JP2010501596A - 抗体含有組成物を用いた非感染性の病状の処置および/または予防 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、抗体含有組成物を用いた、好ましくは局所的適用による非感染性の病状の処置および/または予防に関する。特別な実施形態において、本発明は、抗体含有乳生成物およびまたは卵生成物を、好ましくは局所的適用により投与する工程を含む、癌または非癌疾患もしくは過剰増殖性疾患の処置および/または予防方法に関する。
多くの重篤な病状の処置は、ほぼ例外なく全身的に行なわれる。しかしながら、非全身的な(例えば、局所的)処置がより適当であり得る、ある種の病状があり、例えば、限定されないが、皮膚、胃腸(GI)管(例えば、口腔咽頭)、目、耳、鼻咽頭、膀胱、膣および頚部を冒すものなどの状態が挙げられる。
る人は平均的な人よりも125倍、食道癌を発症しやすい。
チドは、哺乳動物由来の分子(例えば限定されないが、哺乳動物細胞(限定されないが、癌細胞など)の表面上に見られる分子)に対する免疫応答を惹起し得る。
本発明は、生物学的に活性な薬剤の非全身性投与により非感染性の病状の処置および/または予防方法を提供しようとするものである。例えば、抗癌剤を直接癌に適用することは、全身的処置を施すことよりも簡便であり得る。GIの状態および癌の場合、GI管腔
を介した生物学的に活性な薬剤の投与は、全身的処置を施すことよりも簡便であり得る。GI癌では、例えば、生物学的に活性な分子は、GI管内層部の任意の異常細胞を特異的に標的化し、その増殖を抑制するものであるのがよい。
起こす存在体は、一般的に、組み込まれた存在体であって、他の細胞に侵入することができないものである。
05〜2.0g(乾燥重量)抗体/キログラム体重/日の式を用いて算出され得る。この式を用いると、乳児には0.2〜5g(乾燥重量)抗体/日が投与され得、成人には、0.5〜15g(乾燥重量)抗体/日が投与され得る。
であり得る。
法に有用な標的分子が提供され得る。例えば、MUC18(Mel−CAMまたはCD146としても知られる)は、乾癬ならびに一部の癌と多少の関連性を示し、そのため潜在標的が提供される。同様に、他の過剰増殖性疾患も、本発明の方法において使用され得る特異的抗原を有する。
例えば、かかるモニタリングは、患者試料の反復採取、ならびに患者を疾患の存在および/または進行についてモニタリングする方法としてのEphB4発現の測定を伴い得る。本発明はまた、このような方法を行なうためのキットであって、EphB4タンパク質の発現を検出するための抗EphB4抗体および/またはEphB4 mRNAの発現を検出するためのPCRプライマーを含むキットを提供する。本発明で想定されるかかるキットの1つは、試料中のEphB4タンパク質レベルの定量的または定性的な測定または比較が可能であり得るELISA系キットである。EphB4タンパク質の発現の検出には、当業者により種々の免疫学的アッセイが容易に使用され得る。いくつかの企業から、食道試料中のEphB4を特異的に検出するために使用され得る抗体が販売されている。EphB4レベルの測定を行なうためのこのような方法としては、限定されないが、EphB4の存在または非存在を確認するのに使用されるウエスタンブロットの免疫組織化学検査および濃度測定が挙げられ得る。当業者には、限定されないがELISAおよびリアルタイムRT−PCRなどの代替法が認識され、使用することができよう。後に示す実施例では、EphB4発現の検出にPCRの使用を示す。当業者は、標準的な手法を用い、EphB4発現の検出に適したプライマーを容易に調製することができよう。
のアプローチの利点は、必要なのは分子のEph結合領域の作製だけであることである。精製したら、エフリンまたはエフリン断片を支持体上に固定化すると、標準的な手順による細胞溶解物からのEphB4のアフィニティ精製が可能となり得る。
本発明のさらなる形態において、免疫原性ペプチドは、タンパク質のドメイン、例えば、タンパク質の細胞外ドメインであり得る。本発明の特定のある形態において、免疫原性ペプチドの長さ、組成およびコンホメーションは、哺乳動物または鳥と抗体含有乳生成物または卵生成物が投与される患者との間に見られる天然タンパク質の配列相同性の程度によって決定され得る。
1.局所的に適用されるポリクローナル抗体含有乳生成物または卵生成物による局所的処置は、全身的に適用されるモノクローナル抗体と比べて、コストと安全性の両方の利点を有すること;および
2.本発明により、生成が非常に高価であることが示されていた抗体含有乳生成物または卵生成物に伴う問題が解決されることが挙げられる。全身的処置レジメンにおける使用のためのモノクローナル抗体の作製は、抗体含有乳生成物または卵生成物の作製と比較すると非常に高価である。さらに、本発明の方法では、乳生成物または卵生成物をもたらす多数の動物のうちの1種類が使用され得、それにより任意の潜在的抗原に対する高度に特異的で活性な抗体が生成される機会が有意に良好となり得る。
ェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニンのD−異性体が挙げられる。
・抗体含有乳生成物または卵生成物の飲用。その結果、これがGI管内を通過し、それにより、乳生成物または卵生成物中の抗体が、通過中に標的抗原/分子に結合する。このアプローチに適した組成物は、
1)保護化合物およびまたは
2)併用制酸療法剤およびまたは
3)経時的に少しずつ摂取される粘性組成物
を含み得ることが想定され、これにより、乳生成物または卵生成物中の抗体が、GI管内(特に、食道内)での消化過程で生存すること、あるいはGI管内に長期間残留して抗体と標的分子との接触時間を延長させることが補助される。
・抗体含有乳生成物または卵生成物の食道または腸(大腸もしくは小腸)への直接導入。これは、抗体含有乳生成物または卵生成物を、チューブを介してGI管の必要とされる部分内に注入もしくはポンプ輸送することにより、または処置が必要とされる領域上にポンプ/チューブセットを介して直接噴霧することによりなされ得る、
が挙げられ、
・食道の状態の処置では、抗体含有乳生成物または卵生成物が胃に入るのが速くなりすぎるのを抑制するために、胃の付近に設置されるバルーンが使用され得、任意選択で、抗体含有乳生成物または(ore)卵生成物が逆流するのを抑制するために、食道上部に設置されるさらなるバルーンが使用され得ることが想定される。このようにして、罹患領域またはリスク領域の長期処置が、大量でない抗体含有乳生成物または卵生成物により達成され得る。
・結腸の状態の処置では、抗体含有乳生成物を注腸剤の形態で、または結腸灌注によって、または固形もしくは半固形形態で坐剤として結腸内に直接導入することが可能である。
健常ドナーおよび食道腺癌患者由来の試料を、常套的な内視鏡検査中の生検時、または食道切除術後に残留した過剰組織から収集した。患者由来の対照組織を、腫瘍縁部から2〜5cm近位の正常な扁平上皮の内視鏡で明視化される領域から採取した。組織を直ちに、RNA Later(商標)またはRNA Later Ice(商標)中に保存した。RNA抽出に使用した同組織の小切片を、組織病理学者が、正常扁平上皮(N)、またはバレット上皮(腸上皮化生、IM)、または腺癌(腫瘍、T)と確認した。
GreenリアルタイムPCRミックスならびに各々200nMのフォワードおよびリバースプライマーを含有)に使用した。PCR反応は、Corbett Rotorgene(商標)リアルタイムPCR装置(モデル3000または6000)で行なった。遺伝子特異的PCRシグナルを、β−アクチンを用いて標準化した。自由裁量で1に設定した結腸腺癌細胞株HT29に対するEphおよびエフリンの定量を報告する。
上記の実施例1に概要を示した方法を使用し、Het1AおよびOE33細胞株におけるEphB4 mRNAの発現を調べた。Het−1A細胞は、正常食道上皮由来のものであり、OE33は、食道腺癌上皮由来のものである。Het−1Aの4つの培養物とOE−33の3つの培養物を調べた。図3に示した結果は、EphB4発現が、本質的に正常なHet1A細胞株よりも腺癌由来細胞株(OE33)において有意に高いことを示す。
いくつかの手順を使用して、好適に純粋なEphB4抗原が得られ得る。1方法では、純粋なエフリンB1(またはB2)リガンドが使用され、(エフリン−B1、B2を)適当なクロマトグラフィーマトリックスに共有結合させ、これを粗製(結腸腫瘍)細胞抽出物からのEphB4受容体のアフィニティ精製に使用することによりEphB4受容体を精製する。別の方法では、EphB4受容体は、適当なクロマトグラフィーマトリックスに共有結合させた特異的ポリクローナル抗EphB4抗体を使用するイムノアフィニティ精製法を用いて精製される。また別の方法では、EphB4は組換え手法により、公開された手順に従って生成される。
ペプシン、パパインおよびブロメリンが挙げられる。タンパク質分解酵素によるEphB4受容体の加水分解によって、分子の細胞内部分および細胞外部分の両方に由来する種々のペプチドが得られる。これらのペプチドを精製すると、個々のEphB4ペプチドが得られる。サイズ排除クロマトグラフィーはペプチドを大きさの違いだけに基づいて分離するため、同じ大きさを有する種々のペプチドが同じ画分中に溶出される。しかしながら、これらのペプチドが良好な抗原であることがわかっている場合は、これらは、イオン交換(または他の)クロマトグラフィーによってさらに分離され得る。
どのEphB4ペプチド断片が、抗原として使用したとき、高親和性EphB4抗体を生成するのかを確立することは必要である。このことを達成するため、いくつかのウサギ(例えば)を上記のペプチドで免疫処置し、得られた抗血清を、ヒト結腸癌細胞株を用いたインビトロ細胞培養アッセイにおいて試験することができる。
が同定され得る。次いで、このようなペプチドを免疫原(ワクチン接種用抗原)として使用すると、抗EphB4抗体含有乳生成物が生成される。
本発明の方法における使用のためのペプチドの合成は、当業者に公知の標準的な方法によって行なわれ得る。実際には、アミノ酸残基は、固定化されたアミノ酸に、自動化プロセスによって連続的に付加される。アミノ酸が付加されたら、次いで、それは次のアミノ酸残基を受け入れるために脱保護される。アミノ酸残基は、反応1工程ごとに残基が1つだけ付加されること、および該アミノ酸残基の側鎖が反応を受けないことが確実となるように保護される。ペプチドの合成は、一般的に、以下のプロセスに従って行なわれ得る。
gのKLH−MB(これは、PBS中で予め平衡化させたSephadex G−25カラムを用いて遊離MBSを除去することにより得られる)を、0.1Mリン酸ナトリウムバッファー(pH7.0)中に溶解した1mgのペプチドと混合する。これを、撹拌しながら室温で3時間反応させる。反応後、生成物をPBSで透析すると、免疫原として使用され得る。
胃内環境における抗体活性の保護剤としてのウシ初乳の保護効果を調べるため、模擬胃液を、特異的モノクローナル抗体で試験した。活性を、ウシ初乳の存在下と非存在下で比較した。
ある患者が、未知の食道の状態を示している。食道の生検材料を採取し、EphB4の発現レベルを調べると、周囲の正常食道組織よりも高いことがわかる。患者はバレット食道であると結論づけられる。患者に、EphB4に指向される抗体を含有する乳生成物の日用量を(経口)投与する。この乳生成物の継続投与は治療効果を有し、患者のバレット食道の症状は緩和される。
潜在標的分子とそのエピトープが同定されたら、10匹までの雌のニワトリ成鳥を免疫処置するのに充分な量の抗原を調製する。ペプチドの量は当業者に公知であり、最小限の実験で容易に最適化され得る。
以前に、特異的細菌抗原で超免疫化した雌の鳥類が産む卵の中の抗体またはその画分は、腸管内で生存し、活性なままであることが示された。したがって、実施例5のように、ある患者がバレット食道を示している場合、患者には、EphB4に指向される抗体を含有する卵生成物の日用量を(経口)投与してもよい。卵生成物は、1日あたりの「卵酒(
egg flip)」の形態であり得る。卵酒は、成分として噴霧乾燥卵黄を用いて作製され得る。次いで、卵生成物を継続投与すると治療効果を有し、患者のバレット食道の症状が緩和される。かかるプロトコルは、GI管の癌の処置および/または予防にも使用され得る。
Claims (56)
- 哺乳動物または鳥にワクチン接種することを含む、非感染性の病状の予防および/または処置における使用のための抗体含有乳生成物または卵生成物の調製方法。
- 哺乳動物が、ウシ、ヒツジ、ブタおよびヤギからなる群より選択され、鳥が、ニワトリおよびアヒルからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 非感染性の病状が、癌、非癌性状態または過剰増殖性状態である、請求項1または2に記載の方法。
- 癌が、皮膚癌、目の癌、膀胱癌、膣または頚部の癌、口腔咽頭癌、鼻咽頭癌および胃腸の癌からなる群より選択される、請求項3に記載の方法。
- 胃腸の癌が、肛門癌、胆管癌、結腸直腸(結腸および/または直腸の)癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、肝臓癌(ヘパトーマ)、膵臓癌および小腸の癌からなる群より選択される、請求項4に記載の方法。
- 非癌性状態が、バレット食道、結腸直腸ポリープおよび結腸直腸ポリープ切除術後からなる群より選択される、請求項3に記載の方法。
- 過剰増殖性状態が乾癬である、請求項3に記載の方法。
- ワクチン接種する工程が、免疫原性のタンパク質またはペプチドを哺乳動物または鳥に投与することを伴い、該免疫原性のタンパク質またはペプチドが、哺乳動物由来の免疫原性分子に対する免疫応答を惹起できるものである、請求項1〜7いずれか1項に記載の方法。
- 哺乳動物由来の免疫原性分子が、哺乳動物細胞の表面上または哺乳動物細胞内に見られる分子である、請求項8に記載の方法。
- 哺乳動物細胞の表面上の分子が、EphB1、EphB2、EphB4、EfnA1およびEfnB2からなる群より選択される、請求項9に記載の方法。
- 該分子がEphB4であり、該免疫原性のペプチドがPVAGSCVVDAVPAPGPSPSLY(配列番号:4)である、請求項10に記載の方法。
- 請求項1〜11いずれか1項に記載の方法によって生成される抗体含有乳生成物または卵生成物。
- 請求項12に記載の抗体含有乳生成物または卵生成物を含む非感染性の病状の予防および/または処置における使用のための組成物であって、食品、スペシャルティ栄養食品または医薬の形態である組成物。
- 10〜60en%の脂質、5〜50en%のタンパク質および15〜90en%の炭水化物を含む、請求項11に記載の組成物。
- 抗体含有乳生成物または卵生成物を含む、非感染性の病状の予防および/または処置における使用のための医薬組成物。
- 抗体含有乳生成物または卵生成物が、哺乳動物または鳥に免疫原性のタンパク質またはペプチドをワクチン接種することにより得られ、該免疫原性のタンパク質またはペプチドが、哺乳動物由来の免疫原性分子に対する免疫応答を惹起できるものである、請求項15に記載の医薬組成物。
- 哺乳動物由来の免疫原性分子が、哺乳動物細胞の表面上または哺乳動物細胞内に見られる分子である、請求項16に記載の医薬組成物。
- 哺乳動物細胞の表面上の分子が、EphB1、EphB2、EphB4、EfnA1およびEfnB2からなる群より選択される、請求項17に記載の医薬組成物。
- 該分子がEphB4であり、該免疫原性のペプチドがPVAGSCVVDAVPAPGPSPSLY(配列番号:4)である、請求項17に記載の医薬組成物。
- 非感染性の病状の予防および/または処置のための医薬の製造のための抗体含有乳生成物または卵生成物の使用。
- 非感染性の病状の予防および/または処置のための医薬の製造のための請求項12に記載の抗体含有乳生成物または卵生成物の使用。
- 非感染性の病状が、癌、非癌性状態または過剰増殖性状態である、請求項20または21に記載の使用。
- 癌が、皮膚癌、目の癌、膀胱癌、膣または頚部の癌、口腔咽頭癌、鼻咽頭癌および胃腸の癌からなる群より選択される、請求項22に記載の使用。
- 胃腸の癌が、肛門癌、胆管癌、結腸直腸の(結腸および/または直腸の)癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、肝臓癌(ヘパトーマ)、膵臓癌および小腸の癌からなる群より選択される、請求項23に記載の使用。
- 非癌性状態が、バレット食道、結腸直腸ポリープおよび結腸直腸ポリープ切除術後からなる群より選択される、請求項22に記載の使用。
- 過剰増殖性状態が乾癬である、請求項22に記載の使用。
- 医薬が、0.05グラムの免疫グロブリン/kg体重〜2グラムの免疫グロブリン/kg体重/日の投与のために製剤化される、請求項20〜26いずれか1項に記載の使用。
- 患者に請求項13〜19いずれか1項に記載の組成物を非全身性投与する工程を含む、患者の非感染性の病状の予防および/または処置方法。
- 非感染性の病状が、癌、非癌性状態または過剰増殖性状態である、請求項28に記載の方法。
- 癌が、皮膚癌、目の癌、膀胱癌、膣または頚部の癌、口腔咽頭癌、鼻咽頭癌および胃腸の癌からなる群より選択される、請求項29に記載の方法。
- 胃腸の癌が、肛門癌、胆管癌、結腸直腸の(結腸および/または直腸の)癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、肝臓癌(ヘパトーマ)、膵臓癌および小腸の癌からなる群より選択される、請求項30に記載の方法。
- 非癌性状態が、バレット食道、結腸直腸ポリープおよび結腸直腸ポリープ切除術後からなる群より選択される、請求項29に記載の方法。
- 過剰増殖性状態が乾癬である、請求項29に記載の方法。
- 投与する工程が、該抗体含有乳生成物または卵生成物を直接、被験体の胃腸管内に導入することを伴う、請求項28〜33いずれか1項に記載の方法。
- 抗体含有乳生成物または卵生成物が経口投与される、請求項34に記載の方法。
- 抗体含有乳生成物または卵生成物が食品として投与される、請求項34または35に記載の方法。
- 抗体含有乳生成物または卵生成物が経直腸投与される、請求項35に記載の方法。
- 癌が皮膚癌である、請求項29に記載の方法。
- 抗体含有乳生成物または卵生成物が癌に局所的に適用される、請求項38に記載の方法。
- 抗体含有乳生成物または卵生成物が、1日あたり0.05〜2グラムの免疫グロブリン/kg体重が投与されるように投与される、請求項28〜39いずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜11いずれか1項に記載の方法に従って生成される抗体含有乳生成物または卵生成物、および/または、請求項12に記載の抗体含有乳生成物または卵生成物、および/または請求項13〜19いずれか1項に記載の組成物のいずれか1種以上を含む、患者の非感染性の病状の診断、処置および/または予防における使用のためのキット。
- 非感染性の病状が、癌、非癌性状態または過剰増殖性状態である、請求項41に記載のキット。
- 癌が、皮膚癌、目の癌、膀胱癌、膣または頚部の癌、口腔咽頭癌、鼻咽頭癌および胃腸の癌からなる群より選択される、請求項42に記載のキット。
- 胃腸の癌が、肛門癌、胆管癌、結腸直腸の(結腸および/または直腸の)癌、食道癌、胆嚢癌、胃癌、肝臓癌(ヘパトーマ)、膵臓癌および小腸の癌からなる群より選択される、請求項43に記載のキット。
- 非癌性状態が、バレット食道、結腸直腸ポリープおよび結腸直腸ポリープ切除術後からなる群より選択される、請求項42に記載のキット。
- 過剰増殖性状態が乾癬である、請求項42に記載のキット。
- 患者に抗EphB4抗体を投与することを含む、患者の食道の状態の処置および/または予防方法。
- 食道の状態が、バレット食道および食道癌からなる群より選択される、請求項47に記載の方法。
- 抗EphB4抗体が、配列PVAGSCVVDAVPAPGPSPSLY(配列番号:4)を有するペプチドに対して生成されたものである、請求項47または48に記載の方法。
- 抗体が非全身性様式で投与される、請求項47〜49いずれか1項に記載の方法。
- 食道の状態の処置および/または予防のための医薬の調製における抗EphB4抗体の使用。
- 食道の状態が、バレット食道および食道癌からなる群より選択される、請求項51に記載の使用。
- 医薬が非全身性投与用に製剤化される、請求項51または52に記載の使用。
- 患者由来の食道細胞の試料を準備すること、およびEphB4発現を調べることを含み、ここで、正常食道試料と比べたEphB4発現増大の検出は食道の状態の存在を示す、食道の状態の診断方法。
- 食道の状態が、バレット食道および食道癌からなる群より選択される、請求項54に記載の方法。
- EphB4タンパク質の発現を検出するための抗EphB4抗体および/またはEphB4 mRNAの発現を検出するためのPCRプライマーを含む、請求項54に記載の方法を行なうためのキット。
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