CN1478550A - 预防和治疗非典型肺炎的蛋黄抗体组合物及其制备方法 - Google Patents
预防和治疗非典型肺炎的蛋黄抗体组合物及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1478550A CN1478550A CNA031488447A CN03148844A CN1478550A CN 1478550 A CN1478550 A CN 1478550A CN A031488447 A CNA031488447 A CN A031488447A CN 03148844 A CN03148844 A CN 03148844A CN 1478550 A CN1478550 A CN 1478550A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- antibody
- yolk
- yolk antibody
- atypical pneumonia
- igy
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种预防和治疗非典型非炎的蛋黄抗体组合物及其制备方法,主要是由非典型肺炎病原体特异性蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体组成。本发明具有成本低、产量高、特异性强、决定簇广并能进行集约化大规模生产的优点,尤其是能避免HAMA反应和异质性问题,且无毒副作用、安全性好。适用于作为因SARS冠状病毒、腺病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体感染所致的传染性非典型肺炎的预防和治疗剂以及食品、保健品添加剂。
Description
技术领域
本发明属于生物治疗技术领域,特别是涉及一种预防和治疗非典型肺炎的蛋黄抗体组合物及其制备方法,另外还涉及该蛋黄抗体组合物的用途。
背景技术
非典型肺炎(atypical pneumonia)是一种急性呼吸道传染病,国外称其为“严重急性呼吸综合症”(Severe Acute Respiratory Syndrome,SARS),主要通过近距离空气飞沫和密切接触传播,本病发病急、传播快,病死率为5%。本病的明显症状一般有:发烧、干咳、有时带血丝、有呼吸困难;X光片发现肺部有片状阴影;血液检查白细胞不高或者甚至降低;有接触非典型肺炎病人的历史。
现在,我国科技工作者对于传染性非典型肺炎的病原体已成功分离和鉴定,通过电镜形态学、血清学和动物致病性观察及逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增与部分基因序列分析,对分离的病原体进行鉴定,从形态学和分子生物学的证据均证明其治病病原体为冠状病毒(Coronaviridae)。2003年4月16日,世界卫生组织(WHO)在各方研究成果的基础上,正式宣布导致SARS的病原体是一种以前未知的冠状病毒,并命名为SARS冠状病毒。SARS冠状病毒隶属于巢状病毒目,冠病毒科,冠状病毒属。根据其基因组结构分类,它属于单链正义RNA病毒,自身即可发挥翻译模板作用,长度在27-31kb。
在本病病变机理中,过强的自身免疫反应是目前认为最有可能解释SARS病毒引起急性肺损伤的机制。但SARS病毒所具有的结构蛋白和5个全新的未知蛋白进入机体如何成为“超级抗原”,有待于进一步研究。
目前对于SARS还缺乏特效的治疗方法,现有的治疗手段包括抗病毒治疗如利巴韦林及血清疗法等;用激素降低免疫系统对肺的损伤;用抗生素治疗潜在的细菌感染以及辨证的中西医结合治疗;呼吸机的应用以及应激和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的对症支持治疗等。
中国学者毕胜利将广东省治疗非典型肺炎行之有效的经验归纳为:1)支持疗法,为病人提供足够的热能,如葡萄糖、氨基酸、维生素等,保证病人有足够的营养和抵抗力;2)谨慎使用抗菌素,因为抗菌素有毒性;3)根据病情进展的实际情况使用激素,在病人有器官破坏倾向的情况下,可以使用激素,以缓解组织器官的破坏;4)临床要注意保护医务人员;5)灵活应用呼吸机等应急手段。
在本病的临床治疗过程中,上述药物常产生严重的毒副作用以及过敏反应,并很容易产生耐药性,给临床有效治疗SARS带来了一定的困难。
基于上述治疗手段所存在的不足,近几个月来,对SARS治疗药物的研究重点逐渐转移到生物技术药物领域。国内外学者的研究重点多集中在针对于SARS冠状病毒的有效药物的大规模筛选、多肽药物、抗体药物尤其是单克隆抗体药物以及疫苗的研究领域。
单克隆抗体作为治疗剂的研究于近年来已获得重要进展。单克隆抗体药物(monoclonalantibody agent)可应用于治疗肿瘤、病毒性感染、心血管病以及其它疾患,尤其是用于传染性疾病的治疗,已显示出良好的应用前景。
抗体药物一般包括两大类,一是抗病原体单克隆抗体(简称单抗)或多克隆抗体(简称多抗);二是抗病原体单抗或多抗偶联物,或称免疫偶联物(immunoconjugate)。免疫偶联物分子由单抗或多抗与“弹头”药物两部分构成,故称为导向药物,又称生物导弹或“魔弹”(magic bullets),与之相对应的治疗方法称为导向治疗。单抗或多抗所针对的靶标通常为病原体表面的特异性抗原或特定的受体。用作“弹头”的物质主要有三类,即放射性核素、药物和毒素,其与单抗或多抗连接分别构成放射免疫偶联物、化学免疫偶联物和免疫毒素。自80年代以来对抗病原体尤其是抗肿瘤单抗药物进行了大量研究,特别是自1997年以来,Rituxan、Herceptin在美国相继获批准用于临床肿瘤治疗,单抗药物的研究与开发有了新的发展势头,成为生物技术药物的新热点(甄永苏,单克隆抗体药物治疗肿瘤的研究现状与展望,中国医学科学院学报,2000,22:9-12)。
尽管单抗药物的临床研究结果已为其应用于治疗肿瘤展示出良好的前景,但仍有许多问题需要进一步研究解决(Nguyen DT,Amess JA,Doughty H,et al.IDEC-C2B8 anti-CD20(rituximab)immunotherapy in patiebts with low-grade non-Hodgkin′s lymphoma and lymphoproli ferativedisorders:evahuation of response on 48 patients,Eur J Haematol,1999,62:76-82)。单抗药物存在的问题主要涉及免疫学和药理学两方面。免疫学方面的问题关键是人抗鼠Ig抗体(HAMA)反应,因为多年来用于临床研究的单抗药物多数使用小鼠单抗制备,往往导致HAMA反应。此外,病原体在抗原性方面的异质性,病原体的抗原性调变等也能影响单抗药物的疗效。药理学方面的问题主要是到达病原体的药量不足。单抗药物在体内运送过程中受多种因素影响。由于它是异体蛋白,会被网状内皮系统摄取,有相当数量将积聚于肝、脾和骨髓;再者就是机体对该异体蛋白产生抗体而降低其效力。单抗药物是大分子物质,通过毛细血管内皮层以及穿透病原体均受到限制。(甄永苏,单克隆抗体药物治疗肿瘤的研究现状与展望,中国医学科学院学报,2000,22:9-12)。
疾病的免疫治疗是利用病原体免疫原进行主动免疫来激发、增强机体对病原体的主动特异性免疫反应。目前所研究的病原体疫苗主要是基因工程疫苗、肽疫苗、核酸疫苗、抗独特型抗体疫苗。其中a)病原体基因工程疫苗是通过基因重组技术,将目的基因导入受体细胞而制备的疫苗;b)肽疫苗是基于在免疫反应中抗原在胞浆内降解为短肽,最后形成肽-MHC-TCR复合体最终激发细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应;c)核酸疫苗是由编码能引起保护性免疫反应的抗原基因片段和载体构建而成的,包括DNA疫苗和RNA疫苗,目前研究较多的为DNA疫苗;核酸疫苗能够同时刺激机体产生体液免疫和细胞免疫,诱导许多亚单位疫苗不能诱导的CTL效应;d)抗独特型抗体疫苗(Ab2疫苗)是根据抗独特型抗体具有模拟抗原及免疫调节的双重作用,同时能克服机体免疫抑制,打破免疫耐受故能代替病原体抗原诱发特异性主动免疫反应(BhattacharyaCM,Mukerjee S,biddle W,et al.Murine monoclonal anti-idiotype antibldy as a potential networdantigen for human carcinoembryonic antigen.J Immumol,1990,145:2758.)。
在上述病原体疫苗免疫治疗方法中,由于病原体抗原的抗原性强弱不同,且病原体宿主经常处于免疫抑制状态,难以激发有效的抗病原体反应。尽管抗独特型抗体的研究已取得许多进展,但事物总是两方面的。Ab2疫苗应用存在许多困难,因为抗独特型抗体β(Ab2β)虽能模拟小分子多肽抗原,却难以精确反映大分子蛋白质抗原的决定簇,尤其是Ab2β单抗。再者由于病原体抗原极其复杂,常发生调变等,制备广谱的病原体特异性独特型疫苗难度很大。更重要的是目前使用的Ab2β主要来自鼠杂交瘤细胞,为异种蛋白,能激发人免疫系统产生人抗鼠Ig抗体(HAMA),发生中和反应并产生毒性免疫复合物,而降低疗效,严重时可引起血清病反应。
鉴于以上技术方案所存在的诸多问题,为了避免或减少HAMA反应,现通常是使鼠源性单抗人源化或研制完全的人源抗体。单抗人源化主要是通过基因工程技术制备嵌合抗体(chimericantibody)或改形抗体(reshaping antibody)。嵌合抗体是将Fc段置换为人源性,其它部分仍为鼠源性。改形抗体是指除互补决定区(CDR)为鼠源性外,其它部分均为人源性。还可以使偶联物分子小型化,以提高药物对病原体的渗透力,研制高效单抗药物。采取局部注射以提高单抗药物在病原体部位的浓度。使多种抗体混合应用以弥补单抗的异质性问题。其中鼠源性单抗人源化和研制完全的人源抗体具有较高的技术难度,难于在短时期内普及应用。
禽类尤其是鸡在系统发育上与哺乳动物有很大差异,鸡的免疫球蛋白与哺乳动物免疫球蛋白在免疫学特性上也有很大不同。鸡的免疫系统能识别更多的免疫反应位点和更多的抗原决定簇,因此鸡免疫系统对哺乳动物的蛋白或生物分子能产生具有更高效价和亲和力的特异性抗体。鸡免疫系统针对于外源性蛋白所产生的IgY不仅具有更高的免疫特异性,更重要的是这种特异性IgY主要储存在鸡蛋黄中,因此可利用下蛋母鸡作为免疫反应器来大量生产具有重要临床应用价值的抗体药物。
众所周知,鸡蛋作为人类的常用食品和化妆品原料,无论内服和外用均对人体无任何生物毒性和不良作用。因此,利用禽类作为免疫反应器来大量生产抗体药物,并应用于疾病的诊断和免疫治疗,将具有极其广阔的应用前景。以疾病特异性蛋黄抗体IgY为原料制备的免疫药物和抗独特型抗体疫苗(Ab2疫苗)可以很好地解决上述单抗偶联物或上述病原体疫苗所存在的HAMA反应和异质性问题。
授权中国专利申请号93112409.3公开了“一种新型免疫原性复合物制剂及制备方法”,本发明由抗原与抗体组建,抗原量多于抗体量,利用抗原抗体复合物为载体,携带抗原,改变抗原提呈形式,增强机体免疫性。本发明采用血源纯化乙肝表面抗原,很难避免其潜在的感染性。况且该复合物是一种抗原抗体复合物,而不是抗体和抗独特性抗体复合物。
授权中国专利申请号97106291.9公开了“抗原-抗体-重组DNA复合型疫苗”,本发明由微生物抗原-抗体与带有编码微生物的一种或几种基因的重组质粒DNA制备成复合型疫苗,通过诱生对微生物感染处于免疫应答低下或免疫耐受者产生应答,可显著提高机体的特异性体液免疫与细胞免疫,具有抗原提呈形式多,诱生免疫应答速度快,而且用量少,稳定性高等特点。本发明采用基因重组乙肝表面抗原和抗体,再加入乙肝DNA重组质粒。该方法需要基因工程技术,技术工艺周期长,难度大,况且该复合物是一种抗原-抗体-重组DNA复合物,而不是抗体和抗独特性抗体复合物。
中国专利申请号02113744.7公开了“抗禽类病毒性疫病的复合卵黄抗体及其制备和应用”,是由蛋黄抗肠毒素免疫球蛋白、卵转铁蛋白、溶菌酶和余量的水分、灰分及微量元素组成的蛋白复合物,而不是抗体和抗独特性抗体复合物。
中国专利申请号00125941.5公开了“蛋黄免疫活性蛋白复合物”,是由具有抗体活性的抗禽流感、新城疫的鸡卵黄抗体(抗-ANIgY)组成的抗体复合物,也不是抗体和抗独特性抗体复合物。
在现有技术中,单克隆抗体药物和疫苗为两大类相互独立的免疫药物,其中单克隆抗体药物通常用于免疫治疗,疫苗通常用于免疫预防。临床通常是分别单独使用,其中疫苗用于未病先预防,而单克隆抗体药物则主要施用于既病患者,但是,在临床上很难及时判断出就诊者是未发病还是已发病,当就诊者处于观察期或疾病处于窗口期时,是施用疫苗还是施用抗体药物就变得非常难把握,在此情况下,假如对未病者施用抗体药物,不但会造成浪费而且又不能起到预防的目的;如果对已病者施用疫苗,不但达不到预防的目的而又失去了早期治疗的机会,因此临床急需一种能够实现有病治病未病预防的复合型抗体药物。另外,对于减毒或灭活病原体疫苗的使用,会给患者带来潜在感染的隐患,其使用安全性不高。因此研制开发一种既能治病又能防病、安全高效的免疫药物已成为当今生物技术领域的重大课题。
发明目的
本发明目的在于克服上述技术的缺点与不足,提供一种预防和治疗非典型肺炎的蛋黄抗体组合物,包括非典型肺炎病原体特异性蛋黄抗体IgY、抗独特型抗体组合物,以达到既能治病又能防病的目的。该蛋黄抗体组合物用于作为生物治疗剂,能有效避免因减毒或灭活病原体疫苗的使用所导致的潜在感染问题,不存在鼠源性单克隆抗体的HAMA反应,无毒副作用和过敏反应,安全性高,靶向性强,且疗效全面,适用于作为传染性非典型肺炎的预防和治疗剂及诊断剂。
本发明的另一目的还在于预防和治疗非典型肺炎的蛋黄抗体组合物的制备方法。
本发明的另一目的还在于预防和治疗非典型肺炎的蛋黄抗体组合物的用途。技术方案
本发明的技术方案是这样实现的:一种预防和治疗非典型肺炎的蛋黄抗体组合物,其特征在于;主要是由非典型肺炎病原体特异性蛋黄抗体LgY和蛋黄抗独特型抗体组成,其中以预防为目的者,非典型肺炎病原体特异性蛋黄抗独特型抗体的量(w/w)>蛋黄抗体IgY的量;以治疗为目的者,非典型肺炎病原体特异性蛋黄抗体IgY的量(w/w)>蛋黄抗独特型抗体的量;以预防性治疗或早期治疗为目的者,非典型肺炎病原体特异性蛋黄抗体IgY的量(w/w)=蛋黄抗独特型抗体的量。
根据本发明,其特征还在于:所述非典型肺炎病原体特异性蛋黄抗体IgY是针对于病原体特异性免疫原的蛋黄抗体IgY;所述非典型肺炎病原体特异性蛋黄抗独特型抗体是针对于病原体特异性免疫原所对应的特异性抗体包括蛋黄抗体IgY的特异性蛋黄抗独特型抗体。
根据本发明,其特征还在于:所述蛋黄抗体IgY是针对于纯化或重组的非典型肺炎病原体特异性免疫原的抗体。其中所述免疫原包括纯化或灭活的非典型肺炎病原体特异性抗原、通过基因工程技术重组的非典型肺炎病原体特异性抗原或疫苗、非典型肺炎病原体DNA或mRNA及其与相应载体组成的重组体中的任一种或其组合;还包括上述非典型肺炎病原体特异性免疫原的纳米微粒或脂质体复合物;
根据本发明,其特征还在于:所述非典型肺炎病原体特异性蛋黄抗独特型抗体是针对于非典型肺炎病原体特异性抗原的单克隆或多克隆抗体包括蛋黄抗体IgY的抗独特型抗体α(Ab2α)、抗独特型抗体β(Ab2β)、抗独特型抗体γ(Ab2γ)和抗独特型抗体ε(Ab2ε)中的任一种或其组合。
所述抗独特型抗体是针对于外来抗原的抗体分子(Ab1)可变区上独特型(Id)可刺激机体产生相应的抗Id抗体(Ab2)。其中Ab2α属半抗原非抑制性Ab2,具有调节作用,可促进或抑制Ab1克隆;Ab2β具有与外来抗原相似的氨基酸排列顺序或空间构型,它能够在体内模拟始动抗原的作用,故被认为是外部抗原在机体免疫系统中的“内影像”(internal image),可抑制Ab1与相应抗原的结合反应;Ab2γ属半抗原非抑制性Ab2,能抑制抗原与Ab1的结合,具有调节作用,可促进或抑制带有相应Id克隆细胞增殖;Ab2ε又称Epibody,是一种双特异性抗体,能识别Ab1骨架区上的抗原决定簇,同时又能识别自身或外来抗原上的表位,更有利于非典型肺炎的免疫治疗。
根据本发明,其特征还在于:所述非典型肺炎病原体相应免疫原包括SARS冠状病毒、腺病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体特异性的纯化或重组抗原、组织细胞和细胞因子及其受体;所述免疫原是蛋白质、多肽、粘多糖、脂多糖、糖蛋白、细胞核、细胞质、细胞膜、细胞表面受体、核蛋白、DNA、RNA、线粒体、微粒体中的任一种或其组合。
根据本发明,其特征还在于:所述预防和治疗非典型肺炎的蛋黄抗体组合物包括SARS冠状病毒蛋黄抗体组合物、腺病毒蛋黄抗体组合物、肺炎支原体蛋黄抗体组合物、肺炎衣原体蛋黄抗体组合物中的任一种或其组合。
根据本发明,其特征还在于:在上述蛋黄抗体组合物中还含有特异性蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体特异性结合所形成的免疫复合物;所述免疫复合物包括IgY-Ab2α、IgY-Ab2β、IgY-Ab2γ和IgY-Ab2ε复合物中的任一种或其组合。
具有内影像特点的抗独特型抗体能模拟病原体相关抗原诱导机体产生主动免疫应答,其应答过程极其复杂,但主要涉及体液免疫和细胞免疫两方面。Ab2β作为胸腺依赖抗原(TD)激活辅助T淋巴细胞亚群(Th1和Th2),分泌一系列细胞因子,如Th1细胞产生干扰素-γ(INF-γ)、IL-10、TNF和白细胞介素-2(IL-2);Th2细胞产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等。Th2细胞产生的细胞因子影响和促进B淋巴细胞分化和增殖,产生特异性抗体Ab3,Ab3一部分能与Ab1互相模拟,即具有与抗原结合性,称之为抗病原体抗体(Ab1′)。总Ab3的产生已被证实与微小病原体病灶消退和/或病人病情好转呈正相关。被激活的Th1细胞释放细胞因子,如INF-γ可通过影响NK细胞及T细胞功能而发挥抗病原体效应,IL-2可促进T细胞生长、克隆性扩增而增强机体的免疫功能,亦可诱导或促进多种细胞毒性细胞活性,如自然杀伤细胞(NK)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)及肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)等,发挥免疫监视及抗病原体效应。同时IL-2还可协同刺激B细胞增殖及分泌抗体,与补体及效应细胞相作用,发挥抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)及补体依赖性细胞毒性(CDC)抗病原体作用(龚非力等,医学免疫学,第二版,武汉:科学出版社,2000)。人体内免疫系统是一个处于自身动态平衡中的系统。在传染病患者体内的免疫系统中,抗独特型抗体是一个较关键的系统要素,用人为的方法改变抗独特型抗体的质量和数量,必然会使系统发生变化,再在更高的层次上达到新的平衡。使对病原体免疫的系统平衡按照理论上预测的有利于患者的方向发展变化,在某种意义上这正是抗独特型抗体应用的关键所在。
根据本发明,其特征还在于:在上述蛋黄抗体组合物中还含有药用辅料;所述药用辅料包括包衣材料、蛋白稳定剂、药用佐剂、免疫增强剂,其中包衣材料为丙烯酸树脂、羟丙基甲基纤维素及其衍生物中的任一种;蛋白稳定剂为聚乙二醇、蔗糖、海藻糖中的任一种;药用佐剂为氢氧化铝、表面活性剂、福氏(Freund)佐剂中的任一种;免疫增强剂为多聚糖、糖肽、糖脂、脂类和磷脂,其中脂类包括三棕榈酰丝氨酰甘油基半胱氨酸(P3CSS)、单棕榈脂酸、双棕榈脂酸、三棕榈脂酸、棕榈酰赖氨酸、α-氨基十六烷酸(含线性饱和脂性侧链)、月桂酰肽脂中的任一种;上述脂类是以分子内佐剂的形式与所述蛋黄抗体组合物中的特异性蛋黄抗体IgY或蛋黄抗独特型抗体结合成复合物。
根据本发明,其特征还在于:在上述蛋黄抗体组合物中还含有免疫偶联物;所述免疫偶联物包括上述非典型肺炎病原体特异性蛋黄抗体IgY与放射性核素、药物和毒素以及细胞因子的偶联物中的任一种或其组合;其中所述放射性核素包括碘131I、磷32P、锶89Sr、钇90y、钐153Sm、铼188Re中的任一种或其组合;所述药物包括抗病毒药物、抗菌素、免疫调节药物、免疫抑制剂中的任一种或其组合;所述毒素包括包括篦麻籽毒素(RT)、相思子毒素(abrin)、苦瓜毒素(MD)、氧化苦参碱(OXY)、去甲斑蝥素、白喉毒素(DT)、假单胞菌内毒素以及绿脓杆菌外毒素(PE)中的任一种或其组合;所述细胞因子包括白细胞介素、集落刺激因子(CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、趋化因子中的任一种或其组合;从而使所述蛋黄抗体组合物具有导向或靶向作用。
根据本发明,其特征还在于:所述的蛋黄抗体组合物是其纳米微粒或脂质体复合物。
根据本发明,其特征还在于:所述蛋黄抗体组合物是任一种药剂学上所述的剂型;所述剂型包括注射剂、胶囊、口服液、喷雾剂、贴剂中的任一种剂型。
一种预防和治疗非典型肺炎的蛋黄抗体组合物的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
1)采用蛋白质盐析、柱层析纯化非典型肺炎病原体特异性抗原或通过基因重组的办法制备非典型肺炎病原体特异性抗原;所述非典型肺炎病原体特异性抗原包括SARS冠状病毒、腺病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体的纯化或重组特异性抗原;
2)通过免疫动物制备针对于上述非典型肺炎病原体抗原的单克隆或多克隆抗体;或通过基因重组的办法制备非典型肺炎病原体特异性抗体;
3)以步骤1)制备的非典型肺炎病原体特异性抗原为免疫原,多次重复免疫注射给禽类优选是鸡,待5-20天后禽类尤其是鸡的产蛋中即含有针对于上述非典型肺炎病原体特异性免疫原的蛋黄抗体IgY;所述的免疫原注射量为1-2ml,免疫原量10-500μg/ml+等量不完全福氏佐剂;
4)禽蛋尤其是鸡蛋去壳取黄,经灭菌处理后,依次进行a)用5倍体积的0.1mol/L PH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液稀释蛋黄;b)自-20℃到室温反复冻融,每分钟500-1000转低速离心后合并上清液备用:c)向上清液中加入辛酸至终浓度为1.5%,沉淀后取上清液备用;d)向上清液中加入硫酸钠至终浓度为36%,取沉淀备用;e)取沉淀通过浸提、萃取、浓缩、纯化、冷冻或喷雾干燥,即得到针对于非典型肺炎病原体的蛋黄抗体组合物组分之一蛋黄抗体IgY;所述非典型肺炎病原体特异性蛋黄抗体IgY可进一步偶联放射性核素、药物、毒素和细胞因子中的任一种而制备成蛋黄抗体IgY偶联物;
5)取步骤2)制备的针对于上述抗原的抗体或步骤3)制备的蛋黄抗体IgY为免疫原,多次重复免疫注射给禽类优选是鸡,待5-20天后禽类尤其是鸡的产蛋中即含有针对于上述相应抗体包括蛋黄抗体IgY的蛋黄抗独特型抗体;所述的免疫原抗体Ab1的注射量为1-2ml,免疫原抗体Ab1的用量为10-2000μg/ml+等量不完全福氏佐剂;
6)重复步骤4)的过程,即得到针对于非典型肺炎病原体免疫原相应抗体的蛋黄抗体组合物组分之一蛋黄抗独特型抗体;
7)根据实际需要按重量配比调制步骤4)所得的蛋黄抗体IgY和步骤6)所得的蛋黄抗独特型抗体,再辅以可接受量的药用辅料即得到所述的蛋黄抗体组合物;所述的蛋黄抗体组合物可制备成纳米微粒或脂质体复合物以利于吸收;
8)取步骤7)制备的蛋黄抗体组合物经过无菌、安全及毒性试验合格后,再通过相应的制剂工艺制备成药剂学上相应的剂型;所述剂型包括注射剂、胶囊、口服液、喷雾剂、贴剂中的任一种剂型。
根据本发明的制备方法,其特征还在于包括以下步骤:
1)分别取纯化或重组的非典型肺炎病原体特异性抗原和已制备好的针对于上述抗原的抗体包括蛋黄抗体IgY作为免疫原,分别连续或同时多次重复免疫注射给禽类优选是鸡;还可将纯化或重组的非典型肺炎病原体特异性抗原同已制备好针对于上述抗原的抗体包括蛋黄抗体IgY按1∶1比例混合后作为免疫原进行免疫注射;待5-20天后禽类尤其是鸡的产蛋中即同时含有针对于上述抗原的蛋黄抗体IgY和针对于上述抗体包括蛋黄抗体IgY的特异性蛋黄抗独特型抗体;
2)取上一步骤所得的禽蛋或鸡蛋,经灭菌处理后,依次进行a)用5倍体积的0.1mol/L PH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液稀释蛋黄;b)自-20℃到室温反复冻融,每分钟500-1000转低速离心后合并上清液备用;c)向上清液中加入辛酸至终浓度为1.5%,沉淀后取上清液备用;d)向上清液中加入硫酸钠至终浓度为36%,取沉淀备用;e)取沉淀通过浸提、萃取、浓缩、纯化、冷冻或喷雾干燥;一次性提取纯化,即可同时得到蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体两种组合物组分;所述的蛋黄抗体组合物可制备成纳米微粒或脂质体复合物以利于吸收;
3)然后检测其中各组分的含量,再辅以可接受量的药用辅料,并经过无菌、安全及毒性试验合格后,再根据实际需要,通过相应的制剂工艺制备成药剂学上相应的剂型;所述剂型包括注射剂、胶囊、口服液、喷雾剂、贴剂中的任一种剂型。
根据本发明,预防和治疗非典型肺炎的蛋黄抗体组合物的用途,其特征在于:所述蛋黄抗体组合物用于作为非典型肺炎的预防和治疗剂以及食品、保健品添加剂,尤其是用于作为因SARS冠状病毒、腺病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体感染所致的传染性非典型肺炎的预防和治疗剂以及食品、保健品添加剂和诊断剂。技术效果
本发明将蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体有机巧妙地结合在一起,既适用于治疗又适用于预防传染性非典型肺炎,兼具治病和防病于一身,不但避免了单克隆抗体药物和疫苗之功能单一的缺点,而且有效地解决了鼠源性单抗所产生的HAMA反应问题,无毒副作用和过敏反应,安全性高,靶向性强,且疗效全面。更重要的是由于本发明中的特异性蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体免疫复合物的形成,使其所携带的蛋黄抗体IgY的中和或消除靶向抗原的功能同其所携带的蛋黄抗独特型抗体的调节、抑制、模拟“内影像”及双特异性抗体等功能相得益彰、相互促进、相互协调、相互增强,协同作用以达到预防和治疗传染性非典型肺炎的双向目的。
本发明就是采用上述方法所制备的非典型肺炎病原体特异性蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体组合物,作为非典型肺炎特异性治疗剂而用于传染性非典型肺炎的特异性免疫预防和治疗。该蛋黄抗体组合物能够激活特定的淋巴细胞(B细胞和/或T细胞)反应,产生相应的抗非典型肺炎病原体作用,并对将来的非典型肺炎病原体产生记忆反应,激活机体免疫系统甚至重新调节机体免疫的系统平衡,调动体液免疫和细胞免疫作用,产生特异性对抗非典型肺炎病原体的抗体或杀伤性淋巴细胞,来共同杀灭非典型肺炎病原体,以达到预防和治疗非典型肺炎的目的。
本发明通过检测试验和动物实验,取得了意想不到的效果,其实验结果(见实验例)表明,本发明具有下列优点:
1、本发明服用、携带、运输方便,适用于男女、老幼患者使用。
2、本发明疗效确切、无毒副作用和过敏反应,适用于传染性非典型肺炎的预防和治疗剂以及食品、保健品添加剂。
3、本发明可替代和补充昂贵的抗病毒、抗细菌以及免疫抑制药物,能有效避免上述药物的耐药性及毒副作用。
4、本发明制备原料包括免疫原、禽类及其蛋黄、饲料、纯化设备及其所用化学原料来源广泛易得,经济实用。
5、本发明制备工艺成熟,纯度高且质量可靠,容易实施。
6、本发明防治功能齐全,防病与治病集于一身,克服了单抗药物和疫苗的各自的弱点。
7、本发明有效避免了鼠源性单抗的HAMA反应问题。
8、本发明具有较好的导向性或靶向性。
9、本发明各组分间协同作用,相互促进、相互增强、相互协调,能有效防治因SARS冠状病毒感染所致的传染性非典型肺炎,且疗效全面,应用面广。
10、本发明中的蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体免疫复合物更有利于抗独特型抗体模拟“内影像”抗原性的提呈,并且上述免疫复合物比单纯抗独特型抗体可诱生更高滴度的抗体产生和淋巴细胞增殖反应,从而更有效地诱生体液和细胞免疫反应。
下面就结合实施例与实验例对本发明作进一步的描述,但这些实施例与实验例并不限制本发明。
具体实施方式
实施例1:非典型肺炎病原体蛋黄抗体IgY的制备(以SARS冠状病毒免疫原为例)
1)用具有免疫活性的血源纯化SARS冠状病毒抗原或基因重组SARS冠状病毒抗原或SARS冠状病毒疫苗作为免疫原,其中血源纯化SARS冠状病毒抗原和基因重组SARS冠状病毒抗原均由北京华大吉比爱生物技术有限公司提供;
2)取6月龄SPF纯系莱航产蛋母鸡于标准II级清洁级动物房饲养,每只鸡于胸腹部多点注射上述SARS冠状病毒免疫原1ml(免疫原量100μm/ml+等量不完全福氏佐剂),待3周后加强免疫注射2次,待15天后免疫母鸡所产的鸡蛋中即含有针对于上述SARS冠状病毒免疫原的蛋黄抗体IgY;
3)取步骤2)获得的鸡蛋10个去蛋清后的蛋黄液125ml充分搅拌均匀后,加入蛋黄匀浆液5倍体积的0.1mol/L PH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液,然后置于冰盒(-20℃)冰冻1小时,取出于室温复融并低速离心(1000r/min)后沥出收集上清液,再向沉淀物中加入2倍体积的0.1mol/LPH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液,充分混匀溶解沉淀物,依上法再次冻融收集上清液,如此反复冻融3次,合并收集各次得到的上清液,加入辛酸至终浓度为1.5%,沉淀后取上清液备用;
4)取步骤3)制备的上清液,加入硫酸钠至终浓度为36%,取沉淀物通过浸提、萃取、浓缩、纯化、冷冻或喷雾干燥,即得到本发明蛋黄抗体组合物组分之一蛋黄抗体IgY,共得到IgY2.1g,其收率为85%。该蛋黄抗体IgY是针对于上述SARS冠状病毒免疫原的。
实施例2:非典型肺炎病原体蛋黄抗独特型抗体的制备(以SARS冠状病毒抗体特异性蛋黄抗独特型抗体为例)
1)用具有免疫活性的血源纯化SARS冠状病毒抗体或基因重组SARS冠状病毒抗体或上述实施例1中所制备的SARS冠状病毒抗原特异性蛋黄抗体IgY为免疫原;
2)取6月龄SPF纯系莱航产蛋母鸡于标准II级清洁级动物房饲养,每只鸡于胸腹部多点注射上述SARS冠状病毒抗体免疫原1ml(上述免疫原的用量为500μg+等量不完全福氏佐剂),待3周后加强免疫注射2次,待15天后免疫母鸡所产的鸡蛋中即含有针对于上述SARS冠状病毒抗体免疫原的蛋黄抗独特性抗体;
3)取步骤2)获得的鸡蛋10个去蛋清后的蛋黄液138ml充分搅拌均匀后,加入蛋黄匀浆液5倍体积的0.1mol/L PH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液,然后置于冰盒(-20℃)冰冻1小时,取出于室温复融并低速离心(1000r/min)后沥出收集上清液,再向沉淀物中加入2倍体积的0.1mol/LPH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液,充分混匀溶解沉淀物,依上法再次冻融收集上清液,如此反复冻融3次,合并收集各次得到的上清液,加入辛酸至终浓度为1.5%,沉淀后取上清液备用;
4)取步骤3)制备的上清液,加入硫酸钠至终浓度为36%,取沉淀物通过浸提、萃取、浓缩、纯化、冷冻或喷雾干燥,即得到本发明蛋黄抗体组合物组分之一蛋黄抗独特型抗体,共得到IgY2.35g,其收率为82%。该蛋黄抗独特型抗体是针对于上述SARS冠状病毒抗体或SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体IgY为免疫原的。
实施例3:非典型肺炎病原体蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体组合物的制备(以SARS冠状病毒蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体组合物为例)
1)分别取上述实施例1中的SARS冠状病毒抗原免疫原和上述实施例2中的SARS冠状病毒抗体包括蛋黄抗体IgY免疫原等量混合之,成为SARS冠状病毒抗原和SARS冠状病毒抗体包括蛋黄抗体IgY的混合免疫原;
2)取6月龄SPF纯系莱航产蛋母鸡于标准H级清洁级动物房饲养,每只鸡于胸腹部多点注射上述SARS冠状病毒混合免疫原1ml(上述免疫原的用量为1000μg+等量不完全福氏佐剂),待3周后加强免疫注射2次,待15天后免疫母鸡所产的鸡蛋中即含有针对于上述SARS冠状病毒混合免疫原的蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特性抗体;
3)取步骤2)获得的鸡蛋10个去蛋清后的蛋黄液150ml充分搅拌均匀后,加入蛋黄匀浆液5倍体积的0.1mol/L PH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液,然后置于冰盒(-20℃)冰冻1小时,取出于室温复融并低速离心(1000r/min)后沥出收集上清液,再向沉淀物中加入2倍体积的0.1mol/LPH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液,充分混匀溶解沉淀物,依上法再次冻融收集上清液,如此反复冻融3次,合并收集各次得到的上清液,加入辛酸至终浓度为1.5%,沉淀后取上清液备用;
4)取步骤3)制备的上清液,加入硫酸钠至终浓度为36%,取沉淀物通过浸提、萃取、浓缩、纯化、冷冻或喷雾干燥,即得到本发明蛋黄抗体组合物的主要组分即蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体的混合物,共得到IgY2.5g,其收率为80%。该蛋黄抗体混合物是针对于上述SARS冠状病毒抗原和SARS冠状病毒抗体包括SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体IgY为免疫原的。
实施例4:非典型肺炎病原体蛋黄抗体组合物的制备(以SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物为例)
取上述实施例1制备的SARS冠状病毒抗原特异性蛋黄抗体IgY100mg和上述实施例2制备的SARS冠状病毒抗体特异性蛋黄抗独特型抗体100mg,将二者等量混合,然后加入氢氧化铝佐剂200mg,充分混匀,再经过巴氏灭菌和除热源处理后即为SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物。
实施例5:SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体IgY与氧化苦参碱的偶联试验
首先取葡聚糖10g,加入200mL蒸馏水后加高碘酸钠3g,室温下避光反应过夜,使葡聚糖充分氧化为多醛基葡聚糖,蒸馏水充分透析后冻干;注射治疗前2小时内取多醛基葡聚糖100mg加入0.15mol/L(pH7.2)的磷酸缓冲液20mL中,加氧化苦参碱100mg,室温下反应24小时后,再加入已纯化的SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体IgY100mg,4℃搅拌反应24小时;然后在上述反应混合物中加硼氢化钠2mg,在4℃下还原2小时,离心后经Sephadex G-150层析柱过柱,收集第一峰即可应用。
实施例6:SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物的制备
取上述实施例5制备的SARS冠状病毒抗原特异性蛋黄抗体IgY与氧化苦参碱的偶联物50mg和上述实施例2制备的SARS冠状病毒抗体特异性蛋黄抗独特型抗体50mg,将二者等量混合,然后加入分子内佐剂棕榈酰赖氨酸100mg,充分混匀,待反应完全后再经过巴氏灭菌和除热源处理后即成为极易穿透细胞脂质膜且具有靶向抗病毒作用的SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物。该蛋黄抗体组合物不仅具有上述实施例5所制备的蛋黄抗体组合物所具备的免疫协调和治疗作用,而且具有针对于SARS冠状病毒的生物导弹功能,因此对于SARS冠状病毒具有更强的特异性杀伤能力。
实施例7:SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物注射剂的制备
取上述实施例5制备的SARS冠状病毒抗原特异性蛋黄抗体IgY与氧化苦参碱的偶联物50mg和上述实施例2制备的SARS冠状病毒抗体特异性蛋黄抗独特型抗体50mg,将二者等量混合,然后加入分子内佐剂棕榈酰赖氨酸100mg,再加入药用敷料海藻糖2.0g,充分混匀,待反应完全后再经过巴氏灭菌和除热源处理后,冷冻或干燥处理后装安陪、封口即成为注射剂。
实施例8:SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物胶囊的制备
取上述实施例5制备的SARS冠状病毒抗原特异性蛋黄抗体IgY与氧化苦参碱的偶联物50mg和上述实施例2制备的SARS冠状病毒抗体特异性蛋黄抗独特型抗体50mg,将二者等量混合,然后加入分子内佐剂棕榈酰赖氨酸100mg,再加入药用敷料蔗糖100g、大豆磷脂100g,充分混匀,待反应完全后再经过巴氏灭菌和除热源处理后,装入空心胶囊即成为用于口服的胶囊。
实施例9:SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物口服液的制备
取上述实施例5制备的SARS冠状病毒抗原特异性蛋黄抗体IgY与氧化苦参碱的偶联物50mg和上述实施例2制备的SARS冠状病毒抗体特异性蛋黄抗独特型抗体50mg,将二者等量混合,然后加入分子内佐剂棕榈酰赖氨酸100mg,再加入药用敷料蔗糖100g,补足重蒸馏水至2.0ml,充分混匀,待反应完全后再经过巴氏灭菌和除热源处理后,装入口服液瓶并无菌封口即成为口服液。
实施例10:SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物气雾剂的制备
取上述实施例5制备的SARS冠状病毒抗原特异性蛋黄抗体IgY与氧化苦参碱的偶联物50mg和上述实施例2制备的SARS冠状病毒抗体特异性蛋黄抗独特型抗体50mg,将二者等量混合,然后加入分子内佐剂棕榈酰赖氨酸100mg,再加入药用敷料气雾剂溶剂,待反应完全后再经过巴氏灭菌和除热源处理后,打压装带喷嘴耐压气雾剂瓶中即成为气雾剂。
实施例11:SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物贴剂的制备
取上述实施例5制备的SARS冠状病毒抗原特异性蛋黄抗体IgY与氧化苦参碱的偶联物50mg和上述实施例2制备的SARS冠状病毒抗体特异性蛋黄抗独特型抗体50mg,将二者等量混合,然后加入分子内佐剂棕榈酰赖氨酸100mg,再加入适量的药用敷料羟丙基甲基纤维素,充分混匀,待反应完全后再经过巴氏灭菌和除热源处理后,涂布于贴剂基质载体表面即成为贴剂。
实验例:实验例1-8均在生物安全三级实验室(P3实验室)内进行。
实验例1:非典型肺炎病原体蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体的效价检测与鉴定(以SARS冠状病毒蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体组合物为例)
一、方法原理:SARS冠状病毒抗原特异性蛋黄抗体IgY的检测采用ELISA间接法检测,即以SARS冠状病毒抗原液包被酶标板孔,采用辣根过氧化物酶标记的鼠抗鸡IgY抗体作为二抗;SARS冠状病毒抗体特异性蛋黄抗独特型抗体的检测采用ELISA间接法,即以SARS冠状病毒抗原特异性蛋黄抗体IgY包被酶标板孔,采用辣根过氧化物酶标记的鼠抗鸡IgY抗体作为二抗。
二、试剂材料
1)包被缓冲液(PH9.6碳酸盐缓冲液):取Na2CO3 0.16g和NaHCO3 0.29g,蒸馏水加至100ml;
2)稀释液(PH7.2磷酸盐缓冲液):取Na2HPO4·12H2O 2.9g、KH2PO4 0.2g、NaCL 8.0g和KCL 0.2g蒸馏水加至1000ml;
3)封闭液:取上述稀释液500ml加入牛血清白蛋白2.5g和Tween-20 0.25ml即可;
4)洗涤液:取上述稀释液200ml加入表面活性剂Tween-20 0.1ml即可;
5)底物缓冲液(0.1mol/L PH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液):取Na2HPO4·12H2O 1.8g和柠檬酸0.52g,蒸馏水加至100ml,4℃存放,用前加H2O2;
6)终止液(2.0mol/LH2SO4):取浓硫酸55.5ml加蒸馏水444.5ml即可;
7)包被材料重组SARS冠状病毒抗原和SARS冠状病毒IgG抗体均由北京华大吉比爱生物技术有限公司提供;鼠抗鸡IgY由北京成文免疫化学研究所提供,其中辣根过氧化物酶标记鼠抗鸡IgY自行按照过碘酸钠法标记。
8)酶标反应底物用四甲基联苯胺(TMB)。
三、试验设备:酶联免疫检测仪(国产Biocell2010型)、37℃水浴箱、48孔或96孔聚苯乙烯酶标板、微量移液器(50μl、100μ1)
四、间接法ELISA检测操作步骤
1)取包被材料重组SARS冠状病毒抗原或SARS冠状病毒IgG抗体,用包被液稀释成100μg/ml,取100μl/孔量分别加入聚苯乙烯酶标板孔中,于4℃吸附过夜;
2)取上述已包被过夜的酶标板,用洗涤液洗3次,每次3分钟;然后每孔加入200μl封闭液,于4℃封闭过夜;再用洗涤液洗3次,每次3分钟;待干后备用(如暂时不用置4℃存放);
3)分别取上述实施例1、实施例2和实施例3所制备的SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体IgY、蛋黄抗独特型抗体、蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体的混合物,分别进行1∶100至1∶20000的比例稀释,取各种不同的稀释样品分别加入各自相应的检测酶标板孔中,每孔100μl,同时设立阴性和阳性对照孔;
4)于37℃孵育反应1小时后用洗涤液洗4次,每次5分钟;
5)每孔加入100μl辣根过氧化物酶标记的鼠抗鸡IgY抗体(二抗),37℃孵育反应1小时后用洗涤液洗5次,每次3分钟;
6)配制底物溶液:用前取0.1mol/L PH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液7.0ml,加入3%H2O290μl和10mg/ml的四甲基联苯胺(TMB)溶液0.1ml,混匀避光备用;
7)加入新配制的底物溶液100μl/孔,保温15分钟,然后加入终止液(2.0mol/LH2SO4)50μl/孔以终止反应;
8)将酶标板放入酶联免疫检测仪中,波长450nm,以空白对照调零,读取各孔吸光度(OD)值;
9)结果计算:按照公式P/N≥2.1为阳性,否则P/N≤2.1为阴性,其中P为待测标本OD值,N为阴性对照OD值。
五、结果判断:以P/N≥2.1为阳性的最大稀释度作为其效价。
六检测结果:按照上述间接法ELISA检测操作对实施例1、实施例2和实施例3所制备的SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体IgY、蛋黄抗独特型抗体、蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体的混合物的效价进行测定,其检测结果见表1。
表1:蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体效价检测结果
样品稀释度 | 1∶100-1∶1000 | 1∶1200-1∶2000 | 1∶4000-1∶10000 | 1∶12000-1∶20000 |
SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体IgY | P/N≥2.1为阳性 | P/N≥2.1为阳性 | P/N≥2.1为阳性 | P/N≥2.1为阳性的最大稀释度为1∶12000 |
SARS冠状病毒特异性蛋黄抗独特型抗体 | P/N≥2.1为阳性 | P/N≥2.1为阳性 | P/N≥2.1为阳性的最大稀释度为1∶8000 | P/N≤2.1为阴性 |
SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体混合物中的蛋黄抗体IgY | P/N≥2.1为阳性 | P/N≥2.1为阳性 | P/N≥2.1为阳性的最大稀释度为1∶6000 | P/N≤2.1为阴性 |
SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体混合物中的蛋黄抗独特型抗体 | P/N≥2.1为阳性 | P/N≥2.1为阳性 | P/N≥2.1为阳性的最大稀释度为1∶4000 | P/N≤2.1为阴性 |
实验结果表明:SARS冠状病毒抗原特异性蛋黄抗体IgY的效价为1∶12000;SARS冠状病毒抗体特异性蛋黄抗独特型抗体的效价为1∶8000;SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体混合物中的蛋黄抗体IgY的效价为1∶6000;SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体混合物中的蛋黄抗独特型抗体的效价为1∶4000。
实验例2:蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体的鉴定(以SARS冠状病毒蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体组合物为例)
用聚丙烯酰胺凝胶(PADE)电泳(浓缩胶浓度为5%)对SARS冠状病毒抗原特异性蛋黄抗体IgY和SARS冠状病毒抗体特异性蛋黄抗独特型抗体进行纯度鉴定,电泳中均出现一条电泳带,其纯度均为95%。
用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PADE)电泳,分离胶长度为8%,浓缩胶浓度为5%,稳流10mA电泳5小时;测得SARS冠状病毒抗原特异性蛋黄抗体IgY和SARS冠状病毒抗体特异性蛋黄抗独特型抗体的分子量均为180KD。
实验例3:蛋黄抗体组合物的稳定性试验(以SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物为例)
取上述实施例4和实施例6制备的SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物,以10mg/管分装小试管中,分别于-20℃冰冻、4℃、室温和37℃保存,其中37℃保存属于热破坏性试验。再定期进行其效价检测。实验结果表明:SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物于4℃保存,其稳定性至少可保持18个月以上;于-20℃冰冻保存,其稳定性至少可保持5个月以上;于室温(20℃)保存,其稳定性至少可保持4个月以上。该蛋黄抗体组合物以4℃保存稳定性最好。
实验例4;蛋黄抗体组合物中特异性复合物的检测(以SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物为例)
用4%的聚乙二醇6000(PEG6000)检测上述实施例4或实施例6制备的SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物中特异性复合物的含量:将4%PEG6000溶液与1∶100稀释的待检蛋黄抗体组合物溶液混合,置4℃冰箱过夜后离心,将沉淀物用4%PEG6000溶液充分洗涤,重新溶解于0.01mol/L的NaOH中,在波长280nm下测量溶液的吸光度;也可利用散射比浊法直接测定PEG沉淀的免疫复合物;以不同浓度的热聚合IgG作为参考标准来计算免疫复合物的含量。结果表明:上述实施例4所制备的SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物中的免疫复合物占43%;上述实施例6所制备的SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物中的免疫复合物占35%;另取上述SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物经琼脂扩散和免疫印迹鉴定为SARS冠状病毒蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体的特异性免疫结合复合物。
实验例5:蛋黄抗体组合物生物安全性试验(以SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物为例)
毒性实验用体重18-20g小白鼠10只,每腹腔注射上述实施例4或实施例6制备的SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物0.5ml(6.0mg/m1),连续观察7天,小白鼠的体重无一例减轻,无一例死亡,亦未发现任何不良反应。SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物的毒性实验表明:该蛋黄抗体组合物具有较高的生物安全性。
实验例6:鸡SARS冠状病毒病毒感染模型的制备
用SARS冠状病毒RNA阳性血清150μl对15日龄雏鸡进行腹腔注射,每隔15天对鸡血清进行SARS冠状病毒抗原(用双抗体夹心ELISA法)和SARS冠状病毒RNA(逆转录聚合酶链反应RT-PCR)检测,以持续3个月鸡SARS冠状病毒抗原和SARS冠状病毒RNA均为阳性作为鸡SARS冠状病毒感染模型成功建立的标志。
实验例7:SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物的动物试验之一
用上述实施例4制备的SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物对鸡SARS冠状病毒感染模型进行动物实验,其中鸡血清SARS冠状病毒抗原滴度(IU/ml)和鸡血清SARS冠状病毒抗体滴度(IU/ml)的检测用双夹心ELISA法(试剂均由北京华大吉比爱生物技术有限公司提供),鸡血清SARS冠状病毒RNA拷贝值(COPY/ml)的检测用逆转录聚合酶链反应RT-PCR(试剂由上海复星公司提供)方法;其实验结果见表2。
表2:实施例4制备的SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物的动物试验结果
组别 | 雏鸡感染模型只数 | 鸡血清SARS冠状病毒抗原滴度(IU/ml) | 鸡血清SARS冠状病毒抗体滴度(IU/ml) | 鸡血清SARS冠状病毒RNA拷贝值(COPY/ml) |
实验组:注射SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物 | 10 | 7例转阴<0.013例阳性2.3-5.2 | 5例阳性3.2-6.55例阴性<0.01 | 5例阴性<1.0×1035例阳性4.1-6.2×103 |
对照组:注射SARS冠状病毒灭活抗原 | 10 | 3例转阴<0.017例阳性3.8-13.5 | 2例阳性3.5-8.28例阴性<0.01 | 2例阴性<1.0×1038例阳性5.3-7.6×103 |
鸡血清正常参考值 | 20只正常雏鸭 | <0.01 | <0.01 | <1.0×103 |
实验结果表明:实验组用皮下注射SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物的SARS冠状病毒感染鸡,在经过三周的免疫注射后,用ELISA检测感染鸡血清中的SARS冠状病毒抗原,其转阴率为70%;用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测感染鸡血清中的SARS冠状病毒RNA,其转阴率为50%;用ELISA检测感染鸡血清中的SARS冠状病毒抗体(IgG+IgM),其转阳率为50%。而对照组(对感染鸡皮下注射SARS冠状病毒灭活抗原)感染鸡血清中SARS冠状病毒抗原的转阴率仅为30%、SARS冠状病毒RNA的转阴率仅为20%、SARS冠状病毒抗体(IgG+IgM)的转阳率仅为20%。
实验例8:SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物的动物试验之二
用上述实施例6制备的SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物对鸡SARS冠状病毒感染模型进行动物实验,其中鸡血清SARS冠状病毒抗原滴度(IU/ml)和鸡血清SARS冠状病毒抗体滴度(IU/ml)的检测用双夹心ELISA法(试剂均由北京华大吉比爱生物技术有限公司提供),鸡血清SARS冠状病毒RNA拷贝值(COPY/ml)的检测用逆转录聚合酶链反应RT-PCR(试剂由上海复星公司提供)方法;实验结果见表3。
表3:实施例6制备的SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物的动物试验结果
组别 | 雏鸡感染模型只数 | 鸡血清SARS冠状病毒抗原滴度(IU/ml) | 鸡血清SARS冠状病毒抗体滴度(IU/ml) | 鸡血清SARS冠状病毒RNA拷贝值(COPY/ml) |
实验组:注射SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物 | 10 | 8例转阴<0.012例阳性2.3-5.2 | 6例阳性3.2-6.54例阴性<0.01 | 6例阴性<1.0×1034例阳性4.1-6.2×103 |
对照组:注射SARS冠状病毒灭活抗原 | 10 | 3例转阴<0.017例阳性3.8-13.5 | 2例阳性3.5-8.28例阴性<0.01 | 2例阴性<1.0×1038例阳性5.3-7.6×103 |
鸡血清正常参考值 | 20只正常雏鸭 | <0.01 | <0.01 | <1.0×103 |
实验结果表明:实验组用皮下注射SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物的SARS冠状病毒感染鸡,在经过三周的免疫注射后,用ELISA检测感染鸡血清中的SARS冠状病毒抗原,其转阴率为80%;用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测感染鸡血清中的SARS冠状病毒RNA,其转阴率为60%;用ELISA检测感染鸡血清中的SARS冠状病毒抗体(IgG+IgM),其转阳率为60%。而对照组(对感染鸡皮下注射SARS冠状病毒灭活抗原)感染鸡血清中SARS冠状病毒抗原的转阴率仅为30%、SARS冠状病毒RNA的转阴率仅为20%、SARS冠状病毒抗体(IgG+IgM)的转阳率仅为20%。
将本组试验结果与实验例7中的治疗组试验结果相比较并通过统计学分析,本组试验结果明显优于实验例7中的治疗组,两组比较差异有显著性意义,t=3.1-5.3 P<0.01;结果表明实施例6所制备的SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物中由于含有SARS冠状病毒抗原特异性蛋黄抗体IgY与氧化苦参碱的偶联物和分子内佐剂棕榈酰赖氨酸组分,从而使其兼具免疫协调、免疫治疗和靶向抗病毒作用,并且更易于穿透肝细胞脂质膜,因而具有更好的治疗效果。
将本组试验结果与实验例7中的对照组试验结果相比较并通过统计学分析,本组试验结果明显优于实验例7中的对照组,两组比较差异有显著性意义,t=3.9-15.6 P<0.001;结果表明实施例6所制备的SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物比单纯的SARS冠状病毒灭活抗原具有更好的治疗效果。
上述实验结果证明:本SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物的治疗作用具有特异性强、毒副作用小等优点;该SARS冠状病毒特异性蛋黄抗体组合物中的蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体及其免疫复合物更有利于抗独特型抗体模拟“内影像”抗原性的提呈,并且上述组合物及其免疫复合物比单纯采用SARS冠状病毒灭活抗原可诱生更高滴度的抗体产生和淋巴细胞增殖反应,从而更有效地诱生体液和细胞免疫反应,以达到对抗SARS冠状病毒、保护组织细胞的目的。
Claims (12)
1、一种预防和治疗非典型肺炎的蛋黄抗体组合物,其特征在于:主要是由非典型肺炎病原体特异性蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体组成,其中以预防为目的者,非典型肺炎病原体特异性蛋黄抗独特型抗体的量(w/w)>蛋黄抗体IgY的量;以治疗为目的者,非典型肺炎病原体特异性蛋黄抗体IgY的量(w/w)>蛋黄抗独特型抗体的量;以预防性治疗或早期治疗为目的者,非典型肺炎病原体特异性蛋黄抗体IgY的量(w/w)=蛋黄抗独特型抗体的量。
2、根据权利要求1所述的预防和治疗非典型肺炎的蛋黄抗体组合物,其特征在于:所述的非典型肺炎病原体特异性蛋黄抗体IgY是针对于非典型肺炎病原体特异性免疫原的蛋黄抗体IgY;所述的非典型肺炎病原体特异性蛋黄抗独特型抗体是针对于非典型肺炎病原体特异性免疫原所对应的特异性抗体包括蛋黄抗体IgY的特异性蛋黄抗独特型抗体。
3、根据权利要求1或2所述的预防和治疗非典型肺炎的蛋黄抗体组合物,其特征在于:所述蛋黄抗体IgY是针对于纯化或重组的非典型肺炎病原体特异性免疫原的抗体;所述免疫原包括纯化或灭活的非典型肺炎病原体特异性抗原、通过基因工程技术重组的非典型肺炎病原体特异性抗原或疫苗、非典型肺炎病原体DNA或mRNA及其与相应载体组成的重组体中的任一种或其组合;所述免疫原还包括上述非典型肺炎病原体特异性免疫原的纳米微粒或脂质体复合物;所述蛋黄抗独特型抗体是针对于非典型肺炎病原体特异性抗原的单克隆或多克隆抗体包括蛋黄抗体IgY的抗独特型抗体Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε中的任一种或其组合;
4、所述非典型肺炎病原体特异性免疫原包括SARS冠状病毒、腺病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体特异性的纯化或重组抗原、组织细胞和细胞因子及其受体;所述免疫原是蛋白质、多肽、粘多糖、脂多糖、糖蛋白、细胞核、细胞质、细胞膜、细胞表面受体、核蛋白、DNA、RNA、线粒体、微粒体中的任一种或其组合。
5、根据权利要求1所述的预防和治疗非典型肺炎的蛋黄抗体组合物,其特征在于:所述预防和治疗非典型肺炎的蛋黄抗体组合物包括SARS冠状病毒蛋黄抗体组合物、腺病毒蛋黄抗体组合物、肺炎支原体蛋黄抗体组合物、肺炎衣原体蛋黄抗体组合物中的任一种或其组合;在上述蛋黄抗体组合物中还含有特异性蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体特异性结合所形成的免疫复合物;所述复合物包括IgY-Ab2α、IgY-Ab2β、IgY-Ab2γ和IgY-Ab2ε复合物中的任一种或其组合;所述预防和治疗非典型肺炎的蛋黄抗体组合物是其纳米微粒或脂质体复合物。
6、根据权利要求1所述的预防和治疗非典型肺炎的蛋黄抗体组合物,其特征在于:在该组合物中还含有药用辅料;所述药用辅料包括包衣材料、蛋白稳定剂、药用佐剂、免疫增强剂,其中包衣材料为丙烯酸树脂、羟丙基甲基纤维素及其衍生物中的任一种;蛋白稳定剂为聚乙二醇、蔗糖、海藻糖中的任一种;药用佐剂为氢氧化铝、表面活性剂、福氏佐剂中的任一种;免疫增强剂为多聚糖、糖肽、糖脂、脂类和磷脂,其中脂类包括三棕榈酰丝氨酰甘油基半胱氨酸、单棕榈脂酸、双棕榈脂酸、三棕榈脂酸、棕榈酰赖氨酸、α-氨基十六烷酸、月桂酰肽脂中的任一种;所述脂类是以分子内佐剂的形式与上述蛋黄抗体组合物中的特异性蛋黄抗体IgY或蛋黄抗独特型抗体结合成复合物。
7、根据权利要求1所述的预防和治疗非典型肺炎的蛋黄抗体组合物,其特征在于:在该组合物中还含有免疫偶联物;所述免疫偶联物包括上述非典型肺炎病原体特异性蛋黄抗体IgY与放射性核素、药物和毒素以及细胞因子的偶联物中的任一种或其组合;其中所述放射性核素包括碘131I、磷32P、锶89Sr、钇90Y、钐153Sm、铼188Re中的任一种或其组合;所述药物包括抗病毒药物、抗菌素、免疫调节药物、免疫抑制剂中的任一种或其组合;所述毒素包括包括篦麻籽毒素、相思子毒素、苦瓜毒素、氧化苦参碱、去甲斑蝥素、白喉毒素、假单胞菌内毒素以及绿脓杆菌外毒素中的任一种或其组合;所述细胞因子包括白细胞介素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、趋化因子中的任一种或其组合;
8、根据权利要求1所述的预防和治疗非典型肺炎的蛋黄抗体组合物,其特征在于:所述的蛋黄抗体组合物是其纳米微粒或脂质体复合物。
9、根据权利要求1所述的预防和治疗非典型肺炎的蛋黄抗体组合物,其特征在于:所述蛋黄抗体组合物是任一种药剂学上所述的剂型;所述剂型包括注射剂、胶囊、口服液、喷雾剂、贴剂中的任一种剂型。
10、一种预防和治疗非典型肺炎的蛋黄抗体组合物的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
1)用蛋白质盐析、柱层析纯化非典型肺炎病原体特异性抗原或通过基因重组的办法制备非典型肺炎病原体特异性抗原;所述非典型肺炎病原体特异性抗原包括SARS冠状病毒、腺病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体的纯化或重组特异性抗原;
2)通过免疫动物制备针对于上述非典型肺炎病原体抗原的单克隆或多克隆抗体;或通过基因重组的办法制备非典型肺炎病原体特异性抗体;
3)以步骤1)制备的非典型肺炎病原体特异性抗原为免疫原,多次重复免疫注射给禽类优选是鸡,待5-20天后禽类尤其是鸡的产蛋中即含有针对于上述非典型肺炎病原体特异性免疫原的蛋黄抗体IgY;所述的免疫原注射量为1-2ml,免疫原量10-500μg/ml+等量不完全福氏佐剂;
4)禽蛋尤其是鸡蛋去壳取黄,经灭菌处理后,依次进行a)用5倍体积的0.1mol/L PH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液稀释蛋黄;b)自-20℃到室温反复冻融,每分钟500-1000转低速离心后合并上清液备用;c)向上清液中加入辛酸至终浓度为1.5%,沉淀后取上清液备用;d)向上清液中加入硫酸钠至终浓度为36%,取沉淀备用;e)取沉淀通过浸提、萃取、浓缩、纯化、冷冻或喷雾干燥,即得到针对于非典型肺炎病原体的蛋黄抗体组合物组分之一蛋黄抗体IgY;所述非典型肺炎病原体特异性蛋黄抗体IgY可进一步偶联放射性核素、药物、毒素和细胞因子中的任一种而制备成蛋黄抗体IgY偶联物;
5)取步骤2)制备的针对于上述抗原的抗体或步骤3)制备的蛋黄抗体IgY为免疫原,多次重复免疫注射给禽类优选是鸡,待5-20天后禽类尤其是鸡的产蛋中即含有针对于上述相应抗体包括蛋黄抗体IgY的蛋黄抗独特型抗体;所述的免疫原抗体Abl的注射量为1-2ml,免疫原抗体Abl的用量为10-2000μg/ml+等量不完全福氏佐剂;
6)重复步骤4)的过程,即得到针对于非典型肺炎病原体免疫原相应抗体的蛋黄抗体组合物组分之一蛋黄抗独特型抗体;
7)根据实际需要按重量配比调制步骤4)所得的蛋黄抗体IgY和步骤6)所得的蛋黄抗独特型抗体,再辅以可接受量的药用辅料即得到所述的蛋黄抗体组合物;所述蛋黄抗体组合物可制备成纳米微粒或脂质体复合物;
8)取步骤7)制备的蛋黄抗体组合物经过无菌、安全及毒性试验合格后,再通过相应的制剂工艺制备成药剂学上相应的剂型;所述剂型包括注射剂、胶囊、口服液、喷雾剂、贴剂中的任一种剂型。
11、根据权利要求10所述的预防和治疗非典型肺炎的蛋黄抗体组合物的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
1)分别取纯化或重组非典型肺炎病原体特异性抗原和已制备好的针对于上述抗原的抗体包括蛋黄抗体IgY作为免疫原,分别连续或同时多次重复免疫注射给禽类优选是鸡;还可将纯化或重组非典型肺炎病原体特异性抗原同已制备好针对于上述抗原的抗体包括蛋黄抗体IgY按比例混合后作为免疫原进行免疫注射;待5-20天后禽类尤其是鸡的产蛋中即同时含有针对于上述抗原的蛋黄抗体IgY和针对于上述抗体包括蛋黄抗体IgY的特异性蛋黄抗独特型抗体;
2)取上一步骤所得的禽蛋或鸡蛋,经灭菌处理后,依次进行a)用5倍体积的0.1mol/L PH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液稀释蛋黄;b)自-20℃到室温反复冻融,每分钟500-1000转低速离心后合并上清液备用;c)向上清液中加入辛酸至终浓度为1.5%,沉淀后取上清液备用;d)向上清液中加入硫酸钠至终浓度为36%,取沉淀备用;e)取沉淀通过浸提、萃取、浓缩、纯化、冷冻或喷雾干燥;一次性提取纯化,可同时得到蛋黄抗体IgY和蛋黄抗独特型抗体两种组合物组分;所述蛋黄抗体组合物可制备成纳米微粒或脂质体复合物;
3)然后检测其中各组分的含量,再辅以可接受量的药用辅料,并经过无菌、安全及毒性试验合格后,再根据实际需要,通过相应的制剂工艺制备成药剂学上相应的剂型;所述剂型包括注射剂、胶囊、口服液、喷雾剂、贴剂中的任一种剂型。
12、根据权利要求1或10所述的预防和治疗非典型肺炎的蛋黄抗体组合物的用途,其特征在于:所述蛋黄抗体组合物用于作为非典型肺炎的预防和治疗剂以及食品、保健品添加剂和诊断剂,尤其是用于作为因SARS冠状病毒、腺病毒、肺炎支原体、肺炎衣原体感染所致的传染性非典型肺炎的预防和治疗剂以及食品、保健品添加剂。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNB031488447A CN1326567C (zh) | 2003-06-18 | 2003-06-18 | 预防和治疗非典型肺炎的蛋黄抗体组合物及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNB031488447A CN1326567C (zh) | 2003-06-18 | 2003-06-18 | 预防和治疗非典型肺炎的蛋黄抗体组合物及其制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN1478550A true CN1478550A (zh) | 2004-03-03 |
CN1326567C CN1326567C (zh) | 2007-07-18 |
Family
ID=34156290
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNB031488447A Expired - Fee Related CN1326567C (zh) | 2003-06-18 | 2003-06-18 | 预防和治疗非典型肺炎的蛋黄抗体组合物及其制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN1326567C (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111574623A (zh) * | 2020-05-25 | 2020-08-25 | 西安咸辅生物科技有限责任公司 | 一种新冠病毒s1+s2抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法 |
CN111808199A (zh) * | 2020-07-27 | 2020-10-23 | 西安咸辅生物科技有限责任公司 | 一种ace2抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1377894A (zh) * | 2002-04-23 | 2002-11-06 | 郭占军 | 蛋黄抗癌抗体制备方法及其应用 |
-
2003
- 2003-06-18 CN CNB031488447A patent/CN1326567C/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111574623A (zh) * | 2020-05-25 | 2020-08-25 | 西安咸辅生物科技有限责任公司 | 一种新冠病毒s1+s2抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法 |
CN111808199A (zh) * | 2020-07-27 | 2020-10-23 | 西安咸辅生物科技有限责任公司 | 一种ace2抗独特型卵黄抗体疫苗的制备方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN1326567C (zh) | 2007-07-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Coutelier et al. | Virally induced modulation of murine IgG antibody subclasses. | |
Ikewaki et al. | β-glucans: wide-spectrum immune-balancing food-supplement-based enteric (β-WIFE) vaccine adjuvant approach to COVID-19 | |
CN1062605C (zh) | 大肠杆菌疫苗的制备方法 | |
JP2016512204A (ja) | B型肝炎ワクチン | |
CN101830968A (zh) | 一种具有免疫调节作用的法氏囊七肽 | |
CN110859961A (zh) | 病毒免疫治疗药物复合物在制备治疗hbv感染药物中的应用 | |
CN108794624A (zh) | 抗h7n9流感病毒的中和性单克隆抗体 | |
CN1560081A (zh) | 用能产生人IgGl重链-κ轻链小鼠作为制备人源化单克隆抗体和应用 | |
CN1438245A (zh) | 传染性病原体相关蛋黄抗体的制备及应用 | |
CN103561763A (zh) | 免疫原性支气管炎博德特氏菌组合物 | |
CN109207502A (zh) | 猪支原体肺炎和猪圆环病毒2型重组蛋白及制备二联疫苗 | |
Zagorski et al. | Modular nanoarray vaccine for SARS-CoV-2 | |
CN1326567C (zh) | 预防和治疗非典型肺炎的蛋黄抗体组合物及其制备方法 | |
CN1460522A (zh) | 预防和治疗疾病的蛋黄抗体组合物及其制备方法 | |
CN106397602B (zh) | 一种分子佐剂加强型鸡马立克氏病蛋白工程疫苗 | |
CN1218962C (zh) | 生长抑素卵黄抗体及其制备 | |
CN1279972C (zh) | 纯化的细胞因子抑制因子 | |
Kohnehshahri et al. | CpG-containing oligodeoxynucleotides and freund adjuvant in combination with alum augment the production of monoclonal antibodies against recombinant HBsAg | |
CN111450248B (zh) | 一种用于预防和治疗prrsv感染的抗体药物 | |
US20210113683A1 (en) | Immune composition comprising respiratory syncytial virus (rsv) g polypeptide | |
CN1943789A (zh) | 抗丙肝病毒感染的dna疫苗 | |
CN105820228B (zh) | 旋毛虫副肌球蛋白H-2d限制性Th表位P2、其组合物及应用 | |
CN1292794C (zh) | 嗜水气单胞菌中溶血素的免疫刺激复合物的制备工艺 | |
CN1287857C (zh) | 胃癌特异性纳米疫苗的制备方法 | |
Xu et al. | Preparation and determination of immunological activities of anti-HBV egg yolk extraction |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
C19 | Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |