获得高纯度的hoSAA1蛋白。本发明的制备方法以大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta-gami为宿主菌，所述载体选用含有hoSAA1基因序列的质粒载体pET28a(+)，且hoSAA1编码序列位于pET28a(+)载体上NdeI和HindIII酶切位点之间。通过基因人工合成的方法，针对hoSAA1的成熟肽进行克隆重组，去除了hoSAA1前体蛋白的N-端的20个氨基酸，并在其N端加上6个多聚组氨酸(6xHis)亲和多肽标记，构成hoSAA1-6His融合蛋白，进而用大肠杆菌Rosetta-gami作为宿主菌，通过镍亲和柱一步纯化法，且用两次不同浓度的洗涤液进行亲和柱的洗涤，获得可溶性的目的蛋白。

本发明首次采用多聚组氨酸融合表达载体(PET28a)来表达去除信号肽后的hoSAA1蛋白的技术方案，在国内外尚未见有报道。

本发明的有益效果在于：一是可以在大肠杆菌内表达大量可溶的hoSAA1蛋白；二是可利用融合蛋白的N端的6个多聚组氨酸多肽的纯化标记，简便高效的纯化获得高纯度的重组hoSAA1，有利于后续的纯化工艺。同时，本发明利用融合蛋白N端的6个多聚组氨酸多肽的纯化标记能简便，快速制备高纯度的hoSAA1蛋白，得到纯度90％以上的hoSAA1蛋白，这一发明内容作为hoSAA1重组蛋白的纯化工艺，在国内外也属首次报道。

本发明所述的目的基因亚克隆，是指对已经获得的目的DNA片段进行重新克隆，其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或者进行重组改造等。基因亚克隆的基本过程包括：(1)目的DNA片段和载体的制备；(2)目的DNA片段和载体的连接；(3)连接产物的转化；(4)重组子筛选。

本发明的镍亲和柱一步纯化法，纯化步骤简单，所需时间短，纯化全程时间较短，优选的纯化全程时间为4-6小时。纯化优化全程时间与纯化的菌液体积的关系一般为：1升(1L)的表达菌液，纯化时间需4小时左右。

本发明所述的“SAA1前体蛋白”，是指由SAA 1cDNA编码，在细胞内合成的，未切除信号肽的SAA全长蛋白。本发明所述的“SAA1的成熟肽”，是指在细胞内切除信号肽，分泌到血清中，具有生物功能的SAA1蛋白。

本发明所述的“镍亲和柱一步纯化法”，是指只通过一根镍亲和柱，通过合适方法，直接从亲和柱上获得所需要的目的蛋白。不需要依赖其他方法，也不需要依赖其他试剂再进一步纯化。

本发明的亲和柱的洗涤是采用两次不同浓度洗涤液的洗涤方法，改进了常规技术中原核表达系统的一次洗涤方式，得到产物更纯。更优选的是，所述两次不同浓度的洗涤液分别为10mM咪唑，30mM咪唑。

本发明的有益效果在于：(1)采用本发明方法修饰表达的hoSAA1蛋白为可溶性成熟蛋白，避免纯化反应中的变复性步骤，且最大可能性地还原hoSAA1蛋白在体内的折叠结构，保持其有效的生物活性；(2)多聚组氨酸的使用可以简化其纯化方法，且纯化得率很高。通过镍亲和柱一步纯化的方法，在1升工程菌液中可获得高达12mg以上的可溶性重组hoSAA1蛋白。

附图说明

图1：pET28a(+)-hoSAA1重组表达质粒的酶切鉴定；其中，M：DNA ladder；1-14：双酶切鉴定的不同克隆质粒，限制性内切酶为NedI、HindIII；

图2：pET28a-hoSAA1亚克隆方法示意图；

图3：PET28a-hoSAA1重组质粒图谱；

图4：15％的SDS-PAGE检测最终获得的重组蛋白；

图5：蛋白印迹(Western blot)试验；

图6：纯化蛋白的质谱上蛋白分子量分析。hoSAA1蛋白质分子量经质谱分析仪测定为：14.2KD。

具体实施方式

以下结合实施例和附图，来进一步阐述本发明。以下各实施例是为说明本发明而非为限制本发明范围。

实施例1hoSAA1编码基因的克隆、构建重组表达质粒pET28a(+)-hoSAA1

基因克隆、质粒构建的步骤如下：

(1)hoSAA1基因，如SEQ ID NO.1所示的，由Invitrogen公司合成，并克隆于pBluescriptII载体中；

(2)hoSAA1基因的亚克隆；

①将获得的pBluescriptII-SAA1载体转化到DH5 a宿主菌中，筛选并提取包含目的DNA片段的质粒；

②然后经双酶切并通过琼脂糖凝胶电泳分离目的DNA片段；

③用胶回收试剂盒纯化目的DNA片段后，直接定向连接到pET-28a(+)载体上；

④再将连接产物转化到DH5a宿主菌中，提取质粒，用NdeI和HindIII双酶切鉴定。其中，酶切片段大小与预期设计片段大小一致的，即约为300个核苷酸的片段，为阳性克隆。

hoSAA1基因的亚克隆方法，如图1所示。

反应产物用琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示，插入片段的酶切位点为：

NdeI/HindIII，酶切片段的大小约为340bp，图2中所示得到的基因片段与预期设计的基因大小相符。以上常规实验方法，见Sambrooks等编著的《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社1998年出版。

(3)将阳性克隆进行DNA序列测定。

将筛选得到的阳性克隆进行测序，如序列1，SEQ NO.1所示。SEQ NO.1序列为hoSAA1(from nt 61 to stop code)，该序列中已经除去信号肽的序列部分。全长PET28a-hoSAA1重组质粒图谱，见图3所示。全长PET28a-hoSAA1重组质粒核甘酸序列，如序列2，SEQ NO.2所示，其中，SEQ NO.2中的黑体划线部分为插入hoSAA1基因序列。其测序结果与其基因库已报道hoSAA1序列的比较(NM_001081853)，序列比较一致，如序列3，SEQ NO.3所示。

实施例2基因重组菌的大规模表达及纯化方法

重组hoSAA1-多聚组氨酸融合蛋白在大肠杆菌宿主中的表达

1)将PET28a-hoSAA1转化到Rosetta-gami大肠杆菌中在带有卡那霉素抗性(50ng/ml)的LB培养板上，37℃培养过夜；

2)挑取一个单菌落在50ml含有50微克/毫升卡那霉素的LB培养基中，在37℃，250转/分钟的条件下，培养过夜；

3)2％接种培养到1L LB培养基中(包括50ug/ml卡那霉素)，在37℃250转/分钟的条件下培养细菌至A600，O.D值为0.5；

4)加入IPTG至终浓度1mM然后在37℃，300转/分钟条件下诱导培养3小时；

5)高速离心4000rpm 20分钟，收集沉淀并保存在-80℃。

纯化重组hoSAA1-多聚组氨酸融合蛋白的试剂

(1)裂解液：50mM Tris-HCl pH 8.0，400mM NaCl，5mM imidazole，1mM PMSF，10mM 2-Me

(2)洗涤液1：50mM Tris-HCl pH 8.0，400mM NaCl，10mM imidazole，1mM PMSF，10mM 2-Me

(3)洗涤液2：50mM Tris-HCl pH 8.0，400mM NaCl，30mM imidazole，1mM PMSF，10mM 2-Me

(4)洗脱液2：50mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl，200mM imidazole，1mM PMSF，10mM 2-Me

纯化步骤：

1.将1升LB培养基表达的hoSAA1重组融合蛋白的大肠杆菌悬浮在50ml裂解液中；

2.在冰上超声4-5次，30秒/次；

3.10000g高速离心30分钟；

4.取上清上柱到3ml镍柱中；

5.用60ml洗涤液1清洗镍柱；

6.用60ml洗涤液2清洗镍柱；

7.用6ml洗脱液2从镍柱上洗脱目的蛋白，每11滴收集一个试管；

8.将洗脱的样品混合在一起，并用1XPBS，4℃透析三次过夜；

9.将透析好的样品保存在-80℃。

通常情况下，镍亲和柱纯化蛋白时往往使用一种浓度imidazole洗涤液洗涤亲和柱，而本发明纯化方法在裂解菌液离心过柱后，对亲和柱用两次不同浓度imidazole洗涤，从而获得高纯度hoSAA1重组蛋白。基因重组菌的表达及纯化结果，如附图4所示，其中，lane1：IPTG诱导以前总菌裂解液，lane2：IPTG诱导以后总菌裂解液，lane3：镍柱纯化后的产物。

实施例3蛋白印迹法对重组蛋白的证明

1)15％丙稀酰胺胶，90V，3小时；

2)通过Tris-glycine缓冲液将丙稀酰胺胶上的蛋白片段电转到PVDF膜上，条件为1X Tris-glycine缓冲液，20％甲醇，70V电压室温下转移3小时；

3)将电转后的PVDF膜取出，用1X PBST清洗30分钟；

4)用含有5％脱脂奶粉的PBST封闭45分钟；

5)用1X PBST漂洗PVDF膜3次，10分钟/次；

6)加入含1∶2000稀释的抗His抗体的PBST 8mL，室温反应1小时；

7)用1X PBST洗涤PVDF膜三次，15分钟/次；

8)加入含1∶1000稀释的抗小鼠的抗体，室温反应40分钟；

9)用1X PBST洗涤PVDF膜三次，15分钟/次；

10)用含0.3％H2O2和6mg二氨基联苯胺的显色液，显色15秒。

实验结果如图5所示，其中，lane1：镍柱纯化后的产物，M：标准分子量蛋白。

实施例4质谱对纯化蛋白的蛋白分子量进行分析

将以上实施例中所获得的纯化蛋白在质谱上进行分子量分析，按常规质谱分析方法，重组hoSAA1蛋白质分子量经质谱分析仪测定为：14.2KD，其结果如附图6所示，与从氨基酸序列计算得到的分子量相吻合。

序列表

<110>德赛诊断系统(上海)有限公司

<120>马血清淀粉样蛋白A1制备方法及表达载体和基因工程菌

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<210>1

<211>344

<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

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accacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgcca

<210>3

<211>338

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

报道序列 64   TTGTTATCGTTCCTTGGAGAGGCTGCTCGAGGGACTTGGGACATGCTAAGAGCTTACAAT 123

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测序序列 82   TTGTTATCGTTCCTTGGAGAGGCTGCTCGAGGGACTTGGGACATGCTAAGAGCTTACAAT 141

报道序列 124  GACATGAGAGAAGCCAATTACATAGGTGCAGACAAATACTTCCACGCCCGCGGGAACTAT 183

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测序序列 142  GACATGAGAGAAGCCAATTACATAGGTGCAGACAAATACTTCCACGCCCGCGGGAACTAT 201

报道序列 184  GACGCTGCAAAGAGGGGCCCTGGGGGCGCCTGGGCTGCTAAAGTCATCAGCGATGCCAGA 243

              ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

测序序列 202  GACGCTGCAAAGAGGGGCCCTGGGGGCGCCTGGGCTGCTAAAGTCATCAGCGATGCCAGA 261

报道序列 244  GAGAATGTTCAGAGATTCACAGACCGTTTCAGTTTTGGAGGCAGCGGCCGTGGAGCAGAG 303

              ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

测序序列 262  GAGAATGTTCAGAGATTCACAGACCGTTTCAGTTTTGGAGGCAGCGGCCGTGGAGCAGAG 321

报道序列 304  GACTCGAGAGCCGACCAGGCTGCCAATGAATGGGGCCGGAGTGGCAAAGACCCCAATCAC 363

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测序序列 322  GACTCGAGAGCCGACCAGGCTGCCAATGAATGGGGCCGGAGTGGCAAAGACCCCAATCAC 381

报道序列 364  TTCAGACCTCATGGCCTGCCTGACAAGTACTGAAGCTT 401

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测序序列 382  TTCAGACCTCATGGCCTGCCTGACAAGTACTGA-GCTT 418

Claims (5)

1.一种马血清淀粉样蛋白A1的基因工程表达载体，其特征在于，该载体为含有马血清淀粉样蛋白A1基因序列的质粒载体pET28a(+)，并且马血清淀粉样蛋白A1编码序列位于pET28a(+)载体上Nde I和HindIII酶切位点之间；其中，所述马血清淀粉样蛋白A1基因的序列如Seq IDNO：1所示。

2.一种被权利要求1所述的表达载体所转化的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为pET28a(+)-hoSAA1／Rosetta-gami，宿主菌为大肠杆菌Escherichia coli Rosetta-gami。

3.一种制备马血清淀粉样蛋白A1的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将人工合成的SEQ ID NO：1所示的马血清淀粉样蛋白A1基因克隆于pBluescriptII载体；

(2)马血清淀粉样蛋白A1基因的亚克隆：

①将获得的pBluescriptII-hoSAA1载体转化到DH5a宿主菌中，筛选并提取包含目的DNA片段的质粒；

②然后经双酶切并通过琼脂糖凝胶电泳而分离目的DNA片段；

③用胶回收试剂盒纯化目的DNA片段后，直接定向连接到pET-28a(+)载体上；

④将连接产物转化到DH5a宿主菌中，提取质粒，通过用NdeI和HindIII双酶切筛选鉴定；

⑤得到重组目的基因的表达载体；

(3)培养和表达基因工程菌pET28a(+)-hoSAA1／Rosetta-gami；

(4)离心收集基因工程菌；

(5)融合蛋白SAA1的亲和柱纯化；

(6)透析除盐，得到可溶性目的蛋白；

其中，所述步骤(3)中以大肠杆菌Escherichia coli Rosetta-gami为宿主菌，以含有马血清淀粉样蛋白A1基因序列的质粒载体pET28a(+)为载体。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)是通过镍亲和柱一步纯化法，并且用两次不同浓度的洗涤液进行亲和柱的洗涤。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述两次不同浓度的洗涤液分别为10mM咪唑，30mM咪唑。

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