CN117590002A - 一种TNFα抗药抗体的检测方法及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及药物检测领域，特别涉及一种TNFα抗药抗体的检测方法及检测试剂盒。本申请提供一种TNFα抗药抗体的检测方法，包括：S1：将包被有TNFα抗体药的Fab和/或F(ab')2段的固相载体和样本中的抗药抗体结合得到免疫复合物；S2：在步骤S1中加入二抗进行检测。本申请的检测方法准确性高，抗干扰能力强。
Description
技术领域
本申请涉及药物检测领域，特别涉及一种TNFα抗药抗体的检测方法及检测试剂盒。
背景技术
治疗性单克隆抗体药物历经40余年的发展，已经成为全球生物制药市场最重要的品类之一。单抗药物具有特异性高、靶向性强和毒副作用低等特点，在疾病治疗上具有广阔的应用前景，现已被用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病和移植排斥反应等多种疾病。
随着单抗药物的临床应用不断扩大，暴露出来的临床问题也逐渐增多，最常见的问题是初始治疗无应答和治疗过程中出现失应答。
发生失应答的原因有两个：第一个是性别、体重和代谢等原因导致的个体差异；第二个原因是血清药物浓度，如果血清药物浓度太低，可能会因免疫原性诱导产生抗药抗体(anti-drug antibody,ADA)。
监测药物浓度和抗药物抗体(ADA)的浓度有助于医生根据患者的个人需求调整治疗方案，并确保长期治疗的成功率。
TNF-α即肿瘤坏死因子α，是TNF超家族的配体。它是一种多效细胞分子，在炎症、细胞凋亡和免疫系统发育中起着核心作用。
TNF-α由巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、CD4+T细胞、NK细胞分泌。许多转化细胞分泌TNF-α。TNF-α属于促炎细胞因子，参与正常炎症反应和免疫反应，可以协同调节其它细胞因子的产生、细胞存活和死亡来协调组织的稳态。
抗-TNFα抗体：英夫利西单抗、依那西普、阿达木单抗和戈利木单抗。药品信息见下表：
其中，英夫利西单抗是第一个在美国上市的TNF-α抑制剂，属于人鼠嵌合单抗。依那西普在1998年在美国上市，是第二个上市的TNF-α抑制剂，通过DNA重组技术融合了TNF-α受体(TNFR2)和人抗体恒定区的融合蛋白，获批之初用于治疗中度到重度的类风湿性关节炎，之后陆续获批多个适应症。阿达木单抗是全球上市的第一个全人源单克隆抗体，也是TNF-α抑制剂中获批最多适应症(10种)的药品。戈利木单抗也是一种全人源化抗TNF-α的单克隆抗体药物。具体抗体结构见图1。
目前市面上的抗药物抗体(ADA)的检测试剂都是采用双抗体夹心法，捕获抗体和检测抗体都是采用相应的抗体药。针对的抗抗体的结合位点是相同的，这必然导致和抗抗体的结合效率不高。
目前市面上的抗药物抗体(ADA)的检测试剂检测的样本都要求样本里的抗体药物浓度不能超过1μg/mL，太高的话会影响检测结果。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本申请的目的在于提供一种TNFα抗药抗体的检测方法及检测试剂盒，用于解决现有技术中的问题。因为抗药物抗体在人体内有的是游离的，有的是和相应的抗体药物结合在一起，本申请检测针对的是人体内游离的抗抗体。
为实现上述目的及其他相关目的，本申请第一方面提供一种TNFα抗药抗体的检测方法，包括以下步骤：
S1：将包被有TNFα抗体药的Fab和/或F(ab')2段的固相载体和样本中的抗药抗体结合得到免疫复合物；
S2：在步骤S1中加入二抗进行检测。
本申请第二方面提供一种TNFα抗药抗体的检测试剂盒，包括包被有TNFα抗体药的Fab和/或F(ab')2段的固相载体、二抗、荧光标记物质。
本申请第三方面提供TNFα抗体药的Fab和/或F(ab')2段或前述的检测试剂盒在制备TNFα抗药抗体检测产品中的应用。
与现有技术相比，本申请的有益效果为：
1、本申请的检测方法准确性高，能更准确全面地检测出抗药抗体。
2、本申请的抗干扰能力强，在抗体药物浓度超过1μg/mL时也可以检测出抗药抗体，检测浓度干扰在10％之内。
附图说明
图1为现有技术中的英夫利西单抗、依那西普、阿达木单抗和戈利木单抗图。
图2为本申请的胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的作用示意图。
图3为本申请实施例5中的校准曲线图。
图4为本申请实施例6的两个试剂相关性的散点图。
具体实施方式
为了使本申请的发明目的、技术方案和有益效果更加清晰，下面结合实施例对本申请作进一步说明。应理解，所述实施例只用于解释本申请，并非用于限定申请的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，熟悉此技术的人士可由本说明所揭露的内容容易地了解本申请的其他优点及功效。
本申请的发明人经过大量探索研究，发现了一种TNFα抗药抗体的检测方法及检测试剂盒，在此基础上完成了本申请。
本申请一方面提供一种TNFα抗药抗体的检测方法，包括以下步骤：
S1：将包被有TNFα抗体药的Fab和/或F(ab')2段的固相载体和样本中的抗药抗体结合得到免疫复合物；
S2：在步骤S1中加入二抗进行检测。
本申请提供的检测方法为非疾病诊断或治疗目的，例如可以为科研目的。
步骤S1是指将包被有TNFα抗体药的Fab和/或F(ab')2段的固相载体和样本中的抗药抗体结合得到免疫复合物。其中，TNFα抗体药选自英夫利西单抗、依那西普、阿达木单抗、或戈利木单抗。
步骤S1中，样本中可能含有TNFα抗体药，以样本的总体积为基准，样本中的TNFα抗体药的浓度可以为0～1mg/mL、1～4mg/mL、或4～10mg/mL等。本申请的抗干扰能力强，在TNFα抗体药物浓度在不超过4μg/mL时可以在样本中正常检测出抗药抗体，检测浓度干扰在10％之内。
步骤S1中，TNFα抗体药的Fab和/或F(ab')2段通过蛋白酶酶切TNFα抗体药获得，进一步地，蛋白酶选自木瓜蛋白酶和/或胃蛋白酶；更进一步地，木瓜蛋白酶酶切后获得两分子Fab和一分子Fc；胃蛋白酶酶切后获得一分子F(ab')2和切碎的Fc片段，具体作用位点如图2所示。蛋白酶为蛋白酶溶液，以蛋白酶溶液的总体积为基准，蛋白酶的浓度为1～20U/mL；具体地，可以为1～10U/mL、10～15U/mL、或15～20U/mL等。蛋白酶的浓度例如可以通过BCA法测定。BCA法基于双缩脲原理，碱性条件下蛋白质将Cu2+还原成Cu+，BCA鳌合Cu+作为显色剂，产生蓝紫色并在562nm有吸收峰，单价Cu+与蛋白质呈剂量相关性，可以根据样品在562nm处的吸光度计算蛋白浓度。
在一些实施方式中，TNFα抗体药为TNFα抗体药溶液，是将TNFα抗体药置于0.01mol/L的PBS(pH＝7.4)缓冲液进行配置。
在一些实施方式中，木瓜蛋白酶溶液是将木瓜蛋白酶干粉溶于活化溶液中配置获得，活化溶液为0.01mol/L PBS+0.01mol/L半胱氨酸，pH＝7.4。木瓜蛋白酶和胃蛋白酶为本领域常规酶，市售可得。
步骤S1中，酶切时，蛋白酶与TNFα抗体药的质量比为1：1～1：100；具体地，可以为1：1～1：20、1：20～1：50、或1：50～1：100等。
步骤S1中，酶切的温度为25～37℃；具体地，可以为25～30℃、30～32℃、或32～37℃等。酶切的时间为1～10h；具体地，可以为1～2h、2～5h、或5～10h等。合适的酶切条件可以保证蛋白酶的充分反应。
步骤S1中，酶切后还包括中间处理步骤，即在超滤管中超滤除去蛋白酶，得到粗液，再将粗液进行纯化，得到TNFα抗体药的Fab和/或F(ab')2段。在具体实验过程中，可以调整超滤次数，例如可以为4次。在本申请一具体实施例中，每次超滤时添加0.01mol/L的PBS(ph＝7.4)缓冲液。粗液中含有Fab片段或F(ab')2与Fc片段的混合物。纯化可以根据实验需要选择合适的纯化方法，例如柱纯化或层析纯化，柱纯化例如可以用ProteinA/G柱进行，层析纯化例如可以为凝胶过滤层析，纯化步骤为本领域常规步骤。收集纯化后液体，即TNFα抗体药的Fab和/或F(ab')2段。
步骤S1中，固相载体选自磁珠、ELISA板、或胶体金；进一步地，磁珠选自羧基磁珠。羧基磁珠表面修饰有丰富的羧基(-COOH)，能够与含氨基的生物配体，如：蛋白质、抗体、寡聚核苷酸和药物分子等通过共价偶联的方法实现结合。羧基磁珠使用前先用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)活化，EDC作为偶联剂，会在羧基和伯胺之间形成中性酰胺键。EDC活化磁珠时是在EDC缓冲溶液中进行，EDC的缓冲溶液为2-吗啉乙磺酸(MES)。
步骤S1中，当固相载体选自羧基磁珠时，包被羧基磁珠形成免疫复合物的具体制备流程如下：
1.羧基磁珠活化：用MES缓冲液对EDC稀释，加入羧基磁珠进行活化；
2.偶联：向活化后的羧基磁珠中加入Fab或F(ab’)2；
3.封闭：向偶联后的羧基磁珠中加入封闭液；
4.保存：封闭结束后将磁珠保存于磁珠保存液中，获得免疫复合物。
上述制备流程中，步骤1中，MES缓冲液的浓度可以为0.05～0.1mol/L；具体地，可以为0.05～0.06mol/L、0.06～0.08mol/L、或0.08～0.1mol/L等。MES缓冲液的pH为5.4～6；具体地，可以为5.4～5.5、5.5～5.6、或5.6～6等。稀释后的EDC浓度为1～2％(w/v)；具体地，可以为1～1.2％(w/v)、1.2～1.5％(w/v)、或1.5～2％(w/v)等。羧基磁珠与EDC的质量比为1：100～1000；具体地，可以为1：100～200、1：200～500、或1：500～1000等。活化的温度可以为37～42℃，活化的时间为1～2h。
上述制备流程中，步骤2中，磁珠与Fab或F(ab’)2的质量比为50～100：1；具体地，可以为50～60：1、60～80：1、或80～100：1等。
上述制备流程中，步骤3中，封闭液为0.01mol/L PBS缓冲液+1％v/v BSA，封闭液的pH为7.4～7.5。磁珠和封闭液的比例关系为磁珠：封闭液＝1～10mg:100μL；具体地，可以为1～2mg:100μL、2～5mg:100μL、或5～10mg:100μL等。封闭反应的温度为37～42℃，封闭反应的时间为1～2h。
上述制备流程中，步骤4中，磁珠保存液为0.01mol/L PBS缓冲液+5％v/v BSA+1％w/v海藻糖+1‰w/v叠氮化钠。磁珠保存液的pH为7.4～7.5。
本申请提供的检测方法中，步骤S1中，当样本存在TNFα抗药抗体时，免疫复合物中包括TNFα抗药抗体。TNFα抗药抗体会与磁珠上包被的Fab和/或F(ab')2段进行结合，从而在后续步骤中被检测出来。
本申请提供的检测方法中，步骤S2是指在步骤S1中加入二抗进行检测。其中，步骤S2中，二抗为针对人源抗体的二抗，因为试剂是用于检测人体内的抗药物抗体。在一些实施方式中，二抗为羊抗人抗体、鼠抗人抗体、兔抗人抗体、或马抗人抗体。在一些实施方式中，二抗为针对人源IgG抗体的FC端的抗体。
步骤S2中，二抗上连有可检测的标记物质，通过检测标记物质的存在，可以判断样本中是否含有TNFα抗药抗体；进一步地，通过检测可检测的标记物质的信号高低，可以确定样本中的抗药物抗体的浓度。可检测的标记可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。这类标记是本领域熟知的，其实例包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)、藻红蛋白(PE)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如Cy7、Alexa 750)、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物)等。在本申请一具体实施例中，可检测的标记物质为吖啶酯(AE)。
在一些实施方式中，二抗连接可检测的标记物质的方法为本领域常规的方法，当可检测的标记物质为吖啶酯(AE)时，制备二抗-AE的方法例如可以为下述步骤：
1、用碳酸盐缓冲液将二抗的pH调节为碱性；
2、向步骤1中的二抗中加入吖啶酯混匀后水浴反应，加入PBS缓冲液终止反应，得到二抗-AE；
3、将二抗-AE进行透析，置于抗体保存液中保存。
在一些实施方式中，步骤1中的碳酸盐缓冲液浓度例如可以为0.1～1mol/L，其pH为碱性，例如可以为9.5。
在一些实施方式中，步骤2中，二抗与吖啶酯的摩尔比可以为1：1～10；具体可以为1：1～2、1：2～7、或1：7～10等。水浴反应的温度例如可以为37～42℃，水浴反应的时间为1～2h。PBS缓冲液的浓度为0.1～1mol/L；具体地，可以为0.1～0.5mol/L、0.5～0.8mol/L、或0.8～1mol/L等。PBS缓冲液的pH可以为7.4～7.5。
在一些实施方式中，步骤3中，透析液为本领域技术人员熟知的液体，例如可以为0.01mol/L PBS缓冲液，pH7.4。透析的温度为4℃。可以根据实验需要进行多次透析，例如可以进行1～5次透析，每次透析时间为1～4h；具体地，可以为1～2h、2～3h、或3～4h等。抗体保存液可以为0.01mol/L PBS缓冲液+2％(v/v)BSA+1％(w/v)蔗糖+1‰(w/v)叠氮化钠，抗体保存液的pH为7.4～7.5。
在一些实施方式中，包被了Fab或F(ab’)2的磁珠、样本或校准品、二抗-AE先混匀反应，反应形成免疫复合物，清洗去掉游离的组分，加入预激发液和激发液，然后检测发光值。根据发光值进行TNFα抗药抗体的定性或定量判断。磁珠和二抗-AE之间的体积比为1～2：5；具体的，可以为1～1.1：5、1.1～1.2：5、或1.2～2：5等。在本申请一具体实施例中，包被了Fab或F(ab’)2的磁珠为40μL，二抗-AE为100μL。孵育的时间可以为37～42℃，孵育的时间为10～15min。预激发液为过氧化氢酸性溶液，其浓度为1～5％(v/v)；具体地，可以为1～2％(v/v)、2～3％(v/v)、或3～5％(v/v)等。激发液为氢氧化钠溶液，其浓度为1～5％(v/v)；具体地，可以为1～2％(v/v)、2～3％(v/v)、或3～5％(v/v)等。在一些实施方式中，校准品例如为采用人血清样本基质制备，具体制备流程为：人血清样本用56℃灭活1小时，加入1‰叠氮化钠，将高浓度的ADA人血清样本用未使用过抗体药的正常人阴性血清稀释获得校准品。
本申请另一方面提供一种TNFα抗药抗体的检测试剂盒，包括包被有TNFα抗体药的Fab和/或F(ab')2段的固相载体、二抗、荧光标记物质。其中，TNFα抗体药的Fab和/或F(ab')2段由前述的方法，通过蛋白酶酶切TNFα抗体药获得。固相载体选自磁珠、ELISA板、或胶体金；进一步地，磁珠选自羧基磁珠。
本申请提供的检测试剂盒中，二抗为针对人源抗体的二抗。在一些实施方式中，二抗为羊抗人抗体、鼠抗人抗体、兔抗人抗体、或马抗人抗体；二抗为针对人源IgG抗体的FC端的抗体。
本申请提供的检测试剂盒中，荧光标记物质为吖啶酯(AE)。吖啶酯是一类可用作化学发光标记物的化学物质，在碱性H2O2溶液中，吖啶酯的分子受到过氧化氢离子进攻时，吖啶环上的取代基能与吖啶环上的C-9和H2O2(过氧化氢)形成不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N-甲基吖啶酮。吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物在有H2O2的稀碱性溶液中即能发光，不需要催化剂，发光系统简单。
本申请提供的检测试剂盒中，还包括样品稀释液，样品稀释液选自PBS、醋酸钠缓冲液、或Tris-HCl缓冲液。样品稀释液用于将样本浓度稀释到合适的浓度，便于与免疫反应，实现最佳的线性反应效果。
本申请提供的检测试剂盒中，还包括预激发液和激发液。其中，预激发液为过氧化氢酸性溶液，其浓度为1～5％(v/v)；具体地，可以为1～2％(v/v)、2～3％(v/v)、或3～5％(v/v)等。激发液为氢氧化钠溶液，其浓度为1～5％(v/v)；具体地，可以为1～2％(v/v)、2～3％(v/v)、或3～5％(v/v)等。吖啶酯在碱性H2O2溶液中，分子受到过氧化氢离子进攻时，生成不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N-甲基吖啶酮，当其回到基态时发出光子。通过光电倍增管检测相对发光值ALU。
本申请提供的检测试剂盒中，还包括校准品，校准品将高浓度的ADA人血清样本用正常人阴性血清稀释，获得人血清样本灭活后制备而成。
本申请另一方面提供TNFα抗体药的Fab和/或F(ab')2段或前述的检测试剂盒在制备TNFα抗药抗体检测产品中的应用。TNFα抗体药选自英夫利西单抗、依那西普、阿达木单抗、或戈利木单抗。TNFα抗体药的Fab和/或F(ab')2段按照前述的方法，通过蛋白酶酶切TNFα抗体药获得。
本申请的检测方法准确性高、抗干扰能力强，具体体现在本申请的检测方法不仅可以实现对TNFα抗药抗体的精确检测，而且在抗体药物浓度超过1μg/mL时也可以检测出抗药抗体。
下面通过实施例对本申请予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。
实施例1
木瓜蛋白酶酶切TNFα抗体药获取Fab段步骤。
1.取TNFα抗体药置于0.01mol/L的PBS(pH＝7.4)缓冲液中透析4℃透析，透析两次，每次4h。
2.收集透析后的TNFα抗体药，用BCA法测试蛋白浓度。依据测试蛋白浓度，用0.01mol/L的PBS(pH＝7.4)调整其浓度为1mg/mL。
3.将木瓜蛋白酶干粉溶于活化溶液(0.01mol/L PBS+0.01mol/L半胱氨酸，pH＝7.4)，配置成10U/mL的溶液。
4.将木瓜蛋白酶与抗体溶液按1:10的比例混合，在37℃下水浴反应6h。
5.将反应后产物使用10kDa的超滤管在4000rmp，4℃下超滤，除去木瓜蛋白酶，超滤4次，每次超滤时添加0.01mol/L的PBS(pH＝7.4)缓冲液，超滤后的溶液即为Fab片段与Fc片段的混合物。
6.将混合物用ProteinA/G柱纯化，收集穿出部分液体(包含有Fab)。
7.将混合物用凝胶过滤层析柱进一步纯化，收集分子量在48KD左右的蛋白。
实施例2
胃蛋白酶酶切TNFα抗体药获取F(ab’)2段步骤
1.将TNFα抗体药在0.2mol/L的醋酸钠缓冲液(pH＝4.0)4℃透析，透析两次，每次4h。
2.收集透析后的TNFα抗体药，用BCA法测试蛋白浓度。用醋酸钠缓冲液稀释，将TNFα抗体药的浓度调整为1mg/mL。
8.将胃蛋白酶用0.2mol/L的醋酸钠缓冲液溶解，配制浓度为1mg/mL。
9.依据TNFα抗体药蛋白浓度加入胃蛋白酶溶液，混合比为胃蛋白酶：抗体＝1:10(W:W)。在37℃下水浴反应6h。
3.水浴完成后加入3mol/L Tris-Hcl缓冲液(pH8.5)将溶液pH调节至8.5，这一步的目的是使胃蛋白酶失活，终止酶切反应。
4.将反应后的溶液用0.01mol/L的PBS(pH＝7.4)4℃透析，透析两次，每次4h。
5.将混合物用ProteinA/G柱纯化，收集穿出部分液体(包含有F(ab’)2)。
6.将混合物用凝胶过滤层析柱进一步纯化，收集分子量在110KD左右的蛋白。
实施例3
Fab/F(ab’)2包被羧基磁珠步骤
5.羧基磁珠活化：将EDC用0.05mol/L的MES(pH＝5.4)缓冲液稀释为1％(w/v)，1mg羧基磁珠加入1μL的1％(w/v)EDC，37℃下活化30分钟。
6.偶联：向活化后的羧基磁珠中加入Fab或F(ab’)2，加入的比例为1mg磁珠和20μg实施例1和实施例2获得的Fab或F(ab’)2，37℃下反应3h。
7.封闭：向偶联后的羧基磁珠中加入封闭液(0.01mol/L PBS缓冲液+1％v/v BSApH7.4)，加入的比例为1mg磁珠和100μL封闭液。37℃下反应1h。
8.保存：封闭结束后将磁珠保存于磁珠保存液(0.01mol/L PBS缓冲液+5％v/vBSA+1％w/v海藻糖+1‰w/v叠氮化钠pH7.4)中。
实施例4
二抗标记吖啶酯的制备
1.羊抗人IgG【Jackson ImmunoResearch，AffiniPure Goat Anti-Human IgG,Fcγfragment specific,Code:109-005-008】用0.1mol/L碳酸盐缓冲液pH 9.5将pH调节为碱性。
2.向步骤1中的羊抗人IgG中加入吖啶酯(上海迈拓崴化工新材料科技有限公司，吖啶磺酰胺盐-N-乙胺基马来酰亚胺MTW-CLIA-003)，羊抗人IgG：吖啶酯按摩尔比为1：10混合，混匀后37℃下水浴反应2h。
3.反应结束后加入0.1mol/L PBS缓冲液pH7.4终止反应，得到羊抗人IgG-AE。
4.将步骤3标记好的羊抗人IgG(羊抗人IgG-AE)放入透析袋中透析，透析液为0.01mol/LPBS缓冲液pH7.4，4℃透析，透析5次，每次4h。
5.将透析好的羊抗人IgG放入到抗体保存液(0.01mol/L PBS缓冲液+2％v/v BSA+1％w/v蔗糖+1‰w/v叠氮化钠pH7.4)中保存。
实施例5
校准品：采用人血清样本基质制备，人血清样本用56℃灭活1小时。
人血清样本中加入1‰叠氮化钠。
将高浓度的ADA人血清样本用未使用过抗体药的正常人阴性血清稀释。
线性范围为0～1000ng/mL。得到校准品的实验数据如下表和图3所示。
| 浓度(ng/mL) | 测试1(ALU) | 测试2(ALU) | 均值(ALU) | |
| 校准品1 | 0.00 | 213 | 242 | 228 |
| 校准品2 | 47.24 | 2246 | 2038 | 2142 |
| 校准品3 | 113.20 | 4537 | 4596 | 4567 |
| 校准品4 | 238.10 | 9322 | 9731 | 9527 |
| 校准品5 | 464.80 | 20764 | 21653 | 21209 |
| 校准品6 | 983.30 | 43363 | 44265 | 43814 |
实施例6
检测参数：
| 反应温度 | 37℃ |
| 校准品或样本用量 | 10μL |
| 磁珠用量 | 40μL |
| R1试剂用量(羊抗人IgG-AE) | 100μL |
| 孵育时间 | 10min |
| 清洗次数 | 3次 |
检验步骤：
先吸取10μL校准品或样本加入到反应杯中。然后加入40μL磁珠试剂和100μL R1试剂(实施例4制备的羊抗人IgG-AE)，混匀，37℃孵育10分钟。磁珠试剂为实施例3包被后的磁珠。
将反应杯转移到清洗单元中，清洗3次。
将反应杯转移到检测单元中加入100μL预激发液(含1.0％(v/v)过氧化氢酸性溶液)和100μL激发液(含1.0％(v/v)氢氧化钠溶液)，检测发光值。
和德国R-BiopHarm AG公司的Anti-IFX Antibodies试剂盒比对。
德国R-BiopHarm AG公司的产品主要成分：酶标板上包被infliximab抗体，生物素偶联的infliximab抗体，链霉亲和素-HRP。
选取72个英夫利西单抗治疗的患者，结果如下表和图4所示，应用本发明的检测方法检测，可检测出20个患者ADA阳性，而对照试剂仅能检测出15个ADA阳性，产品的cutoff值为150ng/mL。有5个患者遗漏，对这5个患者血清中的英夫利西单抗浓度进行检测，英夫利西单抗浓度检测试剂是用德国R-BiopHarm AG公司的IFX Monitoring试剂盒，结果在0.75-2.73μg/mL之间。
选取高浓度ADA(342ng/mL)且英夫利西单抗浓度检测不到的血清样本，平均分成5份，向里面加入不同浓度的英夫利西单抗，加入浓度为(0、1、2、4、8μg/mL)。37℃孵育60分钟。用本发明的检测方法检测和用德国R-BiopHarm AG公司的试剂检测。
本发明可以检测4μg/mL英夫利西血清中抗抗体，检测浓度干扰在10％之内。抗干扰能力明显优于传统的方法。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本申请。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本申请的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本申请的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种TNFα抗药抗体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将包被有TNFα抗体药的Fab和/或F(ab')2段的固相载体和样本中的抗药抗体结合得到免疫复合物；
S2：在步骤S1中加入二抗进行检测。
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括以下特征中的一种或多种：
a1)步骤S1中，TNFα抗体药选自英夫利西单抗、依那西普、阿达木单抗、或戈利木单抗；
a2)步骤S1中，样本中包括TNFα抗体药，以样本的总体积为基准，样本中的TNFα抗体药的浓度≥1μg/mL；优选地，为0.5～10mg/mL；
a3)步骤S1中，所述TNFα抗体药的Fab和/或F(ab')2段通过蛋白酶酶切TNFα抗体药获得，进一步地，蛋白酶选自木瓜蛋白酶和/或胃蛋白酶；更进一步地，木瓜蛋白酶酶切后获得两分子Fab和一分子Fc；胃蛋白酶酶切后获得一分子F(ab')2和切碎的Fc片段；
a4)步骤S1中，固相载体选自磁珠、ELISA板、或胶体金；进一步地，所述磁珠选自羧基磁珠；
a5)步骤S1中，当样本存在TNFα抗药抗体时，免疫复合物中包括TNFα抗药抗体；
a6)步骤S2中，二抗为抗人IgG抗体；
进一步地，二抗为羊抗人抗体、鼠抗人抗体、兔抗人抗体、或马抗人抗体；和/或，二抗为针对人源IgG抗体的FC端的抗体；
a7)步骤S2中，所述二抗上连有可检测的标记物质，通过检测标记物质的存在，可以判断样本中是否含有TNFα抗药抗体。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，包括以下特征中的一种或多种：
b1)蛋白酶为蛋白酶溶液，以蛋白酶溶液的总体积为基准，蛋白酶的浓度为1～20U/mL；b2)酶切时，蛋白酶与TNFα抗体药的质量比为1：1～1：100；
b3)酶切的温度为25～37℃，酶切的时间为1～10h；
b4)酶切后还包括中间处理步骤，即在超滤管中超滤除去蛋白酶，得到粗液，再将粗液进行纯化，得到TNFα抗体药的Fab和/或F(ab')2段。
4.一种TNFα抗药抗体的检测试剂盒，其特征在于，包括包被有TNFα抗体药的Fab和/或F(ab')2段的固相载体、二抗、荧光标记物质。
5.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述固相载体选自磁珠、ELISA板、或胶体金；进一步地，所述磁珠选自羧基磁珠。
6.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述二抗为抗人IgG抗体。
7.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，二抗为羊抗人抗体、鼠抗人抗体、兔抗人抗体、或马抗人抗体；和/或，二抗为针对人源IgG抗体的FC端的抗体。
8.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述荧光标记物质为吖啶酯。
9.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括样品稀释液，所述样品稀释液选自PBS、醋酸钠缓冲液、或Tris-Hcl缓冲液；
和/或，还包括预激发液和激发液，所述预激发液为过氧化氢酸性溶液，所述激发液为氢氧化钠溶液。
10.TNFα抗体药的Fab和/或F(ab')2段或如权利要求4～9任一项所述的检测试剂盒在制备TNFα抗药抗体检测产品中的应用。
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