CN111574623A - 一种新冠病毒s1+s2抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新冠病毒S1+S2抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法，采用新冠病毒的S1+S2蛋白制备抗S1+S2抗体；用PBS对抗S1+S2抗体进行稀释后，与弗氏不完全佐剂等体积混合，获得第一混合溶液；将第一混合溶液肌肉注射产蛋鸡，对产蛋鸡进行第一免疫；判断产蛋鸡是否满足第二预定条件；若满足第二预定条件，产蛋鸡确定为高免鸡；按照第三预定条件采集高免鸡蛋；对高免鸡蛋进行消毒、卵黄分离、卵黄组织破碎后，获得卵黄液；去除卵黄液中的杂质蛋白，获得抗独特型卵黄抗体粗制品；对抗独特型卵黄抗体粗制品进行纯化，获得抗独特型卵黄抗体精制品。达到了使新冠病毒疫苗分子量大，进入人体不易被分解，体内留存时间长，稳定性强、效力强的技术效果。
Description
技术领域
本发明涉及预防防疫技术领域，特别涉及一种新冠病毒S1+S2抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法。
背景技术
新冠病毒目前已在全球几乎所有国家流行，感染人数超几百万，迄今仍在不断增加，对人类生命安全及社会经济产生巨大破坏作用。目前对付该流行病的主要办法是早诊断、早隔离、早治疗。这些措施对阻止新冠病毒的传播已产生积极作用，但是对各行各业也产生很大负面影响，世界各国为此付出了巨大代价。
人类要阻止该传染病的流行，最终消灭该传染病，最好的办法是尽快研制出有效疫苗。迄今，全世界仍没有一个新冠病毒疫苗面世，只有两个疫苗开始进行临床试验，一个是我国陈薇院士主持的腺病毒疫苗，另一个是美国学者研制的mRNA疫苗。目前在研的新冠病毒疫苗有几十个，这些疫苗归纳起来有以下几类：DNA疫苗、mRNA疫苗、基因重组疫苗。
腺病毒疫苗实际上是基因重组疫苗，是将新冠病毒的致病基因克隆、重组改造后，转染到腺病毒，将腺病毒接种免疫人体，腺病毒在人体内扩增繁殖的同时，表达毒性较小的新冠病毒致病抗原，后者刺激人体产生抗体，使人对新冠病毒感染产生免疫保护能力。
mRNA疫苗是将新冠病毒致病相关的mRNA改造后免疫接种人体，mRNA在人体内复制并表达毒性较小的致病抗原，后者刺激人体产生抗体，使人体对新冠病毒的感染产生免疫保护能力。
DNA疫苗是将病毒与致病相关的DNA克隆改造后，在体外扩增，然后肌肉注射免疫人体，病毒的DNA在肌细胞内扩增，表达mRNA，再以mRNA为模板，表达致病抗原，后者刺激人体产生抗体，使人体对新冠病毒的感染产生免疫保护能力。
但本申请发明人发现上述现有技术至少存在如下技术问题：
现有技术中的DNA疫苗、mRNA疫苗或基因重组疫苗(含腺病毒载体疫苗)，它们最终都是表达产生毒性较小的致病抗原，这些抗原本身是小分子多肽或蛋白质，因为它们分子量较小，进入人体后容易被分解失效，所以稳定性差，体内存留时间短，效力相对较弱是它们的共同缺点。
发明内容
本发明提供了一种新冠病毒S1+S2抗独特型卵黄抗体疫苗的制备用方法，解决了现有技术中新冠病毒疫苗分子量小，进入体不易被分解，稳定相差，体内存留时间段，效力弱的技术问题，达到了使新冠病毒疫苗分子量大，进入体不易被分解，体内留存时间长，稳定性强、效力强的技术效果。
为解决上述问题，第一方面本发明实施例提供了一种新冠病毒S1+S2抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法，所述方法包括：采用新冠病毒的S1+S2蛋白制备抗S1+S2抗体；用PBS对所述抗S1+S2抗体进行稀释后，与弗氏不完全佐剂等体积混合，获得浓度为第一浓度的第一混合溶液；将所述第一混合溶液肌肉注射产蛋鸡，对所述产蛋鸡按照第一预定条件进行第一预定次数的第一免疫；判断所述产蛋鸡是否满足第二预定条件；若满足所述第二预定条件，所述产蛋鸡确定为高免鸡；按照第三预定条件采集高免鸡蛋，其中，所述高免鸡蛋为所述高免鸡生产的鸡蛋；对所述高免鸡蛋进行消毒、卵黄分离、卵黄组织破碎后，获得卵黄液；用水稀释和酸化法去除所述卵黄液中的杂质蛋白，获得抗独特型卵黄抗体粗制品；用酒精沉淀法对所述抗独特型卵黄抗体粗制品进行纯化，获得抗独特型卵黄抗体精制品。
进一步的，所述第一浓度为每毫升所述第一溶液中含80μg所述抗S1+S2抗体。
进一步的，所述第一预定条件为每只所述产蛋鸡每次所述第一免疫注射0.5mL所述第一混合溶液，每隔7-10天进行一次所述第一免疫；所述第一预定次数为3次。
进一步的，所述判断所述产蛋鸡是否满足第二预定条件，具体为：第三次进行所述第一免疫当天，采集所述产蛋鸡生产的鸡蛋，判断所述鸡蛋的卵黄是否含有S1+S2抗独特型卵黄抗体；如果含有所述S1+S2抗独特型卵黄抗体，判断所述S1+S2抗独特型卵黄抗体的效价是否大于等于10-4；如果所述S1+S2抗独特型卵黄抗体的效价大于等于10-4，则所述产蛋鸡满足所述第二预定条件。
进一步得到，所述按照第三预定条件采集高免鸡蛋，具体为：第三次进行所述第一免疫后第三天开始，采集所述高免鸡生产的鸡蛋，连续采集20天。
进一步的，所述用水稀释和酸化法去除所述卵黄液中的杂质蛋白，具体为：将第一体积的无菌蒸馏水加入到第二体积的所述卵黄液中搅拌均匀，获得卵黄溶液；其中，所述第一体积等于15-30倍的所述第二体积；用盐酸和氢氧化钠溶液将所述卵黄溶液的pH值调至5.2-6.0；在4-8℃条件下，将所述卵黄溶液静置14-18小时后，取上部清液，获得第一清液；将底部浑浊液进行离心后，取上部清液，获得第二清液；将所述第一清液、所述第二清液进行混合，获得第三清液；用0.4μm的微孔滤膜对所述第三清液进行过滤。
进一步的，所述抗S1+S2抗体为兔抗S1+S2抗体，所述兔抗S1+S2抗体的制备方法具体为：将S1+S2蛋白溶液与弗氏不完全佐剂等体积混合均匀，获得第二混合溶液；用所述第二混合溶液对M只家兔进行皮下注射，对所述家兔按照第四预定条件进行第二预定次数的第二免疫；判断所述家兔是否满足第五预定条件；若满足所述第五预定条件，则所述家兔确定为高免兔；第三次进行所述第二免疫后5-7天，对所述高免兔进行放血，获得第一血浆；对所述第一血浆进行离心处理后，取血清，获得所述兔抗S1+S2抗体；其中，M≥2，且为正整数。
进一步的，所述判断所述家兔是否满足第五预定条件，具体为：第三次进行所述第二免疫当天，取所述家兔的血液，获得第二血浆；对所述第二血浆进行离心处理，获得第一血清；用ELISA检测法对所述第一血清的效价进行检测；当所述第一血清的效价大于10-4时，所述家兔满足所述第五预定条件。
进一步的，所述抗S1+S2抗体为鼠抗S1+S2抗体，所述鼠抗S1+S2抗体的制备方法包括：将S1+S2蛋白溶液与弗氏不完全佐剂等体积混合均匀，获得第三混合溶液；将所述第三混合溶液对N只小鼠进行腹腔注射，对所述小鼠按照第六预定条件进行第三预定次数的第三免疫；判断所述小鼠是否满足第七预定条件；若满足所述第七预定条件，则所述小鼠确定为高免鼠；第三次进行所述第三免疫后5-7天对所述高免鼠进行放血，获得第三血浆；对所述第三血浆进行离心处理后，取血清，获得所述鼠抗S1+S2抗体；其中，N≥2，且为正整数。
进一步的，所述判断所述小鼠是否满足第七预定条件具体为：第三次进行所述第三免疫当天，取所述小鼠的血液，获得第四血浆；对所述第四血浆进行离心处理，获得第二血清；用ELISA检测法对所述第二血清的效价进行检测；当所述第二血清的价效大于10-4时，所述小鼠满足所述第七预定条件。
本发明实施例中的上述一个或多个技术方案，至少具有如下一种或多种技术效果：
本发明实施例提供了一种新冠病毒S1+S2抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法，所述制备方法包括：采用新冠病毒的S1+S2蛋白制备抗S1+S2抗体；用PBS对所述抗S1+S2抗体进行稀释后，与弗氏不完全佐剂等体积混合，获得浓度为第一浓度的第一混合溶液；将所述第一混合溶液肌肉注射产蛋鸡，对所述产蛋鸡按照第一预定条件进行第一预定次数的第一免疫；判断所述产蛋鸡是否满足第二预定条件；若满足所述第二预定条件，所述产蛋鸡确定为高免鸡；按照第三预定条件采集高免鸡蛋，其中，所述高免鸡蛋为所述高免鸡生产的鸡蛋；对所述高免鸡蛋进行消毒、卵黄分离、卵黄组织破碎后，获得卵黄液；用水稀释和酸化法去除所述卵黄液中的杂质蛋白，获得抗独特型卵黄抗体粗制品；用酒精沉淀法对所述抗独特型卵黄抗体粗制品进行纯化，获得抗独特型卵黄抗体精制品。通过所述制备方法解决了现有技术中新冠病毒疫苗分子量小，进入人体易被分解，稳定性差，体内存留时间短，效力弱的技术问题，达到了使新冠病毒疫苗分子量大，进入人体不易被分解，体内留存时间长，稳定性强、效力强的技术效果。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。
附图说明
图1为本发明实施例中一种新冠病毒S1+S2抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法的流程图；
图2为本发明实施例中一种新冠病毒S1+S2抗独特型卵黄抗体疫苗的鸡IgY标准曲线。
具体实施方式
本发明实施例提供了一种新冠病毒S1+S2抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法，解决了现有技术中新冠病毒疫苗分子量小，进入人体易被分解，稳定性差，体内存留时间短，效力弱的技术问题，达到了使新冠病毒疫苗分子量大，进入人体不易被分解，体内留存时间长，稳定性强、效力强的技术效果。
本发明实施例中的技术方案，总体结构如下：
一种新冠病毒S1+S2抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法，所述制备方法包括：采用新冠病毒的S1+S2蛋白制备抗S1+S2抗体；用PBS对所述抗S1+S2抗体进行稀释后，与弗氏不完全佐剂等体积混合，获得浓度为第一浓度的第一混合溶液；将所述第一混合溶液肌肉注射产蛋鸡，对所述产蛋鸡按照第一预定条件进行第一预定次数的第一免疫；判断所述产蛋鸡是否满足第二预定条件；若满足所述第二预定条件，所述产蛋鸡确定为高免鸡；按照第三预定条件采集高免鸡蛋，其中，所述高免鸡蛋为所述高免鸡生产的鸡蛋；对所述高免鸡蛋进行消毒、卵黄分离、卵黄组织破碎后，获得卵黄液；用水稀释和酸化法去除所述卵黄液中的杂质蛋白，获得抗独特型卵黄抗体粗制品；用酒精沉淀法对所述抗独特型卵黄抗体粗制品进行纯化，获得抗独特型卵黄抗体精制品。通过上述制备方法解决了现有技术中新冠病毒疫苗分子量小，进入体不易被分解，稳定相差，体内存留时间段，效力弱的技术问题，达到了使新冠病毒疫苗分子量大，进入体不易被分解，体内留存时间长，稳定性强、效力强的技术效果。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
本发明实施例提供了一种新冠病毒S1+S2抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法，请参考附图1，所述制备方法包括：
步骤110：采用新冠病毒的S1+S2蛋白制备抗S1+S2抗体；
具体而言，新冠病毒的致病机理主要是由刺突蛋白(spike protein)引起的，刺突蛋白有两个亚基S1和S2，其中，S1含有受体结合域(receptor binding domain，RBD)，它负责识别人体细胞上的膜受体(血管紧张素转化酶2，ACE2)；S2含有膜融合过程所需的基本元件。新冠病毒通过RBD和人细胞上的ACE2结合，产生膜融合，从而进入人体细胞，使人感染发病。本发明的目的是制备S1+S2亚基的抗独特型卵黄抗体，从中筛选出β型抗独特型卵黄抗体，制备新冠病毒S1+S2抗独特型卵黄抗体疫苗，接种免疫人体，使人体产生体液免疫和细胞免疫应答，获得对新型冠状病毒感染的免疫保护能力，对新型冠状病毒的感染起了预防作用。
β型抗独特型抗体能模拟抗原的构型，是抗原的内影像，可当作抗原使用，也可当抗原的疫苗使用。β型抗独特型抗体疫苗，不含抗原的有毒成分，是一种无毒副作用、无污染、安全有效的疫苗。抗体的分子量大，进入人体后不易被分解失效，稳定性和效力较强。抗独特型卵黄抗体疫苗与哺乳动物抗独特型抗体疫苗(含单克隆抗体)相比具有以下优势：①资源丰富、产量高成本低，可工业化生产；②卵黄抗体耐酸耐碱耐高温，方便保存和运输；③使用途径更多样，注射、口服、浸泡(用于鱼)均有效。
可以采用小鼠或者家兔制备所述抗S1+S2抗体，其中采用小鼠制备所得的抗S1+S2抗体为鼠抗S1+S2抗体，用家兔制备的抗S1+S2抗体为兔抗S1+S2抗体。
进一步的，所述抗S1+S2抗体为兔抗S1+S2抗体，所述兔抗S1+S2抗体的制备方法具体为：
步骤210：将S1+S2蛋白溶液与弗氏不完全佐剂等体积混合均匀，获得第二混合溶液；
步骤220：用所述第二混合溶液对M只家兔进行皮下注射，对所述家兔按照第四预定条件进行第二预定次数的第二免疫；
具体而言，将所述S1+S2蛋白用PBS稀释，制成所述S1+S2蛋白溶液。所述第四预定条件为：每次所述第二免疫注射第一剂量的所述第二混合溶液，每隔1-2周对所述家兔进行一次所述第二免疫，其中，所述第一剂量为含4μg所述S1+S2蛋白。所述第二预定次数为三次，也就是说，对M只所述家兔进行三次所述第二免疫，相邻两次所述第二免疫之间的时间间隔为1-2周，每次所述第二免疫通过皮下注射的方式向M只所述家兔体内注射4μg的所述S1+S2蛋白。
步骤230：判断所述家兔是否满足第五预定条件；
进一步的，所述判断所述家兔是否满足第五预定条件，具体为：
第三次进行所述第二免疫当天，取所述家兔的血液，获得第二血浆；
对所述第二血浆进行离心处理，获得第一血清；
用ELISA检测法对所述第一血清的效价进行检测；
当所述第一血清的价效大于10-4时，所述家兔满足所述第五预定条件。
具体而言，在对M只所述家兔第三次进行所述第二免疫的当天，用注射器抽取所述家兔体内的部分血浆，获得所述第二血浆。用离心机对所述第二血浆进行离心处理后，取上部清液，获得所述第一血清。然后用ELISA(enzyme linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附试验)检测法对所述第一血清的效价进行检测，若所述第一血清的价效大于等于10-4，则所述家兔满足所述第五预定条件；否则，所述家兔不满足所述第五预定条件。
步骤240：若满足所述第五预定条件，则所述家兔确定为高免兔；
具体而言，如果所述家兔满足所述五预定条件，则所述家兔被确定为高免兔；当所述家兔不满足所述第五预定条件，所述家兔不能被确定为高免兔，予以舍弃。
步骤250：第三次进行所述第二免疫后5-7天，对所述高免兔进行放血，获得第一血浆；
步骤260：对所述第一血浆进行离心处理后，取血清，获得所述兔抗S1+S2抗体。
具体而言，在第三次对所述高免兔进行所述第二免疫后的5-7天，对所述高免兔进行放血，取所述高免兔的全部血液，即获得所述第一血浆。用离心机对所述第一血浆进行离心处理，取血清，即获得所述兔抗S1+S2抗体。
进一步的，所述抗S1+S2抗体为鼠抗S1+S2抗体，所述鼠抗S1+S2抗体的制备方法包括：
步骤310：将S1+S2蛋白溶液与弗氏不完全佐剂等体积混合均匀，获得第三混合溶液；
步骤320：将所述第三混合溶液对N只小鼠进行腹腔注射，对所述小鼠按照第六预定条件进行第三预定次数的第三免疫；
具体而言，将所述S1+S2蛋白用PBS稀释，制成所述S1+S2蛋白溶液。所述第六预定条件为：每次所述第三免疫注射第二剂量的所述第三混合溶液，每隔1-2周对所述小鼠进行一次所述第三免疫，其中，所述第二剂量为含2μg所述S1+S2蛋白。所述第三预定次数为三次，也就是说，对N只所述小鼠进行三次所述第三免疫，相邻两次所述第三免疫之间的时间间隔为1-2周，每次所述第三免疫通过腹腔注射的方式向N只所述小鼠体内注射2μg的所述S1+S2蛋白。
步骤330：判断所述小鼠是否满足第七预定条件；
进一步的，所述判断所述小鼠是否满足第七预定条件具体为：
第三次进行所述第三免疫当天，取所述小鼠的血液，获得第四血浆；
对所述第四血浆进行离心处理，获得第二血清；
用ELISA检测法对所述第二血清的效价进行检测；
当所述第二血清的价效大于10-4时，所述小鼠满足所述第七预定条件。
具体而言，在对N只所述小鼠第三次进行所述第三免疫后的当天，用注射器抽取所述小鼠体内的部分血浆，获得所述第四血浆。用离心机对所述第四血浆进行离心处理后，取上部清液，获得所述第二血清。然后用ELISA检测法对所述第二血清的效价进行检测，若所述第二血清的效价大于等于10-4，则所述小鼠满足所述第七预定条件；否则，所述小鼠不满足所述第七预定条件。
步骤340：若满足所述第七预定条件，则所述小鼠确定为高免鼠；
具体而言，如果所述小鼠满足所述第七预定条件，则所述小鼠被确定为高免鼠；若所述小鼠的不满足所述第七预定条件，则舍弃所述小鼠。
步骤350：第三次进行所述第三免疫后5-7天对所述高免鼠进行放血，获得第三血浆；
步骤360：对所述第三血浆进行离心处理后，取血清，获得所述鼠抗S1+S2抗体。
具体而言，第三次进行所述第三免疫后的5-7天，对所述高免鼠进行放血，取所述高免鼠的全部血液，即获得所述第三血浆，用离心机对所述第三血浆进行离心处理后，取血清，即获得所述鼠抗S1+S2抗体。
步骤120：用PBS对所述抗S1+S2抗体进行稀释后，与弗氏不完全佐剂等体积混合，获得第一浓度的第一混合溶液；
进一步的，所述第一浓度为每毫升所述第一溶液中含80μg所述抗S1+S2抗体。
具体而言，用PBS(phosphate buffer saline，磷酸盐缓冲液)将0.1mL所述抗S1+S2抗体稀释为2.5mL后，与2.5mL弗氏不完全佐剂进行混合，获得所述第一混合溶液。所述第一混合溶液中所述抗S1+S2抗体的浓度为所述第一浓度，所述第一浓度为80μg/mL，即每毫升所述第一混合溶液中含80μg的所述抗S1+S2抗体。
步骤130：将所述第一混合溶液肌肉注射产蛋鸡，对所述产蛋鸡按照第一预定条件进行第一预定次数的第一免疫；
优选的，所述第一预定条件为每只所述产蛋鸡每次免疫注射0.5mL所述第一混合溶液，每隔7-10天进行一次所述第一免疫；所述第一预定次数为3次。
具体而言，每次所述第一免疫向每只所述产蛋鸡体内注射0.5mL所述第一混合溶液，每隔7-10天对所述产蛋鸡进行一次免疫，对所述产蛋鸡进行三次所述第一免疫。
步骤140：判断所述产蛋鸡是否满足第二预定条件；若满足所述第二预定条件，所述产蛋鸡确定为高免鸡；
进一步的，所述判断所述产蛋鸡是否满足第二预定条件，具体为：
第三次进行所述第一免疫当天，采集所述产蛋鸡生产的鸡蛋，判断所述鸡蛋的卵黄是否含有S1+S2抗独特型卵黄抗体；
如果含有所述S1+S2抗独特型卵黄抗体，判断所述S1+S2抗独特型卵黄抗体的效价是否大于等于10-4；
如果所述S1+S2抗独特型卵黄抗体的效价大于等于10-4，则所述产蛋鸡满足所述第二预定条件。
具体而言，只有高免鸡产的鸡蛋才是高免鸡蛋，只有高免鸡蛋才能用来制作所述抗独特型卵黄抗体。在对所述产蛋鸡第三次进行所述第一免疫后当天，采集所述产蛋鸡生产的鸡蛋，然后用ELISA(enzyme linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附试验)法检测所述鸡蛋的卵黄内是否有S1+S2抗独特型卵黄抗体，如果含有所述S1+S2抗独特型卵黄抗体，则判断所述S1+S2抗独特型卵黄抗体的效价是否大于等于10-4，如果大于等于10-4，则判定生产所述鸡蛋的所述产蛋鸡满足所述第二预定条件，将所述产蛋鸡确定为高免鸡；否则所述产蛋鸡不能确定为高免鸡，予以舍弃。
步骤150：按照第三预定条件采集高免鸡蛋，其中，所述高免鸡蛋为所述高免鸡生产的鸡蛋；
进一步的，所述按照第三预定条件采集高免鸡蛋，具体为：第三次进行所述第一免疫后第三天开始，采集所述高免鸡生产的鸡蛋，连续采集20天。
具体而言，从第三次进行所述第一免疫后的第三天开始，采集所述高免鸡生产的鸡蛋，连续采集20天，采集到的鸡蛋为所述高免鸡蛋。如果还需要所述高免鸡蛋，需要对所述高免鸡追加一次所述第一免疫，然后继续对所述高免鸡采集20天所述高免蛋。也就是说，每隔20天对所述高免鸡追加一次所述第一免疫，直至所述高免鸡被淘汰。
步骤160：对所述高免鸡蛋进行消毒后、卵黄分离、卵黄组织破碎后，获得卵黄液；
具体而言，将所述高免鸡蛋用自来水清洗干净后，放入70％的酒精中浸泡10分钟，对所述高免鸡蛋进行消毒杀菌，然后将所述高免鸡蛋从所述酒精中捞出，放在清洁间中晾干，自此完成对所述高免鸡蛋的消毒杀菌工作。
将消毒杀菌后的所述高免蛋进行卵黄分离，然后用破壁机或高压均质机对将分离出的蛋黄进行破碎，获得所述卵黄液。
步骤170：用水稀释和酸化法去除所述卵黄液中的杂质蛋白，获得抗独特型卵黄抗体粗制品；
进一步的，所述用水稀释和酸化法去除所述卵黄液中的杂质蛋白，具体为：
步骤410：将第一体积的无菌蒸馏水加入到第二体积的所述卵黄液中搅拌均匀，获得卵黄溶液；其中，所述第一体积等于15-30倍的所述第二体积；
步骤420：用盐酸和氢氧化钠溶液将所述卵黄溶液的pH值调至5.2-6.0；
步骤430：在4-8℃条件下，将所述卵黄溶液静置14-18小时后，取上部清液，获得第一清液；
步骤440：将底部浑浊液进行离心处理后，取上部清液，获得第二清液；
步骤450：将所述第一清液、所述第二清液进行混合，获得第三清液；
步骤460：用0.4μm的微孔滤膜对所述第三清液进行过滤。
具体而言，在所述卵黄液中加入无菌蒸馏水，形成所述卵黄溶液。用盐酸和氢氧化钠溶液对所述卵黄溶液的pH值进行调节，将所述卵黄溶液的pH值调节至5.2-6.0，使所述卵黄溶液产生浑浊沉淀。然后，将所述卵黄溶液在4-8℃条件下静置14-18小时后，取所述卵黄液内的上部清液，获得所述第一清液。然后对所述第一卵黄液底部的浑浊液体进行第一离心处理，其中，所述第一离心处理的转速为3500-4000r/min，离心半径为8cm，离心时间为20-40分钟。
对所述底部浑浊液进行所述第一离心处理后，用吸管吸取上部清液，获得第二清液。将所述第一清液、所述第二清液混合后，获得所述第三清液。然后对所述第三清液进行微孔过滤，取过滤后的滤液，所述滤液即为抗独特型卵黄抗体粗制品。其中，所述微孔过滤中微孔滤膜的孔径为0.4μm，所述微孔过滤的目的是进一步去除所述第三清液中的脂蛋白和脂肪。
步骤180：用酒精沉淀法对所述抗独特型卵黄抗体粗制品进行纯化，获得抗独特型卵黄抗体精制品。
进一步的，所述用酒精沉淀法对所述抗独特型卵黄抗体粗制品进行纯化，具体为：
步骤510：将第三体积的所述抗独特型卵黄抗体粗制品与第四体积的冷酒精混合，搅拌均匀后，获得第四混合溶液；其中，所述第四体积为所述第三体积的50％-60％；
步骤520：对所述第四混合溶液进行离心处理后，取沉淀物，获得第一沉淀物；
步骤530：向所述第一沉淀物中加入无菌蒸馏水，搅拌均匀，获得第五混合溶液，所述第五混合溶液的体积为第五体积；其中，所述第五体积等于第三体积。
步骤540：向所述第五混合溶液中加入第六体积的冷酒精，并搅拌均匀，获得第六混合溶液，其中，所述第六体积为所述第五体积的25％-30％；
步骤550：对所述六混合溶液进行离心处理后，取沉淀物，获得第二沉淀物；
步骤560：对所述第二沉淀物重复步骤530-550，取沉淀物，获得所述抗独特型卵黄抗体精制品；
具体而言，所述纯化需要进行3次沉淀，第一次沉淀为步骤510-520，第二次沉淀为步骤530-550，第三次沉淀为步骤560，其中所述第二次沉淀与所述第三次沉淀的操作步骤相同。步骤550中的所述离心处理的转速为4000r/min，离心半径8cm，离心时间20-40min。完成步骤560之后，可将所述抗独特型卵黄抗体精制品在37℃的环境下进行干燥，获得固态的所述抗独特型卵黄抗体精制品；也可用适量的蒸馏水将所述抗独特型卵黄抗体精制品进行溶解，获得液态的所述抗独特型卵黄抗体精制品，所述抗独特型卵黄抗体精制品即为所述新冠病毒S1+S2抗独特型卵黄抗体疫苗。
通过本实施例中的新冠病毒S1+S2抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法，解决了现有技术中新冠病毒疫苗分子量小，进入人体易被分解，稳定性差，体内存留时间短，效力弱的技术问题，达到了使新冠病毒疫苗分子量大，进入人体不易被分解，体内留存时间长，稳定性强、效力强的技术效果。
实施例二
为了检测所述兔抗S1+S2抗体和小鼠抗S1+S2抗体的效价和特异性，本实施例对所述兔抗S1+S2抗体和小鼠抗S1+S2抗体进行了效价检测和特异性检测。
1、效价检测
本实施例采用ELISA法对所述兔抗S1+S2抗体和小鼠抗S1+S2抗体进行效价检测。
(1)采用ELISA法对上所述兔抗S1+S2抗体进行效价检测，具体为：
步骤610：用包被缓冲液将所述S1+S2蛋白稀释为10μg/mL，将稀释后的S1+S2蛋白溶液加入8个反应孔内；
步骤620：常温下静置40-60分钟后，弃去8个所述反应孔内的液体，用PBS清洗三次8个所述反应孔，每次清洗3分钟；
步骤630：将所述兔抗S1+S2抗体分别稀释101、102、103、104、105、106、107、108倍，然后分别添加到8个所述反应孔内，即每个所述反应孔内添加一种浓度的所述兔抗S1+S2抗体，每个所述反应空内添加100μL；
步骤640：常温下静置30分钟后，弃去8个所述反应孔内的液体，并用PBS清洗三次8个所述反应孔，每次清洗3分钟；
步骤650：采用抗体稀释液按照1:1000对HRP标记的羊抗兔IgG抗体进行稀释后，获得所述羊抗兔IgG抗体溶液；
步骤660：向8个所述反应孔内添加所述羊抗兔IgG抗体溶液；
步骤670：常温静置30分钟后，弃去8个所述反应孔内的液体，并用PBS清洗三次8个所述反应孔，每次清洗3分钟；
步骤680：向8个所述反应孔内添加反应底物OPD(C6H8N2，邻苯二胺)，常温避光显色10-15分钟后，向8个所述反应孔内添加终止液；
步骤690：测定各个所述反应孔内的A492nm值，如果所述反应孔的A492nm值大于等于对照孔2.1倍时，则判定所述反应孔为阳性反应。
(2)采用ELISA法对上所述鼠抗S1+S2抗体进行效价检测，具体为：
将步骤630中的所述兔抗S1+S2抗体换成所述鼠抗S1+S2抗体，将步骤650中的羊抗兔IgG抗体换成羊抗鼠IgG抗体。按照步骤610-690，按照与所述兔抗S1+S2抗体进效价检测相同的方法，对所述鼠抗S1+S2抗体进行效价检测。
对所述兔抗S1+S2抗体和鼠抗S1+S2抗体进行效价检测的结果如表1所示：
表1兔抗S1+S2抗体和鼠抗S1+S2抗体效价检测结果
由表1知，本实施例中的所述兔抗S1+S2抗体的效价为10-5，所述鼠抗S1+S2抗体的效价为10-5，所述兔抗S1+S2抗体和所述鼠抗S1+S2抗体具有较高效价，可用于新型冠状病毒抗独特型卵黄抗体的制备。
2、特异性检测
本实施例中采用ELISA检测法分别对所述兔抗S1+S2抗体和所述鼠抗S1+S2抗体的特异性进行检测。
(1)对所述兔抗S1+S2抗体的特异性进行检测，具体为：
步骤710：用包被缓冲液分别将所述将S1+S2蛋白溶液、RBD蛋白溶液、ACE2蛋白溶液稀释为10μg/mL；
步骤720：将稀释后的所述将S1+S2蛋白溶液、RBD蛋白溶液、ACE2蛋白溶液分别加入到反应孔内，每个所述反应孔100μL，即每种蛋白溶液包被一个所述反应孔；
步骤730：常温下静置1小时后，弃去3个所述反应孔内的液体，用PBS清洗三次所述反应孔，每次清洗3分钟；
步骤740：向每个所述反应孔内添加稀释1000倍后的所述兔抗S1+S2抗体，每个所述反应孔100μL；其中，使用抗体稀释液对所述兔抗S1+S2抗体进行稀释；
步骤750：常温静置30分钟后，弃去所述反应孔内的液体，并用PBS清洗三次所述反应孔，每次清洗3分钟；
步骤760：将HRP标记的羊抗兔IgG抗体稀释1000倍后，加入到各个所述反应孔内，每个所述反应孔100μL；
步骤770：常温下静置30分钟后，弃去所述反应孔内的液体，并用PBS清洗三次所述反应孔，每次清洗3分钟；
步骤780：向各个所述反应孔内添加反应底物OPD，常温避光显色10-15分钟后，向所述反应孔内添加终止液；
步骤790：测定各个所述反应孔内的A492nm值，如果所述反应孔的A492nm值大于等于对照孔2.1倍时，则判定所述反应孔为阳性反应。
(2)对所述鼠抗S1+S2抗体的特异性进行检测，具体为：
将步骤740中的所述兔抗S1+S2抗体更换为所述鼠抗S1+S2抗体，将步骤760中的羊抗兔IgG抗体更换为羊抗鼠IgG抗体。按照步骤710-790，按照与所述兔抗S1+S2抗体进特异性检测相同的方法，对所述鼠抗S1+S2抗体进行特异性检测。
对所述兔抗S1+S2抗体和所述鼠抗S1+S2抗体进行特异性检测的结果如表2所示：
表2兔抗S1+S2抗体和鼠抗S1+S2抗体特异性检测结果
由表2知，本实施例中所述兔抗S1+S2抗体只和S1+S2发生免疫反应，所述鼠抗S1+S2抗体只和S1+S2发生免疫反应，所述兔抗S1+S2抗体和所述鼠抗S1+S2抗体都不和RBD、ACE2发生免疫反应，说明所述兔抗S1+S2抗体和所述鼠抗S1+S2抗体都是S1+S2特异性抗体。
实施例三
为了检测所述抗独特型卵黄抗体精制品的效价、特异性和浓度，本实施例对所述抗独特型卵黄抗体精制品进行了效价检测、特异性和浓度检测。
1、效价检测
本实施例中的所述S1+S2抗独特型卵黄抗体精制品是采用所述兔抗S1+S2抗体制得的，即步骤110的所述抗S1+S2抗体为兔抗S1+S2抗体。具体检测步骤为：
步骤810：用包被缓冲液将所鼠抗S1+S2抗体稀释1000倍后，加入到8个反应孔内，每个所述反应孔内添加100μL，常温下静置1小时；
步骤820：弃去8个所述反应孔内的液体，用PBS清洗三次8个所述反应孔，每次清洗3分钟；
步骤830：用PBS将所述S1+S2抗独特型卵黄抗体精制品分别稀释101、102、103、104、105、106、107、108倍，然后分别添加到8个所述反应孔内，即每个所述反应孔内添加一种浓度的所述S1+S2抗独特型卵黄抗体精制品，每个所述反应孔内添加100μL；
步骤840：常温下静置30分钟后，弃去8个所述反应孔内的溶液，并用PBS清洗三次8个所述反应孔，每次清洗3分钟；
步骤850：采用抗体稀释液按照1:1000对HRP标记的羊抗鸡IgY抗体进行稀释后，获得羊抗鸡IgY抗体溶液；
步骤860：向8个所述反应孔内添加所述羊抗鸡IgY抗体溶液，每孔100μL；
步骤870：常温静置30分钟后，弃去8个所述反应孔内的溶液，并用PBS清洗三次8个所述反应孔，每次清洗3分钟；
步骤880：向8个所述反应孔内添加反应底物OPD，常温避光显色10-15分钟后，向8个所述反应孔内添加终止液；
步骤890：测定各个所述反应孔内的A492nm值，如果所述反应孔的A492nm值大于等于对照孔2.1倍时，则判定所述反应孔为阳性反应。
对所述S1+S2抗独特型卵黄抗体精制品进行效价检测的结果如表3所示：
表3S1+S2抗独特型卵黄抗体精制品效价检测结果
由表3知，本实施例中的所述S1+S2抗独特型卵黄抗体精制品的效价为10-5，具有较高效价。
2、特异性检测
本实施例中采用ELISA检测法对所述S1+S2抗独特型卵黄抗体精制品的特异性进行检测，具体为：
步骤910：用包被缓冲液分别将所述鼠抗S1+S2抗体、鼠抗RBD抗体、鼠抗ACE2抗体稀释1000倍；
步骤920：将稀释后的所述鼠抗S1+S2抗体、所述鼠抗RBD抗体、所述鼠抗ACE2抗体分别加入到3个反应孔内，每个所述反应孔100μL，即每种抗体溶液包被一个所述反应孔；
步骤930：常温下静置1小时后，弃去3个所述反应孔内的液体，用PBS清洗三次所述反应孔，每次清洗3分钟；
步骤940：向每个所述反应孔内添加稀释1000倍后的所述S1+S2抗独特型卵黄抗体精制品，每个所述反应孔100μL；其中，使用抗体稀释液对所述S1+S2抗独特型卵黄抗体精制品进行稀释；
步骤950：采用抗体稀释液按照1:1000对HRP标记的羊抗鸡IgY抗体进行稀释后，获得羊抗鸡IgY抗体溶液；
步骤960：向所述反应孔内添加所述羊抗鸡IgY抗体溶液，每孔100μL；
步骤970：常温静置30分钟后，弃去所述反应孔内的溶液，并用PBS清洗三次8个所述反应孔，每次清洗3分钟；
步骤980：向所述反应孔内添加反应底物OPD，常温避光显色10-15分钟后，向8个所述反应孔内添加终止液；
步骤990：测定各个所述反应孔内的A492nm值，如果所述反应孔的A492nm值大于等于对照孔2.1倍时，则判定所述反应孔为阳性反应。
对所述S1+S2抗独特型卵黄抗体精制品进行特异性检测的结果如表4所示：
表4 S1+S2抗独特型卵黄抗体精制品特异性检测结果
由表4知，本实施例中所述S1+S2抗独特型卵黄抗体精制品只和鼠抗S1+S2抗体发生免疫反应，不和所述鼠抗RBD抗体、所述鼠抗ACE2发生免疫反应，说明所述S1+S2抗独特型卵黄抗体是抗S1+S2特异性抗体。
3、浓度检测
本实施例采用ELISA检测法对所述S1+S2抗独特型卵黄抗体精制品的浓度进行检测，具体为：
步骤1010：用包被缓冲液将IgY标准品分别稀释21、22、23、24、25、26倍，然后分别加入6个反应孔内，每孔100μL；
用包被缓冲液将所述S1+S2抗独特型卵黄抗体精制品分别稀释21、22、23、24、25、26倍，然后分别加入6个反应孔内，每孔100μL；
步骤1020：在常温下静置1h后，弃去12个所述反应孔内的溶液，用PBS清洗三次，每次清洗3分钟；
步骤1030：将羊抗鸡IgY抗体稀释1000倍后，添加到12个所述反应孔内，每孔100μL；
步骤1040：按照步骤970-990进行操作。
对所述S1+S2抗独特型卵黄抗体精制品进行浓度检测的结果如表5所示：
表5 S1+S2抗独特型卵黄抗体浓度
根据测定的标准品A492nm值，用CurveExpert软件绘制标准曲线，所述标准曲线如附图2所示。
根据附图2所示标准曲线，计算本发明制备的新冠病毒抗独特型卵黄抗体精制品的浓度，所述S1+S2抗独特型卵黄抗体精制品浓度为8mg/mL。
实施例四
本实施例提供了所述S1+S2抗独特型卵黄抗体精制品诱导产蛋鸡和家兔产生S1+S2抗体(Ab3)的试验，具体为：
取产蛋鸡10羽，家兔10只，分别分成两组，实验组产蛋鸡5羽，家兔5只，对照组产蛋鸡5羽，家兔5只。实验组每羽产蛋鸡注射所述S1+S2抗独特型卵黄抗体与牛血清白蛋白的偶联物和弗氏不完全佐剂的混合液0.5mL(含抗独特型卵黄抗体40μg)，每只兔皮下注射所述S1+S2抗独特型卵黄抗体和弗氏不完全佐剂的混合液0.5mL(含抗独特型卵黄抗体40μg)。隔一周免疫一次，共免疫3～4次。对照组用PBS取代S1+S2抗独特型卵黄抗体，免疫方法和次数同实验组。第3次免疫后第三天开始收鸡蛋，连续收5天。家兔在第3次免疫后第5～7天放血取血清。用ELISA检测实验组与对照组S1+S2抗体的免疫反应强度，检测结果如表6所示：
表6 S1+S2抗独特型卵黄抗体诱导产蛋鸡和家兔产生S1+S2抗体(Ab3)
由表6知，所述新冠病毒S1+S2抗独特型卵黄抗体能诱导产蛋鸡和家兔产生抗S1+S2抗体，鸡蛋卵黄和兔血清(1:1000)能分别和新冠病毒S1+S2蛋白产生强阳性反应，A492nm值分别为0.528±0.097和0.920±0.104，与对照组A492nm值0.205±0.107和0.331±0.027比有显著差别(P＜0.05，P＜0.01)，结果表明所述新冠病毒S1+S2抗独特型卵黄抗体是β型抗独特型抗体，可作新冠病毒S1+S2的疫苗使用。
本发明实施例中的上述一个或多个技术方案，至少具有如下一种或多种技术效果：
本发明实施例提供了一种新冠病毒S1+S2抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法，所述制备方法包括：采用新冠病毒的S1+S2蛋白制备抗S1+S2抗体；用PBS对所述抗S1+S2抗体进行稀释后，与弗氏不完全佐剂等体积混合，获得浓度为第一浓度的第一混合溶液；将所述第一混合溶液肌肉注射产蛋鸡，对所述产蛋鸡按照第一预定条件进行第一预定次数的第一免疫；判断所述产蛋鸡是否满足第二预定条件；若满足所述第二预定条件，所述产蛋鸡确定为高免鸡；按照第三预定条件采集高免鸡蛋，其中，所述高免鸡蛋为所述高免鸡生产的鸡蛋；对所述高免鸡蛋进行消毒、卵黄分离、卵黄组织破碎后，获得卵黄液；用水稀释和酸化法去除所述卵黄液中的杂质蛋白，获得抗独特型卵黄抗体粗制品；用酒精沉淀法对所述抗独特型卵黄抗体粗制品进行纯化，获得抗独特型卵黄抗体精制品。通过上述制备方法解决了现有技术中新冠病毒疫苗分子量小，进入人体易被分解，稳定性差，体内存留时间短，效力弱的技术问题，达到了使新冠病毒疫苗分子量大，进入人体不易被分解，体内留存时间长，稳定性强、效力强的技术效果。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明实施例的精神和范围。这样，倘若本发明实施例的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种新冠病毒S1+S2抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法，所述制备方法包括：
采用新冠病毒的S1+S2蛋白制备抗S1+S2抗体；
用PBS对所述抗S1+S2抗体进行稀释后，与弗氏不完全佐剂等体积混合，获得浓度为第一浓度的第一混合溶液；
将所述第一混合溶液肌肉注射产蛋鸡，对所述产蛋鸡按照第一预定条件进行第一预定次数的第一免疫；
判断所述产蛋鸡是否满足第二预定条件；若满足所述第二预定条件，所述产蛋鸡确定为高免鸡；
按照第三预定条件采集高免鸡蛋，其中，所述高免鸡蛋为所述高免鸡生产的鸡蛋；
对所述高免鸡蛋进行消毒、卵黄分离、卵黄组织破碎后，获得卵黄液；
用水稀释和酸化法去除所述卵黄液中的杂质蛋白，获得抗独特型卵黄抗体粗制品；
用酒精沉淀法对所述抗独特型卵黄抗体粗制品进行纯化，获得抗独特型卵黄抗体精制品。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一浓度为每毫升所述第一溶液中含80μg所述抗S1+S2抗体。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一预定条件为每只所述产蛋鸡每次所述第一免疫注射0.5mL所述第一混合溶液，每隔7-10天进行一次所述第一免疫；
所述第一预定次数为3次。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述判断所述产蛋鸡是否满足第二预定条件，具体为：
第三次进行所述第一免疫当天，采集所述产蛋鸡生产的鸡蛋，判断所述鸡蛋的卵黄是否含有S1+S2抗独特型卵黄抗体；
如果含有所述S1+S2抗独特型卵黄抗体，判断所述S1+S2抗独特型卵黄抗体的效价是否大于等于10-4；
如果所述S1+S2抗独特型卵黄抗体的效价大于等于10-4，则所述产蛋鸡满足所述第二预定条件。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述按照第三预定条件采集高免鸡蛋，具体为：
第三次进行所述第一免疫后第三天开始，采集所述高免鸡生产的鸡蛋，连续采集20天。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述用水稀释和酸化法去除所述卵黄液中的杂质蛋白，具体为：
将第一体积的无菌蒸馏水加入到第二体积的所述卵黄液中搅拌均匀，获得卵黄溶液；其中，所述第一体积等于15-30倍的所述第二体积；
用盐酸和氢氧化钠溶液将所述卵黄溶液的pH值调至5.2-6.0；
在4-8℃条件下，将所述卵黄溶液静置14-18小时后，取上部清液，获得第一清液；
将底部浑浊液进行离心后，取上部清液，获得第二清液；
将所述第一清液、所述第二清液进行混合，获得第三清液；
用0.4μm的微孔滤膜对所述第三清液进行过滤。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗S1+S2抗体为兔抗S1+S2抗体，所述兔抗S1+S2抗体的制备方法具体为：
将S1+S2蛋白溶液与弗氏不完全佐剂等体积混合均匀，获得第二混合溶液；
用所述第二混合溶液对M只家兔进行皮下注射，对所述家兔按照第四预定条件进行第二预定次数的第二免疫；
判断所述家兔是否满足第五预定条件；
若满足所述第五预定条件，则所述家兔确定为高免兔；
第三次进行所述第二免疫后5-7天，对所述高免兔进行放血，获得第一血浆；
对所述第一血浆进行离心处理后，取血清，获得所述兔抗S1+S2抗体；
其中，M≥2，且为正整数。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述判断所述家兔是否满足第五预定条件，具体为：
第三次进行所述第二免疫当天，取所述家兔的血液，获得第二血浆；
对所述第二血浆进行离心处理，获得第一血清；
用ELISA检测法对所述第一血清的效价进行检测；
当所述第一血清的效价大于10-4时，所述家兔满足所述第五预定条件。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗S1+S2抗体为鼠抗S1+S2抗体，所述鼠抗S1+S2抗体的制备方法包括：
将S1+S2蛋白溶液与弗氏不完全佐剂等体积混合均匀，获得第三混合溶液；
将所述第三混合溶液对N只小鼠进行腹腔注射，对所述小鼠按照第六预定条件进行第三预定次数的第三免疫；
判断所述小鼠是否满足第七预定条件；
若满足所述第七预定条件，则所述小鼠确定为高免鼠；
第三次进行所述第三免疫后5-7天对所述高免鼠进行放血，获得第三血浆；
对所述第三血浆进行离心处理后，取血清，获得所述鼠抗S1+S2抗体；
其中，N≥2，且为正整数。
10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述判断所述小鼠是否满足第七预定条件具体为：
第三次进行所述第三免疫当天，取所述小鼠的血液，获得第四血浆；
对所述第四血浆进行离心处理，获得第二血清；
用ELISA检测法对所述第二血清的效价进行检测；
当所述第二血清的价效大于10-4时，所述小鼠满足所述第七预定条件。
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