CN115785280A - 重组人源纤连蛋白及其在毕赤酵母中的表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组人源纤连蛋白及其在毕赤酵母中的表达方法。所述的重组人源纤连蛋白是将人源纤连蛋白中与胶原蛋白和细胞整合素结合的功能区域进行理性设计优化后所得，包含1个胶原蛋白结合区域和2个重复的细胞整合素协同结合区域。所述的表达重组人源纤连蛋白的高拷贝重组菌株通过将重组人源纤连蛋白序列经密码子优化后转化到毕赤酵母中，并经G418抗性梯度筛选获得。本发明的重组人源纤连蛋白在护肤品和医药领域具有广泛的应用前景。

Description

重组人源纤连蛋白及其在毕赤酵母中的表达方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种重组人源纤连蛋白及其在毕赤酵母中的表达方法。

背景技术

纤连蛋白(Fibronectin，FN)是一种参与细胞黏附、扩散、迁移、增殖和凋亡过程的细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)糖蛋白，主要以可溶的血浆纤连蛋白、不溶的细胞纤连蛋白和胎儿纤连蛋白三种形式存在。纤连蛋白的生理功能与其氨基酸组成密切相关，它是一种具有可变分子构象和剪接变体的二聚体糖蛋白，总分子量高达500kDa，每个FN单体包含有三种类型的重复亚基：FNI,FNII,FNIII型。FNI和FNII亚基是由二硫键固定的β折叠片层，而FNIII亚基则是易受机械变性的7股β桶状结构。其中，FNIII9-10区域包含了调控纤连蛋白与细胞整合素黏附的协同结合位点PHSRN和RGD，是纤连蛋白执行细胞黏附、迁移和增殖的关键功能结构域。除此之外，FN还包含了与其他FN亚基、胶原蛋白、肝素、纤维蛋白、基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPs)和生长因子识别结合的序列，共同执行着纤连蛋白在细胞外基质中的生理功能。

在创伤愈合的四个阶段(止血、炎症、增殖和重塑)，纤连蛋白起到了关键性的作用。在止血阶段，血浆纤连蛋白通过与纤维蛋白形成纤维状基质帮助血小板在创伤面凝集，加速伤口的止血；在炎症阶段，血浆纤连蛋白通过形成暂时的细胞外基质增强巨噬细胞的吞噬作用净化创面环境；在增殖阶段，细胞纤连蛋白与I型胶原蛋白相互作用对细胞外基质进行组装和重塑促进新血管的生成和细胞的迁移；在最终组织重塑阶段，血浆纤连蛋白和细胞纤连蛋白共同调控细胞凋亡从而有助于细胞外基质的稳态。有研究表明，在伤口愈合过程中，外源添加完整纤连蛋白分子或纤连蛋白片段，对成纤维细胞和免疫细胞都具有趋化效应，促进它们迅速进入伤面，也可以提高整合素的表达，促进肉芽组织的增生及成熟，从而加快损伤组织修复。

传统的纤连蛋白主要通过从动物血浆中逐级分离纯化的方式获得，耗时长、步骤复杂且最终产率极低，且在大规模生产过程中极易受到酶解，很难得到完整长度的纤连蛋白，且存在安全性问题。随着合成生物学的快速发展，人为设计构建生物系统已成为现今生物学的主流趋势，而从头设计基因元件模块是合成生物学的基础。基于此理念，结合蛋白质工程理性改造策略，合理设计具有一定生理功能的重组纤连蛋白片段，并实现其在异源宿主中的高效表达，将极大有助于纤连蛋白在工业化生产中的应用。

毕赤酵母(Pichia pastoris)是至今仅次于大肠杆菌最常见的蛋白表达系统，已有上千种蛋白在毕赤酵母系统中得到了成功表达，同时它也被美国FDA认定为GRAS(Generally Recognized As Safe)微生物。此外，毕赤酵母还具备系统的基因编辑系统和完备的蛋白分泌表达机制，是现今广泛应用于食品和医药领域的异源宿主。

发明内容

本发明通过设计优化人源纤连蛋白部分功能片段，提供一种重组人源纤连蛋白。

本发明所述的重组人源纤连蛋白，含有1个如SEQ ID No.4所示的人源纤连蛋白I区胶原蛋白结合域和2个重复的如SEQ ID No.5所示的人源纤连蛋白III区细胞整合素协同结合域，且2个人源纤连蛋白III区细胞整合素协同结合域分别融合在人源纤连蛋白I区胶原蛋白结合域的氨基端和羧基端，氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

本发明还提供上述重组人源纤连蛋白的编码基因，含有1个如SEQ ID No.1所示的人源纤连蛋白I区胶原蛋白结合域和2个重复的如SEQ ID No.2所示的人源纤连蛋白III区细胞整合素协同结合域，且2个人源纤连蛋白III区细胞整合素协同结合域分别融合在人源纤连蛋白I区胶原蛋白结合域的氨基端和羧基端，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

进一步地，本发明提供表达上述重组人源纤连蛋白的毕赤酵母基因工程菌。

同时，本发明提供上述表达重组人源纤连蛋白的毕赤酵母基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

先PCR扩增重组人源纤连蛋白的编码基因，然后克隆到pPIC9K质粒的α因子分泌信号肽下游，验证正确后提取质粒，用SalI酶切线性化后电转化到毕赤酵母感受态中，经G418抗性梯度筛选高拷贝重组子，获得表达重组人源纤连蛋白的毕赤酵母基因工程菌。

更进一步地，本发明提供上述表达重组人源纤连蛋白的毕赤酵母基因工程菌的培养方法，包括以下步骤：将表达重组人源纤连蛋白的毕赤酵母基因工程菌接接种至BMMY培养基中，30±2℃下，甲醇诱导，收集上清中的重组人源纤连蛋白。

本发明所述的BMMY培养基为本领域常见的适用于毕赤酵母的培养基，每L培养基包括以下组分：20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，10×YNB 100mL，10×磷酸钾缓冲液pH 6.0100ml，余量为水。

本发明所述的培养方法中，甲醇诱导时间为72～120小时。

本发明通过在重组人源纤连蛋白上融合胶原蛋白结合功能域，有助于创伤处胶原蛋白的黏附和聚集，加快了伤口愈合过程中的止血阶段；同时，融合2个细胞整合素结合功能域不仅能诱导炎症细胞和成纤维细胞等往创面的迁移加速急性炎症阶段，还能激活细胞信号传导反应促进新生组织的增殖和分化。本发明的重组人源纤连蛋白，在合适浓度下，没有潜在细胞毒性，且具有良好的生物活性，能够促进细胞的生长增殖，增强细胞的黏附力，促进细胞迁移的能力。本发明构建的重组人源纤连蛋白几乎可作用于伤口愈合的整个过程，极大缓解由于外部感染、自身免疫力低下或凝血功能障碍造成的伤口长期不愈的现象。同时，由于它能激活组织的增殖，因而一定程度上该重组人源纤连蛋白还可用于组织的修复，提升皮肤的抵抗力，在护肤品和医药领域具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为表达重组人源纤连蛋白的重组质粒的结构示意图。

图2为表达重组人源纤连蛋白的重组质粒的电泳图，孔道1：1kb DNA marker，孔道2：pPIC9K线性化片段；孔道3：pPIC9K+重组人源纤连蛋白线性化片段；孔道4：重组人源纤连蛋白基因片段。

图3为表达重组人源纤连蛋白的高拷贝毕赤酵母基因工程菌培养基上清(甲醇诱导72小时)的SDS-PAGE图，其中20、24、25、30为不同的高拷贝重组子，每个重组子发酵两个平行，其中30号重组子为筛选获得的最高拷贝毕赤酵母基因工程菌。

图4为细胞毒性试验结果图。

图5为细胞增殖试验结果图。

图6为细胞黏附试验结果图。

图7为细胞迁移试验结果图。

具体实施方式

下面通过实施例和附图进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

下述实施例中，涉及的培养基组成如下：

BMGY培养基：每L培养基含有20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，10×YNB 100ml，10×磷酸钾缓冲液pH 6.0100ml，10×甘油100ml，余量为水。

BMMY培养基：每L培养基含有20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，10×YNB 100ml，10×磷酸钾缓冲液pH 6.0 100ml，余量为水。

实施例1

1.重组人源纤连蛋白的结构设计

(1)从人源纤连蛋白片段中筛选胶原蛋白结合区域和细胞整合素协同结合区域；

(2)在人源纤连蛋白I区胶原蛋白结构域(氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)的氨基酸和羧基端分别融合人源纤连蛋白III区细胞整合素协同结构域(氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示)，获得同时具备胶原蛋白和整合素结合位点的重组人源纤连蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)。

2.表达重组人源纤连蛋白高拷贝毕赤酵母基因工程菌的构建

(1)将上述设计的重组人源纤连蛋白的氨基酸序列以毕赤酵母密码子偏好性进行密码子优化，得到优化后的重组人源纤连蛋白的编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

(2)利用引物1：AGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAGGGAAGAAGAGACAACAT(SEQ ID NO.7)和引物2：GTCATGTCTAAGGCGAATTAGAGCGGTTGGCAGTGCCATT(SEQ ID NO.8)，PCR扩增重组人源纤连蛋白的编码基因，纯化后，利用Gibson assembly技术无缝克隆到pPIC9K质粒的α因子分泌信号肽下游，重组后的质粒结构如图1所示。经PCR和DNA测序验证正确后提取质粒，用SalI酶切线性化后电转化到毕赤酵母GS115感受态中，经1～6g/LG418抗性梯度影印平板筛选获得高拷贝重组子。

3.重组人源纤连蛋白在毕赤酵母基因工程菌中的表达

将表达重组人源纤连蛋白的高拷贝毕赤酵母基因工程菌株接种于30mLBMGY培养基中，培养16-20小时，然后以初始OD₆₀₀为1的接种量接种于30mL BMMY培养基中进行培养，每隔24小时补充300μL过滤除菌的甲醇，甲醇诱导120小时后，取2mL培养基，离心收集上清，利用SDS-PAGE对重组人源纤连蛋白进行定性分析，检测结果见图4。由图4可知，该高拷贝毕赤酵母基因工程菌株能够成功表达重组人源纤连蛋白。

实施例2

利用MTT法检测重组人源纤连蛋白对细胞活性和细胞增殖的影响：测定样品在570nm的紫外光吸收值，根据公式细胞活性＝(OD_样品/OD_空白)×100％，计算细胞活性。该方法的原理是：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在570nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。

1.细胞毒性

(1)向96孔板中每孔中加入10⁴个培养状态良好的小鼠成纤维细胞(L929细胞)，37℃孵育24h；

(2)弃上清，设置10％血清培养基配制的不同浓度的重组人源纤连蛋白溶液为实验组、10％血清培养基为空白对照组以及10％血清培养基配制的10％二乙基二硫代氨基甲酸锌(ZDEC)溶液为阳性对照组，每组设置6个重复，每孔中加入100μL不同浓度的重组人源纤连蛋白溶液、培养基或ZDEC溶液，37℃孵育24h；

(3)弃上清，每孔中加入50μL MTT-完全培养基溶液；

(4)弃上清，每孔加入100μL的DMSO于脱色摇床上振摇10min；

(5)检测波长为570nm，OD值为570nm的OD值，根据用公式细胞活性＝(OD_样品/OD_空白)×100％，计算细胞活性。

结果如图4所示，可以看出，本发明的重组人源纤连蛋白没有潜在细胞毒性。

2.细胞增殖

(1)向96孔板中每孔中加入8000个培养状态良好的人类永生化表皮细胞(HaCaT细胞)或加入4000个培养状态良好的人皮肤成纤维细胞(HFF-1细胞)，37℃孵育24h；

(2)弃上清，设置10％血清培养基配制的不同浓度的重组人源纤连蛋白溶液为实验组、10％血清培养基为空白对照组，每组设置6个重复，每孔中加入100μL不同浓度的重组人源纤连蛋白溶液或培养基，37℃孵育48h；

(3)弃上清，每孔中加入50μL MTT-完全培养基溶液，37℃孵育2h；

(4)弃上清，每孔加入100μL的DMSO于脱色摇床上振摇10min；

(5)检测波长为490nm，以630nm为参考波长，OD值为490nm的OD值减去630nm的OD值，根据公式细胞相对增殖率＝OD_样品/OD_空白×100％，计算细胞相对增殖率。

结果如图5所示，可以看出，在浓度0.01％时，本发明的重组人源纤连蛋白对于表皮细胞和成纤维细胞的细胞增殖能力均高于空白对照组，具有优秀的促进细胞增殖能力。

实施例3

利用离心法检测待测蛋白样品的细胞黏附性，该方法的原理是：通过离心法定量测定胶原蛋白与细胞形成黏附后分离所需的力。具体方法为将细胞悬液在涂有重组人源纤连蛋白的培养皿中培养一定时间，用荧光标记细胞，在最佳相对离心力，洗脱未黏附的细胞，测定离心前后细胞分离百分比，评价待测重组纤连蛋白样品的相对促细胞黏附性，根据公式黏附百分比＝离心后细胞数/离心前细胞数×100％，细胞相对黏附率＝样品的黏附百分比平均值/空白对照组的黏附百分比平均值，计算细胞相对黏附率。具体如下：

(1)设置无血清培养基配制的不同浓度的重组人源纤连蛋白溶液为实验组和添加等量PBS溶液的空白对照组，每组设置6个重复，向96孔板中每孔中加入100μL不同浓度的重组人源纤连蛋白溶液或PBS溶液，37℃孵育1～4h；

(2)弃上清，每孔中加入100μL 1％BSA，37℃孵育48h；

(3)PBS清洗三次，用封口膜密封后置于4℃备用；

(4)每孔中加入5000个培养状态良好的人类永生化表皮细胞(HaCaT细胞)或人皮肤成纤维细胞(HFF-1细胞)，含10％Hoechst33342荧光染色剂，37℃孵育1h；

(5)使用倒置显微镜捕获3个孔中每个孔的荧光平铺图像；

(6)每个孔用D-PBS填充以形成“反向弯月面”，吹扫气泡并用封口膜覆盖，以350g离心力在离心(倒置放置)5min；

(7)离心后，弃去封口膜，从孔中取出上清液，用D-PBS清洗1次后，加入100μL D-PBS，对于3个孔中的每个孔进行拍摄；

(8)使用Image J细胞计数程序来计数荧光标记的细胞核数目，测定离心前后的细胞数。

细胞的黏附率可以反应纤连蛋白的活性。蛋白的活性越高，越能在短时间给细胞提供优质的外环境，帮助细胞贴壁。由图6可知，实验浓度下，本发明的重组人源纤连蛋白能够促进细胞黏性，且随着蛋白溶液的浓度增加而增加，表现出优秀的促进细胞黏附活性。

实施例4

利用细胞划痕法测定细胞迁移运动。在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其他硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间24h，观察周边细胞是否迁移至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能力，按公式计算细胞迁移速率：细胞迁移速率＝固定划痕区移行细胞的总面积/初始划痕区面积×100％。具体步骤如下：

(1)用marker笔比着直尺在6孔板底部画3条横线，人类永生化表皮细胞(HaCaT细胞)浓度调整为5×10⁵个/孔，人皮肤成纤维细胞(HFF-1细胞)浓度调整为2.5×10⁵个/孔，接种到6孔板，每孔体积2ml，培养24h(具体接种数量可根据细胞不同而调整，目标为培养24小时后能达到95％～100％汇合状态)；

(2)用20μL枪头比着直尺垂直对准孔板(也可用划痕专用细胞培养皿)，向下轻推纵向划线形成划痕；

(3)用PBS漂洗细胞3次，去除划掉的细胞；

(4)在实验组加入2mL无血清培养基配制的不同浓度的重组人源纤连蛋白溶液，空白对照组只加入2mL无血清培养基，在37℃，5％CO₂培养箱培养，于0h、24h后，以横向划线和纵向划痕的交点为核心，在40倍显微镜下拍照，每孔获得9个部位的照片，每组合计27个数据；

(4)用Image J软件测量划痕面积并计算细胞每组的细胞迁移速率。

结果如图7所示，可以看出，当前实验浓度下，本发明的重组人源纤连蛋白表现出优秀的促进细胞迁移能力。

综上所述，本发明的重组人源纤连蛋白，在合适浓度下，没有潜在细胞毒性，且具有良好的生物活性，能促进细胞的生长增殖，增强细胞的黏附力，促进细胞迁移的能力。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.重组人源纤连蛋白，其特征在于，含有1个如SEQ ID No.4所示的人源纤连蛋白I区胶原蛋白结合域和2个重复的如SEQ ID No.5所示的人源纤连蛋白III区细胞整合素协同结合域，且2个人源纤连蛋白III区细胞整合素协同结合域分别融合在人源纤连蛋白I区胶原蛋白结合域的氨基端和羧基端，氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

2.重组人源纤连蛋白的编码基因，其特征在于，含有1个如SEQ ID No.1所示的人源纤连蛋白I区胶原蛋白结合域和2个重复的如SEQ ID No.2所示的人源纤连蛋白III区细胞整合素协同结合域，且2个人源纤连蛋白III区细胞整合素协同结合域分别融合在人源纤连蛋白I区胶原蛋白结合域的氨基端和羧基端，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

3.表达权利要求1所述的重组人源纤连蛋白的毕赤酵母基因工程菌，其特征在于，通过以下步骤构建：

先PCR扩增重组人源纤连蛋白的编码基因，然后克隆到pPIC9K质粒的α因子分泌信号肽下游，验证正确后提取质粒，用SalI酶切线性化后电转化到毕赤酵母感受态中，经G418抗性梯度筛选高拷贝重组子，获得表达重组人源纤连蛋白的毕赤酵母基因工程菌。

4.根据权利要求3所述的表达重组人源纤连蛋白的毕赤酵母基因工程菌的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：将表达重组人源纤连蛋白的毕赤酵母基因工程菌接接种至BMMY培养基中，30±2℃下，甲醇诱导，收集上清中的重组人源纤连蛋白。

5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述的BMMY培养基中，每L培养基包括以下组分：20g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，10×YNB 100mL，10×磷酸钾缓冲液pH 6.0100ml，余量为水。

6.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，甲醇诱导时间为72～120小时。

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