CN113588964A - 一种慢加急肝衰检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于试剂盒制备技术领域，公开了一种慢加急肝衰检测试剂盒及其制备方法，进行人CD103单克隆抗体的制备；进行CD103流式抗体检测试剂盒的制备；进行IL‑33Elisa检测试剂盒的制备；进行慢加急肝衰公式的创建。试剂盒由CD103单克隆抗体，红细胞裂解液，流式细胞洗涤缓冲液，96孔酶标板、12ml的酶标抗体工作液、12ml的10×标本稀释液、50ml的20×浓缩ELISA洗涤液、20ng/瓶2瓶的IL‑33标准品、12ml的底物工作液、12ml的第一抗体工作液以及12ml的终止液组成。本发明弥补当前市面上缺少慢加急肝衰发生前期诊断试剂盒的现状，为预测慢性肝病肝衰发生提供有力的检测工具。

Description

一种慢加急肝衰检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明属于试剂盒制备技术领域，尤其涉及一种慢加急肝衰检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
目前，慢加急性肝衰竭(Acute on chronic liver failure，ACLF)是在慢性肝病基础上由多种急性促发因素导致的肝功能急性严重受损，并发一个或多个器官功能衰竭的一组复杂临床症候群，病死率极高，是我国肝衰竭中最常见的类型。
2018年12月中华医学会再次对我国的《肝衰竭诊治指南》进行更新，将肝衰竭分为四类：急性肝衰竭、亚急性肝衰竭、慢加急性肝衰竭和慢性肝衰竭。由于我国是乙肝大国，在我国肝衰竭的主要病因是HBV再激活引起的ACLF。目前针对ACLF的治疗以内科支持治疗结合肝移植为主，但是内科综合治疗和人工肝治疗疗效仍不令人满意，肝移植作为目前最有效的治疗手段，却受到供肝来源稀缺、医疗费用高昂等诸多限制。由于治疗手段有限，若能在肝衰竭发生之前，对患者肝衰竭发生风险进行早期预测并及时干预，阻止疾病进展，无疑会有效改善患者预后，并减轻患者的经济负担；同时如果能针对ACLF发生的关键分子进行跟踪检测尽早预判治疗效果，也将进一步降低患者的死亡率。近年来，肝衰竭的早期预警日益引起人们的关注，肝衰竭前期概念的提出及其相关预警研究逐渐成为热点，但是现阶段临床还没有较为准确的ACLF早期预警试剂盒在临床应用，因此提供可在临床大规模应用的ACLF早期诊断试剂盒将提升临床治疗ACLF的成功率。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：当前市面上缺少慢加急肝衰发生前期诊断试剂盒，还没有较为准确的ACLF早期预警试剂盒在临床应用。
解决以上问题及缺陷的难度为：由于现阶段ACLF的免疫发生机制尚不清楚，没有较好的生物监测靶分子，同时由于ACLF患者无法取到肝组织因此现有市面上尚未有可以早期预测肝衰发生的方法和诊断试剂盒。
解决以上问题及缺陷的意义为：本发明研发的成功可以通过外周血早期预测肝衰的发生，弥补市面上缺少利用外周血预测ACLF发生的试剂盒，为ACLF患者的早期治疗提供新的检测手段，为临床ACLF的治疗提供依据。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种慢加急肝衰检测试剂盒及其制备方法，尤其涉及一种以人CD103流式抗体为核心的慢加急肝衰检测试剂盒及其制备方法。
本发明是这样实现的，一种慢加急肝衰检测试剂盒的制备方法，所述慢加急肝衰检测试剂盒的制备方法包括以下步骤：
步骤一，进行人CD103单克隆抗体的制备；制备具有自主产权的CD103单克隆抗体，为本技术发明奠定物质基础。
步骤二，进行CD103流式抗体检测试剂盒的制备；规范简明的操作规范使本技术具备市场推广的可能性；外周血CD103检测的完成为步骤四联合外周血CD103和IL-33的表达预测ACLF的发生奠定基础。
步骤三，进行IL-33Elisa检测试剂盒的制备：规范简明的操作规范使本技术具备市场推广的可能性。IL-33检测的完成为步骤四联合外周血CD103和IL-33的表达预测ACLF的发生奠定基础。
步骤四，公式计算ACLF的发生概率，利用已有的研究数据建立ACLF发生计算公式，根据患者外周血CD103和IL-33的表达量计算ACLF发生的概率。
进一步，步骤一中，所述人CD103单克隆抗体的制备，包括：
(1)人CD103/L929基因转染细胞膜表面GFP的表达；
(2)利用RT-PCR及Western-blot法检测L929/CD103细胞中人CD103基因的转录；
(3)特异性分泌鼠抗人CD103单抗的杂交瘤细胞株的建立；
(4)单抗的Ig亚型、效价、特异性鉴定及Ig类别、特异性鉴定及杂交瘤的核型分析。
进一步，步骤(1)中，所述人CD103/L929基因转染细胞膜表面GFP的表达，包括：
常规脂质体法将重组表达载体pIRES2-EGFP-CD103-Fc转染L929细胞，转基因L929细胞置于G418选择性培养基中筛选，选择单克隆集落较大的细胞进行扩大培养；获得的抗药性L929细胞经流式细胞术检测，结果显示绿色荧光蛋白GFP报告基因得到较高的表达，表明导入的外源基因在细胞基因组中得到稳定整合和表达。
进一步，步骤(2)中，所述利用RT-PCR及Western-blot法检测L929/CD103细胞中人CD103基因的转录，包括：
选择高表达GFP的基因转染细胞株扩大培养后，通过RT-PCR及Western-blot法在基因和蛋白水平检测人CD103的表达；RT-PCR结果显示，转基因细胞中能扩增出1000bp的目的片段，而阴性对照无特异性条带产生；Western-blot检测显示表明L929/CD103的细胞裂解液能与CD103商品化多抗反应产生特异性条带，而L929/mock则没有对应条带；由此证明导入的外源性人CD103基因已整合到L929细胞基因组中，并能很好地转录成相应的mRNA和蛋白。
进一步，步骤(3)中，所述特异性分泌鼠抗人CD103单抗的杂交瘤细胞株的建立，包括：
利用已构建成功的能稳定表达人CD103分子的转基因细胞，进行细胞融合，将复测为阳性的杂交瘤细胞3次克隆化培养，获得1株能持续分泌特异性鼠抗人CD103分子的杂交瘤细胞株，命名为12C8。
该单抗能特异性结合CD103，阳性率为95.4％，而不与L929/mock细胞结合；该杂交瘤细胞株经体外连续传代50代培养，液氮冻存半年后复苏，仍生长良好并稳定分泌抗体；将L929/mock、L929/CD103、L929/BTLA和L929/CD28基因转染细胞与12C8反应进行免疫荧光标记。
进一步，步骤(4)中，所述单抗的Ig亚型、效价、特异性鉴定及Ig类别、特异性鉴定及杂交瘤的核型分析，包括：
快速定性试纸法鉴定表明，12C8重链为IgGl，轻链则为κ；染色体数目超过100采用本室建立的腹水诱生方法生产单克隆抗体，腹水纯化后单抗蛋白含量在2.15mg/ml；免疫荧光法分析结果表明，纯化后单抗的效价为1：1000以上，抗体用于间接免疫荧光分析的用量为0.2～2μg/106细胞；IP-Western blot显示单克隆抗体12C8与商品化多抗识别的为同一分子，表明这株单抗具有特异性的识别CD103分子的特性。
进一步，步骤二中，所述CD103流式抗体检测试剂盒的制备，包括：
(1)取对照管与测定管各1管，分别加入全血100μL，对照管依次加入CD3-APC、CD8-PerCP、CD25-FITC和鼠IgG2a-PE各10μL；测定管依次加入CD3-APC、CD8-PerCP、CD25-FITC和鼠抗人CD103-PE各10μL，室温避光孵育15min；加入FACS 1：10稀释溶血素2ml，混匀，室温避光反应15～20min；1300r/min离心5min，弃上清液；加PBS 2ml混匀，1300r/min离心5min，弃上清液；加入PBS 500μL重悬，应用流式细胞仪检测和分析。
(2)流式细胞仪检测CD103的表达：采用CellQuest软件处理，在前向角散射光FSC、侧向角散射光SSC散点图上圈出淋巴细胞，设为R1门，去除碎片和死亡细胞，在R1门的基础上获取CD3+CD8+T细胞，建立逻辑门获取目标细胞CD103的表达，并进行结果计算与判断。
进一步，步骤三中，所述IL-33Elisa检测试剂盒的制备，包括：
采用双抗体夹心ABC-ELISA法，用抗人IL-33单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的IL-33与单抗结合，加入生物素化的抗人IL-33，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，IL-33浓度与OD值成正比，通过绘制标准曲线求出标本中IL-33浓度。
进一步，步骤三中，所述IL-33Elisa检测试剂盒的制备，还包括：
(1)准备试剂与收集血样
①收集标本：将血清、血浆、细胞培养上清液和组织匀浆尽早检测，2～8℃保存48h；更长时间须-20℃或-70℃冷冻保存，避免反复冻融；其中，所述血浆包括EDTA、柠檬酸盐和肝素抗凝；
②标准品液配制：使用前加入1ml蒸馏水混匀，配成20ng/ml的溶液；设标准管8管，第一管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul；在第一管中加入20ng/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管；如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去；第八管为空白对照；
③10×标本稀释液用蒸馏水作1：10倍稀释；
④洗涤液：用重蒸水1：20稀释。
(2)检测程序
①加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置于37℃120min；
②洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，向滤纸上印干；
③每孔中加入第一抗体工作液100ul，将反应板充分混匀后置37℃60min；
④洗板；
⑤每孔加酶标抗体工作液100ul，将反应板置37℃30min；
⑥洗板；
⑦每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15min；
⑧每孔加入100ul终止液混匀；
⑨30min内用酶标仪在450nm处测吸光值。
本发明的另一目的在于提供一种应用所述的慢加急肝衰检测试剂盒的制备方法制备得到的慢加急肝衰检测试剂盒，所述慢加急肝衰检测试剂盒，由96孔酶标板、12ml的酶标抗体工作液、12ml的10×标本稀释液、50ml的20×浓缩洗涤液、20ng/瓶2瓶的标准品、12ml的底物工作液、12ml的第一抗体工作液以及12ml的终止液组成，于2～8℃保存。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的慢加急肝衰检测试剂盒，以人CD103流式抗体为核心的辅以CD3流式抗体，CD8流式抗体，CD25流式抗体以及人IL-33的检测试剂盒，该试剂盒的开发可以弥补当前市面上缺少慢加急肝衰发生前期诊断试剂盒的现状，为预测慢性肝病肝衰发生提供有力的检测工具。
发明人在前期研究发现白介素33(IL-33)与肝细胞的坏死存在相关性，并通过一系列实验证明坏死的肝脏组织会释放大量的IL-33，IL-33/ST2信号通路的活化可以促进CD8+T细胞表面CD103表达升高并分泌IFN-γ，最终导致ACLF的发生；因此推测通过检测患者外周血中CD8+T细胞和Treg(CD3+CD25high)细胞表面CD103的表达联合血清中IFN-γ，IL-33和sST2含量的变化，预判人工肝治疗肝衰竭的效果和预后。
正是在此基础上发明人首先制备了CD103单克隆抗体，同时收集HBV-ACLF患者人工肝支持系统(Artificial liver support system，ALSS)治疗前，治疗后和慢性乙肝患者(Chronic hepatitis B patients，CHB)的外周血，利用自主构建的人CD103流式抗体的辅以CD3流式抗体，CD8流式抗体，CD25流式抗体以及人IFN-γ，人IL-33，人ST2的自制检测试剂盒，分析发现HBV-ACLF患者发生肝衰前12小时外周血中CD8+T细胞表面CD103表达升高，同时IL-33的表达水平也明显高于CHB患者；进一步分析发现ALSS治疗效果好的HBV-ACLF患者ALSS治疗前外周血CD8+T细胞表面CD103表达和IL-33明显低于治疗效果差的患者；通过随访还发现ALSS治疗后IL-33再次升高且外周血Treg(CD3+CD25+)细胞表面CD103表达升高的患者易发生感染预后差。因此利用本发明可以预判慢性肝病患者发生肝衰的几率，提高临床的治疗效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的慢加急肝衰检测试剂盒的制备方法流程图。
图2(a)和图2(b)是本发明实施例提供的人CD103/L929基因转染细胞膜表面GFP的表达结果示意图。
图3是本发明实施例提供的L929/CD103基因转染细胞的鉴定结果示意图。
图3(a)是本发明实施例提供的RT-PCR检测CD103基因水平的表达结果示意图；
图中：1、L929/CD103 GAPDH；2、L929/CD103 CD103全片段；3、MARKER；4、L929/mockGAPDH；5、L929/mock CD103全片段。
图3(b)是本发明实施例提供的Western-blot检测CD103在蛋白水平的表达结果示意图；
图中：1、THP-1+CD103多抗；2、L929/CD103+CD103多抗；3、L929/mock+CD103多抗。
图4是本发明实施例提供的单克隆抗体12C8特异性识别结合人CD103分子示意图。图4的(a)和(b)表示L929/mock、L929/CD103、L929/BTLA和L929/CD28基因转染细胞与12C8反应进行免疫荧光标记。
图5是本发明实施例提供的单克隆抗体12C8的Ig亚类鉴定结果示意图。
图6是本发明实施例提供的杂交瘤细胞株12C8的染色体数目(×1000)示意图。
图7是本发明实施例提供的免疫荧光法分析纯化后单抗的效价示意图。
图8是本发明实施例提供的IP-Westernblot分析单抗12C8与CD103分子特异性结合的结果示意图。
图8(a)是本发明实施例提供的用12C8与转基因细胞裂解液免疫共沉淀复合物的SDS-考马斯亮蓝染色电泳结果示意图。
图8(b)是本发明实施例提供的IP-Westernblot示意图；
图中：1、阳性对照；2、免疫共沉淀复合物+羊二抗；3、免疫共沉淀复合物+CD103商品化多抗+羊二抗；4、免疫共沉淀复合物+8C10+鼠二抗。
图9是本发明实施例提供的临床样本分析外周血IL-33的含量与HBV-ACLF的发生及人工肝支持系统治疗效果的分析示意图。
图10是本发明实施例提供的免疫荧光法检测表明坏死组织IL-33表达升高示意图；a：非坏死组织中IL-33的表达情况；b：坏死组织中IL-33的表达情况。
图11是本发明实施例提供的免疫荧光分析IL-33与CD11b，CD3，CD31及FSP1的关系示意图。
图12是本发明实施例提供的敲除ST2对ACLF的影响示意图；a：生存曲线分析WT小鼠和ST2-/-小鼠在LF和ACLF模型中的生存率；b-e：CD45，CD4，CD8，CD103和IFN-γ在LF和ACLF小鼠肝组织中的流式图；f-j：统计学分析CD45+细胞，CD103+CD4+细胞，CD103+CD8+细胞，CD103+IFN-γ+CD4+细胞和CD103+IFN-γ+CD8+细胞的表达量。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种慢加急肝衰检测试剂盒及其制备方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的慢加急肝衰检测试剂盒的制备方法包括以下步骤：
S101，进行人CD103单克隆抗体的制备；
S102，进行CD103流式抗体检测试剂盒的制备；
S103，进行IL-33Elisa检测试剂盒的制备；
S104，将S102和S103得到的数据代入自主建立的慢加急肝衰预测工具进行慢加急肝衰预测。
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
在前期研究发现白介素33(IL-33)与肝细胞的坏死存在相关性，并通过一系列实验证明坏死的肝脏组织会释放大量的IL-33，IL-33/ST2信号通路的活化可以促进CD8+T细胞表面CD103表达升高并分泌IFN-γ，最终导致ACLF的发生；因此推测通过检测患者外周血中CD8+T细胞和Treg(CD3+CD25high)细胞表面CD103的表达联合血清中IFN-γ，IL-33和sST2含量的变化，预判人工肝治疗肝衰竭的效果和预后。
正是在此基础上首先制备了CD103单克隆抗体，同时收集HBV-ACLF患者人工肝支持系统(Artificial liver support system，ALSS)治疗前，治疗后和慢性乙肝患者(Chronic hepatitis B patients，CHB)的外周血，利用自主构建的人CD103流式抗体的辅以CD3流式抗体，CD8流式抗体，CD25流式抗体以及人IFN-γ，人IL-33，人ST2的自制检测试剂盒，分析发现HBV-ACLF患者发生肝衰前12小时外周血中CD8+T细胞表面CD103表达升高，同时IL-33的表达水平也明显高于CHB患者；进一步分析发现ALSS治疗效果好的HBV-ACLF患者ALSS治疗前外周血CD8+T细胞表面CD103表达和IL-33明显低于治疗效果差的患者；通过随访还发现ALSS治疗后IL-33再次升高且外周血Treg(CD3+CD25+)细胞表面CD103表达升高的患者易发生感染预后差。因此利用本发明可以预判慢性肝病患者发生肝衰的几率，提高临床的治疗效果。
本发明实施例提供的慢加急肝衰检测试剂盒的制备方法包括以下步骤：
1、人CD103单克隆抗体的制备
1.1人CD103/L929基因转染细胞膜表面GFP的表达
常规脂质体法将重组表达载体pIRES2-EGFP-CD103-Fc转染L929细胞，转基因L929细胞置于G418选择性培养基中筛选，选择单克隆集落较大的细胞进行扩大培养。获得的抗药性L929细胞经流式细胞术检测，结果显示绿色荧光蛋白(GFP)报告基因得到了较高的表达(见图2)，表明导入的外源基因在细胞基因组中得到了稳定整合和表达。
1.2 RT-PCR及Western-blot法检测L929/CD103细胞中人CD103基因的转录
选择高表达GFP的基因转染细胞株扩大培养后，通过RT-PCR及Western-blot法在基因和蛋白水平检测人CD103的表达。RT-PCR结果显示，转基因细胞中能扩增出大约1000bp左右的目的片段，而阴性对照无特异性条带产生。Western-blot检测显示表明L929/CD103的细胞裂解液能与CD103商品化多抗反应产生特异性条带，而L929/mock则没有对应条带。由此证明导入的外源性人CD103基因已整合到L929细胞基因组中，并能很好地转录成相应的mRNA和蛋白(见图3)。
1.3特异性分泌鼠抗人CD103单抗的杂交瘤细胞株的建立
利用已构建成功的能稳定表达人CD103分子的转基因细胞，按常规方法进行细胞融合，将复测为阳性的杂交瘤细胞3次克隆化培养，获得1株能持续分泌特异性鼠抗人CD103分子的杂交瘤细胞株，命名为12C8。该单抗能特异性结合CD103，阳性率为95.4％，而不与L929/mock细胞结合。该杂交瘤细胞株经体外连续传代(50代)培养，液氮冻存半年后复苏，仍生长良好并稳定分泌抗体。
将L929/mock、L929/CD103、L929/BTLA和L929/CD28基因转染细胞与12C8反应进行免疫荧光标记，如图4所示。
1.4单抗的Ig亚型、效价、特异性鉴定及Ig类别、特异性鉴定及杂交瘤的核型分析
快速定性试纸法鉴定表明，12C8重链为IgGl，轻链则为κ(见图5)。染色体数目超过100(见图6)采用本室建立的腹水诱生方法生产单克隆抗体，腹水纯化后单抗蛋白含量在2.15mg/ml。免疫荧光法分析结果表明，纯化后单抗的效价为1：1000以上，抗体用于间接免疫荧光分析的用量为0.2～2μg/106细胞(见图7)。IP-Westernblot显示单克隆抗体12C8与商品化多抗识别的为同一分子，表明这株单抗具有特异性的识别CD103分子的特性(见图8)。
2、CD103流式抗体检测试剂盒的研制
1.CD3-APC、CD8-PerCP、CD25-FITC和人CD103-PE鼠抗人抗体。
2.FACS Calibur流式细胞仪购自美国BD公司。
3.溶血素
准备试剂与收集血样
1.采用乙二胺四乙酸二钾(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA-K2)真空采血管(美国BD公司)采集研究对象静脉血2ml，6h内取100出样本进行检测处理。
2.10×溶血素用蒸馏水作1：10倍稀释(示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水)。
操作程序
1.取对照管与测定管各1管，分别加入全血100μL，对照管依次加入CD3-APC、CD8-PerCP、CD25-FITC和鼠IgG2a-PE各10μL；测定管依次加入CD3-APC、CD8-PerCP、CD25-FITC和鼠抗人CD103-PE各10μL，室温避光孵育15min。加入FACS 1：10稀释溶血素2ml，混匀，室温避光反应15～20min。1300r/min离心5min，弃上清液；加PBS 2ml混匀，1300r/min离心5min，弃上清液；加入PBS 500μL重悬，应用流式细胞仪检测和分析。
2.流式细胞仪检测CD103的表达：采用CellQuest软件处理，在前向角散射光(forward scatter，FSC)、侧向角散射光(side scatter，SSC)散点图上圈出淋巴细胞，设为R1门，去除碎片和死亡细胞，在R1门的基础上获取CD3+CD8+T细胞，建立逻辑门获取目标细胞CD103的表达。
3.结果计算与判断。
3、IL-33Elisa检测试剂盒
本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗人IL-33单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的IL-33与单抗结合，加入生物素化的抗人IL-33，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，IL-33浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中IL-33浓度。
试剂盒组成(2～8℃保存)
酶标板(CoatedWells)96孔
酶标抗体工作液(Enzyme Conjugate)12ml
10×标本稀释液(Sample Buffer)12ml
20×浓缩洗涤液(Wash Buffer)50ml
标准品(Standards)：20ng/瓶2瓶
底物工作液(TMB Solution)12ml
第一抗体工作液(BiotinylatedAntibody)12ml
终止液(Stop Solution)12ml
准备试剂与收集血样
1.收集标本：血清、血浆(EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝)、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2～8℃保存48小时；更长时间须冷冻(-20℃或-70℃)保存，避免反复冻融。
2.标准品液配制：使用前加入1ml蒸馏水混匀，配成20ng/ml的溶液。设标准管8管，第一管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul。在第一管中加入20ng/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。
3.10×标本稀释液用蒸馏水作1：10倍稀释(示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水)。
4.洗涤液：用重蒸水1：20稀释(示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水)
检测程序
1.加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃120分钟。
2.洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，向滤纸上印干。
3.每孔中加入第一抗体工作液100ul。将反应板充分混匀后置37℃60分钟。
4.洗板：同前。
5.每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃30分钟。
6.洗板：同前。
7.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟。
8.每孔加入100ul终止液混匀。
9.30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。
结果计算与判断
1.所有OD值都应减除空白值后再行计算。
2.以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。
3.根据样品OD值在该曲线图上查出相应IL-33含量。
试剂盒性能
1.灵敏度：最小的IL-33检测浓度小于1pg/ml。
2.特异性：可同时检测重组或天然的人IL-33。不与人其它细胞因子有交叉反应。
3.重复性：板内、板见变异系数均小于10％。
4、结果判断
1.慢性肝衰患者外周血IL-33>5pg/mL且CD3+CD8+CD103+/CD3+CD8+>5％时慢性肝病患者发生肝衰几率>50％。
2.经人工肝治疗后患者24h内IL-33>5pg/mL且CD3+CD8+CD103+/CD3+CD8+>5％时患者死亡率>66％。
注意事项
1.以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。
2.洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致精确度误差及OD值错误地升高。
3.板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。
4.本试剂盒宜置4℃冰箱保存。
5.本试剂盒仅用于科研，不能用于临床诊断。
下面结合实验对本发明的技术效果作详细的描述。
(1)临床样本分析外周血IL-33的含量与HBV-ACLF发生的关系及ALSS治疗效果的分析。临床收集HBV-ACLF患者ALSS治疗前，治疗后和慢性乙肝患者(Chronic hepatitis B，CHB)的外周血，利用ELISA分析发现HBV-ACLF患者ALSS治疗前外周血IL-33的表达水平明显高于CHB患者；进一步分析发现ALSS治疗效果好的HBV-ACLF患者ALSS治疗前外周血IL-33明显低于治疗效果差的患者；通过随访还发现ALSS治疗后IL-33再次升高的患者预后差(图9)。
图9临床样本分析外周血IL-33的含量与HBV-ACLF的发生及人工肝支持系统治疗效果的分析。a：CHB患者和HBV-ACLF患者血清中IL-33的含量；b：ALSS治疗效果好和差的患者血清中IL-33的含量；c：9名HBV-ACLF患者血清中IL-33随时间变化的情况。
(2)免疫荧光法检测表明坏死肝组织IL-33表达升高。在坏死肝组织中IL-33表达升高(图10)而在非坏死组织中则没有这种现象(图10)。
图10免疫荧光法检测表明坏死组织IL-33表达升高。a：非坏死组织中IL-33的表达情况；b：坏死组织中IL-33的表达情况。
(3)免疫荧光分析发现坏死肝脏组织中IL-33不来自固有免疫细胞(CD11b+)，T细胞(CD3+)，血管内皮细胞(CD31+)和纤维细胞(FSP1+)等细胞(图11)。
图11免疫荧光分析IL-33与CD11b，CD3，CD31及FSP1的关系。
(4)ST2可能通过调控CD103+CD8+T细胞的功能参与ACLF的发生。利用WT小鼠和ST2-/-小鼠构建LF及ACLF动物模型，随访发现当敲除ST2后ACLF的生存率升高(图12的a)。与LF小鼠的非坏死肝组织比较，WT小鼠坏死组织中CD45+细胞，CD103+CD4+T细胞，CD103+CD8+T细胞，CD103+IFN-γ+CD4+T细胞和CD103+IFN-γ+CD8+T细胞比例增多，当敲除ST2后则没有这些现象出现(图12的b-j)。
图12敲除ST2对ACLF的影响。a：生存曲线分析WT小鼠和ST2-/-小鼠在LF和ACLF模型中的生存率；b-e：CD45，CD4，CD8，CD103和IFN-γ在LF和ACLF小鼠肝组织中的流式图；f-j：统计学分析CD45+细胞，CD103+CD4+细胞，CD103+CD8+细胞，CD103+IFN-γ+CD4+细胞和CD103+IFN-γ+CD8+细胞的表达量。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种慢加急肝衰检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述慢加急肝衰检测试剂盒的制备方法包括以下步骤：
步骤一，进行人CD103单克隆抗体的制备；
步骤二，进行CD103流式抗体检测试剂盒的制备；
步骤三，进行IL-33Elisa检测试剂盒的制备；
步骤四，将步骤二和步骤三得到的数据代入自主建立的慢加急肝衰预测工具进行慢加急肝衰预测。
2.如权利要求1所述的慢加急肝衰检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述人CD103单克隆抗体的制备，包括：
(1)人CD103/L929基因转染细胞膜表面GFP的表达；
(2)利用RT-PCR及Western-blot法检测L929/CD103细胞中人CD103基因的转录；
(3)特异性分泌鼠抗人CD103单抗的杂交瘤细胞株的建立；
(4)单抗的Ig亚型、效价、特异性鉴定及Ig类别、特异性鉴定及杂交瘤的核型分析。
3.如权利要求2所述的慢加急肝衰检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述人CD103/L929基因转染细胞膜表面GFP的表达，包括：
常规脂质体法将重组表达载体pIRES2-EGFP-CD103-Fc转染L929细胞，转基因L929细胞置于G418选择性培养基中筛选，选择单克隆集落较大的细胞进行扩大培养；获得的抗药性L929细胞经流式细胞术检测，结果显示绿色荧光蛋白GFP报告基因得到较高的表达，表明导入的外源基因在细胞基因组中得到稳定整合和表达。
4.如权利要求2所述的慢加急肝衰检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述利用RT-PCR及Western-blot法检测L929/CD103细胞中人CD103基因的转录，包括：
选择高表达GFP的基因转染细胞株扩大培养后，通过RT-PCR及Western-blot法在基因和蛋白水平检测人CD103的表达；RT-PCR结果显示，转基因细胞中能扩增出1000bp的目的片段，而阴性对照无特异性条带产生；Western-blot检测显示表明L929/CD103的细胞裂解液能与CD103商品化多抗反应产生特异性条带，而L929/mock则没有对应条带；由此证明导入的外源性人CD103基因已整合到L929细胞基因组中，并能很好地转录成相应的mRNA和蛋白。
5.如权利要求2所述的慢加急肝衰检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述特异性分泌鼠抗人CD103单抗的杂交瘤细胞株的建立，包括：
利用已构建成功的能稳定表达人CD103分子的转基因细胞，进行细胞融合，将复测为阳性的杂交瘤细胞3次克隆化培养，获得1株能持续分泌特异性鼠抗人CD103分子的杂交瘤细胞株，命名为12C8；
该单抗能特异性结合CD103，阳性率为95.4％，而不与L929/mock细胞结合；该杂交瘤细胞株经体外连续传代50代培养，液氮冻存半年后复苏，仍生长良好并稳定分泌抗体；将L929/mock、L929/CD103、L929/BTLA和L929/CD28基因转染细胞与12C8反应进行免疫荧光标记，该抗体只与L929/CD103结合而不与其他细胞结合。
6.如权利要求2所述的慢加急肝衰检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述单抗的Ig亚型、效价、特异性鉴定及Ig类别、特异性鉴定及杂交瘤的核型分析，包括：
快速定性试纸法鉴定表明，12C8重链为IgGl，轻链则为κ；染色体数目超过100采用本室建立的腹水诱生方法生产单克隆抗体，腹水纯化后单抗蛋白含量在2.15mg/ml；免疫荧光法分析结果表明，纯化后单抗的效价为1：1000以上，抗体用于间接免疫荧光分析的用量为0.2～2μg/106细胞；IP-Western blot显示单克隆抗体12C8与商品化多抗识别的为同一分子，表明这株单抗具有特异性的识别CD103分子的特性。
7.如权利要求1所述的慢加急肝衰检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述CD103流式抗体检测试剂盒的制备，包括：
(1)取对照管与测定管各1管，分别加入全血100μL，对照管依次加入CD3-APC、CD8-PerCP、CD25-FITC和鼠IgG2a-PE各10μL；测定管依次加入CD3-APC、CD8-PerCP、CD25-FITC和鼠抗人CD103-PE各10μL，室温避光孵育15min；加入溶血素2ml，混匀，室温避光反应15～20min；1300r/min离心5min，弃上清液；加PBS 2ml混匀，1300r/min离心5min，弃上清液；加入PBS 500μL重悬，应用流式细胞仪检测和分析；
(2)流式细胞仪检测CD103的表达：采用CellQuest软件处理，在前向角散射光FSC、侧向角散射光SSC散点图上圈出淋巴细胞，设为R1门，去除碎片和死亡细胞，在R1门的基础上获取CD3+CD8+T细胞，建立逻辑门获取目标细胞CD103的表达，并进行结果计算与判断。
8.如权利要求1所述的慢加急肝衰检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述IL-33Elisa检测试剂盒的制备，包括：
采用双抗体夹心ABC-ELISA法，用抗人IL-33单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的IL-33与单抗结合，加入生物素化的抗人IL-33，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，IL-33浓度与OD值成正比，通过绘制标准曲线求出标本中IL-33浓度。
9.如权利要求1所述的慢加急肝衰检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述IL-33Elisa检测试剂盒的制备，还包括：
(1)准备试剂与收集血样
①收集标本：将血清、血浆、细胞培养上清液和组织匀浆尽早检测，2～8℃保存48h；更长时间须-20℃或-70℃冷冻保存，避免反复冻融；其中，所述血浆包括EDTA、柠檬酸盐和肝素抗凝；
②标准品液配制：使用前加入1ml蒸馏水混匀，配成20ng/ml的溶液；设标准管8管，第一管加标本稀释液900ul，第二至第八管加入标本稀释液500ul；在第一管中加入20ng/ml的标准品溶液100ul混匀后用加样器吸出500ul，移至第二管；如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去；第八管为空白对照；
③10×标本稀释液用蒸馏水作1：10倍稀释；
④洗涤液：用重蒸水1：20稀释；
(2)检测程序
①加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置于37℃120min；
②洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，向滤纸上印干；
③每孔中加入第一抗体工作液100ul，将反应板充分混匀后置37℃60min；
④洗板；
⑤每孔加酶标抗体工作液100ul，将反应板置37℃30min；
⑥洗板；
⑦每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15min；
⑧每孔加入100ul终止液混匀；
⑨30min内用酶标仪在450nm处测吸光值。
10.一种实施权利要求1～9任意一项所述的慢加急肝衰检测试剂盒的制备方法制备得到的慢加急肝衰检测试剂盒，其特征在于，所述慢加急肝衰检测试剂盒，由96孔酶标板、12ml的酶标抗体工作液、12ml的10×标本稀释液、50ml的20×浓缩洗涤液、20ng/瓶2瓶的标准品、12ml的底物工作液、12ml的第一抗体工作液以及12ml的终止液组成，于2～8℃保存。
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