CN112625124A - 一种新型冠状病毒蛋白的快速免疫方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及免疫抗体技术领域，公开了一种新冠病毒蛋白的快速免疫方法及其应用。所述快速免疫方法为，以兔为试验对象，首免后5天即使用完全弗氏佐剂乳化抗原后进行第二次加强免疫，在第二次免疫后10天即进行第三次免疫，在第三次免疫后10天即进行第四次免疫，免疫完成后5天收集血清，后续经过抗血清protein G纯化后记得高特异性、高亲和力的多克隆抗体。本发明在首免后5天即进行加强免疫，能够在一个月内得到高亲和力和高特异性的新冠蛋白的多克隆抗体，大幅度缩短多克隆抗体的制备周期，可以为研究和解决新冠的传播提供非常及时的抗体试剂。
Description
【技术领域】
本发明属于免疫抗体技术领域，具体涉及一种新冠病毒蛋白的快速免疫方法及其应用。
【背景技术】
新型冠状病毒SARS-CoV-2可通过人类上呼吸道入侵人体，以多种细胞表面表达的ACE2为受体达到感染，主要感染器官包括肺部、心脏、肾脏等多个主要器官。如何在短时间内获得高特异性，高亲和力的新型冠状病毒的抗体是整个行业需要解决的问题。获得快速的免疫方法，针对不同的抗原及需求有不同的方案选择，主要包括：免疫的动物、免疫的剂量、时间和途径。
免疫原合适剂量的选定应考虑抗原性强弱、分子量大小和免疫时间。抗原需可量多，时间间隔长，剂量可适当加大。大动物抗原剂量(以蛋白抗原为准)约0.5～1mg/只，小动物约0.1～0.6mg/只。剂量加大极易造成免疫耐受(免疫抑制)而遭失败。已有证明，几微克的蛋白质也能很好地免疫出抗血清。
免疫注射的途径也很重要。一般采用多点注射，一只动物注射总数约为8～10点，包括足掌及肘窝淋巴结周围，背部两侧、颌下、耳后等处皮内或皮下，皮内易引起细胞免疫反应，对提高抗体效价有利。
免疫间隔时间也是重要因素，特别是首次与第二次之间更应注意。传统的免疫方式认为第一次免疫后，因动物机体正处于识别抗原B细胞增殖阶段，如很快接着第二次注入抗原，极易造成免疫抑制。一般以间隔10～20天为好。二次以后每次的间隔一般为7～10天，不能太长，以防刺激变弱，抗体效价不高。
目前商业化抗体的主要目的，传统的免疫方式更多将精力放在如何提高动物免疫反应的强度及特异性上。从商业化产品出发，以客户角度思考，抗体的制备周期则需要更多的关注。
因此，有必要提供一种快速免疫方案。
【发明内容】
本发明目的在于克服现有技术的不足而提供一种新型冠状病毒蛋白的快速免疫方法、抗体及其应用，在常规的弗氏佐剂免疫基础上，通过周期的改良及佐剂的使用，更大幅度的刺激动物免疫反应，能够更快的获得高滴度的抗血清，纯化后得到所需的多克隆抗体。
为实现上述目的，本发明是通过如下方案实现的：
一种新型冠状病毒蛋白的快速免疫方法，包括如下步骤：
1.以兔为受体，第1天用完全弗氏佐剂，进行第一次免疫；
2.第5天，再重复步骤S1进行第二次免疫；
3.第15天，用非完全弗氏佐剂进行第三次免疫；
4.第25天，再重复步骤S3进行第四次免疫；
所述免疫使用的抗原为SARS-CoV-2重组蛋白。
根据本发明的实施例，所述免疫使用的抗原为SARS-CoV-2Nucleoprotein、SARS-CoV-2Spike RBD、SARS-CoV-2Spike S1或SARS-CoV-2Spike S2 ECD中的一种。
根据本发明的实施例，所述免疫使用的抗原为Abclonal RP01264、AbclonalRP01258、Abclonal RP01262或Abclonal RP01267中的一种。
根据本发明的实施例，所述兔为3kg，所述步骤1中所述抗原用量为0.3mg，所述步骤3中抗原为0.15mg。
根据本发明的实施例，所述步骤1至4中所述抗原与佐剂的体积比为1：1。
根据本发明的实施例，所述步骤1至4中免疫部位为背部皮下。
本发明另一个目的在于，提供上述快速免疫方法获得的多克隆抗体。
本发明还有一个目的在于，提供上述的免疫方法在制备新型冠状病毒多克隆抗体中的应用，制备方法为：完成免疫后，在第30天收集血清，经过抗血清protein G纯化后获得多克隆抗体。
相比现有技术，本发明的有益效果为：
1.本发明本提供的快速免疫方法在首免后5天即进行加强免疫，能够在一个月内得到高亲和力和高特异性的新冠蛋白的多克隆抗体，大幅度缩短多克隆抗体的制备周期，为研究和解决新冠的传播提供非常及时的抗体试剂。
2.本发明提供的快速免疫方法缩短了多克隆抗体的制备周期也同时缩短了实验动物的饲养周期，降低了抗体制备的成本。以更少的免疫次数，降低了实验动物的痛苦，更符合动物福利。
3.本发明操作过程简单快速，主体操作及佐剂设置基于弗氏佐剂的常规免疫流程，操作简单、适用范围广。
【附图说明】
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明SARS-CoV-2Nucleoprotein的抗原和抗体Elisa检测结果。
图2为本发明SARS-CoV-2Spike RBD的抗原和抗体Elisa检测结果。
图3为本发明SARS-CoV-2Spike S1的抗原和抗体Elisa检测结果。
图4为本发明SARS-CoV-2Spike S2 ECD的抗原和抗体Elisa检测结果。
【具体实施方式】
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰明白，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并不是为了限定本发明。
本发明提供快速免疫方法是基于新冠病毒(SARS-CoV-2)蛋白，快速免疫方法涉及到的试剂有：
抗原的选择：实验采用的抗原为武汉爱博泰克生物技术有限公司生产。蛋白的序列，区域和货号分别为：
SARS-CoV-2Nucleoprotein，Accession#QHD43423.2，119aa，Abclonal Cat#RP01264；
SARS-CoV-2Spike RBD，Accession#YP_009724390.1，319-541aa，Abclonal Cat#RP01258；
SARS-CoV-2Spike S1，Accession#YP_009724390.1，16-685aa，Abclonal Cat#RP01262；
SARS-CoV-2Spike S2 ECD，Accession#YP_009724390.1，686-1213aa，AbclonalCat#RP01267。
实验动物的选择：实验动物为5个月左右的日本大耳白兔，体重为3kg左右。
实施例：快速免疫组
本实施例快速免疫的步骤如下：
1)第一次免疫：抗原0.3mg，完全弗氏佐剂，抗原与佐剂体积比为1:1，免疫方式为背部两侧皮下多点注射；
2)第二次免疫：首免完成后第5天进行进行第二次免疫，第二次免疫剂量及方式与首免相同；
3)第三次免疫：二免完成后第10天进行第三次免疫，免疫剂量为0.15mg，非完全弗氏佐剂，抗原与佐剂体积比为1:1，免疫方式为背部两侧皮下多点注射；
4)第四次免疫：三免完成后第10天进行第四次免疫，抗原0.15mg，非完全弗氏佐剂，抗原与佐剂体积比为1:1，免疫方式为背部两侧皮下多点注射。第30天取血。
快速免疫周期如表1所示。
表1：正常免疫周期的设置
| 动物操作 | 周期 | 免疫剂量 | 免疫佐剂 | 免疫部位 | 免疫动物状态 |
| 第一次免疫 | 1天 | 0.3mg | 完全弗氏佐剂 | 背部皮下(S.C.) | 良好 |
| 第二次免疫 | 5天 | 0.3mg | 完全弗氏佐剂 | 背部皮下(S.C.) | 良好 |
| 第三次免疫 | 15天 | 0.15mg | 不完全弗氏佐剂 | 背部皮下(S.C.) | 良好 |
| 第四次免疫 | 25天 | 0.15mg | 不完全弗氏佐剂 | 背部皮下(S.C.) | 良好 |
| 血清采集 | 30天 |
本实例分别对4种不同的抗原进行免疫周期的设置，选择8只日本大耳白兔，每组2只进行免疫，编号如表2所示。
表2：
对比例：正常免疫组
本实施例正常免疫的步骤如下：
1)第一次免疫：正常周期首免抗原0.3mg，完全弗氏佐剂，抗原与佐剂体积比为1:1，免疫方式为背部两侧皮下多点注射；
2)第二次免疫：首免完成12天进行进行第二次免疫，抗原剂量为0.15mg；
3)第三次免疫：第二免完成后第26天进行第三次免疫，抗原剂量为0.15mg，非完全弗氏佐剂，抗原与佐剂体积比为1:1，免疫方式为背部两侧皮下多点注射；
4)第四次免疫：第三免完成后40天进行第四次免疫，抗原剂量为0.15mg，非完全弗氏佐剂，抗原与佐剂体积比为1:1，免疫方式为背部两侧皮下多点注射。三免完成后52天进行取血。
正常免疫周期如表3所示。
表3：正常免疫周期的设置
| 动物操作 | 周期 | 免疫剂量 | 免疫佐剂 | 免疫部位 | 免疫动物状态 |
| 第一次免疫 | 1天 | 0.3mg | 完全弗氏佐剂 | 背部皮下(S.C.) | 良好 |
| 第二次免疫 | 12天 | 0.15mg | 完全弗氏佐剂 | 背部皮下(S.C.) | 良好 |
| 第三次免疫 | 26天 | 0.15mg | 不完全弗氏佐剂 | 背部皮下(S.C.) | 良好 |
| 第四次免疫 | 40天 | 0.15mg | 不完全弗氏佐剂 | 背部皮下(S.C.) | 良好 |
| 血清采集 | 52天 |
本实例分别对4种不同的抗原进行正常免疫周期的设置，选择8只日本大耳白兔，每组2只进行免疫，编号如表4所示。
表4：
实验例1：抗血清的采集及纯化
分别对实施例和对比例进行抗血清的采集及纯化。
1.抗血清的采集：耳动脉采集5ml全血后，37℃孵育1h后，4℃过夜沉淀，离心后收集血清。
2.抗血清的纯化：使用免疫原进行抗原亲和纯化，收集抗体，最终缓冲液为PBS，甘油。
具体地，抗血清纯化方法如下：
1)制备亲和层析柱(参见博格隆protein G基质说明书)；
2)抗血清孵育：分别取5ml抗血清，加入等体积的PBS溶液稀释后与基质混合，使用垂直混合仪室温孵育1h；
3)使用恒流泵抽干柱子，注意不能完全抽干基质，防止基质板结；
4)预洗脱使用5倍柱体积的PBS，PH8.0；
5)使用20ml，PH为2.2的0.1M甘氨酸洗脱，洗脱液立即使用1M Tris中和；
6)收集少量基质用于SDS-page检测，标记洗脱后将不同洗脱组分的抗体收集后4℃过夜透析至PBS，PH7.3中分别取样；
7)使用PEG20000浓缩抗体后，加入等体积甘油(有些抗体有特殊要求)，测浓度，-20℃保存。
实验例2：多克隆抗体的检测
检测原理为：利用抗原和抗体能特异性结合的特点，可以通过ELISA实验检测SARS-CoV-2抗原和抗体结合的数值检测抗体效价，从而比较快速免疫和正常免疫的效果。
本实验例检测多克隆抗体涉及到材料如表3。
表3：
多克隆抗体的检测步骤为：
1)蛋白溶解与分装储存
取适量无菌水溶解SARS-CoV-2蛋白冻干粉至200ug/mL储存浓度，按实验需求对蛋白储存液进行分装，长期保存时储存在-80℃。
2)包被酶标板
取1mL包被液至1.5mL EP管中，取SARS-CoV-2蛋白储存液10μL加入包被液，稀释至2μg/mL，用移液枪轻柔吹打混匀，取100μL/孔加入到酶标板中，4℃过夜孵育。
3)封闭非特异性位点
取出酶标板，弃包被液，加入200μL封闭液，37℃恒温箱中孵育2小时。
4)反应抗体的梯度稀释
抗体稀释液至1.5mL EP管中，取抗体储存液5μL加入到稀释液中，使最大反应浓度为1μg/mL，设置1个稀释液对照。从37℃恒温箱取出酶标板，按300μL/孔，1.5min/次，加入洗涤液洗酶标板1次，弃洗涤液后，分别取100μL抗体稀释液到对应酶标板孔中，37℃恒温箱放置2小时。
5)抗体孵育
取1mL蛋白稀释液，加入1μL HRP GoatAnti-Rabbit IgG(H+L)Ab，使抗体稀释比为1:1000。从37℃恒温箱取出酶标板，按300μL/孔，1.5min/次，加入洗涤液洗酶标板3次，弃洗涤液后，按100μL/孔加入稀释后的抗体，37℃恒温箱放置1小时。
6)显色：从37℃恒温箱取出酶标板，按300μL/孔，1.5min/次，加入洗涤液洗酶标板3次，弃洗涤液后，按100μL/孔加入TMB显色液，避光显色10min。
7)加终止液：向酶标板中加入终止液50μL/孔。
8)酶标仪测OD450nm数值。
按照以上步骤对本发明实施例及对比例例获得的纯化抗体进行检测，实施例和对比例中，分别以免疫前的大耳白兔血清作为空白对照组，4种不同的抗原经免疫获得的抗体与Elisa抗原检测结果分别如图1-4所示。
其中，图1为Elisa抗原和抗体SARS-CoV-2Nucleoprotein检测结果；
图2为Elisa抗原和抗体SARS-CoV-2Spike RBD检测结果；
图3为Elisa抗原和抗体SARS-CoV-2Spike S1检测结果；
图4为Elisa抗原和抗体SARS-CoV-2Spike S2 ECD检测结果。
从以上图1-4检测结果判断，在快速免疫后采集血清，纯化后得到的抗体检测结果与传统方式免疫检测结果差异不大，说明改进后的免疫方式能够在一个月左右即得到较高滴度的抗血清，其特异性及滴度均能够满足后续试验要求。
上述仅为本发明的几个具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，因此在不脱离本发明技术的实质和范围下的变化和优化，应属本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种新型冠状病毒蛋白的快速免疫方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.以兔为受体，第1天用完全弗氏佐剂，进行第一次免疫；
S2.第5天，再重复步骤S1进行第二次免疫；
S3.第15天，用非完全弗氏佐剂进行第三次免疫；
S4.第25天，再重复步骤S3进行第四次免疫；
所述免疫使用的抗原为SARS-CoV-2重组蛋白。
2.根据权利要求1所述的免疫方法，其特征在于，所述免疫使用的抗原为SARS-CoV-2Nucleoprotein、SARS-CoV-2Spike RBD、SARS-CoV-2Spike S1或SARS-CoV-2Spike S2 ECD中的一种。
3.根据权利要求1所述的免疫方法，其特征在于，所述免疫使用的抗原为AbclonalRP01264、Abclonal RP01258、Abclonal RP01262或Abclonal RP01267中的一种。
4.根据权利要求1所述的免疫方法，其特征在于，所述兔为3kg，所述步骤S1中所述抗原用量为0.3mg，所述步骤S3中抗原为0.15mg。
5.根据权利要求3所述的免疫方法，其特征在于，所述步骤S1至S4中所述抗原与佐剂的体积比为1：1。
6.根据权利要求1所述的免疫方法，其特征在于，所述步骤S1至S4中免疫部位为背部皮下。
7.权利要求1所述快速免疫方法获得的多克隆抗体。
8.根据权利要求1所述的免疫方法在制备新型冠状病毒多克隆抗体中的应用，其特征在于，完成免疫后，在第30天收集血清，经过抗血清protein G纯化后获得多克隆抗体。
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