CN113801226A - 抗人PlGF鼠源单克隆抗体及应用 - Google Patents

抗人PlGF鼠源单克隆抗体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了抗人PlGF鼠源单克隆抗体，包括Pl‑Ab1和Pl‑Ab2，此抗体对PlGF蛋白具有很强的亲和力和特异性。此外，本发明还公开了利用此抗体制备的化学发光试剂盒，具有较高的灵敏度强和精密度，可满足应用需求。可填补相应的原料需求，促进相应检测的完善，有利于子痫前期的预防和治疗，提高生育质量。

Description

抗人PlGF鼠源单克隆抗体及应用
技术领域
本发明属于抗体的制备及序列测定领域，具体涉及抗人PlGF鼠源单克隆抗体及应用。
背景技术
子痫前期是一种常见的产科疾病，约影响2%-8%的妊娠女性，在我国的发病率约为9.4%。是一种多系统进展性疾病，其主要特征是在人生后半期或产后新发高血压和蛋白尿，或者表现为新发高血压和显著的终末器官功能障碍，伴有或不伴有蛋白尿。此疾病的主要病因为胎盘及母体血管功能障碍，分娩后会消退,但消退时间不确定。
胎盘生长因子(Placental growth factor,PlGF)是妊娠期重要的细胞因子，在胎儿胎盘循环过程中发挥着促进血管生成的重要作用。目前研究表明妊娠期女性血液中PlGF浓度水平的下降发生时间要早于子痫前期临床症状的发生，是较理想的子痫前期发生预测指标。正常情况下，PlGF在胎盘和母体血液中呈现高表达量，且伴随妊娠期浓度水平逐渐上升。妊娠期前三个月PlGF浓度较低，从第11-12周开始增加，并且在第30周达到峰值，之后快速下降。而在子痫前期患者中，母体血清PlGF水平低于正常妊娠女性；且子痫前期病情发展程度与PlGF水平表现出相关性。Levine等研究表明PlGF浓度的降低比高血压和蛋白尿病症的出现要早9-11周，同时可溶性类fms酪氨酸激酶-1（sFLT-1）浓度水平升高，sFLT-1/PlGF值可评估子痫前期和妊娠结局。综上，对PlGF浓度水平的监控，有利于子痫前期的临床预防和治疗，可减少不良妊娠结局的发生。
而对临床血液样本中PlGF浓度水平的检测可基于于免疫学方法，比如在化学发光平台，借助于两株高特异性和亲和力的抗体对PlGF蛋白进行夹心法测定。目前国内外对针对PlGF蛋白的优质单克隆抗体具有较大的需求。
发明内容
为解决市场上对抗体原料的需求问题，本发明提供了抗人PlGF鼠源单克隆抗体，可填补相应的原料需求，促进相应检测的完善，有利于子痫前期的预防和治疗，提高生育质量。
同时提供检测人PlGF检测试剂盒，该试剂盒基于磁微粒化学发光法，结合市场上现有发光检测仪器，可实现操作方便、结果准确。
本发明提供如下技术方案：
抗人PlGF鼠源单克隆抗体，包括Pl-Ab1和Pl-Ab2，
所述Pl-Ab1重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述单克隆抗体Pl-Ab2重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
抗人PlGF鼠源单克隆抗体在制备子痫前期辅助检测诊断试剂中的应用。
抗人PlGF鼠源单克隆抗体用于体外诊断检测试剂盒。
检测人PlGF的检测试剂盒，为磁微粒化学发光法检测试剂盒，使用Pl-Ab1和Pl-Ab2作为包被和检测抗体。
采用重组表达基因工程技术在生物反应器中表达目的蛋白，并将表达产物纯化；使用目标蛋白免疫小鼠，并利用杂交瘤融合技术构建和筛选分泌针对目标蛋白PlGF抗体的细胞株，经多次亚克隆后筛选得到高亲和力和特异性的单克隆抗体配对组合；同时本发明基于上述两株单克隆抗体，提供了一种磁珠化学发光法检测试剂盒，性能良好，可满足相应的临床需求。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了抗人PlGF的单克隆抗体，此抗体组合具有高亲和力和特异性的特点，同时也提供了基于上述抗体的体外诊断检测试剂盒。本发明解决了目前市场上PlGF检测项目抗体原料和试剂盒的相对短缺的问题，促进妇科子痫前期疾病的预防和诊断，提高生育质量。
附图说明
图1为本发明试剂盒线性与罗氏PlGF试剂盒检测结果相关性。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：重组蛋白表达和纯化
将含有人PlGF基因片段的重组质粒热激转化入大肠杆菌表达体系BL21，在添加抗生素的培养基上挑取单菌落，并在含有卡那霉素抗性的LB液体培养基中扩大培养，按1:200比例转接上述培养基进行诱导表达，当菌液OD值在0.4-0.6之间时，加入IPTG 终浓度为2mM，30℃培养20小时后离心收集菌体，经均质高压机充分破碎，亲和层析镍柱纯化获得重组蛋白。重组蛋白用SDS-PAGE法检定相应纯度＞95%，可用于小鼠免疫。
实施例2：动物免疫与效价检测
取50ug重组抗原与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化后对适龄小鼠进行多点皮下注射；首次免疫后2周后，取30ug抗原与等体积的弗氏不完全佐剂充分混合乳化后对小鼠进行皮下多点注射；二次免疫1周后，取30ug抗原与等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后对小鼠进行皮下多点注射，注射7天后对小鼠尾静脉采血测效价；对于三次免疫效价复合的小鼠，取30ug抗原进行腹腔注射作为加强免疫。
将符合要求的小鼠处死取淋巴细胞。以50%PEG 4000作为融合剂，在37℃水浴条件下，骨髓瘤细胞和淋巴细胞两种细胞融合比例为1:3-1:5，将50%PEG在1min中加入到混匀且弃上清的脾脏细胞与骨髓瘤细胞细胞团中，震荡1min后静止2min，然后加入10ml无血清1640培养基。离心弃上清，用添加有HAT的1640培养基重悬细胞。融合后将细胞放置到CO2培养箱中37度培养7-9天，观察融合状态。10天开始采用间接ELISA板进行筛选。对初步筛选的阳性克隆挑选阳性强和稀薄数较多的细胞株利用有限稀释法进行4次亚克隆。通过上述筛选过程，获得两株高亲和力和且能稳定分泌抗体的细胞株，相应的抗体株分别编码为Pl-Ab1和Pl-Ab2。
实施例3：单克隆抗体的制备
选取6-8周生长发育正常的BALB/c小鼠，每只小鼠首先腹腔注射0.5ml弗氏不完全佐剂；10天后进行腹腔注射2x106个杂交瘤细胞。小鼠接种杂交瘤细胞7-9天后可产生腹水，观察小鼠健康状况及腹水生产量；在腹水生产量较多而小鼠健康较差时处死小鼠，收集相应的腹水。
用3倍体积的50mM醋酸缓冲液（pH=4.0）稀释收集的小鼠腹水。在混合溶液中加入终浓度为3%的正辛酸沉淀腹水杂质。14500rpm低温4℃离心30min，取上清溶液。用1M的氢氧化钠溶液调节pH 至7.4。将溶液通过平衡后的proteinA/G层析柱，使用磷酸盐溶液冲洗后利用0.1M Gly-Hcl（pH=2.8）溶液洗脱，洗脱产物用1M tris-HCL（pH=9.0）调节pH至7.5。
实施例4：磁微粒化学发光法检测试剂盒制备
在本实施例中，以Pl-Ab1作为捕获抗体标记至磁珠表面，以Pl-Ab2作为检测抗体标记吖啶酯，标记后优化缓冲体系和抗体使用浓度，最终得到良好的反应性能。
1、Pl-Ab1标记磁珠
取2ml活化缓冲液MES于洁净容器中，准确量取5mg羧基磁珠于上述溶液中，充分混合后加入50ul EDC溶液（10mg/ml，须现用现配）后在37℃震荡反应30min；反应结束后使用磁分离架分离磁珠，弃上清；清洗一次后加入50ug抗体，37℃震荡反应3h。反应结束后使用PBST缓冲液清洗3次。最终使用5ml磁珠储存液重悬抗体磁珠，水浴超声一分钟后备用。磁珠储存液：50mM PB、2%Nacl、0.5%Casein、0.1%Tween20、0.1%proclin300。
2、Pl-Ab2标记吖啶酯
使用移液器准确吸取1mg抗体加入到1ml PB反应缓冲液中，加入吖啶酯活性分子，吖啶酯分子和抗体分子的比例为10:1，上述反应体系在37℃条件下反应60min后转移到透析袋中，透析换液5次后回收相应的抗体吖啶酯标记物。将吖啶酯-抗体使用R2配制液稀释至1.2ug/ml，稀释后的溶液即为R2试剂，上述R2配制液配方为20mM Tris、100mM KCl、1.5%BSA、0.2%Tween20、0.16%proclin300。
3、配置校准品和质控品
使用抗原稀释液将抗原分别稀释至0、100、500、1000、5000、10000pg/ml，分装至校准品管中。使用抗原稀释液将抗原稀分别释液至110、1200pg/ml，分装至质控品管中。
上述抗原稀释液配方为50mM PB、150mM Nacl、2%BSA、5%Glycerin、3%procin300,pH=7.5。
4、检测模式
将多次对比和优化，本发明试剂盒较好的检测模式为样本量50ul、磁珠抗体量10ul、吖啶酯抗体R2试剂100ul，上述反应体系在37℃孵育20min后清洗三次后在检测室加入相应的预激发液和激发液。
本发明试剂盒性能评估
精密度：
按照CLSI精密度评估指导文件EP5-A2，取本发明试剂盒在一台仪器上连续20天，每天上下午各运行检测一次，每次检测每个样本重复检测两次，结果见下表，说明本发明的试剂盒精密度良好，可满足对精密度的要求。
Figure 470288DEST_PATH_IMAGE001
本发明提供了抗人PlGF的单克隆抗体，此抗体组合具有高亲和力和特异性的特点，同时也提供了基于上述抗体的体外诊断检测试剂盒。本发明解决了目前市场上PlGF检测项目抗体原料和试剂盒的相对短缺的问题，促进妇科子痫前期疾病的预防和诊断，提高生育质量。
序列表
<110> 南京佰抗生物科技有限公司
<120> 抗人PlGF鼠源单克隆抗体及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Pro Ala Ala Ala Gly Val Gly Leu Gly Gly Ser Gly Pro Gly Leu Val
1 5 10 15
Leu Pro Ser Gly Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Thr Ser
20 25 30
Ile Thr Ser Ala Thr Ala Thr Ala Thr Ile Ala Gly Leu Pro Gly Ala
35 40 45
Leu Leu Gly Thr Met Gly Thr Ile Ser Thr Ser Gly Ser Thr Ser Thr
50 55 60
Ala Pro Ser Leu Leu Ser Ala Ile Ser Ile Thr Ala Ala Thr Ser Leu
65 70 75 80
Ala Gly Pro Pro Leu Gly Leu Ala Ser Val Thr Thr Gly Ala Thr Ala
85 90 95
Thr Thr Thr Cys Ala Ala Ala Gly Gly Ile Thr Thr Thr Pro Ala Thr
100 105 110
Thr Gly Gly Gly Thr Pro Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Pro Ala Ala Ala Ala Ile Gly Leu Thr Gly Ser Pro Ala Ser Leu Ala
1 5 10 15
Val Ser Leu Gly Gly Ala Ala Thr Ile Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser
20 25 30
Val Ala Ser Thr Gly Ala Ser Pro Met His Thr Thr Gly Gly Leu Pro
35 40 45
Gly Gly Pro Pro Leu Leu Leu Ile Thr Leu Ala Ser Ala Leu Gly Ser
50 55 60
Gly Val Pro Ala Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Ala Thr Ala Pro Thr
65 70 75 80
Leu Thr Ile Ala Pro Val Gly Ala Ala Ala Ala Ala Thr Thr Thr Cys
85 90 95
Gly Gly Ala Ala Gly Ala Pro Thr Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Leu
100 105 110
Gly Ile Leu
115
<210> 3
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Pro Ala Ala Ala Gly Val Gly Leu Val Gly Ser Gly Gly Gly Leu Val
1 5 10 15
Gly Pro Leu Gly Ser Leu Leu Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Pro Thr
20 25 30
Pro Ala Thr Thr Ala Met Ala Thr Val Ala Gly Ala Pro Gly Leu Gly
35 40 45
Leu Gly Thr Val Ala Ala Ile Ala Ser Leu Ser Ala Ala Thr Ala Thr
50 55 60
Thr Thr Ala Ala Ser Val Leu Ala Ala Pro Thr Ile Ser Ala Ala Ala
65 70 75 80
Ser Gly Ser Ile Leu Thr Leu Gly Met Ala Ala Leu Leu Thr Gly Ala
85 90 95
Thr Val Met Thr Thr Cys Val Ala His Ala Thr Thr Gly Ser Ser Thr
100 105 110
Pro Ala Thr Thr Gly Gly Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 4
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Pro Ala Ala Ala Ala Ile Gly Leu Thr Gly Pro Pro Ser Thr Leu Ala
1 5 10 15
Ala Ser Pro Gly Gly Thr Ile Thr Ile Ala Cys Ala Ala Ser Leu Ser
20 25 30
Ile Ser Leu Thr Leu Ala Thr Thr Gly Gly Leu Pro Gly Leu Thr Ala
35 40 45
Leu Leu Leu Ile Thr Ser Gly Ser Thr Leu Gly Ser Gly Ile Pro Ser
50 55 60
Ala Pro Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Pro Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gly Pro Gly Ala Pro Ala Met Thr Thr Cys Gly Gly His Ala
85 90 95
Gly Thr Pro Thr Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Leu Gly Ile Leu
100 105 110

Claims (5)

1.抗人PlGF鼠源单克隆抗体，其特征在于：包括Pl-Ab1和Pl-Ab2，
所述Pl-Ab1重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQID NO.2所示；
所述单克隆抗体Pl-Ab2重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.权利要求1所述的抗人PlGF鼠源单克隆抗体在制备子痫前期辅助检测诊断试剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的抗人PlGF鼠源单克隆抗体在制备子痫前期辅助检测诊断试剂中的应用，其特征在于：抗人PlGF鼠源单克隆抗体用于体外诊断检测试剂盒。
4.检测人PlGF的检测试剂盒，其特征在于：含有权利要求1中的抗体。
5.根据权利要求4所述的检测人PlGF的检测试剂盒，其特征在于：试剂盒为磁微粒化学发光法检测试剂盒，使用Pl-Ab1和Pl-Ab2作为包被和检测抗体。
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