CN1377894A - 蛋黄抗癌抗体制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蛋黄抗癌抗体的制备方法,包括针对于肿瘤免疫原的蛋黄多克隆抗癌抗体IgY、抗独特型抗体和肿瘤特异性表达抗原的制备方法,另外还涉及该蛋黄抗癌抗体的用途。本发明主要以产蛋禽类尤其是鸡作为免疫反应器,用一种或多种肿瘤免疫原进行免疫注射,特点是多种免疫原单独或多种联合进行禽类尤其是鸡的免疫注射,其产蛋中即有针对于上述肿瘤免疫原的多克隆抗癌抗体IgY或抗独特型抗体或肿瘤特异性表达抗原中的任一种或其组合物存在和储存。本发明具有成本低、产量高、特异性强、决定簇广并能进行集约化大规模生产的优点,尤其是能避免HAMA反应和异质性问题,且无毒副作用、安全性好。适用于肿瘤的免疫诊断、治疗和预防,尤其适用于肿瘤的主、被动免疫治疗。
Description
本发明属于生物技术领域,特别是涉及一种蛋黄抗癌抗体制备方法,另外还涉及该蛋黄抗癌抗体的用途。
抗癌抗体的制备对肿瘤的诊断、治疗和预防具有非常重要的意义,因而受到国内外生物医学界的广泛关注,已开展了大量的工作并取得了较大的进展。在现有技术中多采用单克隆抗癌抗体应用于恶性肿瘤的诊断和生物治疗,其中单克隆抗癌抗体的制备方法一般包括获取癌细胞相关抗原、免疫小鼠和融合杂交瘤三个步骤,亦即a首先利用生化和免疫化学的方法获取携带有癌细胞相关信息的癌细胞相关抗原,b然后将该癌细胞相关抗原多次重复注射入小鼠体内,待小鼠发生特异性免疫反应一定时间后,取出其脾脏并分离出带有癌细胞相关抗原信息的致敏淋巴细胞,再将该致敏淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合成杂交瘤细胞,再筛选出针对于癌细胞相关抗原的阳性杂交瘤细胞进行体外扩增或接种于小鼠腹腔内,即可从培养上清液或小鼠腹水中获得所需的单克隆抗癌抗体。
上述单克隆抗体(简称单抗)或多单克隆抗体(简称多抗)作为癌症(亦称为恶性肿瘤)诊断剂或检测剂,近年来已在医学和生物学领域得到广泛应用。该类方法的原理是基于单抗或多抗对相应肿瘤抗原的高特异性识别能力而设计的,结合以相应的标记物(酶标、金标、荧光、发光和放射性标记等)而显示肿瘤抗原的存在与否及其量的多少。
单抗作为治疗剂的研究也于近年获得重要进展。单抗药物(monoclonal antibodyagents)可应用于治疗肿瘤、病毒性感染、心血管病以及其它疾患,尤其是用于肿瘤治疗,已显示出良好的前景。抗肿瘤抗体药物一般包括两类,一是抗肿瘤单抗或多抗;二是抗肿瘤单抗或多抗偶联物,或称免疫偶联物(immunoconjugate)。免疫偶联物分子由单抗或多抗与“弹头”药物两部分构成,故称为导向药物,又称为生物导弹或“魔弹”(magic bullets),与之相对应的治疗方法称为导向治疗。单抗或多抗所针对的靶标通常为肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原或特定的受体。用作“弹头”的物质主要有三类,即放射性核素、药物和毒素,其与单抗或多抗连接分别构成放射免疫偶联物、化学免疫偶联物和免疫毒素。自80年代以来对抗肿瘤单抗药物进行了大量研究,特别是自1997年以来,Rituxan、Herceptin在美国相继获批准用于临床肿瘤治疗,单抗药物的研究与开发有了新的发展势头,成为生物技术药物的新热点(甄永苏,单克隆抗体药物治疗肿瘤的研究现状与展望,中国医学科学院学报,2000,22:9-12)。
尽管单抗药物的临床研究结果已为其应用于治疗肿瘤展示出良好的前景,但仍有许多问题需要进一步研究解决(Nguyen DT,Amess JA,Doughty H,et al.IDEC-C2B8anti-CD20(rituximab)im munotherapy in patients with low-grade non-Hodgkin′slymphoma and lymphoproli ferative disorders:evaluation of response on 48 patients.Eur JHaematol,1999,62:76-82)。单抗药物存在的问题主要涉及免疫学和药理学两方面。免疫学方面的问题关键是人抗鼠Ig抗体(HAMA)反应,因为多年来用于临床研究的单抗药物多数使用小鼠单抗制备,往往导致HAMA反应。此外,肿瘤细胞群体在抗原性方面的异质性,肿瘤细胞的抗原性调变等也能影响单抗药物的疗效。药理学方面的问题主要是到达肿瘤的药量不足。单抗药物在体内运送过程中受多种因素影响。由于它是异体蛋白,会被网状内皮系统摄取,有相当数量将积聚于肝、脾和骨髓;再者就是机体对该异体蛋白产生抗体而降低其效力。单抗药物是大分子物质,通过毛细血管内皮层以及穿透肿瘤细胞外间隙均受到限制。(甄永苏,单克隆抗体药物治疗肿瘤的研究现状与展望,中国医学科学院学报,2000,22:9-12)。
肿瘤疫苗免疫治疗是利用肿瘤抗原进行主动免疫来激发、增强机体对肿瘤的主动特异性免疫反应。目前所研究的肿瘤疫苗主要是基因工程疫苗、肽疫苗、核酸疫苗、抗独特型抗体疫苗。其中a肿瘤基因工程疫苗是通过基因重组技术,将目的基因导入受体细胞而制备的疫苗。b肽疫苗制备是基于在免疫反应中抗原在胞浆内降解为短肽,最后形成肽-MHC-TCR复合体最终激发CTL反应。肽疫苗主要包括:(1)肿瘤特异性抗原肽疫苗:其特异性高,作为肽疫苗是最为理想的选择。(2)病毒相关肽疫苗:一些人类肿瘤的发生发展与病毒密切相关,这些肿瘤细胞有病毒基因,能编码合成病毒相关抗原作为机体免疫攻击的靶抗原。(3)癌基因、抑癌基因突变肽疫苗:癌基因、抑癌基因的改变在肿瘤发生、发展中起重要作用。改变的癌基因、抑癌基因产物可以成为机体免疫系统攻击的目标。因此,来源于癌基因、抑癌基因突变产物的肽疫苗在肿瘤的治疗及预防上具有重要意义。c核酸疫苗是由编码能引起保护性免疫反应的抗原基因片段和载体构建而成的,包括DNA疫苗和RNA疫苗,目前研究较多的为DNA疫苗。核酸肿瘤疫苗能够同时刺激机体产生体液免疫和细胞免疫,诱导许多亚单位疫苗不能诱导的CTL效应。d抗独特型抗体疫苗(Ab2疫苗)是根据抗独特型抗体具有模拟抗原及免疫调节的双重作用,同时能克服机体免疫抑制,打破免疫耐受故能代替肿瘤抗原诱发特异性主动免疫反应(Bhattacharya CM,Mukerjee S,biddle W,et al.Murinemonoclonal anti-idiotype antibldy as a potential netword antigen for humancarcinoembryonic antigen.J Immumol,1990,145:2758.)。另外还有用肿瘤细胞制成的肿瘤疫苗进行主动免疫治疗,可使病人体内产生大量对抗肿瘤细胞的抗体。
在上述肿瘤疫苗免疫治疗方法中,由于肿瘤抗原的抗原性较弱,且带瘤宿主经常处于免疫抑制状态,难以激发有效的抗肿瘤反应。尽管抗独特型抗体的研究已取得许多进展,但事物总是两方面的。Ab2疫苗应用存在许多困难,因为Ab2β虽能模拟小分子多肽抗原,却难以精确反映大分子蛋白质抗原的决定簇,尤其是Ab2β单抗。再者由于肿瘤抗原极其复杂,常发生调变等,制备广谱的肿瘤特异性独特型疫苗难度很大。更重要的是目前使用的Ab2β主要来自鼠杂交瘤细胞,为异种蛋白,能激发人免疫系统产生人抗鼠Ig抗体(HAMA),发生中和反应并产生毒性免疫复合物,而降低疗效,严重时可引起血清病反应。
鉴于以上技术方案所存在的诸多问题,为了避免或减少HAMA反应,现通常是使鼠源性单抗人源化或研制完全的人源抗体。单抗人源化主要是通过基因工程技术制备嵌合抗体(chimeric antibody)或改形抗体(reshaping antibody)。嵌合抗体是将Fc段置换为人源性,其它部分仍为鼠源性。改形抗体是指除互补决定区(CDR)为鼠源性外,其它部分均为人源性。使偶联物分子小型化,以提高药物对肿瘤的渗透力,研制高效单抗药物。局部注射以提高单抗药物在肿瘤部位的浓度。多种抗体混合应用以弥补单抗的异质性问题。其中鼠源性单抗人源化和研制完全的人源抗体具有较高的技术难度,难于普及应用。
禽类尤其是鸡在系统发育上与哺乳动物有很大差异,鸡的免疫球蛋白与哺乳动物免疫球蛋白在免疫学特性上也有很大不同。鸡的免疫系统能识别更多的免疫反应位点和更多的抗原决定簇,因此鸡免疫系统对哺乳动物的蛋白或生物分子能产生具有更高效价和亲和力的特异性抗体。鸡免疫系统针对于外源性蛋白所产生的IgY不仅具有更高的免疫特异性,更重要的是这种特异性IgY主要储存在鸡蛋黄中,因此可利用下蛋母鸡作为免疫反应器来大量生产具有重要临床应用价值的抗体药物。
众所周知鸡蛋作为人类的常用食品和化妆品原料,无论内服和外用均对人体无任何生物毒性和不良作用。因此,利用禽类作为免疫反应器来大量生产抗体药物,并应用于肿瘤的诊断和导向治疗,将具有极广阔的应用前景。以蛋黄抗癌抗体IgY为原料制备的生物导弹和抗独特型抗体肿瘤疫苗(Ab2疫苗)可以很好地解决上述单抗偶联物或上述肿瘤疫苗所存在的HAMA反应和异质性问题。
本发明的目的在于克服上述缺点与不足,提供一种蛋黄抗癌抗体的制备方法,包括针对于肿瘤免疫原的蛋黄多克隆抗癌抗体IgY、抗独特型抗体和肿瘤特异性表达抗原的制备方法,另外还涉及该蛋黄抗癌抗体的用途即采用该蛋黄抗癌抗体制备相关药物、食品或保健品。
本发明的技术方案是这样实现的:一种蛋黄抗癌抗体的制备方法是利用禽类作为免疫反应器,通过将肿瘤特异性免疫原(包括肿瘤细胞、纯化或重组抗原或疫苗瘤苗、肿瘤特异性DNA或mRNA及其与相应载体组成的重组体、针对于肿瘤特异性抗原的单克隆或多克隆抗体)及其组合物单独或联合注射给产蛋禽类尤其是鸡,使其产生针对于肿瘤特异性免疫原的蛋黄IgY抗体或抗独特型抗体(包括Ab2α和Ab2β)或肿瘤特异性表达抗原中的任一种或其组合物而被大量地输送到蛋黄中储存,然后无创性的利用蛋黄提纯所需要的抗癌抗体(包括肿瘤特异性蛋黄IgY抗体、肿瘤特异性表达抗原和抗独特型抗体Ab2α和Ab2β中的任一种或其组合物)。利用该蛋黄抗癌抗体中的IgY抗体为主要原料可制备成针对于肿瘤特异性抗原的免疫诊断药剂和免疫治疗药剂,包括肿瘤体外诊断试剂、肿瘤体内导向诊断试剂和特异性蛋黄抗癌抗体免疫治疗剂以及特异性蛋黄抗癌抗体偶联药物或毒素的导向药物即生物导弹;利用该蛋黄抗癌抗体中的肿瘤特异性表达抗原可制备成针对于肿瘤特异性抗原的免疫诊断药剂和免疫治疗药剂,包括肿瘤体外诊断试剂和肿瘤特异性疫苗瘤苗和核酸疫苗;利用该蛋黄抗癌抗体中的抗独特型抗体Ab2α和Ab2β为主要原料可制备成针对于肿瘤的免疫诊断药剂和免疫治疗药剂,包括肿瘤体外诊断试剂、肿瘤体内导向诊断试剂(主要采用Ab2α)和抗独特型抗体Ab2α偶联药物或毒素的导向药物即抗独特型生物导弹和抗独特型抗体肿瘤疫苗(主要采用Ab2β);用于肿瘤的诊断、免疫治疗和导向治疗。另外该蛋黄抗癌抗体还可作为添加剂添加于食品、饮料及保健品中,用于肿瘤的预防及早期预防性治疗。
由于采用本发明方法制备蛋黄抗癌抗体,利用鸡免疫系统对哺乳动物的蛋白或生物分子能产生具有更高效价和亲和力的特异性抗体,可诱导高滴度的特异性抗人类肿瘤抗原的抗体,且具有成本低、产量高、特异性强、决定簇广并能进行集约化大规模生产的优点,更重要的是该蛋黄抗癌抗体能够很好地解决上述鼠源性单抗偶联物或肿瘤疫苗所存在的HAMA反应和异质性问题,且对人体无毒副作用,具有较好的安全性。再者就是本发明所制备的蛋黄抗癌抗体及其组合物能够在被动免疫和主动免疫两方面共同发挥其免疫调节和治疗作用。本发明适用于肿瘤的免疫诊断、治疗和预防,尤其是适用于肿瘤的被动免疫和主动免疫治疗,将具有极其广阔的应用前景。
为了进一步公开本发明,下就对本发明进行更进一步的详细描述。
一种蛋黄抗癌抗体的制备方法,其特征在于:以产蛋禽类尤其是鸡作为免疫反应器,用一种或多种纯化或灭活的肿瘤抗原或细胞或通过基因工程技术重组的肿瘤特异性抗原或疫苗瘤苗或肿瘤特异性DNA或mRNA及其与相应载体组成的重组体或针对于肿瘤特异性抗原的单克隆或多克隆抗体或其脂质体复合物作为免疫原,分别单独进行或多种联合进行禽类尤其是鸡的多次重复免疫注射,然后再以不完全佐剂进行追加强化反应,待5-20天后禽类尤其是鸡的产蛋中即有针对于上述肿瘤免疫原的多克隆抗癌抗体IgY或抗独特型抗体或肿瘤特异性表达抗原中的任一种或其组合物存在和储存。其具体步骤包括:
a)肿瘤免疫原或其组合物进行多次免疫注射禽类优选为鸡。在此所述的肿瘤免疫原是采用纯化的人类肿瘤抗原或通过灭活的肿瘤细胞或组织、通过基因工程技术重组的肿瘤特异性抗原或疫苗瘤苗、通过提取纯化的肿瘤特异性裸DNA或mRNA及其与相应载体组成的重组体、肿瘤特异性抗原的单克隆或多克隆抗体,另外还包括上述肿瘤免疫原的脂质体微粒甚至是纳米微粒的免疫注射,借助于脂质体对组织和细胞的亲和性以强化免疫效果;所述禽类包括鸡、鸭、鹅、鹌鹑,首选是鸡;注射部位包括肌肉、皮下、皮内、血管和生殖腔囊;注射方法包括将上述肿瘤免疫原单独进行注射和多种免疫原联合进行多次重复免疫注射,其中所述的多种肿瘤免疫原联合进行免疫注射包括用不同种类和来源的肿瘤抗原、基因重组肿瘤特异性抗原或疫苗瘤苗、肿瘤特异性裸DNA或mRNA及其重组体中的任一种及其组合物;还包括不同种类和来源的肿瘤特异性单克隆或多克隆抗体中的任一种及其组合物;所述的免疫原注射量为1-2ml(免疫原量10-500μg/ml+等量不完全福氏佐剂,其中抗体Ab1的用量为100~2000μg/ml+等量不完全福氏佐剂)。
b)上述肿瘤免疫原用不完全佐剂进行追加免疫反应。
c)待5-20天后禽类尤其是鸡的产蛋中即有针对于上述肿瘤免疫原的蛋黄抗癌抗体存在和储存。其中所述的蛋黄抗癌抗体包括针对于上述人类肿瘤抗原、细胞或组织、重组肿瘤抗原或疫苗瘤苗或其脂质体或纳米微粒的蛋黄多克隆抗癌抗体IgY中的任一种或其组合物;针对于肿瘤特异性裸DNA或mRNA及其重组体或其脂质体或纳米微粒的肿瘤特异性表达抗原中的任一种或其组合物;针对于肿瘤特异性单克隆或多克隆抗体或上述蛋黄多克隆抗癌抗体IgY或其脂质体或纳米微粒的抗独特型抗体Ab2α和Ab2β中的任一种或其组合物。
本发明用上述肿瘤免疫原注射免疫产蛋禽类尤其是鸡,并以所产蛋黄作为针对于上述肿瘤免疫原的抗癌抗体的来源,该类方法具有很多优点如禽类尤其是鸡易于饲养,费用不高,收集产蛋方便,无需抽动物血,无损伤,符合现代动物保护规则;另外还具有产生有效免疫反应所需抗原量小的优点,高度保守的哺乳动物蛋白质对种系发生学上距离较远的禽类尤其是鸡通常有较强的免疫原性。
一种蛋黄抗癌抗体的制备方法,其特征还在于:该蛋黄抗癌抗体的提取纯化方法是采用水稀释法、反复冻融法或硫酸铵、硫酸钠、PEG、硫酸葡聚糖、藻酸钠或辛酸沉淀或浸提、萃取、浓缩、膜过滤的方法从上述禽类蛋黄尤其是鸡蛋黄中提取纯化针对于上述肿瘤免疫原的多克隆抗癌抗体IgY或抗独特型抗体或肿瘤特异性表达抗原中的任一种或其组合物,然后将该纯化的蛋黄抗癌抗体添加相应辅料包括海藻糖而制备成药剂学上的任意剂型包括片剂、针剂、口服液和喷雾剂。其具体步骤包括:
a)取禽蛋尤其是鸡蛋去壳取黄,除去粘附于蛋黄膜上的蛋白组分,然后将蛋黄置于灭菌蒸馏水中,反复洗涤三次,进一步除去蛋黄膜上的蛋白组分,沥干后刺破蛋黄膜,收集蛋黄。
b)将上述收集蛋黄充分搅拌均匀后,加入蛋黄匀浆5倍体积的0.1mol/L PH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液,制成稀释蛋黄液。在该稀释蛋黄液中海藻糖的重量百分比是5-30%。
c)将上述稀释蛋黄液置于冰盒(-20℃)冰冻1-5小时,然后取出于室温复融并低速离心(500-1000r/min)后沥出收集上清液,然后再向沉淀物中加入2-5倍体积的0.1mol/L PH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液,充分混匀溶解沉淀物,依上法再次冻融收集上清液,如此反复冻融3-5次,合并收集各次得到的上清液备用。
d)向上述收集上清液中按比例加入硫酸铵、硫酸钠、PEG、硫酸葡聚糖、藻酸钠或辛酸沉淀剂中的任一种或其复合物,离心收集其沉淀物,该沉淀物中即含有针对于上述肿瘤免疫原的多克隆抗癌抗体IgY或抗独特型抗体或肿瘤特异性表达抗原中的任一种或其组合物。
e)将上述沉淀物用蒸馏水复溶后透析或超滤浓缩或凝胶层析,进一步纯化针对于上述肿瘤免疫原的多克隆抗癌抗体IgY或抗独特型抗体或肿瘤特异性表达抗原中的任一种或其组合物。
f)向上述纯化的蛋黄抗癌抗体按比例添加相应辅料,将其制备成药剂学上的任意剂型包括片剂、针剂、口服液和喷雾剂。在此所述的辅料包括海藻糖。
一种蛋黄抗癌抗体的制备方法,其特征还在于:该蛋黄抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α的修饰处理方法是采用偶联或共价结合放射性核素、药物和毒素及其他细胞毒性物质的方法制备免疫导向药物或生物导弹;是采用偶联或共价结合放射性核素、发光物质、胶体金或酶的方法制备体内免疫诊断药剂和体外免疫诊断试剂包括免疫组化试剂;是采用向上述蛋黄抗癌抗体尤其是抗独特型抗体Ab2β或肿瘤特异性表达抗原中添加不完全佐剂及其他组分的方法制备特异性肿瘤疫苗(包括抗独特型抗体疫苗和多肽疫苗)。
导弹的主要部件一是能追踪目标的导航系统,二是摧毁特定目标的炸弹。应用这一原理制备出一种能追踪肿瘤而又能专一性地杀伤肿瘤的“武器”,即生物导弹,它的基本部件是能特异地识别肿瘤抗原目标的抗体以及在抗体的末端接上杀伤肿瘤细胞的毒性药物。这样从理论上讲,只要能研制出可识别肿瘤细胞的抗体,并使它带上毒性药物就可大功告成。但事实上并不那么简单,首先是抗体问题,早期人们是用纯度及特异性相对较高的肿瘤抗原免疫小鼠后的完整抗体(即由识别抗原簇的Fab片段和Fc片段所组成的免疫球蛋白),使它的“尾端”(Fc片段)携带上放射性核素碘(125I);1975年杂交瘤技术的建立及单克隆抗体的问世,使单抗与放射性核素的结合,推动了肿瘤导向治疗的进展。然而,经过一段时间的实验,单抗与多抗在体内治疗的结果,并没有明显的差别,其主要原因是:①单抗和多抗都是完整抗体,它们一旦进入机体,就会被正常组织交叉吸附,不能相对集中地到达靶肿瘤;而且不容易清除和排出体外;②由于完整抗体的分子量大,不易通过机体的生理屏障(如结缔组织等)进入肿瘤中心部位;③由于完整的抗体都来源于小鼠,对人体来说是一种异性蛋白,所以可在体内产生抗抗体而被中和。由于存在以上问题,因此使完整抗体用于导向治疗受到限制。
根据以上存在的问题,近几年来研究人员已设法研究制备出应用小分子量的抗体片段,而且设法用人-人杂交瘤来制备人-人单克隆抗体,目前又用基因工程的方法来制备出基因工程抗体,这是一种不含Fc片段的Fab小分子多肽,并建立了双功能抗体技术。后者有特异性识别的双臂(即把两个Fab片段结合在一起),因此有双重识别能力,即既可以与肿瘤结合,又可与药物弹头相连接。由于基因工程抗体不含Fc片段,因此减少了非特异吸附,并可将鼠源性成分减少到最低限度;小分子的基因工程产物,有利于杀瘤物质进入肿瘤内部且不易被宿主识别为异物而产生抗抗体;这种双功能抗体,使弹头直接命中瘤细胞,若将双功能抗体与LAK,TIL细胞联合应用,则可获得更大的效应,从而有效地控制恶性肿瘤的发展。但该类方法均有较高的技术难度,难于推广。
本发明就是为了克服以上问题而利用蛋黄抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α的修饰处理即采用其偶联或共价结合放射性核素、药物和毒素及其他细胞毒性物质的方法制备免疫导向药物或生物导弹。其具体步骤包括:
a)蛋黄抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α的酶分解或偶联活性基团预修饰处理,其中酶分解是利用胃蛋白酶或无花果蛋白酶将蛋黄抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α分解再用二巯基苏糖醇或β-巯基乙醇还原为Fab′小片断,以使其具有更好的组织穿透力;或用不同的活化试剂将蛋黄抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α或其Fab′小片断上的氨基或羧基或巯基或醛基活化,如用1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)把其变成活泼酯,然后再同各种不同的药物分子偶联。
b)偶联药物的预修饰处理包括将放射性核素、药物和毒素分子用不同的活化试剂活化,如用1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)把其变成活泼酯,如此采用类似公知共用的方法,可以分别把含有羟基、氨基、醛基、肼基、巯基等基团的偶联药物活化,以使其能够与蛋黄抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α或其Fab′小片断发生共价结合。
c)蛋黄抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α或其Fab′小片断与已活化处理的偶联药物包括将放射性核素、药物和毒素分子共价结合而成为肿瘤特异性免疫导向药物或生物导弹。
本发明是采用蛋黄抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α的修饰处理即采用偶联或共价结合放射性核素、发光物质、胶体金或酶的方法制备体内免疫诊断药剂和体外免疫诊断试剂。其具体步骤包括:
a)将蛋黄抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α采用公知共用的方法进行放射性核素、发光物质、胶体金或酶标记而制备其相应的标记物。
b)将蛋黄抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α的放射性核素、发光物质、胶体金或酶标记物中的任一种配合其他组分制备体内免疫诊断药剂和体外免疫诊断试剂(包括免疫组化试剂)。
本发明是采用蛋黄抗癌抗体中的蛋黄抗癌抗体IgY制备肿瘤特异性免疫治疗剂。其具体步骤包括:向上述中蛋黄抗癌抗体IgY添加不完全佐剂及其他组分,然后再进行免疫注射,免疫机体产生针对于蛋黄抗癌抗体IgY的抗独特型抗体Ab2β,从面诱导机体产生抗肿瘤的特异性免疫应答。
本发明是采用蛋黄抗癌抗体中的抗独特型抗体Ab2β或肿瘤特异性表达抗原制备特异性肿瘤疫苗。其具体步骤包括:向上述抗独特型抗体Ab2β、肿瘤特异性表达抗原中的任一种或其组合物中添加不完全佐剂及其他组分制备特异性肿瘤疫苗。在此所述的抗独特型抗体Ab2β疫苗是采用向禽类尤其是鸡注射肿瘤特异性单克隆或多克隆抗体尤其是注射蛋黄抗癌抗体中的抗癌抗体IgY而制备的。
针对外来抗原的抗体分子(Ab1)可变区上独特型(Id)可刺激机体产生相应的抗Id抗体(Ab2)。其中Ab2β具有与外来抗原相似的氨基酸排列顺序或空间构型,它能够在体内模拟始动抗原的作用,故被认为是外部抗原在机体免疫系统中的"内影像"(internalimage)。应用Ab2β的这一特性,可有目的地制备Ab2β,将其作为抗原的替代物用于诱导机体产生抗病原体的特异性免疫应答,即所谓抗独特型疫苗(anti-idiotypevaccine)。
一种蛋黄抗癌抗体的制备方法,其特征还在于:将上述蛋黄抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α制备成脂质体微粒甚至是纳米微粒然后再偶联上述细胞毒性物质成免疫导向药物的方法,以增加其对肿瘤组织的亲和性和渗透性;将上述抗独特型抗体Ab2β或肿瘤特异性表达抗原制备成脂质体微粒甚至是纳米微粒的特异性肿瘤疫苗的方法。
脂质体技术是被喻为“生物导弹”的第四代靶向给药技术,脂质体属于纳米级药物载体,该技术利用脂质体的独有特性,将毒副作用大、在血液中稳定性差、降解快的药物包裹在脂质体内,根据人体病灶部位血管内皮细胞间隙较大,脂质体药物可透过此间隙到达病灶部位,在病灶部堆积释放,从而达到定向给药。脂质体主要辅料为磷脂,而磷脂在血液中消除极为缓慢,因此脂质体药物在血循环系统保留时间长,使病灶部位得到充分治疗的效果。利用该技术可将一大批已知高毒性活性药物安全有效地应用于临床治疗,其中有抗癌药、抗生素类药、抗真菌类药、抗寄生虫类药、蛋白质或多肽类药物,极大地提高了临床治疗水平,减轻了患者的病痛。同时可将单克隆抗体连接到脂质体上,借助于抗原与抗体的特异反应,将载药脂质体定向送入。本发明就是利用上述蛋黄抗癌抗体包括蛋黄抗癌抗体IgY、抗独特型抗体Ab2α、抗独特型抗体Ab2β和肿瘤特异性表达抗原中的任一种或其组合物所制备的脂质体微粒甚至是纳米微粒,能够有效到达肿瘤靶区,共同发挥其主动和被动免疫治疗作用。
一种蛋黄抗癌抗体的制备方法,其特征还在于:将上述蛋黄抗癌抗体中的具有相同或相近作用的两种或两种以上组分同其他辅料按一定配比混合成组合物,使相应蛋黄抗癌抗体组分针对于肿瘤发挥协同作用。
一种蛋黄抗癌抗体的用途,其特征在于:上述蛋黄抗癌抗体中的任一种或任意组合的任意剂型单独或联合用于肿瘤的诊断、治疗和预防。
人体对癌症有一定的免疫力,但不同的人,免疫力有强有弱。肿瘤免疫治疗是设法调动人体内各种积极防御因素,提高机体的免疫力,以消除手术或化疗后残余的肿瘤细胞,以防止肿瘤的复发和转移。肿瘤的免疫治疗概括起来可分为特异性免疫治疗和非特异性免疫治疗两大类。免疫治疗是一种扶正措施,副作用少,所以易受病人欢迎。肿瘤的被动免疫治疗是指给机体输注外源的免疫效应物质,由这些外源性效应物质在机体内发挥治疗肿瘤作用。目前主要有以下两大类:
a)抗肿瘤导向治疗即利用高度特异性的单克隆抗体为载体,将细胞毒性的杀伤分子带到肿瘤病灶处,可特异地杀伤肿瘤细胞。目前根据所用的杀伤分子的性质不同,将肿瘤的导向治疗分为:①放射免疫治疗,将高能放射性核素与单克隆抗体连接,可将放射性核素带至瘤灶杀死肿瘤细胞;②抗体导向化学疗法,抗肿瘤药物与单抗通过化学交联组成的免疫偶联物,可以将药物导向肿瘤部位,杀伤肿瘤细胞,常用的有氨甲蝶呤(MTX)、阿霉素等;③免疫毒素疗法(immunotoxintherapy),将毒素与单克隆抗体相连,制备的免疫毒素对肿瘤细胞有特异性的强杀伤活性。常用的毒素有两类:一类是植物毒素,包括篦麻籽毒素(RT)、相思子毒素(abrin)、苦瓜毒素(MD)等。另一类是细胞毒素,包括白喉毒素(DT)、绿脓杆菌外毒素(PE)。但目前所用的单克隆抗体多为鼠源单克隆抗体,应用人体后会产生抗鼠源单克隆抗体的抗体,使其不能反复应用影响了其疗效。用基因工程的方法,使鼠源抗体人源化可减少这个问题,但技术难度较高,广泛推广受限。
b)过继免疫疗法(adoptive immunotherapy)是取对肿瘤有免疫力的供者淋巴细胞转输给肿瘤患者,或取患者自身的免疫细胞在体外活化、增殖后,再转输入患者体内,使其在患者体内发挥抗肿瘤作用。过继免疫疗法的效应细胞具有异质性,如CTL、NK细胞、巨噬细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)和肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)等都在杀伤肿瘤细胞中起作用。
本发明就是针对以上问题利用蛋黄抗癌抗体中的IgY抗体为主要原料制备成针对于肿瘤特异性抗原的免疫诊断药剂和免疫治疗药剂,包括肿瘤体外诊断试剂、肿瘤体内导向诊断试剂和特异性蛋黄抗癌抗体免疫治疗剂以及特异性蛋黄抗癌抗体偶联药物或毒素的导向药物即生物导弹;利用该蛋黄抗癌抗体中的肿瘤特异性表达抗原可制备成针对于肿瘤特异性抗原的免疫诊断药剂和免疫治疗药剂,包括肿瘤体外诊断试剂和肿瘤特异性疫苗瘤苗和核酸疫苗;利用该蛋黄抗癌抗体中的抗独特型抗体Ab2α和Ab2β为主要原料可制备成针对于肿瘤的免疫诊断药剂和免疫治疗药剂,包括肿瘤体外诊断试剂、肿瘤体内导向诊断试剂(主要采用Ab2α)和抗独特型抗体Ab2α偶联药物或毒素的导向药物即抗独特型生物导弹和抗独特型抗体肿瘤疫苗(主要采用Ab2β);用于肿瘤的诊断、免疫治疗和导向治疗。另外该蛋黄抗癌抗体IgY和抗独特型抗体还可作为添加剂添加于食品、饮料及保健品中,用于肿瘤的预防及早期预防性治疗。
由于采用本发明方法制备蛋黄抗癌抗体,利用鸡免疫系统对哺乳动物的蛋白或生物分子能产生具有更高效价和亲和力的特异性抗体,可诱导高滴度的特异性抗人类肿瘤抗原的抗体,且具有成本低、产量高、特异性强、决定簇广并能进行集约化大规模生产的优点,更重要的是该蛋黄抗癌抗体能够很好地解决上述鼠源性单抗偶联物或肿瘤疫苗所存在的HAMA反应和异质性问题,且对人体无毒副作用,具有较好的安全性。再者就是本发明所制备的蛋黄抗癌抗体及其组合物能够在被动免疫和主动免疫两方面共同发挥其免疫治疗作用。本发明适用于肿瘤的免疫诊断、治疗和预防,尤其是适用于肿瘤的被动免疫和主动免疫治疗。
一种蛋黄抗癌抗体的用途,其特征还在于:上述蛋黄抗癌抗体中的多克隆抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α或其荧光、发光、酶、金属标记物中的任一种用于配制体外用免疫诊断试剂;上述蛋黄抗癌抗体中的多克隆抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α或其脂质体甚至纳米微粒的放射性核素标记物用于配制体内免疫导向诊断试剂。上述所述的免疫诊断试剂包括免疫组化试剂。
一种蛋黄抗癌抗体的用途,其特征还在于:上述蛋黄抗癌抗体中的多克隆抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α或其脂质体甚至纳米微粒用于制备治疗性免疫制剂;上述蛋黄抗癌抗体中的多克隆抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α或其脂质体甚至纳米微粒与放射性核素、药物和毒素的偶联物用于制备免疫导向药物或生物导弹。
一种蛋黄抗癌抗体的用途,其特征还在于:上述蛋黄抗癌抗体中的肿瘤特异性表达抗原用于制备肿瘤多肽疫苗;上述蛋黄抗癌抗体中的抗独特型抗体Ab2β用于制备肿瘤抗独特型抗体疫苗。
特异性主动免疫治疗是通过激活特定的免疫系统,达到消灭肿瘤细胞的目的,这种治疗并不影响周围正常组织。从理论上讲,由疫苗介导的特异性免疫治疗,能够激活特定的淋巴细胞〔B细胞和(或)T细胞〕反应,产生即刻的抗肿瘤作用,并对将来的肿瘤产生记忆反应。最初,利用自体或同种异体肿瘤细胞制备疫苗;后来,肿瘤细胞膜成为制备疫苗的材料。随着分子生物学方法的进展,利用可表达抗原的基因修饰肿瘤细胞来增强免疫原性或利用修饰基因以分泌细胞因子等技术用于疫苗制备。同时,也可利用提纯的肿瘤相关抗原、DNA编码蛋白抗原和(或)蛋白衍生肽制备疫苗。疫苗接种的最终目的是激活免疫系统的某一部分,如抗体或淋巴细胞,来杀灭肿瘤。目前,特异性主动免疫治疗有很多方法,如完整肿瘤细胞与卡介苗等佐剂的混合物;用遗传学方法改变肿瘤细胞,(如转导粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因的肿瘤细胞)。另外,亦可用肽、黏蛋白和碳水化合物等单个抗原制备疫苗。许多重组疫苗可表达各种抗原如癌胚抗原。利用重组疫苗,其他基因(例如编码协同刺激因子分子的基因)亦可以肿瘤相关基因转导。针对特异性抗体还可采用抗独特型抗体,因为肿瘤抗原的抗原性较弱,且带瘤宿主经常处于免疫抑制状态,难以激发有效的抗肿瘤反应。80年代以来,许多学者通过动物实验证明用抗原内影像型Ab2(又称抗独特型疫苗)能够克服免疫抑制,诱导机体产生特异性免疫应答。免疫网络理论认为,抗体(Ab1)分子上存在的独特型(Id)抗原决定簇可以刺激机体产生A-Id抗体(Ab2)及Ab3等一系列抗体的产生,从而构成一个复杂的免疫网络。根据抗独特型抗体与抗体独特位反应的特点和抗独特型抗体的功能,可将A-Id分为Ab2α、Ab2β、Ab2γ、Ab2δ。其中Ab2β可识别Ab1上与抗原互补的决定簇,能完全抑制抗原与Id的结合。它具有类似抗原的结构,可以"模拟"抗原,产生与抗原相同的生物学效应,被认为是外部抗原在机体免疫系统中的“内影像”(internal image)。Ab2β具有下列特点:a)能特异性与不同种属个体产生的抗体(Ab1)反应;b)能特异性与不同类抗体(Ab1)反应;c)Ab2β与抗原能竞争性地结合Ab1,二者之间存在竞争性抑制作用;d)能诱导不同种属个体产生特异性免疫应答。
具有内影像特点的抗独特型抗体能模拟肿瘤相关抗原诱导机体产生主动免疫应答,其应答过程极其复杂,但主要涉及体液免疫和细胞免疫两方面。Ab2β作为胸腺依赖抗原(TD)激活辅助T淋巴细胞亚群(Th1和Th2),分泌一系列细胞因子,如Th1细胞产生INF-γ、IL-10、TNF和IL-2;Th2细胞产生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等。Th2细胞产生的细胞因子影响和促进B淋巴细胞分化和增殖,产生特异性抗体Ab3,Ab3一部分能与Ab1互相模拟,即具有与抗原结合性,称之为抗肿瘤抗体(Ab1′)。总Ab3的产生已被证实与微小肿瘤病灶消退和/或病人生存时间延长呈正相关。被激活的Th1细胞释放细胞因子,如INF-γ可通过影响NK细胞及T细胞功能而发挥抗肿瘤效应,IL-2可促进T细胞生长、克隆性扩增而增强机体的免疫功能,亦可诱导或促进多种细胞毒性细胞活性,如NK、CTL、LAK及TIL等,发挥免疫监视及抗肿瘤效应。同时IL-2还可协同刺激B细胞增殖及分泌抗体,与补体及效应细胞相作用,发挥ADCC及CDC抗肿瘤作用(龚非力等,医学免疫学,第二版,武汉:科学出版社,2000)。人体内免疫系统是一个处于自身动态平衡中的系统。在肿瘤患者体内的免疫系统中,抗独特型抗体是一个较关键的系统要素,用人为的方法改变抗独特型抗体的质量和数量,必然会使系统发生变化,再在更高的层次上达到新的平衡。使肿瘤免疫的系统平衡按照理论上预测的有利于患者的方向发展变化,在某种意义上这正是抗独特型抗体应用的关键所在。
本发明就是采用上述方法所制备的蛋黄肿瘤特异性表达抗原和肿瘤抗独特型抗体Ab2β作为肿瘤特异性疫苗而用于肿瘤的特异性免疫治疗,能够激活特定的淋巴细胞〔B细胞和(或)T细胞〕反应,产生相应的抗肿瘤作用,并对将来的肿瘤产生记忆反应,激活机体免疫系统甚至重新调节肿瘤免疫的系统平衡,调动体液免疫和细胞免疫作用,产生特异性肿瘤抗体或杀伤性淋巴细胞,来共同杀灭肿瘤细胞,达到免疫性治疗肿瘤的目的。
一种蛋黄抗癌抗体的用途,其特征还在于:上述蛋黄抗癌抗体中的多克隆抗癌抗体IgY、肿瘤特异性表达抗原、抗独特型抗体Ab2α、Ab2β的任一种或任意组合用于制备预防肿瘤的食品、饮料和保健品。即采用将本发明中的多克隆抗癌抗体IgY、肿瘤特异性表达抗原、抗独特型抗体Ab2α、Ab2β中的任一种或任意组合按一定配比添加于食品、饮料及保健品中,用于肿瘤的预防及早期预防性治疗。
下面结合实施例进一步说明本发明。
实施例1:用具有免疫活性的肿瘤特异性免疫原包括肿瘤特异性抗原、疫苗瘤苗、DNA或mRNA和抗体及其脂质体复合物中的任一种或其复合物免疫产蛋禽类尤其是鸡,然后再以不完全佐剂进行追加强化反应,待5-20天后禽类尤其是鸡的产蛋中即有针对于上述肿瘤免疫原的多克隆抗癌抗体IgY或抗独特型抗体或肿瘤特异性表达抗原中的任一种或其组合物存在和储存,其具体步骤包括:取6月龄SPF纯系莱航产蛋母鸡于标准II级清洁级动物房饲养,每只鸡于胸腹部多点注射上述肿瘤免疫原1-2ml(免疫原量10-500μg/ml+等量不完全福氏佐剂,其中抗体Ab1的用量为100~2000μg+等量不完全福氏佐剂),2~4周后加强免疫注射3-5次,待5-20天后免疫母鸡所产的免疫蛋中即含有蛋黄抗癌抗体。
实施例2:蛋黄抗癌抗体的制备 将上述免疫鸡蛋去蛋清后的卵黄充分搅拌均匀后,加入蛋黄匀浆5倍体积的0.1mol/L PH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液,然后置于冰盒(-20℃)冰冻1-5小时,取出于室温复融并低速离心(500-1000r/min)后沥出收集上清液,再向沉淀物中加入2-5倍体积的0.1mol/L PH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液,充分混匀溶解沉淀物,依上法再次冻融收集上清液,如此反复冻融3-5次,合并收集各次得到的上清液加入硫酸钠,使硫酸钠的终浓度达10-30%,离心收集其沉淀物,并将该沉淀物用蒸馏水复溶后对盐透析后超滤浓缩、凝胶过滤、冷冻干燥即得到纯化的蛋黄抗癌抗体包括蛋黄多克隆抗癌抗体IgY或抗独特型抗体或肿瘤特异性表达抗原中的任一种或其组合物。实验结果表明:批量制备的蛋黄抗癌抗体,每只鸡蛋大约可提取57~152mg的肿瘤特异性蛋黄抗癌抗体,平均每只鸡蛋可提取84mg。
实施例3:蛋黄抗癌抗体的检测 癌胚抗原特异性蛋黄抗癌抗体IgY的检测采用ELISA间接法检测,以癌胚抗原CEA液包被酶标板孔,采用辣根过氧化物酶标记的鼠抗鸡IgY单抗作为二抗;特异性表达癌胚抗原的检测采用ELISA双抗体夹心法,以抗癌胚抗原抗体包被酶标板孔,采用辣根过氧化物酶标记的抗癌胚抗原抗体作为标记抗体;癌胚抗原特异性蛋黄抗独特型抗体的检测采用ELISA间接法,以癌胚抗原特异性蛋黄抗癌抗体IgY包被酶标板孔,采用辣根过氧化物酶标记的鼠抗鸡IgY单抗作为二抗;上述ELISA检测依常规操作进行。实验结果表明:癌胚抗原特异性蛋黄抗癌抗体的效价在1∶5000-1∶15000之间,其中蛋黄抗癌抗体IgY的平均效价在1∶12000左右;特异性表达癌胚抗原的平均效价在1∶5400左右;癌胚抗原特异性蛋黄抗独特型抗体的平均效价在1∶9600左右。
实施例4:蛋黄抗癌抗体稳定性试验 蛋黄抗癌抗体经过滤除菌,以10mg/ml分装小试管中,分别于-20℃冰冻、4℃和室温保存,定期进行其效价检测。实验结果表明:蛋黄抗癌抗体于-20℃冰冻保存,其稳定性至少可保持12个月以上;于4℃保存,其稳定性至少可保持6个月以上;于室温保存,其稳定性至少可保持2个月以上。
实施例5:癌胚抗原特异性蛋黄抗癌抗体IgY与丝裂霉素的偶联试验 首先取葡聚糖1.0g,加入200mL蒸馏水后加高碘酸钠0.3g,室温下避光反应过夜,使葡聚糖充分氧化为多醛基葡聚糖,蒸馏水充分透析后冻干;注射治疗前2小时内取多醛基葡聚糖10mg加入0.15mol/L(pH7.2)的磷酸缓冲液2mL中,加丝裂霉素10mg,室温下反应24小时后,再加入已纯化的癌胚抗原特异性蛋黄抗癌抗体IgY10mg,4℃搅拌反应24小时;然后在上述反应混合物中加硼氢化钠0.2mg,在4℃下还原2小时,离心后经Sephadex G-150层析柱过柱,收集第一峰即可用于治疗。
实施例6:治疗效果观察 通过对37例大肠癌患者(其中术后26例,术前7例,晚期术后转移4例)分别给予单独化疗、癌胚抗原特异性蛋黄抗癌抗体IgY-丝裂霉素导向治疗、癌胚抗原特异性蛋黄抗癌抗体IgY-丝裂霉素和癌胚抗原特异性蛋黄抗独特型抗体Ab2β联合治疗并进行疗效观察和比较。实验结果表明:就毒副作用来讲后两组明显优于单独化疗组;组织病理学显示癌细胞退变程度后两组(达3级)亦明显优于单独化疗组(多为2级);大肠癌组织内浸润的淋巴细胞CD3的数目联合治疗组(81.3%)明显多于导向治疗组(67.1%)和单独化疗组(58.6%)。进一步说明:癌胚抗原特异性蛋黄抗癌抗体IgY-丝裂霉素导向治疗具有特异性强、毒副作用小等优点;癌胚抗原特异性蛋黄抗癌抗体IgY-丝裂霉素和癌胚抗原特异性蛋黄抗独特型抗体Ab2β联合治疗具有激活机体细胞及体液免疫的作用。
Claims (10)
1、一种蛋黄抗癌抗体的制备方法,其特征在于:以产蛋禽类尤其是鸡作为免疫反应器,用一种或多种纯化的或采用基因工程技术重组的肿瘤特异性抗原或疫苗瘤苗或肿瘤特异性DNA或mRNA及其与之相应载体组成的重组体或针对于肿瘤特异性抗原的单克隆或多克隆抗体或肿瘤组织细胞或上述肿瘤免疫原的脂质体复合物作为免疫原,分别单独进行或多种联合进行禽类尤其是鸡的多次重复免疫注射,然后再以不完全佐剂进行追加强化反应,待5-20天后禽类尤其是鸡的产蛋中即有针对于上述肿瘤免疫原的多克隆抗癌抗体IgY或抗独特型抗体或肿瘤特异性表达抗原中的任一种或其组合物存在和储存。其具体步骤包括:
a)肿瘤免疫原或其组合物进行多次免疫注射禽类优选为鸡。在此所述的肿瘤免疫原是通过纯化的人类肿瘤抗原或通过灭活的肿瘤细胞或组织、通过基因工程技术重组的肿瘤特异性抗原或疫苗瘤苗、通过提取纯化的肿瘤特异性裸DNA或mRNA及其与相应载体组成的重组体、肿瘤特异性抗原的单克隆或多克隆抗体,另外还包括上述肿瘤免疫原的脂质体微粒甚至是纳米微粒;所述禽类包括鸡、鸭、鹅、鹌鹑,首选是鸡;注射部位包括肌肉、皮下、皮内、血管和生殖腔囊;注射方法包括将上述肿瘤免疫原单独进行注射和多种免疫原联合进行多次重复免疫注射,其中所述的多种肿瘤免疫原联合进行免疫注射包括用不同种类和来源的肿瘤抗原、基因重组肿瘤特异性抗原或疫苗瘤苗、肿瘤特异性裸DNA或mRNA及其重组体中的任一种及其组合物;还包括不同种类和来源的肿瘤特异性单克隆或多克隆抗体中的任一种及其组合物;所述的免疫原注射量为1-2ml(免疫原量10-500μg/ml+等量不完全福氏佐剂,其中抗体Ab1的用量为100~2000μg/ml+等量不完全福氏佐剂)。
b)上述肿瘤免疫原用不完全佐剂进行追加免疫反应。
c)待5-20天后禽类尤其是鸡的产蛋中即有针对于上述肿瘤免疫原的蛋黄抗癌抗体存在和储存。其中所述的蛋黄抗癌抗体包括针对于上述人类肿瘤抗原、细胞或组织、重组肿瘤抗原或疫苗瘤苗或其脂质体或纳米微粒的蛋黄多克隆抗癌抗体IgY中的任一种或其组合物;针对于肿瘤特异性裸DNA或mRNA及其重组体或其脂质体或纳米微粒的肿瘤特异性表达抗原中的任一种或其组合物;针对于肿瘤特异性单克隆或多克隆抗体或上述蛋黄多克隆抗癌抗体IgY或其脂质体或纳米微粒的抗独特型抗体Ab2α和Ab2β中的任一种或其组合物。
2、根据权利要求1所述的一种蛋黄抗癌抗体的制备方法,其特征还在于:上述蛋黄抗癌抗体的提取纯化方法是采用水稀释法、反复冻融法或硫酸铵、硫酸钠、PEG或辛酸沉淀或浸提、萃取、浓缩、膜过滤的的方法从上述禽类尤其是鸡蛋黄中提取纯化针对于上述肿瘤免疫原的多克隆抗癌抗体IgY或抗独特型抗体或肿瘤特异性表达抗原中的任一种或其组合物,然后将该纯化的蛋黄抗癌抗体添加相应辅料包括海藻糖而制备成药剂学上的任意剂型包括片剂、针剂、口服液和喷雾剂。其具体步骤包括:
a)取禽蛋尤其是鸡蛋去壳取黄,除去粘附于蛋黄膜上的蛋白组分,然后将蛋黄置于灭菌蒸馏水中,反复洗涤三次,进一步除去蛋黄膜上的蛋白组分,沥干后刺破蛋黄膜,收集蛋黄。
b)将上述收集蛋黄充分搅拌均匀后,加入蛋黄匀浆5倍体积的0.1mol/L PH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液,制成稀释蛋黄液。在该稀释蛋黄液中海藻糖的重量百分比是5-30%。
c)将上述稀释蛋黄液置于冰盒(-20℃)冰冻1-5小时,然后取出于室温复融并低速离心(500-1000r/min)后沥出收集上清液,然后再向沉淀物中加入2-5倍体积的0.1mol/L PH7.2磷酸盐-海藻糖稀释液,充分混匀溶解沉淀物,依上法再次冻融收集上清液,如此反复冻融3-5次,合并收集各次得到的上清液备用。
d)向上述收集上清液中按比例加入硫酸铵、硫酸钠、PEG、硫酸葡聚糖、藻酸钠或辛酸沉淀剂中的任一种或其复合物,离心收集其沉淀物,该沉淀物中即含有针对于上述肿瘤免疫原的多克隆抗癌抗体IgY或抗独特型抗体或肿瘤特异性表达抗原中的任一种或其组合物。
e)将上述沉淀物用蒸馏水复溶后透析或超滤浓缩或凝胶层析,进一步纯化针对于上述肿瘤免疫原的多克隆抗癌抗体IgY或抗独特型抗体或肿瘤特异性表达抗原中的任一种或其组合物。
f)向上述纯化的蛋黄抗癌抗体按比例添加相应辅料,将其制备成药剂学上的任意剂型包括片剂、针剂、口服液和喷雾剂。在此所述的辅料包括海藻糖。
3、根据权利要求1或2所述的一种蛋黄抗癌抗体的制备方法,其特征还在于:上述蛋黄抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α的修饰处理方法是偶联或共价结合放射性核素、药物和毒素制备免疫导向药物或生物导弹;是偶联或共价结合放射性核素、发光物质、胶体金或酶制备体内免疫诊断药剂和体外免疫诊断试剂包括免疫组化试剂;是向上述蛋黄抗癌抗体IgY中添加不完全佐剂制备肿瘤特异性免疫治疗剂;是向上述蛋黄抗癌抗体尤其是抗独特型抗体Ab2β或肿瘤特异性表达抗原中添加不完全佐剂及其他组分制备特异性肿瘤疫苗。其具体步骤包括:
a)蛋黄抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α的酶分解或偶联活性基团预修饰处理,其中酶分解是利用胃蛋白酶或无花果蛋白酶将蛋黄抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α分解再用二巯基苏糖醇或β-巯基乙醇还原为Fab′小片断,以使其具有更好的组织穿透力;或用相应的活化试剂将蛋黄抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α或其Fab′小片断上的氨基或羧基或巯基或醛基活化,然后再同各种不同的药物分子偶联。
b)偶联药物的预修饰处理包括将放射性核素、药物和毒素分子用相应的活化试剂,分别把含有羟基、氨基、醛基、肼基、巯基等基团的偶联药物活化,然后再使其与蛋黄抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α或其Fab′小片断发生共价结合。
c)蛋黄抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α或其Fab′小片断与已活化处理的偶联药物包括将放射性核素、药物和毒素分子共价结合而制备肿瘤特异性免疫导向药物或生物导弹。
d)将蛋黄抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α进行放射性核素、发光物质、胶体金或酶标记而制备其相应的标记物。
e)将蛋黄抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α的放射性核素、发光物质、胶体金或酶标记物中的任一种配合其他组分制备体内免疫诊断药剂和体外免疫诊断试剂(包括免疫组化试剂)。
f)向上述中蛋黄抗癌抗体IgY添加不完全佐剂及其他组分,然后再进行免疫注射,免疫机体产生针对于蛋黄抗癌抗体IgY的抗独特型抗体Ab2β,从而诱导机体产生抗肿瘤的特异性免疫应答。
g)向上述抗独特型抗体Ab2β、肿瘤特异性表达抗原中的任一种或其组合物中添加不完全佐剂及其他组分制备特异性肿瘤疫苗(包括抗独特型抗体疫苗和多肽疫苗)。
h)向禽类尤其是鸡注射肿瘤特异性单克隆或多克隆抗体尤其是注射蛋黄抗癌抗体中的抗癌抗体IgY,制备所述的抗独特型抗体Ab2β疫苗。
4、根据权利要求1-3所述的一种蛋黄抗癌抗体的制备方法,其特征还在于:将上述蛋黄抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α制备成脂质体微粒甚至是纳米微粒然后再偶联上述细胞毒性物质而制备免疫导向药物的方法;将上述抗独特型抗体Ab2β或肿瘤特异性表达抗原制备成脂质体微粒甚至是纳米微粒的特异性肿瘤疫苗的方法。
5、根据权利要求1-4所述的一种蛋黄抗癌抗体的制备方法,其特征还在于:将上述蛋黄抗癌抗体中的具有相同或相近作用的两种或两种以上组分同其他辅料按一定配比混合成组合物,使相应蛋黄抗癌抗体组分针对于肿瘤发挥协同作用。
6、一种蛋黄抗癌抗体的用途,其特征在于:上述蛋黄抗癌抗体中的任一种或任意组合的任意剂型单独或联合用于肿瘤的诊断、治疗和预防。
7、根据权利要求6所述的一种蛋黄抗癌抗体的用途,其特征还在于:上述蛋黄抗癌抗体中的多克隆抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α或其荧光、发光、酶、金属标记物中的任一种用于配制体外用免疫诊断试剂;上述蛋黄抗癌抗体中的多克隆抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α或其脂质体甚至纳米微粒的放射性核素标记物用于配制体内免疫导向诊断试剂。上述所述的免疫诊断试剂包括免疫组化试剂。
8、根据权利要求6所述的一种蛋黄抗癌抗体的用途,其特征还在于:上述蛋黄抗癌抗体中的多克隆抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α或其脂质体甚至纳米微粒用于制备治疗性免疫制剂;上述蛋黄抗癌抗体中的多克隆抗癌抗体IgY或抗独特型抗体Ab2α或其脂质体甚至纳米微粒与放射性核素、药物和毒素的偶联物用于制备免疫导向药物或生物导弹。
9、根据权利要求6所述的一种蛋黄抗癌抗体的用途,其特征还在于:上述蛋黄抗癌抗体中的抗癌抗体IgY用于制备肿瘤免疫治疗剂;上述蛋黄抗癌抗体中的肿瘤特异性表达抗原用于制备肿瘤多肽疫苗;上述蛋黄抗癌抗体中的抗独特型抗体Ab2β用于制备肿瘤抗独特型抗体疫苗。
10、根据权利要求6所述的一种蛋黄抗癌抗体的用途,其特征还在于:上述蛋黄抗癌抗体中的多克隆抗癌抗体IgY、肿瘤特异性表达抗原、抗独特型抗体Ab2α、Ab2β的任一种或其组合物用于制备预防肿瘤的食品、饮料和保健品。
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