CN112358546B - 杂交瘤细胞株9c1、plgf-1单克隆抗体及其应用 - Google Patents

杂交瘤细胞株9c1、plgf-1单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了杂交瘤细胞株9C1、PLGF‑1单克隆抗体及其制备方法和应用，PLGF‑1单克隆抗体由单克隆抗体杂交瘤细胞株9C1分泌，于2019年9月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2019216。本发明针对PLGF‑1重组蛋白制备出的单克隆抗体对PLGF‑1抗原具有较高的特异性和灵敏度，为胎盘生长因子的功能研究和开发以及相应的诊断试剂的研制奠定基础。

Description

杂交瘤细胞株9C1、PLGF-1单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及杂交瘤细胞株9C1、PLGF-1单克隆抗体及其制备方法和应用。
背景技术
在子宫螺旋动脉重塑过程中，合体滋养层细胞分泌胎盘生长因子(placentalgrowth factor，PLGF-1)，促进血管生成，改善血流灌注，正常妊娠时，健康孕妇血清在孕5～15周PLGF-1水平低，15-26周PLGF-1表达迅速增加，在妊娠28～30周达高峰，之后胎盘逐渐成熟老化，PLGF-1水平也随之明显下降。胎盘形成缺陷时PLGF-1水平显著降低，导致胎盘发育不良，引起胎盘功能不全，难以给胎儿提供充分的养分和氧气，可能引发一系列的疾病，诸如流产、妊娠期高血压、先兆子痫(preeclampsia，PE)、胎儿生长受限和早产等，情况严重时还会引起相关并发症，诸如死胎、子痫、HELLP综合征和胎盘早剥等，与传统诊断方式相比，PLGF-1浓度值的下降比高血压和蛋白尿的出现要早9～11周，可在疾病发病前五周内浓度有较集中的体现。
目前检测PLGF-1的方法有酶联免疫法、使用微流控的荧光免疫法，然而PLGF-1浓度在血清中含量较低，对相应的检测抗体要求高。因而开发一种快速、灵敏的抗人胎盘生长因子-1抗体及发展一种有望用于临床诊断的抗人胎盘生长因子-1抗体迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的是提供杂交瘤细胞株9C1，该杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2019年9月11日，保藏编号为：CCTCC NO：C2019216。
本发明的又一目的是提供一种抗人胎盘生长因子-1的单克隆抗体，它是由保藏编号为：CCTCC NO：C2019216的杂交瘤细胞株9C1分泌，其重链氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO.1所示，轻链氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型。
本发明的另一目的是提供上述抗人胎盘生长因子-1的单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
(1)抗原制备：PLGF-1重组蛋白含有132个氨基酸(GenBank登录号：P49763.2)，利用大肠杆菌表达获得，该蛋白的制备由上海普欣生物技术有限公司完成；
(2)小鼠免疫：选择6周龄的BALB/C小鼠，以PLGF-1重组蛋白为抗原对小鼠进行免疫，每只小鼠以100ug的抗原肽混合佐剂后大腿内侧肌肉注射免疫，第21天后再免疫一次；第3次加强免疫3天后用于融合；
(3)小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使其保持良好的生长状态用于杂交瘤细胞融合；
(3)细胞融合：采用聚乙二醇细胞融合法，以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，接种BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞于96孔培养板，含20％小牛血清的HAT培养基培养一天，将步骤(2)中备好的小鼠处死，获取脾脏淋巴细胞，收集步骤(3)中的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，将上述两种细胞混合离心，然后以聚乙二醇介导细胞融合，融合后的细胞用细胞培养基稀释，接种至饲养细胞培养板，置37℃5％CO2培养箱中培养；
(4)杂交瘤细胞的筛选：培养上述培养物，在细胞集落长到大小合适时，吸取细胞培养上清液做抗体鉴定，筛选阳性克隆；
(5)杂交瘤细胞的克隆化：以有限稀释法克隆阳性的杂交瘤细胞，将稀释到一定密度的细胞接种至96孔细胞培养板，使每孔只有一个细胞生长；形成细胞集落的孔取培养上清液做酶联免疫吸附检测(ELISA)，筛选和鉴定阳性克隆；重复克隆若干次，直到杂交瘤细胞的阳性孔率达到100％；
(6)诱生腹水：在接种杂交瘤细胞前1周，给BALB/C小鼠腹腔注射降植烷每只0.5ml，然后每只接种生长良好的5×106个阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水离心，测定抗体效价；
(7)单克隆抗体的纯化：利用Protein G亲和纯化法纯化腹水中的单克隆抗体；
(8)单克隆抗体的亚型鉴定：采用Serotec公司的小鼠单克隆抗体免疫球蛋白分型试剂盒分析，将纯化的单抗作适当稀释后进行检测，操作严格按试剂盒说明书进行，杂交瘤细胞株9C1分泌的单克隆抗体为IgG1、κ型，与抗PLGF-1抗原具有高的特异性和灵敏性。
本发明具有有益效果：本发明杂交瘤细胞9C1，分泌PLGF-1单克隆抗体高效稳定，经液氮冻存复苏后生长良好，抗体分泌未见衰退；本发明PLGF-1单克隆抗体与PLGF-1抗原具有高的特异性和灵敏性，可用于制备对临床和实验室定性和定量检测的检测试剂，检测结果为临床提供实验室诊断依据，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为重组人PLGF-1(rHuPLGF-1)电泳图。其中1是蛋白Marker，2和3为rHuPLGF-1蛋白。
图2为间接ELISA法检测PLGF-1单克隆抗体的灵敏度。
图3为化学发光法检测PLGF-1单克隆抗体的准确度。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。
实施例1
PLGF-1单克隆抗体的制备，步骤如下：
(1)抗原制备：PLGF-1重组蛋白含有132个氨基酸(GenBank登录号：P49763.2)，利用大肠杆菌表达获得，SDS-PAGE结果显示重组蛋白分子量约为15kDa(图1)，该蛋白的制备由上海普欣生物技术有限公司完成；
(2)小鼠免疫：选择6周龄的BALB/C小鼠，以PLGF-1重组蛋白为抗原对小鼠进行免疫，每只小鼠以100ug的抗原肽混合佐剂后大腿内侧肌肉注射免疫，第21天后再免疫一次；第3次加强免疫3天后用于融合；
(3)小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使其保持良好的生长状态用于杂交瘤细胞融合；
(3)细胞融合：采用聚乙二醇细胞融合法，以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，接种BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞于96孔培养板，含20％小牛血清的HAT培养基培养一天，将步骤(2)中备好的小鼠处死，获取脾脏淋巴细胞，收集步骤(3)中的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0，将上述两种细胞混合离心，然后以聚乙二醇介导细胞融合，融合后的细胞用细胞培养基稀释，接种至饲养细胞培养板，置37℃5％CO2培养箱中培养；
(4)杂交瘤细胞的筛选：培养上述培养物，在细胞集落长到大小合适时，吸取细胞培养上清液做抗体鉴定，筛选阳性克隆；
(5)杂交瘤细胞的克隆化：以有限稀释法克隆阳性的杂交瘤细胞，将稀释到一定密度的细胞接种至96孔细胞培养板，使每孔只有一个细胞生长；形成细胞集落的孔取培养上清液做酶联免疫吸附检测(ELISA)，筛选和鉴定阳性克隆；重复克隆若干次，直到杂交瘤细胞的阳性孔率达到100％；
(6)诱生腹水：在接种杂交瘤细胞前1周，给BALB/C小鼠腹腔注射降植烷每只0.5ml，然后每只接种生长良好的5×106个阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水离心，测定抗体效价；
(7)单克隆抗体的纯化：利用Protein G亲和纯化法纯化腹水中的单克隆抗体。
(8)单克隆抗体的亚型鉴定：采用Serotec公司的小鼠单克隆抗体免疫球蛋白分型试剂盒分析，将纯化的单抗作适当稀释后进行检测，操作严格按试剂盒说明书进行，杂交瘤细胞株9C1分泌的单克隆抗体为IgG1、κ型，与PLGF-1抗原具有高的特异性和灵敏性。
杂交瘤细胞株9C1已由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏；地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2019年9月11日；保藏编号为：CCTCC NO：C2019216。
实施例2
本实施例中采用间接ELISA法检测PLGF-1单克隆抗体特异性和灵敏度，步骤如下：
(1)用CBS(碳酸盐缓冲液)将PlGF-1重组蛋白梯度稀释(1000ng/ml开始两倍梯度稀释)，加入96孔酶标板中(100μl/孔)，4℃包被过夜；
(2)PBST(含吐温-20的磷酸盐缓冲液)洗涤三次，每次5min；
(3)加入封闭液(含5％牛血清白蛋白的PBS)置于37℃封闭1h，PBST洗涤；
(4)加入PBS(磷酸盐缓冲液)梯度稀释的抗体(500ng/ml开始两倍梯度稀释)每孔100μl，阴性对照为PBS，37℃孵育1h，PBST洗涤；
(5)加入HRP标记的羊抗鼠二抗，每孔100μl，37℃孵育45min，PBST洗涤；
(6)加入TMB显色液，37℃孵育15min，加入2M硫酸溶液终止，酶标仪读数(450nm)。
结果如图2、表1所示，本次实验中，抗体浓度500ng/ml时，重组蛋白浓度在32.2ng/ml时仍然OD值仍然呈明显的阳性信号。针对单个浓度的重组蛋白进行测试，9C1在≥250ng/ml浓度呈现显著的敏感度。
表1 OD值
Figure GDA0003470227250000071
采用化学发光法检测PLGF-1单克隆抗体的准确性，步骤如下：
(1)单抗9C1标记生物素，PLGF商用抗体(Human PlGF Antibody(R&D systerms，货号AF-264-PB)标记吖啶酯；
(2)磁珠用稀释液稀释至1mg/ml；
(3)标记后的抗体用抗体稀释液稀释至500ng/ml；
(4)抗体和磁珠分别装到试剂盒中；
(5)孕妇血样样本利用罗氏人胎盘生长因子(PIGF)电化学发光试剂盒进行赋值；
(6)将试剂盒插入全自动化学发光仪，血样样本插入样本槽中；
(7)设置一步法检测样本；
结果如表2、图3所示，线性方程为y＝1150.1x-2509.1，R2＝0.9906。
表2
样本编号 plgf浓度(pg/ml) 检测结果
6 1197 1336969
5 902.4 1112826
4 669.5 743862
3 500.7 604021
2 392.8 419783
1 368 383987
0 0 16169
本发明采用间接ELISA法是将细胞融合后所得的杂交瘤细胞培养上清液与PLGF-1抗原于96孔酶标板中反应，继而加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体，450nm工作波长测定各孔光吸收值，筛选得到分泌抗PLGF-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，标记为9C1。经免疫学检测筛选方法，筛选出分泌抗PLGF-1单克隆抗体的杂交瘤细胞，其分泌的抗体即为抗PLGF-1的单克隆抗体。
本发明针对PLGF-1制备出的单克隆抗体对检测PLGF-1蛋白具有较高的准确度、特异性和灵敏度，该抗体的应用将为PLGF-1的功能研究和开发基于PLGF-1的诊断试剂奠定基础。
序列表
<110> 宁波奥丞生物科技有限公司
<120> 杂交瘤细胞株9C1、PLGF-1单克隆抗体及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 1
Met Ala Pro Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln Gly
1 5 10 15
Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ile Pro Ser Ser Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile
35 40 45
Ser Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys
50 55 60
Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn
85 90 95
Leu Glu Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Tyr Ser Lys
100 105 110
Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala
115 120 125
Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu
130 135 140
Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn
165 170 175
Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
180 185 190
Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His
195 200 205
Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile
210 215 220
Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230
<210> 2
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工合成(Artificial synthesis)
<400> 2
Met Ala Val Leu Gly Leu Leu Phe Cys Leu Val Thr Phe Pro Ser Cys
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Thr Thr Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Leu Gly Val Met Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala
65 70 75 80
Gly Phe Ile Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
85 90 95
Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asn Asp Thr Ala Ile Tyr
100 105 110
Phe Cys Ala Arg Asn Gly Tyr His Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
115 120 125
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr
130 135 140
Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu
145 150 155 160
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp
165 170 175
Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
180 185 190
Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser
195 200 205
Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser
210 215 220
Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys
225 230 235 240
Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro
245 250 255
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser
260 265 270
Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp
275 280 285
Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr
290 295 300
Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val
305 310 315 320
Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu
325 330 335
Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg
340 345 350
Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val
355 360 365
Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr
370 375 380
Cys Met Val Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr
385 390 395 400
Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu
405 410 415
Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys
420 425 430
Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu
435 440 445
Gly Leu His Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly
450 455 460
Lys
465

Claims (5)

1.杂交瘤细胞株9C1，其特征在于，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：C2019216。
2.PLGF-1单克隆抗体，其特征在于，其由权利要求1所述的保藏编号为：CCTCC NO：C2019216的杂交瘤细胞株9C1产生。
3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株9C1在制备PLGF-1单克隆抗体中的应用。
4.权利要求2所述的PLGF-1单克隆抗体在制备抗人胎盘生长因子-1检测试剂中的应用。
5.一种检测试剂，其特征在于，所述检测试剂包括权利要求2所述的PLGF-1单克隆抗体。
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