CN102071214A - 人胱抑素c真核表达载体的构建及其表达、纯化 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种利用真核表达系统进行重组人胱抑素C蛋白表达及其纯化的方法。由于原核表达系统缺少翻译后修饰等机制使得表达纯化后的蛋白与天然蛋白相比具有活性低，结构差异大的缺点，这应该是利用大肠杆菌来源重组胱抑素C蛋白制备的单抗在建立胱抑素C检测试剂遇到困难的主要原因。本方法利用真核表达系统克服了原核表达的缺点获得了高活性的重组人胱抑素C蛋白，为获得高质量抗体提供了有力的基础。

Description

人胱抑素C真核表达载体的构建及其表达、纯化 

技术领域

本发明涉及生物技术，特别是涉及利用真核表达系统进行重组人胱抑素C表达、纯化的方法。 

背景技术

胱抑素C基因属“看家基因”，能在几乎所有的有核细胞表达，无组织学特异性，故机体胱抑素产生率相当恒定。因胱抑素是一种低分子量蛋白质，可经肾小球自由滤过，在近曲小管被重吸收并降解，肾脏是清除循环中胱抑素的唯一器官，所以血清胱抑素浓度主要由肾小球滤过率(GFR)决定，由此可见胱抑素是一种理想的反映GFR变化的内源性标志物。 

目前有很多关于人胱抑素C重组及表达的方法，但都是利用大肠杆菌系统表达，另外一个事实是市售的胱抑素C单抗在建立胱抑素C检测方法时，绝大多数抗体都存在特异性差、灵敏度低的缺点。我们认为利用原核系统进行蛋白表达过程中，由于缺乏与天然胱抑素C相同的表达环境导致重组的胱抑素C与天然胱抑素C结构有差异之处，导致制备出来的单抗存在识别天然胱抑素C特异性差和灵敏度低的缺点。 

为此我们选择真核表达系统模拟天然胱抑素C的表达环境可选用CHO等真核表达系统进行人胱抑素C表达、纯化。 

CHO表达系统具有以下的优点： 

(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子； 

(2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力； 

(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定； 

(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下 游产物分离纯化； 

(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。 

本方法利用真核表达系统克服了原核表达的缺点获得了高活性的重组人胱抑素C蛋白，为获得高质量抗体提供了有力的基础。 

发明内容

本发明所要解决的问题是建立一种人胱抑素C真核表达载体构建及其表达、纯化的方法，包括下述步骤： 

1)首先设计引物通过PCR扩增的方法以带有胱抑素基因的原核表达载体为模板扩增获得两端带有酶切位点的基因片段。 

2)经过限制性内切酶的消化在连接酶的作用下与用同样限制性内切酶消化过的真核表达载体连接、转化大肠杆菌，经过鉴定获得带有胱抑素C基因片段的重组子。 

3)利用获得的正确重组子扩增纯化得到的质粒在转染方法的作用下，进入真核细胞中进行表达。 

4)利用蛋白的物理性质通过色谱柱将目的蛋白纯化，使目的蛋白获得较高的纯度。 

5)使用市售高质量胱抑素C检测试剂检测目的蛋白的测定值和理论值的差异。 

所述真核表达载体是具有可以携带基因片段并可以通过调控元件在真核表达系统调控表达携带基因片段的分子生物学载体工具。更进一步的说是可以通过信号肽进行分泌或不带有信号肽进行胞内表达的载体或者可以通过包装病毒进行感染宿主细胞将携带基因整合到宿主基因组而进行该基因表达的载体。本发明不限制选择使用载体，在进一步的试验中我们选择使用pcDNA3.1(+)载体。 

所述的真核表达系统是可以适合外源基因表达的所有真核细胞，本发明 不限制选择使用宿主细胞，在进一步的试验中我们选择使用CHO细胞系。 

所述的转染方法是指可以促进外源质粒进入宿主细胞的方法，其包括化学转染和物理方法转染。再进一步的试验中我们选择了化学方法中的脂质体法转染。 

所述的纯化是指利用蛋白的物理性质通过色谱柱将目的蛋白纯化，使目的蛋白获得较高的纯度。在进一步的试验中我们使用亲和层析柱利用蛋白的his标签对目的蛋白进行一步法纯化。得到蛋白纯度超过95％。 

所述的检测是利用能够对胱抑素C进行定量检测的试剂对目的蛋白进行含量的测定。进一步的试验中我们使用胶乳增强免疫比浊法。 

附图说明

1、纯化后重组胱抑素C的SDS-PAGE图。图1，纯化后重组胱抑素C的SDS-PAGE图。 

2、利用胱抑素C胶乳增强免疫比浊试剂盒进行分析的结果。图2，北京九强胱抑素C校准工作曲线；图3，纯化的胱抑素C系列稀释后理论与测定值比较。 

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 

实施例1 

胱抑素C真核表达载体的构建及其表达、纯化 

(1)胱抑素C真核表达载体的构建。 

按照胱抑素C的序列设计引物： 

上游引物ATCGGGATCCTCCAGTCCTGGCAAG 

下游引物CGGAATTCTTAATGATGATGATGATGATGGGC GTCCTGACAGGT 

其中在上游引物引入BamHI酶切位点，在下游引物引入EcoRI酶切位点及6×组氨酸标签(划线部分表示)。以56度为退火温度进行PCR扩增，胶回收后，进行酶切，与同样用BamHI、EcoRI消化的pcDNA3.1(+)载体连接并转化大肠杆菌DH5a，经过PCR鉴定，选择阳性重组子进行测序鉴定。 

(2)胱抑素C在CHO细胞中的表达 

经过测序鉴定正确的克隆，大量制备质粒，使用lipofectAMINE试剂，依据说明书进行转染，加入G418(0.8mg/ml)，进行阳性克隆的筛选，将培养体系增大到1L，经过72小时的培养收集细胞，采用超声破碎法破碎细胞，离心后收集上清，使用Ni柱进行亲和层析。经过SDS-PAGE分析，蛋白大小为13KD左右，与理论值相同。产量为3mg/L。根据SDS-PAGE的条带灰度估算蛋白浓度后，将蛋白浓缩到3mg/ml。 

实施例2 

使用北京九强公司胱抑素C检测试剂盒对纯化蛋白进行测定： 

(1)先用迈瑞BS300全自动生化仪按照试剂盒说明书所说的方法步骤进行校准，其工作曲线见附图2。 

(2)将纯化后的蛋白用蛋白保护液稀释到约8.50μg/ml，用以上曲线测定三次，结果均值为7.80μg/ml。 

(3)用蛋白保护液将上面测定的蛋白倍比稀释成一系列值(包括原浓度和0浓度的蛋白保护液)，即7.80μg/ml，7.02μg/ml，6.24μg/ml，5.46μg/ml，4.68μg/ml，3.90μg/ml，3.12μg/ml，2.34μg/ml，1.56μg/ml，0.78μg/ml，0μg/ml。 

(4)然后用生化仪对以上各浓度值测定三次取平均值，相关系数R＞0.99，理论稀释值与测定值比较图见附图3。 

Claims (5)

1.人胱抑素C真核表达载体的构建及其表达、纯化

2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，它是具有可以携带基因片段并可以通过调控元件在真核表达系统调控表达携带基因片段的分子生物学载体工具。

3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，包括不限于pcDNA3.1等可以通过信号肽进行分泌或不带有信号肽进行胞内表达的载体或者可以通过包装病毒进行感染宿主细胞将携带基因整合到宿主基因组而进行该基因表达的载体。

4.根据权利要求1所述的真核表达系统，其特征在于，可以适合外源基因表达的所有真核细胞，包括但不限于目前常用的CHO细胞、NSO细胞、酵母、昆虫细胞及人源细胞。

5.根据权利要求1所述的纯化，其特征在于利用重组胱抑素C的物理特性进行各种色谱柱进行纯化使最终得到的重组胱抑素C具有较高的纯度。

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