EA024697B1 - Применение композиции, содержащей обогащенный анти-lps-антителами иммуноглобулиновый препарат, для лечения заболеваний печени - Google Patents

Применение композиции, содержащей обогащенный анти-lps-антителами иммуноглобулиновый препарат, для лечения заболеваний печени Download PDF

Info

Publication number
EA024697B1
EA024697B1 EA201171304A EA201171304A EA024697B1 EA 024697 B1 EA024697 B1 EA 024697B1 EA 201171304 A EA201171304 A EA 201171304A EA 201171304 A EA201171304 A EA 201171304A EA 024697 B1 EA024697 B1 EA 024697B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
cells
colostrum
liver
antibodies
composition
Prior art date
Application number
EA201171304A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201171304A1 (ru
Inventor
Ярон Илан
Гади Лалазар
Томер Адар
Меир Мизрахи
Ами Бен-Я'аков
Original Assignee
Иммурон Лимитед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Иммурон Лимитед filed Critical Иммурон Лимитед
Publication of EA201171304A1 publication Critical patent/EA201171304A1/ru
Publication of EA024697B1 publication Critical patent/EA024697B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39508—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum from milk, i.e. lactoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39583—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials not provided for elsewhere, e.g. haptens, coenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/04—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from milk
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1228—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K16/1232—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia from Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/12—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production isolated from milk

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)

Abstract

Изобретение относится к применению композиции, содержащей обогащенный анти-LPS-антителами иммуноглобулиновый препарат, полученный из молозива, для лечения индивида, страдающего заболеванием печени, выбранным из хронического гепатита C, неалкогольного стеатогепатита (NASH), жировой дистрофии печени или гепатоэнцефалопатии.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к применению препаратов, обогащенных анти-ЬР§-антителами, таких как препараты, полученные из молозива млекопитающих или яиц птиц, и необязательно дополнительно обогащенных антителами против антигенов, связанных с заболеванием, молозивом, компонентом(и) молока или молочных продуктов и любыми адъювантами, для лечения, подавления или профилактики прогрессирования патологического расстройства, такого как хроническое заболевание печени, цирроз и любое осложнение или расстройство, связанное с ними. Изобретение, кроме того, относится к комбинированным композициям, содержащим комбинацию обогащенных анти-ЬР§-антителами препаратов и антител, распознающих по меньшей мере один антиген, специфичный для патологического расстройства, и к его применению для лечения связанных с иммунной системой расстройств.
Уровень техники
Все публикации, упомянутые в данной заявке, в полном объеме включены в данный документ для сведения, включая все источники, цитированные в них.
Хронический гепатит представляет собой воспаление печени, которое продолжается, по меньшей мере, в течение 6 месяцев. Хронический гепатит хотя и существенно менее распространен, чем острый гепатит, может протекать годами, даже десятилетиями. У большинства людей он протекает в умеренно выраженной форме и не вызывает значительного повреждения печени. Однако, у некоторых индивидов продолжающееся воспаление медленно разрушает печень, приводя в конечном итоге к циррозу (образование рубцовой ткани в печени), печеночной недостаточности и иногда раку печени. Хронический гепатит обычно вызывается вирусом гепатита В (ИВУ), вирусом гепатита С (НСУ) и лекарственными препаратами.
Хроническая инфекция, вызванная вирусом гепатита С (НСУ), характеризуется неспособностью хозяина продуцировать сильный иммунный ответ. В то же время хроническая инфекция НСУ связана с устойчивыми, патологически высокими уровнями активации иммунной системы. Такая активация вносит свой вклад в повреждение печени и прогрессирование заболевания. У пациентов с хронической НСУ инфекцией наблюдается различное течение заболевания: у одних индивидов развивается цирроз, в то время как у других отсутствуют признаки прогрессирования заболевания печени.
Несколько факторов риска, включая сопутствующее потребление алкоголя, связано с ускоренным повреждением печени и прогрессированием цирроза. Было установлено, что у пациентов с хроническим НСУ и употреблением алкоголя имеет место быстрое прогрессирование заболевания печени. Это связано с повышенными уровнями ЬР§ [Вебодт О., Ат. ί. СаЦгосШсгок. 103(9):2248-2253 (2008)]. Интересно отметить, что недавно проведенное исследование показало, что неструктурный белок НСУ Ν85Α активирует То11-подобный рецептор (ТЬК) 4, который также активируется ЬР§ [МасЫба К. е! а1. , Ргос. ΝαΙΙ. Асаб. 8с1. И8А, 106(5):1548-1553 (2009)].
ЬР8 может быть не только связан с прогрессированием заболевания печени, но он также способствует поддержанию хронической инфекции. При сравнении с пациентами, у которых наблюдается самоограничивающаяся инфекция, моноциты пациентов с хроническим НСУ продуцируют значительно больше 1Б-10 и ΤΝΡ-альфа в ответ на основной белок или ЬР§ НСУ [Магбп-В1опбе1 О. е! а1., I. Уиа1. Нера005 (Магсй 11, 2009)]. Таким образом, несмотря на то что транслокация продуктов микроорганизмов в кишечнике, активация иммунной системы и прогрессирование заболевания печени тесно связаны, доказательство причинной связи отсутствует. Кроме того, оказалось, что имеется взаимосвязь между уровнем ЬР§ и клиренсом вируса, хотя это нуждается в дополнительном выяснении. Таким образом, необходимы исследования для выяснения этих взаимодействий. Если транслокация микроорганизмов регулируется активацией иммунной системы и прогрессированием заболевания печени, то стратегии, которые снижают или предупреждают транслокацию микроорганизмов, следовательно, могут оказывать большое влияние на активацию иммунной системы и, таким образом, на естественное течение хронической НСУ инфекции.
Спонтанный бактериальный перитонит (§ВР) представляет распространенное и тяжелое осложнение хронических заболеваний печени, таких как цирроз печени, портальная гипертензия и асцит. §ВР имеет место у 30% пациентов, и по его причине внутригоспитальная смертность больных доходит до 25%. Бактериальная транслокация в застойную и иммуноослабленную перитонеальную жидкость рассматривается в качестве основного патогенного механизма 8ВР. Несмотря на то что парацентез и лечение антибиотиками широкого спектра действия являются эффективным лечением острой инфекции, у многих пациентов возникает рецидив §ВР, вызванный патогенами, которые становятся резистентными к лечению антибиотиками [8оп§ К.Н. е! а1., ВМС 1п1ес1. Όίδ., 9(1):41 (2009)]. Способы профилактики §ВР с длительным применением антибиотиков являются спорными и его связывают с развитием штаммов, резистентных к антибиотикам [Сойеп М.Е е! а1., СосЬгапе Эа!аЪа8е §у8!. Кеу. 2:С’ЭО04791 (2009)].
Недавно была установлена возрастающая связь между бактериальной транслокацией и частотой осложнений в результате цирроза. Уровень бактериальных продуктов (рибосомальной 168 РНК) в сыворотке крови или эндотоксемия (ЬР§ или ЬВР) коррелируют с частотой кровотечения из варикознорасширенных вен, гепаторенального синдрома и гипердинамического состояния кровообращения у больных с циррозом |Е1-№щдаг М.М. е! а1., I. Меб. М1сгоЪю1., 57(Р! 12):1533-38 (2008)].
- 1 024697
В течение десятилетий предпринимались различные попытки повысить секрецию иммуногенспецифических антител молочной железой сельскохозяйственных животных. Такие попытки были направлены на продукцию больших количеств иммуноген-специфических антител с молоком. Однако, концентрация антител в зрелом молоке остается низкой (примерно на порядок) по сравнению с их уровнем, имеющимся в молозиве.
Молозиво (также известное, как первое молоко) является формой молока, продуцируемой молочными железами на поздней стадии беременности и в первые дни после родов. В женском молозиве содержится большое количество питательных веществ и антител, но оно продуцируется в небольшом количестве. Молозиво богато углеводами, белком, минеральными солями, витаминами и иммуноглобулином. Оно также содержит различные плавающие клетки, такие как железистые и стромальные клетки, нейтрофилы, моноциты/макрофаги и лимфоциты, и оно включает ростовые факторы, гормоны и цитокины.
Лейкоциты также присутствуют в молозиве в больших количествах; они способствуют защите от вирусов и бактерий. Лейкоциты молозива усиливают пассивный иммунитет новорожденного теленка, особенно в отношении антител и иммуноглобулинов, относящихся к классам, которые важны для кишечного иммунитета.
Большое количество секреторных антител, обнаруживаемых в молозиве, помогает защищать слизистые горла, легких и кишечника новорожденных. Коровье молозиво (ВС) содержит три основных класса иммуноглобулинов: 1дС. 1дМ и 1дА.
Как уже указывалось выше, молозиво является, по существу, уникальным продуктом, который продуцируется в определенном физиологическом и функциональном состоянии молочной железы. У жвачных принципиальным различием в составе молозива и зрелого молока является очень высокое содержание биологически активных компонентов, таких как лактоферрин и иммуноглобулины [ТатЬе11 Κ.ν. с1 а1., 1. Ехр. Мей., 199:1467-1677 (2004); В1ие81опе ТА. апй Тапд р.1. Аи1о1ттии., 24:55-62 (2005); РиФат А.1. е1 а1., 1. Аи1о1ттии., 24:55-62 (2005)], из которых 1дО составляет 80-90%.
Иммунизация животного, такого как корова, специфическими антигенами способствует продукции и получению специфических антител, которые можно использовать для модуляции иммунного ответа и, тем самым, для лечения связанных с иммунной системой расстройств. Следовательно, этот способ служит в качестве простого и безопасного средства для получения антиген-специфических антител и иммунных адъювантов.
В нескольких предшествующих патентах и заявках на патент, авторами которых являются некоторые из заявителей настоящего изобретения, описано применение антител, специфических к бактериальным патогенам, полученным из коровьего молозива для пассивного лечения инфекционных заболеваний. Например, в международной заявке \УО 04/078209, авторами которой являются некоторые из заявителей настоящего изобретения, описаны соединения и композиции для лечения или профилактики желудочнокишечных расстройств, полученных иммунизацией животного-хозяина вакциной, содержащей один или более антигенов клеточной стенки кишечных бактерий, в частности грамотрицательных бактерий. Продуцируемый гипериммунный материал находится в виде таблеток для перорального введения. В международной заявке \УО 03/097094 описано применение гипериммунного молозива в получении антител (целых 1дО) или Р(аЬ')2-фрагментов, конъюгированных с молозивом и экстрактом молозива млекопитающих, для интраназального введения с целью предупреждения симптомов, развивающихся в результате присутствия переносимых воздушным путем патогенных бактерий.
Мукозальная толерантность рассматривается в качестве привлекательного подхода для лечения аутоиммунных и воспалительных заболеваний за счет отсутствия токсичности, простоты введения и антиген-специфического механизма действия [^еткЬФ В.К. апй РитиФ О.Т., 1. А11егду С1ш. 1ттипо1., 121:8380-3; ςφζ 8415 (2008); Рапа А.М. апй Аешег Н.Ь., С1Ф. Ое\. 1ттипо1., 13:143-157 (2006)]. Так, были сделаны усиленные попытки в получении стабильных полученных из молозива продуктов, подходящих для перорального и интраназального введения. Например, в международной заявке \УО 95/08562, авторами которой являются некоторые из заявителей настоящего изобретения, описан способ получения иммуноглобулинов высокой чистоты из богатого антителами молозива и прессования данных антител молозива в таблетку без существенной потери активности. Специфические антитела можно получить иммунизацией млекопитающего специфическими антигенами против энтеротоксических бактерий, таких как Е. сой, 8а1топе11а и 8Ыде11а. В международной заявке \УО 06/053383, авторами которой являются некоторые из заявителей настоящего изобретения, описывается карбоновая кислота и подщелачивающие группы, которые придают биологически активной композиции гипериммунного молозива, лактоферрину или лактоферрацину стабильность в условиях желудка с различным рН. Наконец, в международной заявке XVО 03/080082, авторами которой являются некоторые из заявителей настоящего изобретения, описан способ повышения сохранности лабильных биологически активных соединений, предпочтительно иммуноглобулинов или их фрагментов, или ферментов, в среде желудка, включающий смешивание биологически активного вещества, молозива и экстракта молозива млекопитающих. Такая конъюгация защищает антитела или фрагменты антител от протеолиза, катализируемого ферментами, или в среде с низким рН и сохраняет их функцию в желудке или рубце, или другой среде хозяина.
- 2 024697
Слизистая кишечника представляет крупный лимфоидный орган организма. Он играет двойную роль, заключающуюся во всасывании питательных веществ, одновременно с поддержанием физического и иммунологического барьера для содержимого кишечника. Несмотря на постоянную стимуляцию антигенами подавления воспаления является нормой. Имеется два основных принципа лечения вирусного заболевания и его осложнений с использованием молозива: мукозальная транслокация микроорганизмов и повышенная иммунная регуляция при пероральном поступлении болезнетворных антигенов, называемая оральной толерантностью.
Повышенная мукозальная транслокация микроорганизмов - это основная концепция в патогенезе заболеваний. Более высокая степень транслокации микроорганизмов, количественно оцениваемая по присутствии ЬР§ и бактериальной ДНК, является важной для состояния хронической активации иммунной системы, которая приводит к истощению иммунной системы и нарушению аутоиммунитета.
Стимуляция через слизистую кишечника вызывает толерогенный иммунный ответ. Данное свойство можно использовать преимущественно для индукции толерантности к аутоантигенам и тем самым подавлять аутоиммунитет. Действительно было показано, что оральная толерантность эффективно снижает иммунный ответ на вводимые через рот антигены на моделях различных заболеваний |§аГаЙ1 К. е! а1., Ат. 1. СавйоеШегок, 98 (11): 2505-15 (2003)].
Ранее было показано, что препараты, полученные из коровьего молозива, можно использовать для лечения опосредованных токсинами кишечных заболеваний. В испытании, проведенном на 10 добровольцах, которых перорально заражали концентратом энтеротоксигенных Е. соП. введение концентрата коровьих антител, полученных иммунизацией коров соответствующими штаммами Е. сой, предупреждало развитие диареи у всех 10 участников испытаний, получавших продукт; в противоположность у 9 из 10 индивидов в контрольной группе развилась диарея [Таске! С.О. е1 а1., N. Епд1. 1. Мей, 318 (19):1240-3 (1988)]. В другом эксперименте введение полученных из молока антител против фактора колонизации энтеротоксигенных Е. сой предупреждало диарею у 14 из 15 индивидов по сравнению с 7 из 10 индивидами, которым давали плацебо [Ртеейтап И.1 е! а1., 1. 1п£есй Όίδ., 177(3):662-7 (1998)].
Еще одним заболеванием с аналогичным патогенезом является псевдомембранозный колит. Результаты эксперимента, проведенного с целью оценки влияния белка иммунной сыворотки, полученной иммунизацией коров инактивированными токсинами и цельными клетками убитых С. йШтсйе, свидетельствовали о предупреждении рецидива заболевания, вызванного С. йтЕйсйе. У всех 16 пациентов, получавших продукт после обычного лечения по поводу подтвержденного эпизода колик, вызванных С. йИПсйе, в течение двух недель, за исключением одного пациента, С. йКПсйе исчезали из кала, и не было рецидива заболевания до завершающего визита через 333 суток [уап И1е88е1 1.Т. е! а1., 1. Мей. МютоЫок, 54 (2): 197-205 (2005)].
В совокупности на основании этих установленных фактов можно предположить, что полученные из коровьего молозива препараты доставляют специфические антитела в биологически активных концентрациях в просвет кишечника при пероральном введении и способны блокировать различные формы бактериальных токсинов в пищеварительном тракте посредством данного механизма.
Поскольку транслокация микроорганизмов регулирует иммунную активацию и прогрессирование заболевания печени, то стратегии, направленные на снижение или предупреждение транслокации микроорганизмов, могут оказывать существенное влияние на иммунную активацию и, таким образом, естественное течение хронической НСУ инфекции. В настоящее время данное изобретение показало, что использование порошкообразных препаратов из коровьего молозива (ВРС) иммунизированных коров, содержащих антитела в высоких концентрациях, в качестве иммуномодуляторов, способно подавлять иммунную активацию в ответ на продукты микроорганизмов, такие как ЬР§. Не желая связываться с теорией, заявители выдвинули гипотезу о том, что присоединение антител ВРС к антигенам микроорганизмов может предупреждать их транслокацию в кровяное русло, тем самым ограничивая иммунный ответ. Эти эффекты на иммунную систему обеспечивают применение таких препаратов молозива для лечения инфекционных заболеваний, вовлекающих иммунную систему. Конкретнее, настоящее изобретение относится к применению полученного из молозива препарата, содержащего анти-ЕР§-антитела в высоких концентрациях, для лечения и ослаблении хронических заболеваний печени.
Транслокация микроорганизмов часто связана с модификацией воспаления печени при различных заболеваниях печени, в том числе при заболеваниях, вызванных вирусами, опосредованных лекарственными препаратами, при неалкогольном стеатогепатите и любом другом заболевании печени. Также транслокация микроорганизмов может быть связана с инсулинорезистентностью, диабетом типа 2, ожирением и избыточной массой тела. Как показано в изобретении, предупреждение такой транслокации можно достичь с использованием обогащенного анти-ЕР§-антителами молозива по изобретению, необязательно наряду с регуляцией регуляторных Т-клеток или другого компонента иммунной системы, с использованием комбинации обогащенного анти-ЕР§-антителами молозива вместе с препаратами молозива, обогащенными антителами, распознающими специфические для заболевания антигены, например молозиво, обогащенное антителами к инсулину. Таким образом, изобретение, кроме того, относится к композициям, комбинированным композициям и способам лечения любого острого или хронического заболевания печени, диабета и любого осложнения, связанного с ними, жировой печени, неалкогольного
- 3 024697 стеатогепатита и ожирения.
Следовательно, целью изобретения является обеспечение применения обогащенных анти-ЬР§антителами иммуноглобулиновых препаратов, полученных из молозива или яиц птиц, в композициях и способах лечения, подавления или профилактики прогрессирования хронического заболевания печени, цирроза и любого осложнения или расстройства, связанного с ними.
Еще одной целью изобретения является обеспечение комбинированных композиций, содержащих комбинацию обогащенного анти-ЕР§-антителами молозива и антител, распознающих по меньшей мере один антиген, специфичный для патологического расстройства, и их применений для лечения связанных с иммунной системой расстройств.
Эти и другие цели изобретения станут более понятными из нижеприведенного подробного описания.
Сущность изобретения
Изобретение относится к применению композиции, содержащей обогащенный анти-ЬР§антителами иммуноглобулиновый препарат, полученный из молозива, для лечения индивида, страдающего заболеванием печени, выбранным из хронического гепатита С, неалкогольного стеатогепатита (ΝΑδΗ), жировой дистрофии печени или гепатоэнцефалопатии.
В одном из вариантов осуществления индивид имеет повышенные уровни аспартатаминотрансферазы (ΑδΤ) или аланинаминотрансферазы (АЬТ).
Еще в одном варианте лечение заболевания печени включает уменьшение уровней ΑδΤ или АЬТ у индивида.
В одном из вариантов молозиво является молозивом коровы.
Краткое описание фигур.
Фиг. 1 - пероральное введение обогащенного анти-^Рδ-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, снижает активность ферментов печени.
Значения представляют среднее значение±стандартное отклонение. АСТ; аспартатаминотрансфераза и АЛТ; аланинаминотрансфераза.
Фиг. 2 - пероральное введение обогащенного анти-^Рδ-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, повышает количество СЭ4+СЭ25+ регуляторных Т-клеток в печени.
А: средняя поверхностная экспрессия маркеров на лимфоцитах. Значения представляют среднее значение±стандартное отклонение. В: репрезентативный дот-блот, полученный ΡΑСδ анализом.
Фиг 3 - пероральное введение обогащенного анти-^Рδ-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, повышает количество СИ25+СО4+ЕАР-, СИ45+ЬАР+ и СО3+ЬАР+ регуляторных Т-клеток в печени. Значения представляют средние значения.
Α: средняя поверхностная экспрессия маркеров на лимфоцитах. В: репрезентативный дот-блот, полученный ΡΑСδ анализом.
Фиг. 4 - пероральное введение обогащенного анти-^Рδ-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, повышает количество СО45+ЬАР+ и СО8+ЬАР+ регуляторных Т-клеток в селезенке.
Α: средняя поверхностная экспрессия маркеров на лимфоцитах. Значения представляют среднее значение±стандартное отклонение. В: репрезентативный дот-блот, полученный ΡΑί','δ анализом.
Фиг. 5 - пероральное введение ТЛдО-молозива снижает уровень инсулина в сыворотке крови мышей ОЬ/ОЬ.
Значения представляют среднее значение±стандартное отклонение.
Фиг. 6 - пероральное введение обогащенного анти-^Рδ-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, снижает толерантность к глюкозе у мышей ОЬ/ОЬ.
Фиг. 7 - пероральное введение обогащенного анти-^Рδ-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, уменьшает повреждение печени у мышей ОЬ/ОЬ.
Значения представляют среднее значение±стандартное отклонение; ΑΟΓ; аспартатаминотрансфераза и АЛТ, аланинаминотрансфераза.
Фиг. 8 - пероральное введение обогащенного анти-^Рδ-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, снижает концентрацию триглицеридов в печени (ТС) у мышей ОЬ/ОЬ.
Значения представляют среднее значение±стандартное отклонение.
Фиг. 9 - пероральное введение обогащенного анти-^Рδ-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, повышает количество СЭ3+Е-ЛР+ регуляторных Т-клеток в селезенке.
Α: средняя поверхностная экспрессия маркеров на лимфоцитах. Значения представляют среднее значение±стандартное отклонение. В: репрезентативный дот-блот, полученный ΡΑΡδ анализом.
Фиг. 10 - пероральное введение обогащенного анти-^Рδ-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, повышает количество СЭ8+СЭ25+ регуляторных Т-клеток в селезенке.
Значения представляют среднее значение±стандартное отклонение.
Фиг. 11 - пероральное введение обогащенного анти-^Рδ-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, повышает количество СЭ8+СЭ25+ регуляторных Т-клеток в селезенке.
- 4 024697
Репрезентативный дот-блот, полученный РАСЗ анализом.
Фиг. 12 - пероральное введение обогащенного анти-ЬРЗ-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, повышает количество ί'Ό4+ί'Ό25+ регуляторных Т-клеток в жировой ткани.
А: средняя поверхностная экспрессия маркеров на лимфоцитах. Значения представляют среднее значение±стандартное отклонение. В: репрезентативный дот-блот, полученный РАС8 анализом.
Фиг. 13 - пероральное введение обогащенного анти-ЬРЗ-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, повышает количество СО3+ЬАР+ регуляторных Т-клеток в жировой ткани.
А: средняя поверхностная экспрессия маркеров на лимфоцитах. Значения представляют среднее значение±стандартное отклонение. В: репрезентативный дот-блот, полученный РАСЗ анализом.
Фиг. 14 - пероральное введение обогащенного анти-ЬРЗ-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, повышает количество ί'Ό4+ί'Ό25+ регуляторных Т-клеток в стромальных васкулярных клетках (содержащих преадипоциты).
А: средняя поверхностная экспрессия маркеров на лимфоцитах. Значения представляют среднее значение±стандартное отклонение. В: репрезентативный дот-блот, полученный РАСЗ анализом.
Фиг. 15 - пероральное введение обогащенного анти-ЬРЗ-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, повышает количество СО4+СО25+ЬАР+ лимфоцитов в стромальных васкулярных клетках (содержащих преадипоциты).
А: средняя поверхностная экспрессия маркеров на лимфоцитах. Значения представляют среднее значение±стандартное отклонение. В: репрезентативный дот-блот, полученный РАСЗ анализом.
Фиг. 16 - пероральное введение обогащенного анти-ЬРЗ-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, снижает активность ферментов печени у мышей ОЬ/ОЬ.
Значения представляют среднее значение±стандартное отклонение; АСТ; аспартатаминотрансфераза и АЛТ, аланинаминотрансфераза.
Фиг. 17 - пероральное введение обогащенного анти-ЬРЗ-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, снижает уровень общего холестерина у мышей ОЬ/ОЬ.
Значения представляют среднее значение±стандартное отклонение.
Фиг. 18 - пероральное введение обогащенного анти-ЬРЗ-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, снижает уровень ТС в печени у мышей ОЬ/ОЬ.
Пероральное введение Т-1дС- и Н1ВС-молозива снижает уровень ТС в печени у мышей ОЬ/ОЬ. Значения представляют среднее значение±стандартное отклонение. Снижение было достоверным для мышей группы А по сравнению с группами Ό, Е, Р (*р<0,05).
Фиг. 19 - пероральное введение обогащенного анти-ЕРЗ-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, снижает количество ΟΟ3+ΝΚΤ.1+ клеток в печени мышей ОЬ/ОЬ.
А: пероральное введение Т-1дС в дозах 1 мкг, 1, 3 мг вместе с Н1ВС в дозе 100 мкг снижало количество ΟΟ3+ΝΚ1.1+ клеток в печени мышей ОЬ/ОЬ. Средняя поверхностная экспрессия маркеров на лимфоцитах. Значения представляют среднее значение±стандартное отклонение. В: пероральное введение Т1дС в дозах 1 и 100 мкг снижало количество ΟΟ3+ΝΚ1.1+ клеток в печени мышей ОЬ/ОЬ. Репрезентативный дот-блот, полученный РАСЗ анализом.
Фиг. 20 - пероральное введение обогащенного анти-ЕРЗ-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, повышает количество СО4+СО25+ЕАР-/ЬАР+ клеток в печени у мышей ОЬ/ОЬ.
А: средняя поверхностная экспрессия маркеров на лимфоцитах. Значения представляют среднее значение±стандартное отклонение. В: репрезентативный дот-блот, полученный РАСЗ анализом.
Фиг. 21 - пероральное введение обогащенного анти-ЬРЗ-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, индуцирует изменения количества СО25+ЬАР-лимфоцитов в печени.
Пероральное введение Т-1дС- и Н1ВС-молозива индуцирует изменения количества СО25+ЬАРлимфоцитов в печени. Репрезентативный дот-блот, полученный РАСЗ анализом.
Фиг. 22 - пероральное введение обогащенного анти-ЬРЗ-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, снижает количество СЭ25+ЬАР+ лимфоцитов в селезенке.
А: пероральное введение Т-1дС- и Н1ВС-молозива снижает количество СО25+ЬАР+ лимфоцитов в селезенке. Средняя поверхностная экспрессия маркеров на лимфоцитах. Значения представляют среднее значение±стандартное отклонение. В: репрезентативный дот-блот, полученный анализом РАСЗ.
Фиг. 23 - пероральное введение обогащенного анти-ЬРЗ-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, повышает количество СО4+СО25+ЬАР-лимфоцитов в селезенке.
А. Пероральное введение Т-1§С-молозива в дозах 1 и 3 мг и Н1ВС-молозива в дозе 100 мг повышает количество СО4+СО25+ЬАР-лимфоцитов в селезенке.
Фиг. 24 - пероральное введение обогащенного анти-ЬРЗ-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, повышает количество СО4+СО25+ в жировой ткани.
А: пероральное введение Т-ТдС-молозива повышает количество 004+0025+ в жировой ткани.
- 5 024697
Средняя поверхностная экспрессия маркеров на лимфоцитах. Значения представляют среднее значение±стандартное отклонение.
Фиг. 25 - пероральное введение обогащенного анти-ЬР§-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, повышает количество СЭ4+СЭ25+ в адипоцитах.
А: пероральное введение Т-1§0-молозива в дозе 100 мг повышает количество 004+0025+ в адипоцитах. Средняя поверхностная экспрессия маркеров на лимфоцитах. Значения представляют среднее значение±стандартное отклонение. В: пероральное введение Т-1§С-молозива в дозах 1 мкг, 100 и 1 мг повышает количество ΟΌ4+ΟΌ25+ в адипоцитах. Репрезентативный дот-блот, полученный РАС8 анализом.
Фиг. 26 - пероральное введение обогащенного анти-ЬР§-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, повышает количество СЭ3+ЬАР+ в адипоцитах.
А: пероральное введение Т-1§С-молозива повышает количество СЭ3+ЬАР+ в адипоцитах. Средняя поверхностная экспрессия маркеров на лимфоцитах. Значения представляют среднее значение±стандартное отклонение. В: репрезентативный дот-блот, полученный РАС8 анализом.
Фиг. 27 - пероральное введение обогащенного анти-РР§-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, повышает количество СО4+СО25+РАР- в адипоцитах.
Подробное описание изобретения
Продуктивный иммунный ответ возникает в результате эффективной интеграции позитивных и негативных сигналов, которые оказывают влияние на природные и адаптационные иммунные клетки. В том случае, когда доминируют позитивные сигналы, то имеет место активация клеток и провоспалительные ответы, приводящие к элиминации патогенных микроорганизмов, вирусов, а также трансформированных клеток. В отсутствии такой продуктивной стимуляции активация клеток блокируется, и могут иметь место противоспалительные ответы. Модуляция данной бинарной системы проходит через активацию цитокинов, негативную регуляцию сигнальных путей и межклеточного контакта. Нарушение порогов этих эффектов может привести к аномальных ответам, которые являются недостаточными, для того чтобы справиться с патогенными микроорганизмами, или приводит к потере толерантности и индукции аутоиммунных ответов. В настоящем изобретении показано иммуномодулирующее действие иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, обогащенного антителами против липополисахарида (ЬР8), который может активно действовать для лечения связанных с иммунной системой расстройств.
Регуляторные Т-клетки (Тгед) получают все большее признание в качестве важного иммуномодулирующего компонента адаптационной иммунной системы. Нарушение иммунной регуляции может привести к развитию хронического воспаления в качестве запуска хронической нечувствительности к инсулину. Настоящее изобретение показывает на конкретном примере, что пероральное введение антиЬРЗ-антител, полученных из молозива, стимулирует Тгед в жировой ткани и в стромальной сосудистой сети, связанной с жировой тканью. Данные изменения приводят к ослаблению метаболического синдрома и повреждения печени на модели мышей оЬ/оЬ. Следовательно, настоящее изобретение относится к новой лекарственной композиции для ослабления и лечения метаболического синдрома.
Заявители настоящего изобретения показали, что введенные перорально анти-РР§-антитела стимулируют Тгед в печени, селезенке, жировой ткани и §У (стромально-сосудистых клетках). В печени индуцируются СО25+ЬАР+ Т-клетки, СО4+СО25+ЬАР+ Т-клетки, СО4+СО25+ЬАР- Т-клетки, СО45+ЬАР+ Т-клетки и 003+ЬАР+Т-клетки. В селезенке индуцируются СО45+ЬАР+ Т-клетки, СО8+ЬАР+ Т-клетки, СО3+ЬАР+ Т-клетки, СО8+СЭ25+ Т-клетки. В жировой ткани индуцируются СО4+СО25+ Т-клетки, СО3+ЬАР+ Т-клетки, СО4+СО25+ЬАР- Т-клетки. В стромальных сосудистых клетках индуцируются СО4+СО25+ Т-клетки и СО4+СО25+ЬАР+ Т-клетки, в то время как количество ΟΩ3+ΝΚ1.1 + клеток в печени и СО25+ЬАР-Т-клеток в печени снижается.
Различные составляющие жировой ткани, такие как зрелые адипоциты и стромальные сосудистые клетки, обладают разными функциями. Они экспрессируют и секретируют различные виды биологически активных молекул, которые в совокупности называются адипокинами. Измененный характер секреции адипокинов характерен для ожирения и инсулинорезистентности, которые являются основными факторами развития сахарного диабета типа 2. В стромальных клетках крыс при ожирении и тощих крыс 2иекег имеются региональные и генотипические различия [ТигкепкогГ 1.1. е1 а1., Ιηΐ. 1. 0Ье8., 12:515-24 (1988)]. Установление профиля экспрессии генов с использованием ДНК-микрочипов выявило различия между жировой тканью, адипоцитами и стромальными сосудистыми клетками [Регтапа (2008) Φΐά.]. Настоящее изобретение дополнительно подтверждает эти данные, показывая, что распределение Тгед в данных тканях является важным в развитии метаболического синдрома и заболеваний печени.
Изобретение дополнительно показывает, что стимуляция Тгед в жировой ткани и §У введением анти-ЬР§-антител приводит к ослаблению инсулинорезистентности. Это подтверждено анализом толерантности к глюкозе. Кроме того, воспалительное повреждение печени ослабляется настоящим изобретением, что подтверждается снижением активности ферментов печени.
Как описано выше, изобретение показывает, что пероральное введение полученных из молозива ан- 6 024697 ти-ЬР8-антител может служить в качестве средства для стимуляции Тгед в жировой ткани и в сосудистой сети стромы, связанной с жировой тканью.
Изобретение также представляет синергию между полученными из молозива компонентами и антиЬРЗ-антителами в действии на распределение Тгед. В грудном молоке было идентифицировано несколько белков, принимающих участие в защите хозяина [Кайп З.Е. е! а1., Иа!иге, 444:840-6 (2006)], включая высокие концентрации медиаторов врожденной иммунной системы [Родд1 М. е! а1., Э|аЬе1о1од1а (2009)]. Среди данных медиаторов находятся многочисленные белки дефензины, сфинголипиды, остеопонтин, экзосомы, ТЬК, кателицидин, нейротоксин из эозинофилов и белок из группы высокой мобильности Ьох 1 и ЬЬ-37 [Родд1 (2009) 1Ыб.; Иадато!о Т. е! а1., С1ш. Ехр. 1ттипо1., 138:47-53 (2004); Абтуге С. е! а1., 1. 1ттипо1., 179:1969-78 (2007); Оррепйепп 1.1. апб Уапд Ό., Сигг. Орш. 1ттипо1., 17:359-65 (2005)]. Эти белки могут активировать врожденные и адаптационные иммунные системы, некоторые из них называются аларминами за счет их роли в мобилизации иммунной системы [Оррепйеш (2005) 1Ыб.]. Алармины обладают хемотаксическим и активирующим действием на АРС и, таким образом, могут усиливать врожденный и Ад-специфический иммунный ответы, для того чтобы сигнализировать об опасности [Уапд Ό. е! а1., 1. 1ттипо1., 173:6134-42 (2004); Оррепйеш 1.1. е! а1., Α6ν. Ехр. Меб. Вю1., 601:185-94 (2007)]. Коровье молозиво (ВС) содержит β-гликосфинголипиды в высоких концентрациях (ВОЗ) [Матбп М.1. е! а1., Ыр1б5, 36:291-298 (2001); За1а-Уйа А. е! а1., НиМбои, 21:467-73 (2005); Уап Υ.Η. е! а1., Э1аЬе!е5, 58:146-55 (2009); Иада!ото Т. е! а1., С1ш. Ехр. 1ттипо1., 138:47-53 (2004)], состав которых может определять действие АРС или других компонентов иммунной системы кишечника [Иоуак 1. е! а1., 1п!. Кеу. 1ттипо1., 26:49-72 (2007); №\\ак М. апб 3!ет-3!гейеш, 1. 1п!. Реу. 1ттипо1., 26:95-119 (2007); №коороиг Е. апб ЗсН\уаг1/ 1.А., 1пГ1атт. А11егду Эгид ТагдеК 7:203-210 (2008); Абтуге С. е! а1. , 1. 1ттипо1., 179:1969-78 (2007); Оррепйепп 1.1. апб Υаид Ό., Сигг. Орт. 1ттипо1., 17:359-365 (2005); Υапд Ό. е! а1., 1. 1ттипо1., 173:6134-6142 (2004); Оррепйепп 1.1. е! а1., Αбν. Ехр. Меб. Вю1., 601:185-194 (2007)]. Некоторые из данных медиаторов могут служить в качестве мукозальных адъювантов, повышая перекрестный разговор между субпопуляциями АРС и Тгед в слизистой кишечника [У1дпай Э.А. е! а1., Иа!. Кеу. 1ттипо1., 8:523-32 (2008); Матдай! М. е! а1., 1. Рйаттасо1. Ехр. Тйет., 319:105-110 (2006); ОобГгеу Ώ.Ι. апб Вег/пъ З.Р., 1ттипо1., 7:505-518 (2008); Матдай! М. апб 11ап Υ., Шег 1п!., 25:501-504 (2005); Nоνак 1. е! а1., 1п!. Кеу. 1ттипо1., 26:49-72 (2007); №\\ак М. апб З!еш-З!гейет, 1. 1п!. Кеу. 1ттипо1., 26:95-119 (2007); №коороиг Е. апб ЗсН\уаг1/ 1.А., 1пГ1атт. А11егду Эгид Тагдей, 7:203-210 (2008)]. Индукция Тгедклеток может привести к длительной толерантности к антигенам β-клеток, опосредованной модуляцией местного иммунитета в дренажных лимфатических узлах поджелудочной железы (РЬИ) |Нотапп Ό. е! а1., 1. 1ттипо1., 163:1833-8 (1999); Нотапп Ό. е! а1., 1ттит!у, 11:463-472 (1999)]. Данное терапевтическое вмешательство показало обещающую перспективность на животных моделях, но проявило низкую эффективность в испытаниях у людей. В испытаниях, целью которых было предупреждение диабета, только в подгруппе пациентов после иммунизации аутоантигенами островков Лангерганса имел место положительный эффект [Зку1ег 1.З. е! а1., Э1аЬе!е8 Саге, 28:1068-1076 (2005)]. Предупреждение диабета типа 1 наблюдали только, когда пациентов иммунизировали в предиабетической фазе, но иммунизация оказалась неэффективной в отмене уже развившегося диабета [Ьатсйе М. апб ^тайй Э.С.. Иа!. Меб., 11:369-76 (2005)]. Следовательно, для антиген-специфического вмешательства могут потребоваться дополнительные адъюванты для успешного применения у людей, особенно при диабете на ранних стадиях [Наг1ап (2005) ιΈΐά.].
Заявители настоящего изобретения показали дозозависимые эффекты на иммунную систему.
Таким образом, изобретение четко показало, что анти-ЕРЗ-антитела вместе с адъювантами из молозива могут стимулировать аккумуляцию Тгед клеток и тем самым служат в качестве средства для ослабления воспалительного ответа, устранения повреждения печени и осложнений при метаболическом синдроме. Кроме того, согласно изобретению регуляторные Т-лимфоциты в жировой ткани и ЗУ могут служить в качестве новой терапевтической мишени у пациентов с метаболическим синдромом. Также иммуноглобулины в молозиве могут стимулировать регуляторные Т-клетки или любые клетки, связанные с иммунной системой, антигенспецифическим или не антигенспецифическим образом, направленным действием на случайные антигены или воздействием на неассоциированные антигены.
Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей обогащенный анти-ЕРЗ-антителами иммуноглобулиновый препарат для применения для лечения и/или профилактики патологического расстройства. Обогащенный анти-ЕРЗ-антителами иммуноглобулиновый препарат можно получить из молозива или яиц птиц.
В том смысле, в котором в данном документе используется термин лечение, он относится к подавлению или ослаблению тяжести симптомов заболевания, частоты, с которой симптом проявляется, или обоих эффектов.
В том смысле, в котором в данном документе используется термин профилактика, он относится к полному или частичному предупреждению или ингибированию симптома заболевания или частоты, с которой симптом проявляется.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к композиции для лечения и/или профилак- 7 024697 тики патологического расстройства. Композиция по изобретению содержит в качестве активного ингредиента обогащенный антителами против липополисахарида (анти-ЬР§-антителами) иммуноглобулиновый препарат, полученный из молозива млекопитающих, и необязательно дополнительно молозиво, компонент(ы) молока или молочного продукта, и любой адъювант(ы). Иммуноглобулиновый препарат или любые его фракции распознают и связывают ЬР8 или любые его фрагменты. Необязательно композиция по изобретению может содержать комбинацию обогащенного анти-ЬР§-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, по меньшей мере с одним иммуноглобулиновым препаратом, содержащим иммуноглобулины, распознающие по меньшей мере один антиген, специфичный для указанного расстройства, тем самым активируя или ингибируя иммунный ответ, специфически направленный против указанного расстройства. Также необходимо отметить, что обогащенные анти-ЬР§антителами иммуноглобулиновые препараты, полученные из молозива, по изобретению можно комбинировать с любым другим иммуномодулятором, включая, не ограничиваясь этим, другие антитела, полученные из молозива, другой антиген, другой адъювант, другие цитокины или любые типы молекул, которые могут модифицировать любой компонент иммунной системы. Комбинацию можно вводить в виде одного продукта или двух или более отдельных продуктов. Комбинацию можно вводить вместе или по отдельности друг от друга.
Согласно одному конкретному варианту осуществления обогащенный анти-ЬР§-антителами иммуноглобулиновый препарат, полученный из молозива, может содержать мономерный, димерный или полимерный иммуноглобулин, выбранный из группы, состоящей из 1дС, 1дА и 1дМ и любых их фрагментов. Как уже указывалось выше, у жвачных основное различие в составе молозива и зрелого молока заключается в очень высоком содержании иммуноглобулинов молозива, из которых 1§С составляет 8090%.
Таким образом, согласно конкретному варианту осуществления обогащенный анти-ЬР§-антителами иммуноглобулиновый препарат, полученный из молозива, по изобретению в основном содержит 1§С, в частности 1дС1 и 1дС2.
В том смысле, в котором в данном документе используется термин иммуноглобулин С (1дС), он означает полимерный иммуноглобулин, состоящий из двух тяжелых цепей и двух легких цепей. Каждый комплекс имеет два антигенсвязывающих сайта. Это наиболее распространенный иммуноглобулин, и он примерно в равном количестве распределен в крови и тканевых жидкостях, составляя 75% сывороточных иммуноглобулинов человека. В общем, количество подклассов 1§С варьирует в широких пределах между видами в пределах от одного подкласса у кроликов до семи подклассов у лошадей, что затрудняет поиск ортологов. Например, у людей 1дС1 и 1дС3 являются наиболее распространенными провоспалительными подклассами 1§С. Однако, у мышей 1§С2а и 1§С2Ь представляют наиболее провоспалительные молекулы 1дС, которые проявляют более высокую активность по сравнению с 1дС1 и 1дС3 мыши на многих моделях в условиях ίη νίνο.
Необязательно или дополнительно обогащенный анти-ЬР§-антителами иммуноглобулиновый препарат, полученный из молозива, может содержать секреторное антитело, в частности §1§А.
Димерный и полимерный 1§А и 1дМ секретируются рядом эндокринных тканей. 1§А является преобладающим секреторным иммуноглобулином, находящимся в молозиве, слюне, слезах, секретах бронхов, слизистой носовой полости, секрете предстательной железы, влагалищных секретах и секретах слизистых тонкого кишечника. Продукция 1§А превышает синтез всех других иммуноглобулинов, что делает его основным антителом, продуцируемым организмом ежедневно, и он является основным иммуноглобулином, обнаруженным в молоке, сыворотке и молозиве человека. Секреция 1дМ менее избыточна, но может повышаться для компенсации дефицита секреции 1§А. 1§А, содержащий 1-цепь, продуцируется и секретируется В-иммуноцитами плазмы, расположенными в собственной пластинке под базальной мембраной экзокринных клеток. 1§А обладает характерной для иммуноглобулинов структурой, состоящей из четырех цепей (Мг 160000), двух тяжелых цепей (Мг 55000) и двух легких цепей (Мг 23000). У людей имеется два подкласса 1дА. Это 1дА1 и 1дА2, содержащие соответственно одну или две тяжелые цепи. 1§А может находиться в виде мономеров, димеров, тримеров или полимеров. В плазме крови 10% от общего количества 1дА является полимерным, в то время как остальные 90% представляет мономерный 1§А. Секретируемый 1§А связывается с поли-1д-рецептором с молекулярной массой Мг 100000, расположенным на базолатеральной поверхности большинства клеток слизистой. Затем комплекс рецептор1дА транслоцируется на апикальную поверхность, где секретируется 1§А. Связывание димерного 1дА с поли-1д-рецептором полностью зависит от присутствия 1-цепи. Мономерный 1§А не будет связываться с рецептором.
Различие в функциях 1§С и 1§А связано с тем, где молекулы осуществляют свое действие. В основном 1§А обнаруживается на поверхностях слизистых, на которых имеется небольшое количество жидкости для переноса иммунных клеток и химических веществ. Следовательно, 1дА (часто в виде димера) предпочтительно осуществляет физическую нейтрализацию патогенов, но может быть очень эффективным в других иммунных функциях. 1дС присутствуют в тканевой жидкости и крови, где имеется полная коллекция лейкоцитов, комплементная система, макрофаги и т. п., они могут физически эффективно нейтрализовать патоген, и также являются более эффективными в обеспечении коммуника- 8 024697 ции/презентации по сравнению с 1дА, т. е. они имеют тенденцию лучше индуцировать опсонизацию фагоцитами (например, Т-клетками киллерами и макрофагами) и лучше запускать систему комплемента.
Более конкретно, обогащенные анти-ЬР§-антителами иммуноглобулиновые препараты по изобретению можно получить из молозива, сыворотки молозива, гипериммунного молока или молозива, сыворотки молозива (сыра или казеина), сыворотки сыра или казеина, непосредственно из сливок, цельного молока или восстановленной формы таких жидкостей.
Очевидно, что обогащенный анти-ЬР§-антителами иммуноглобулиновый препарат, находящийся в композиции по изобретению, может представлять любую фракцию молозива. Так, в том смысле, в котором в данном документе используется термин молозиво, он включает молозиво, обработанное молозиво, такое как молозиво, обработанное для частичного или полного удаления одного или более из жира, клеточного дебриса, лактозы и казеина.
Молозиво или молоко, содержащее анти-ЬР§-антитела и необязательно антигенспецифические антитела, можно предпочтительно собрать доением, собранное таким образом молозиво или молоко можно использовать непосредственно, можно подвергнуть дальнейшей обработке, например выделить антиЬР8-антитела и необязательно антигенспецифические антитела. В данной области описаны способы (частичной) очистки антител (анти-ЬР§-антител и необязательно антигенспецифических антител) из молозива или молока.
Также, очевидно, что любые адъюванты можно добавить в композиции по изобретению. Так, подходящие адъюванты могут представлять антиген, антитело, гликофосфолипиды, белки, цитокины, молекулы межклеточной адгезии и компонент, который активирует или модифицирует функцию антигенпрезентирующих клеток или любых других клеток, связанных с иммунной системой, прямо или опосредованно.
Альтернативно, обогащенный анти-ЬР§-антителами иммуноглобулиновый препарат может представлять антитела, очищенные аффинной хроматографией, или любые их фрагменты. В том смысле, в котором в данном документе используется термин антитело, он включает интактные молекулы, а также их фрагменты, например, такие как РаЬ и Р(аЬ')2, которые способны связываться с антигеном. В РаЬ- и Р(аЬ')2-фрагментах отсутствует Ре-фрагмент интактного антитела, они быстрее элиминируют из кровотока и могут обладать меньшим неспецифическим связыванием с тканями по сравнению с интактным антителом. Очевидно, что РаЬ и Р(аЬ')2 и другие фрагменты антител, подходящие для настоящего изобретения, можно использовать для иммуномодуляции согласно способам, раскрытым в данном документе для интактных молекул антител. Как правило, такие фрагменты получают протеолитическим гидролизом с использованием ферментов, таких как папаин (для получения РаЬ-фрагментов) или пепсин (для получения Р(аЬ')2-фрагментов).
Как уже говорилось выше, антитело, способное специфически распознавать определенный антиген, является таким антителом, если оно способно специфически взаимодействовать с антигеном, который в данном конкретном примере представляет антиген или смесь антигенов, специфических для определенного связанного с иммунной системой расстройства, тем самым связываясь с молекулой антитела.
Антиген представляет молекулу или фрагмент молекулы, способную связываться с антителом, которая дополнительно способна индуцировать у животного продукцию антитела, которое связывается с эпитопом такого антигена. Антиген может содержать один или более эпитопов. В том смысле, в котором в данном документе используется термин эпитоп, он относится к любой молекуле, способной связываться с антителом, которая также распознается этим антителом. Эпитопы или антигенные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как боковые цепи аминокислот или сахаров, и имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические зарядные свойства.
В еще одном варианте осуществления обогащенный анти-ЬР§-антителами иммуноглобулиновый препарат, используемый в качестве активного ингредиента для композиции по изобретению, можно получить от млекопитающего, иммунизированного ЬР8 или любыми его фрагментами. Необязательно в дополнении к ЬР§ указанное млекопитающее согласно некоторым вариантам осуществления можно иммунизировать по меньшей мере одним антигеном или смесью по меньшей мере двух антигенов, специфичных для указанного расстройства, а также смесью по меньшей мере двух различных антител, направленных по меньшей мере против двух различных антигенов, связанных с заболеванием.
Согласно одному варианту осуществления ЬР§ или любой антиген, использованный для иммунизации указанного млекопитающего, предпочтительно крупного рогатого скота и птицы, можно получить в виде выделенного и очищенного пептида, очищенного рекомбинантного белка, слитого белка, клеточного лизата, мембранного препарата, ядерного препарата или цитозольного препарата любой клеточной культуры тканей, первичных клеток или тканевых образцов, полученных от индивида, страдающего указанным расстройством.
Согласно еще одному варианту осуществления композиция по изобретению может необязательно дополнительно содержать компонент(ы) молозива, например, такие как алармины, дефенензины, колостринин и любые другие полученные из молозива или молока углеводы, гликолипиды, или любые другие молекулы или компоненты, которые могут дополнительно повысить или ингибировать модуляцию им- 9 024697 мунного ответа, или любые их препараты, смеси или комбинации. Кроме того, композиция по изобретению может содержать любой дополнительный адъювант. Следовательно, подходящие адъюванты могут представлять антиген, антитело, гликосфинголипиды, белки, цитокины, молекулы межклеточной адгезии и компонент, который может активировать или модифицировать функцию антигенпрезетирующих клеток или любых клеток, связанных с иммунной системой, прямо или опосредованно.
В некоторых вариантах осуществления композиции композиция содержит составляющий компонент яйца птиц, где яйцо птиц содержит 1дУ. специфичный для ЬР§ или его фрагмента. Сырой куриный желток можно использовать в качестве источника антител. Однако, антитела птиц обычно очищают или концентрируют из желтка перед применением. Специалисту в данной области очевидно, что составляющий компонент яйца птиц можно сконцентрировать или очистить при необходимости. В некоторых вариантах осуществления композиции композиция содержит желток яйца или его любую фракцию, содержащую 1дУ. Желток является более предпочтительным по сравнению с яичным белком, поскольку желток, как правило, содержит более высокие концентрации 1дУ по сравнению с яичным белком. Однако, яичный белок может содержать концентрации Ι§Υ, достаточные для некоторых применений.
В некоторых вариантах осуществления антитела композиции, например Ι^Υ, концентрируют, выделяют или очищают из составляющего компонента яйца птицы. Это можно провести с использованием различных способов. В некоторых вариантах осуществления антитела можно выделить методом разбавления водой. Далее преципитат можно удалить обычным способом, включая центрифугирование. Затем супернатант можно хранить замороженным, например, при -20°С. Затем Ι§Υ можно выделить осаждением сульфатом аммония и последующим диализом. Если это требуется, то титр 1дУ-антител можно определить иммуноанализом, например ЕЬ1§Л. Метод разбавления водой подробно описан в хорошо известной литературе, например Лкйа и Ν;·ι1<;·ιί (1993), этот источник включен для сведения в данный документ в целях описания данного метода. Другие подходящие способы описаны, например, в патенте США № 4550019, патенте США № 4748018 и публикации патента США № 2004/0161427, которые включены в данный документ для сведения. Имеются промышленно доступные наборы производства Рготеда Согротайои (Майкоп, ХУексогМп).
Некоторые варианты осуществления композиции антител, по существу, представляют выделенные антитела. В таких вариантах осуществления значительная фракция компонента желтка, не относящегося к антителу, удалена. Компонент желтка, не относящийся к антителу, может представлять, например, липидный компонент желтка, углеводный компонент желтка, желтковые гранулы, гидрофобный компонент желтка, стероидный компонент желтка и белковый компонент желтка, отличный от иммуноглобулинов. Удаляемая фракция компонента составляет по меньшей мере 50%. В некоторых вариантах осуществления удаляемая фракция составляет по меньшей мере 60, 75, 80, 90, 95, 99 или 99,9%. Большие удаляемые фракции обеспечивают преимущество получения более чистого антитела. Меньшие удаляемые фракции обеспечивают преимущество в меньшей обработке.
Некоторые варианты осуществления композиции антител, по существу, представляют концентрированные антитела. В таких вариантах осуществления концентрация 1дУ будет выше в композиции по сравнению с яичным желтком. По существу, концентрированное антитело содержит 1дУ, который по меньшей мере в два раза более сконцентрирован, чем в желтке. Некоторые варианты осуществления, по существу, концентрированной композиции антител сконцентрированы по меньшей мере в 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 100, 1000 или 10000 раз. Более концентрированные композиции антитела имеют преимущество обеспечения той же массы антител в меньшем объеме. Менее концентрированные композиции антитела имеют преимущество в необходимости меньшей обработки.
Композиции антител по настоящему изобретению можно обработать таким образом, чтобы в значительной степени удалить все изотипы, за исключением 1дО и 1дУ. В некоторых вариантах осуществления иммуноглобулин можно получить от различного числа доноров. Можно использовать любое число доноров. В еще одних вариантах осуществления антитела получают от 1-10 доноров. В еще одних вариантах осуществления антитела получают от 10-100 доноров. В еще одних вариантах осуществления антитела получают от 100-1000 доноров. В еще одних вариантах осуществления антитела получают от более чем 1000 доноров.
В некоторых вариантах осуществления композиции антител композиция получена способом, включающим получение снесенных яиц птицей, предварительно иммунизированной от гриппа, и выделение фракции антител из яичного желтка. В некоторых вариантах осуществления композиции птицу предварительно активно иммунизируют, например, вакцинацией. Предпочтительно птица является домашней птицей. Домашняя птица может представлять курицу, утку, лебедя, гуся, индейку, павлина, цесарку, страуса, голубя, перепела, фазана, горлицу или другую домашнюю птицу. Предпочтительно домашняя птица представляет курицу. Домашняя птица более предпочтительно представляет домашнюю курицу яичного или мясного направления. Птицу можно иммунизировать против любого штамма гриппа, любого подтипа гриппа, любого типа гриппа или их комбинаций.
Применение яиц от кур яичного или мясного направления, вакцинированных для данной цели, имеет большое преимущество использования их в качестве поголовья для получения яиц, которые являются промышленно доступными в больших объемах и при низкой стоимости. Ранее животных, используемых
- 10 024697 для получения антител, выращивали исключительно или в основном для данной цели и содержали в небольшом количестве при очень высокой стоимости.
В некоторых вариантах осуществления композиции антител композицию антител получают способом, включающим активную иммунизацию курицы антигеном, сбор яиц от курицы после иммунизации и выделение фракции антител из яичного желтка. Необязательно, сбор яиц от курицы может иметь место непрерывно после иммунизации. Иммунизацию птицы можно проводить любыми способами, известными в данной области. Например, птице можно вводить вакцину, о которой известно, что она эффективно стимулирует иммунный ответ у птиц, или о которой известно, что она эффективно стимулирует иммунный ответ у млекопитающих. Многие такие вакцины против гриппа являются промышленно доступными, и их может разработать специалист в данной области без излишнего экспериментирования; специалистам в данной области известны другие способы получения 1дУ со специфической мишенью.
Такие способы можно найти, например, в патенте США 4550019, патенте США 4748018 и публикации патента США 2004/0161427, которые включены в данный документ в качестве ссылки.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей обогащенный анти-ЬР8-антителами иммуноглобулиновый препарат, для применения для лечения и/или профилактики патологического расстройства, где обогащенный анти-ЬР8-антителами иммуноглобулиновый препарат получен из яиц птиц и дополнительно содержит негипериммунное молозиво.
В одном из вариантов осуществления патологическое расстройство представляет острое или хроническое заболевание печени, цирроз или любое заболевание или осложнение, связанное с ними. В еще одном варианте осуществления острое или хроническое заболевание печени, цирроз или любое заболевание или осложнение, связанное с ними, выбрано из группы, состоящей из печеночной энцефалопатии, спонтанного бактериального перитонита (8ВР), асцита, кровотечения из варикозно-расширенных вен, гипердинамического состояния кровообращения, связанного с циррозом, гепаторенального синдрома, гепатопульмонарного синдрома, портопульмонарной гипертензии, кровотечения из варикознорасширенных вен, недостаточности надпочечников и измененного состояния сознания. В еще одном варианте осуществления патологическое расстройство представляет повреждение печени.
В еще одном варианте осуществления патологическое расстройство представляет связанное с иммунной системой расстройство, выбранное из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания, неалкогольного стеатогепатита, жирной печени, атеросклероза, метаболического синдрома и любого расстройства, связанного с ними, инфекционного заболевания и пролиферативного расстройства.
Альтернативно, патологическое расстройство может быть выбрано из группы, состоящей из вторичного перитонита и послеоперационной инфекции, печеночной кардиомиопатии и гипотензии, гепатоадренального синдрома, гепатоцеллюлярной карциномы, болезни Альцгеймера, любого типа потери памяти, любого типа деменции, синдрома дефицита внимания (АЭНА), любого типа неспособности к обучению, влияния алкоголя или лекарственных препаратов на головной мозг, любого типа опосредованного иммунной системой заболевания, включая астму, и перитонита.
В еще одном варианте осуществления иммуномодулирующая композиция по изобретению способна подавлять, элиминировать или ингибировать мукозальную транслокацию микроорганизмов, тем самым модулируя иммунную активацию. Необходимо отметить, что хроническая активация иммунной системы является отличительной особенностью прогрессирующей вирусной инфекции и предупреждает развитие заболевания. Ранее было показано, что циркулирующие продукты микроорганизмов, вероятно, поступившие из желудочно-кишечного тракта, в процессе также известном как мукозальная транслокация микроорганизмов, являются основной причиной, связанной с вирусом активации иммунной системы. Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления композиции по изобретению могут модулировать функцию иммунной системы или альтернативно подавлять или модифицировать число бактерий или связанных с бактериями продуктов, которые изменяют иммунную систему.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретение относится к композиции, содержащей в качестве активного ингредиента обогащенный антителами против липополисахарида (ЬР8) иммуноглобулиновый препарат, полученный из молозива млекопитающих. Такая композиция, где указанная композиция, в частности, применима для лечения, предупреждения и профилактики острого или хронического заболевания печени, цирроза и любого заболевания или осложнения, связанного с ними, где указанная композиция дополнительно содержит дополнительный лекарственный препарат, или носитель, или адъювант.
Более конкретно, согласно изобретению острое или хроническое заболевание печени, цирроз или любое заболевание или осложнение, связанное с ними, выбрано из группы, состоящей из печеночной энцефалопатии, спонтанного бактериального перитонита (8ВР), асцита, кровотечения из варикознорасширенных вен, гипердинамического состояния кровообращения, связанного с циррозом, гепаторенального синдрома, гепатопульмонарного синдрома, портопульмонарной гипертензии, кровотечения из варикозно-расширенных вен, недостаточности надпочечников и измененного состояния сознания.
В еще одном варианте осуществления изобретения композицию по изобретению можно использовать для лечения патологических расстройств, таких как вирусное заболевание любого типа, включая 11С\Л ΗΒν, СМV и ΕΒν.
- 11 024697
Необходимо отметить, что такие полученные из молозива препараты, следовательно, можно комбинировать с любым другим лекарственным препаратом, используемым для лечения заболевания печени, в качестве дополнительного лекарственного препарата.
Как используется в данном документе термин цирроз относится к конечному распространенному гистологическому исходу различных хронических заболеваний печени, характеризующемуся замещением ткани печени фиброзной рубцовой тканью и регенерацией узелков, приводящих к прогрессирующей потере функции печени. Обычно цирроз вызван вирусами гепатита В и С, алкоголизмом и жировым перерождением печени.
Как используется в данном документе термин асцит описывает состояние, характеризующееся патологическим скоплением жидкости в брюшной полости, причиной которого обычно является цирроз и тяжелые заболевания печени.
Необходимо отметить, что такие полученные из молозива препараты можно, следовательно, комбинировать с любым иммуномодулирующим лекарственным средством(и) или любой их комбинацией или смесью, с получением комбинированной иммуномодулирующей композиции для лечения и/или профилактики связанных с иммунной системой расстройств, неалкогольного стеатогепатита, жирной печени, атеросклероза, метаболического синдрома и любого расстройства, связанного с ними, инфекционного заболевания, злокачественных или инфекционных расстройств.
Необходимо отметить, что полученная из молозива композиция по изобретению может дополнительно содержать любой добавленный адъювант.
Следует отметить, что поскольку транслокация микроорганизмов также связана с модификацией воспаления печени при многих расстройствах печени, включая опосредованные вирусами, опосредованные лекарственными препаратами заболевания, неалкогольный стеатогепатит и любое другое расстройство печени, а также с инсулинорезистентностью, диабетом типа 2, ожирением и избыточной массой тела, то предупреждение этой транслокации композицией по изобретению может применяться для лечения данных расстройств.
Следовательно, изобретение дополнительно относится к применению композиций анти-Ь^антител по изобретению необязательно в комбинации с препаратами молозива, обогащенными антителами против антигенов, связанных с заболеванием, например антителами к инсулину, для лечения острого или хронического заболевания печени, диабета и любого осложнения диабета, жирной печени, неалкогольного стеатогепатита и ожирения.
В еще одном варианте осуществления композиция дополнительно содержит иммуноглобулиновый препарат, содержащий иммуноглобулины, которые распознают и связывают по меньшей мере один антиген, специфичный для указанного патологического расстройства. Дополнительный иммуноглобулиновый препарат может быть получен из молозива или яиц птиц.
Согласно еще одному необязательному варианту осуществления изобретение относится к комбинированным композициям, содержащим комбинацию обогащенного анти-^Рδ-антителами иммуноглобулинового препарата по меньшей мере с одним иммуноглобулиновым препаратом, полученным из молозива, содержащим иммуноглобулины, которые распознают и связывают по меньшей мере один антиген, специфичный для указанного патологического расстройства, и тем самым модулируют иммунные регуляторные клетки, в частности регуляторные Т-клетки. Необходимо отметить, что такая модуляция может приводить, например, к модуляции баланса ТН1/ТН2-. Тт1/ТЬ3-клеток к противовоспалительному ТЬ2, Тг1/ТН3 иммунному ответу, тем самым ингибируя иммунный ответ, специфически направленный против указанного расстройства.
Иммуноглобулины, которые распознают и связывают по меньшей мере один антиген, специфичный для указанного патологического расстройства, и тем самым модулируют иммунные регуляторные клетки, в частности, регуляторные Т-клетки включают следующие продукты:
антитела против гриппа для лечения и/или профилактики гриппа; анти-НСУ-антитела для лечения и/или профилактики любого типа рака печени или острых или хронических заболеваний печени, связанных с НСУ-инфекцией; анти-НВУ-антитела для лечения и/или профилактики любого типа рака печени или острых или хронических заболеваний печени, связанных с НВУ-инфекцией; анти-СМУ-антитела для лечения и/или профилактики острых или хронических расстройств, связанных с СМУ-инфекцией; антимиелоидные антитела для лечения и/или профилактики болезни Альцгеймера, печеночной энцефалопатии, любого типа потери памяти, синдрома дефицита внимания (ΑΌΗΑ), любого типа неспособности к обучению, влияния алкоголя или лекарственных препаратов на головной мозг; антитела против любого антигена вирусов, бактерий, спирохет, прионов, паразитов, спор или грибов для лечения и/или профилактики острых и хронических расстройств, связанных с соответствующей инфекцией; антитела к инсулину для лечения и/или профилактики любого расстройства, связанного с инсулинорезистентностью; антитела против любого типа антигена, связанного с раком, для лечения и/или профилактики любого злокачественного заболевания, включая метастатические и неметастатические, солидные и несолидные опухоли, связанные с антигеном-мишенью; антитела против антигенов, специфических для заболевания и связанных с заболеванием антигенов для лечения и/или профилактики любого типа опосредованного иммунной системой или аутоиммунного заболевания; антитела против Ηδν, 1С-вируса, аденовируса,
- 12 024697 вируса парагриппа и антитела против К8У для лечения и/или профилактики вирусного заболевания; антитела против Мусор1а8та/Ьедюпе11а для лечения и/или профилактики пневмонии; антитела к РТНгр, альдостерона, стероидов, ОН и пролактина для лечения и/или профилактики секретирующих опухолей; антитела против 1Ь-12, отр С для лечения и/или профилактики ΙΒΌ; антитела к внутреннему фактору для лечения и/или профилактики мегалобластной анемии; антитела против Н. ру1оп для лечения и/или профилактики инфекции, вызванной Н. ру1оп; антитела против ЕВУ для лечения и/или профилактики лимфомы Беркитта и антитела, специфичные для антигенов, связанных с аутоиммунным панкреатитом, хроническими заболеваниями легких, такими как СР, астма и т. д., циррозом печени, фиброзом печени (ССЬ4) и гиперкальцемией.
Согласно еще одному альтернативному варианту осуществления изобретения обогащенный антиЬР8-антителами иммуноглобулиновый препарат может дополнительно содержать иммуноглобулины против антигенов, которые не являются специфическими для расстройства, которое лечится. Такие антигены могут представлять любые связанные с иммунной системой компоненты-мишени, оказывающие модулирующее влияние на иммунный ответ. Таким образом, распознавание таких антигенов, неспецифических для заболевания, иммуноглобулиновым препаратом по изобретению может привести к модуляции иммунного ответа. Такая модуляция может привести, например, к модуляции баланса ТЫ/ТН2-, Тг1/ТЬ3-клеток к противовоспалительному ТЬ2, Тг1/ТН3 иммунному ответу, тем самым ингибируя иммунный ответ, специфически направленный против указанного расстройства. Согласно еще одному варианту осуществления комбинированная композиция по изобретению может необязательно содержать дополнительное лекарственное средство, или любой носитель, или адъювант.
Альтернативно или дополнительно, комбинированный иммуноглобулиновый препарат, полученный из молозива, а также иммуномодулирующая композиция, полученная из него, могут действовать непосредственно посредством активации или стимуляции специфических субпопуляций регуляторных клеток, или антигенпрезентирующих клеток, или любого типа межклеточного контакта. Действие такой комбинированной композиции, обогащенной анти-ЕР§-антителами, может быть непосредственно направлено на различные компоненты иммунной системы. Например, активация специфических регуляторных Т-клеток, В-клеток или антигенпрезентирующих клеток, или любых других клеток, связанных с воздействием на иммунную систему, индуцирует секрецию цитокинов или хемокинов или оказывает влияние на иммунную систему иным образом. Модификация или стимуляция иммунных клеток может дополнительно включать индукцию регуляторных клеток любого типа, предпочтительно регуляторных Т-клеток, например ТЬ3-, Тг1-, Т17-клеток, или регуляторных клеток любого другого типа, клетокэффекторов или клеток-супрессоров, очевидно, что Т17 клетки представляют собой недавно идентифицированную подгруппу СИ4 хэлперных Т-клеток. Они были обнаружены в области контакта внешней среды и внутренней среды, например, коже или выстилке желудочно-кишечного тракта. Более конкретно, необходимо отметить, что обогащенные анти-ЕР§-антителами иммуноглобулиновые препараты, полученные из молозива, по изобретению могут стимулировать регуляторные Т-клетки или любые другие клетки, связанные с иммунной системой, антигенспецифическим или не антигенспецифическим образом, направленным действием на случайные антигены или воздействием на неассоциированные антигены.
Таким образом, согласно еще одному варианту осуществления изобретение относится к комбинации обогащенного анти-ЕР§-антителами иммуноглобулинового препарата по изобретению по меньшей мере с одним дополнительным иммуноглобулиновым препаратом, содержащим иммуноглобулины по меньшей мере против одного антигена, связанного с указанным расстройством, с получением комбинированной композиции для лечения расстройств, связанных с иммунной системой. Следовательно, такая композиция может быть специфичной для антигена или заболевания, или альтернативно может усиливать или индуцировать специфические клетки или части иммунной системы неспецифическим для антигена образом, включая иммунный случайный эффект.
В одном из вариантов осуществления изобретения композиция модулирует регуляторные Т-клетки, приводя к модуляции баланса ТЫ/ТЙ2-, Тт1/ТЬ3-клеток к противовоспалительному ТЬ2, Тг1/ТН3 иммунному ответу или провоспалительному ТЫ иммунному ответу, тем самым ингибируя или активируя иммунный ответ, специфически направленный против указанного расстройства.
В еще одном варианте осуществления изобретения композиция модулирует баланс ТЫ/ТН2-, Тт1/ТЬ3-клеток к противовоспалительному ТЬ2, Тг1/ТН3 иммунному ответу, тем самым ингибируя иммунный ответ, специфически направленный против указанного расстройства, и где указанная композиция предназначена для лечения любого заболевания, выбранного из аутоиммунного заболевания, неалкогольного стеатогепатита, жирной печени, атеросклероза, метаболического синдрома и любого расстройства, связанного с ними, выбранного из диабета типа 2, инсулинорезистентности, ожирения и избыточной массы тела.
В еще одном варианте осуществления изобретения композиция предназначена для лечения и/или профилактики метаболического синдрома, или неалкогольного стеатогепатита, или обоих заболеваний. В еще одном варианте осуществления композиция предназначена для лечения и/или профилактики диабета, лечения нарушенной толерантности к глюкозе, такого как снижение толерантности к глюкозе, снижение уровня инсулина в сыворотке крови, снижения уровня триглицеридов в печени или снижения уровня
- 13 024697 холестерина.
В еще одном варианте осуществления изобретения композиция модулирует баланс Τ1ι1/Τ1ι2-,
Тг1/ТЬ3-клеток к провоспалительному ТН1/ТН2 иммунному ответу, тем самым усиливая иммунный ответ, специфически направленный против указанного расстройства, и где указанная композиция предназначена для лечения инфекционных заболеваний и пролиферативных расстройств.
Композиция может дополнительно содержать лекарственное средство, носитель или адъювант, и/или негипериммунное молозиво.
Необходимо также отметить, что обогащенный анти-ЬР§-антителами иммуноглобулиновый препарат по изобретению можно использовать для активного или пассивного лечения.
В еще одном варианте осуществления иммуномодулирующей композиции по изобретению указанное связанное с иммунной системой расстройство представляет любое заболевание, выбранное из аутоиммунного заболевания, инфекционного заболевания и пролиферативного расстройства.
Необходимо отметить, что композиция по изобретению может быть применима для лечения острых осложнений или профилактики развития или рецидива этих осложнений.
Согласно одному варианту осуществления комбинированная композиция приводит к модуляции баланса ТН1/ТН2-, Тг1/ТЬ3-клеток к противовоспалительному ТЬ2, Тг1/ТЬ3 иммунному ответу, тем самым ингибируя иммунный ответ, специфически направленный против указанного расстройства. Такая регуляция может касаться регуляторных Т-клеток, антигенпрезентирующих клеток, любого типа Тклеток или В-клеток, функция которых связана прямо или опосредованно с иммунной системой, или любого типа цитокинов или хемокинов, или адъюванта. Согласно данному конкретному варианту осуществления такая композиция может быть применима для лечения аутоиммунного заболевания. Примеры аутоиммунных расстройств включают, не ограничиваясь этим, очаговую алопецию, красную волчанку, анкилозирующий спондилит, болезнь Меньера, антифосфолипидный синдром, смешанное соединительно-тканное заболевание, аутоиммунную болезнь Аддисона, рассеянный склероз, аутоиммунную гемолитическую анемию, тяжелую псевдопаралитическую миастению, аутоиммунный гепатит, вульгарный пемфигус, болезнь Бехчета, пернициозную анемию, буллезный пемфигоид, нодозный полиартрит, кардиомиопатию, полихондрит, целиакийный спру-дерматит, полигландулярный синдром, синдром хронической усталости (СРГО8), ревматоидную полимиалгию, хроническую воспалительную демиелинизацию, полимиозит и дерматомиозит, хроническую воспалительную полинейропатию, первичную агаммаглобулинемию, синдром Хурга-Штраусса, первичный биллиарный цирроз, буллезный пемфигоид, псориаз, СКЕ§Т-синдром, феномен Рейно, болезнь Холодовых агглютининов, синдром Рейтера, болезнь Крона, ревматическую лихорадку, дискоидную красную волчанку, ревматоидный артрит, эссециальную смешанную криоглобулинемию, саркоидоз, фибромиалгию, склеродерму, болезнь Граве, синдром Шегрена, синдром Гуллиана-Барра, синдром ригидного человека, тиреоидит Хашимото, артериит Такаясу, идиопатический пульмонарный фиброз, темпоральный артериит/гигантоклеточный артериит, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (1ТР), язвенный колит, 1§А-нефропатию, увеит, инсулинзависимый диабет (типа I), васкулит, красный плоский лишай и витилиго. Комбинированные композиции, описанные в данном документе, можно вводить индивиду для лечения или профилактики расстройств, связанных с аномальным или нежелательным иммунным ответом, связанным с трансплантацией клеток, ткани или органа, например трансплантацией почек, печени и сердца, например, синдром трансплантат против хозяина (ОУНЭ) или для предупреждения отторжения аллотрансплантата.
В еще одном варианте осуществления комбинированные композиции по изобретению можно использовать для лечения любого заболевания, выбранного из неалкогольного стеатогепатита, жирной печени, атеросклероза, метаболического синдрома и любого расстройства, связанного с ними, например диабета типа 2, инсулинорезистентности, ожирения и избыточной массы тела.
Альтернативно, комбинированная композиция по изобретению может приводить к модуляции баланса ТН1/ТН2-, Тг1/ТЬ3-клеток к провоспалительному ТН1/ТН2 иммунному ответу, тем самым усиливая иммунный ответ, специфически направленный против указанного расстройства. Такая регуляция может включать регуляторные Т-клетки, антигенпрезентирующие клетки, Т-клетки или В-клетки любого типа, функция которых связана прямо или опосредованно с иммунной системой, или любой тип цитокинов, или хемокинов, или адъювант. Согласно данному конкретному варианту осуществления такая композиция может быть применима для лечения инфекционных заболеваний и пролиферативных расстройств.
Согласно одному конкретному варианту осуществления изобретения злокачественное пролиферативное расстройство, которое может представлять солидную и несолидную опухоль, например карциному, саркому, меланому, лейкоз, миелому или лимфому.
Согласно еще одному конкретному варианту осуществления композиция по изобретению предназначена для профилактики и/или лечения карциномы, такой как гепатоцеллюлярная карцинома, рак предстательной железы, карцинома молочной железы, карцинома ободочной кишки. В еще одном варианте осуществления композицию по изобретению можно использовать для профилактики и/или лечения лейкоза, более конкретно, острого или хронического лейкоза.
Как используются в данном документе термины рак, опухоль и злокачественное образование все в равной степени относятся к гиперплазии ткани или органа. В том случае, если ткань является ча- 14 024697 стью лимфатической или иммунной системы, то злокачественные клетки могут включать несолидные опухоли из циркулирующих клеток. Злокачественные образования других тканей или органов могут образовать солидные опухоли. В основном способы и композиции по настоящему изобретению можно использовать для лечения несолидных и солидных опухолей.
Злокачественное образование, как понимается в настоящем изобретении, можно выбрать из группы, состоящей из карцином, меланом, лимфом и сарком. Злокачественные заболевания, которые могут найти применимость в настоящем изобретении, могут включать, не ограничиваясь этим, злокачественные заболевания крови (включая лейкоз, лимфому и миелопролиферативные заболевания), гипопластическую и апластическую анемию (индуцированную вирусом и идиопатическую), миелодисплатические синдромы, все типы паранеопластических синдромов (опосредованные иммунной системой и идиопатические) и солидные опухоли (включая злокачественные опухоли легких, печени, молочной железы, ободочной кишки, предстательной железы, органов желудочно-кишечного тракта, поджелудочной железы и саркому Капоши). Более конкретно, злокачественное заболевание может представлять гепатоцеллюлярную карциному, рак ободочной кишки, меланому, миелому и острый или хронический лейкоз.
Согласно еще одному варианту осуществления иммуномодулирующая композиция по изобретению может специфически применяться для лечения инфекционных заболеваний, например заболеваний, вызванных вирусами, такими как НСУ, НВУ, СМУ и ЕВУ.
Согласно одному конкретному варианту осуществления комбинированная иммуномодулирующая композиция по изобретению может привести к ТЬ2, Тг1/ТЬ3 противовоспалительному ответу. Более конкретно, такой противовоспалительный ответ может сопровождаться снижением или уменьшением количества или экспрессии провоспалительных цитокинов, таких как 1Ь-2, 1Б-17. 1Б-23. ΙΡΝ-γ, 1Ь-6. Такое снижение или уменьшение по изобретению может представлять снижение, находящееся в пределах примерно от 5 до 99%, конкретнее, снижение, составляющее примерно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% по сравнению с необработанным контролем. В еще одном конкретном варианте осуществления композиция по изобретению может повышать или увеличивать количество или экспрессию противовоспалительных цитокинов, таких как ТСР-β, ГЬ-10, 1Ь-4, 1Ь-5, 1Ь-9 и ГБ-13. Более конкретно, повышение или увеличение противовоспалительных цитокинов может представлять повышение, составляющее примерно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99% по сравнению с необработанным контролем.
Очевидно, что противовоспалительное действие комбинированной иммуномодулирующей композиции по изобретению достигается активацией или стимуляцией специфических подгрупп регуляторных клеток, антигенпрезентирующих клеток или межклеточных контактов любого типа или прямой или опосредованной активацией цитокинов и/или хемокинов. Также необходимо отметить, что может вовлекаться любой тип регуляторных или эффекторных клеток, в частности регуляторных Т-клеток, включая ТН3и Тг1-клетки. Таким образом, обогащенные анти-ЬРЗ-антителами иммуноглобулиновые препараты, полученные из молозива, по изобретению могут стимулировать регуляторные Т-клетки или любые другие клетки, связанные с иммунной системой, антигенспецифическим или не антигенспецифическим образом, направленным действием на случайные антигены, или воздействием на неассоциированные антигены.
Более конкретно, связанные с иммунной системой клетки, активируемые или стимулируемые композицией по изобретению, могут представлять собой АРС (такие как ОС), Тгед-клетки или любые другие клетки, связанные прямо или опосредованно с иммунной системой, включая, не ограничиваясь этим, тромбоциты, макрофаги, В-клетки любого типа, Т-клетки (включая двойные негативные клетки) и некомпетентные антигенпрезентирующие клетки любого типа, адипоциты, эндотелиальные клетки, клетки любого типа, представляющие часть органа, в частности органа, связанного со связанным с иммунной системой расстройством, которое лечится, и клетки любого типа, обладающие регуляторными стимулирующими или ингибирующими свойствами. Конкретнее композиции по изобретению проявляют противовоспалительное действие на связанных с иммунной системой клетках, таких как регуляторные Тклетки, например адипоциты и антигенпрезентирующие клетки (АРС), такие как ОС.
Следовательно, в одном из вариантов осуществления композицию по изобретению можно использовать для индукции по меньшей мере одних регуляторных Т-клеток (Тгед) или любых клеток, обладающих регуляторными свойствами, супрессорными или индуктивными, адипоцитов и антигенпрезентирующих клеток (АРС) у индивида, страдающего заболеванием печени.
Как уже указывалось выше, композиции или необязательные комбинированные композиции по изобретению предназначаются для профилактики и/или лечения патологического расстройства, в частности заболеваний печени, или связанного с иммунной системой расстройства. Как используется в данном документе термин расстройство относится к состоянию, при котором имеет место нарушение нормального функционирования организма. Термин болезнь представляет любое аномальное состояние организма или умственной деятельности, которое вызывает дискомфорт, дисфункцию или дистресс человека, который поражается, или окружающим его людям. В некоторых случаях термин используется в широком смысле с включением травм, инвалидности, синдромов, симптомов, девиантного поведения и атипичных вариаций структуры и функции, в то время как в другом контексте они могут рассматривать- 15 024697 ся в качестве различимых категорий. Необходимо отметить, что термины болезнь, расстройство, состояние и заболевание используются в данном документе взаимозаменяемо. Также необходимо отметить, что термины связанное с иммунной системой расстройство или заболевание или заболевание печени могут представлять любое расстройство, связанное, вызванное или связанное с аномальным иммунным ответом. Такие расстройства обычно могут иметь место вместе с нарушенным иммунным ответом или, как полагается, могут оказывать влияние или сопровождаться аномальным иммунным ответом.
Композицию можно формулировать для введения перорально, ингаляцией в виде аэрозоля или для парентерального, интравагинального, внутриназального, мукозального, сублингвального, местного или ректального введения или их комбинацией.
В одном из вариантов осуществления иммуноглобулиновый препарат или любые его фракции распознают и связывают ЬР§ или его любые фрагменты.
В еще одном варианте осуществления композиция ингибирует транслокацию микроорганизмов. В еще одном варианте осуществления композиция ингибирует транслокацию микроорганизмов и тем самым модулирует иммунную активацию.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей обогащенный анти-ЬР§-антителами иммуноглобулиновый препарат, полученный из молозива, для модуляции иммунной толерантности у индивида, или в еще одном аспекте для модуляции оральной толерантности у индивида.
Согласно одному предпочтительному варианту осуществления любую из композиций по изобретению можно вводить перорально или ингаляцией в виде аэрозоля, или внутривенным, внутримышечным, подкожным, внутрибрюшинным, парентеральным, трансдермальным, интравагинальным, интраназальным, мукозальным, сублингвальным, местным, ректальным или подкожным введением или комбинацией указанных путей. Полагается, что введенные перорально антитела будут деградировать в желудочнокишечном тракте с учетом низкого рН в желудке и присутствия желудочных и кишечных протеаз. Однако, сообщалось, что 1§О коровьего молозива (ВС1д) особенно устойчив к разложению в желудочнокишечном тракте по сравнению с другими иммуноглобулинами. Результаты ранних исследований показали, что указанный ВС1дО обладает заметной резистентностью к протеолитическому расщеплению в кишечнике гетерологичного хозяина. Также имеются доказательства того, что бычий Ι§01 несколько более устойчив к протеолизу под действием трипсина, химотрипсина и пепсина по сравнению с другими 1дО. Данные результаты ранее во многом определили разработку терапии антителами при пероральном введении. Конкретнее композиция по изобретению может быть более подходящей для мукозального введения, например пульмонарного, буккального, назального, интраназального, сублингвального, ректального, интравагинального введения и любой комбинации этих путей.
Как уже отмечалось выше, несмотря на то что пероральное и назальное введение является предпочтительным, очевидно, что можно использовать любой другой путь введения, например внутривенный, внутримышечный, подкожный, внутрибрюшинный, парентеральный, интравагинальный, интраназальный, мукозальный, сублингвальный, местный, ректальный или подкожный пути введения или любую комбинацию этих путей.
Кроме того, обогащенный анти-ЬР§-антителами иммуноглобулиновый препарат, используемый в композициях и комбинированных композициях по изобретению, можно приготовить в виде препаратов, таких как кормовые добавки, водные растворы, эмульсии, гели и т. д., и данные препараты можно вводить перорально, место, ректально, назально, буккально или вагинально. Препараты можно вводить в лекарственных формах, содержащих обычные нетоксичные приемлемые носители, и также они могут содержать одну или более приемлемых добавок, включающих приемлемые соли, полимеры, растворители, буферы, наполнители, придающие объем вещества, разбавители, наполнители, суспендирующие вещества, смазывающие вещества, адъюванты, растворители, системы для доставки, эмульгаторы, разрыхлители, абсорбенты, консерванты, поверхностно-активные вещества, красители, вкусовые вещества или подсластители. Необязательной лекарственной формой в настоящем изобретении может быть порошок для включения в напитки, пилюли, сироп, капсулы, таблетки, гранулы, шарики, жевательные таблетки или кормовые добавки, с использованием методов, известных в данной области. Таким образом, иммуномодулирующую композицию по изобретению можно вводить в форме, выбранной из группы, состоящей из активных при пероральном введении порошков, пилюль, капсул, чая, экстрактов, сухих экстрактов, сублингвальных форм, спреев, дисперсий, растворов, суспензий, эмульсий, пен, сиропов, лосьонов, мазей, гелей, паст, дермальных пластырей, инъекционных препаратов, вагинальных кремов и суппозиториев.
Лекарственные композиции можно вводить в любой обычной лекарственной форме. Как правило, лекарственные формы включают по меньшей мере один активный ингредиент, имеющий значения, определенные выше, вместе с одним или более приемлемыми носителями.
Каждый носитель должен быть фармацевтически и физиологически приемлемым в том смысле, что он должен быть совместимым с другими ингредиентами и не токсичным для пациента. Лекарственные формы включают формы, подходящие для перорального, ректального, назального или парентерального введения (включая подкожное, внутримышечное, внутривенное и внутрикожное введение или ингаляци- 16 024697 онное введение). Лекарственные формы могут соответственно находиться в разовой лекарственной форме, и их можно приготовить с использованием любых способов, известных в области фармации. Природа, доступность, источники и введение всех таких соединений, включая эффективные количества, необходимые для получения требуемых эффектов у индивида, являются хорошо известными в данной области и не нуждаются в дополнительном описании в данном документе.
Получение фармацевтических композиций хорошо известно в данной области и описано во многих статьях и руководствах, см., например, Кеш1п§1оп'8 РЬагтасеиИса1 8с1спсс5. Оеппаго А.К еб., Маек РиЬНкЫпд Со., ЕаИоп, РА, 1990, и в частности, с. 1521-1712 в нем, этот источник в полном объеме включен в данный документ для сведения.
Фармацевтическую композицию по изобретению можно вводить и дозировать согласно принципам надлежащей медицинской практики.
Композиция по изобретению может содержать активное вещество в свободной форме и его можно вводить непосредственно индивиду, который подвергается лечению. Как правило, композиции содержат по меньшей мере один активный ингредиент, имеющий значения, определенные выше, вместе с одним или более носителями. Каждый носитель должен быть фармацевтически и физиологически приемлемым в том смысле, что он должен быть совместимым с другими ингредиентами и не токсичным для пациента.
Лекарственные формы включают формы, подходящие для перорального, назального или парентерального введения (включая подкожное (п/к), внутримышечное (в/м), внутрибрюшинное (в/б), внутривенное (в/в) и внутрикожное введение или ингаляционное введение через слизистые легких). Лекарственные формы могут соответственно находиться в разовой лекарственной форме, и их можно приготовить с использованием любых способов, известных в области фармации. Природа, доступность, источники и введение всех таких соединений, включая эффективные количества, необходимые для получения требуемых эффектов у индивида, являются хорошо известными в данной области и не нуждаются в дополнительном описании в данном документе.
Фармацевтические композиции по изобретению обычно содержат буферное вещество, вещество, которое доводит осмолярность композиции, и необязательно один или более фармацевтически приемлемых носителей, наполнителей и/или добавок, известных в данной области. В композиции можно включить дополнительные активные ингредиенты. Носитель может быть растворителем или диспергирующей средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и тому подобное), их подходящие смеси и растительные масла. Можно достичь требуемой сыпучести, например, с использованием оболочки, такой как лецитин, сохранением необходимого размера частиц в случае дисперсии и применением поверхностно-активных веществ.
Как используется в данном документе выражение фармацевтически приемлемый носитель включает любой или все растворители, дисперсионную среду, оболочки, антибактериальные и противогрибковые средства и тому подобное. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных соединений хорошо известно в данной области. За исключением того, когда обычные среды или средства несовместимы с активным ингредиентом, во всех других случаях предусматривается их применение в лекарственной композиции.
В тех случаях, когда пероральное введение проводится в форме таблетки или капсулы, то активные лекарственные компоненты (обогащенный анти-ЬР§-антителами иммуноглобулиновый препарат или комбинацию с другим иммуноглобулиновым препаратом) можно комбинировать с нетоксичным фармацевтически приемлемым инертным носителем, таким как лактоза, крахмал, сахароза, глюкоза, модифицированные сахара, модифицированные крахмалы, метилцеллюлоза и ее производные, дикальций фосфат, сульфат кальция, маннит, сорбит и другие редуцирующие и нередуцирующие сахара, стеарат магния, стеариновая кислота, стеарилфумарат натрия, глицерилбегенат, стеарат кальция и тому подобное. Для перорального введения в жидкой форме активные лекарственные компоненты можно объединить с нетоксичными, фармацевтически приемлемыми, инертными носителями, такими как этанол, глицерин, вода и тому подобное. В тех случаях, когда это требуется или является необходимым, то также в смесь можно включить подходящие связывающие вещества, смазывающие вещества, разрыхлители, красители и вкусовые вещества. Также можно добавить стабилизирующие агенты, такие как антиоксиданты, пропилгаллат, аскорбат натрия, лимонная кислота, метабисульфит кальция, гидрохинон и 7гидроксикумарин, для стабилизации лекарственных форм. Другие подходящие соединения включают желатин, подсластители, природные и синтетические камеди, такие как аравийская камедь, трагакант или альгинаты, карбоксиметилцеллюлоза, полиэтиленгликоль, воск и тому подобное.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению обогащенного анти-ЬР§антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива млекопитающих, и необязательно полученного из молозива иммуноглобулинового препарата, распознающему по меньшей мере один антиген, специфический для патологического расстройства, в производстве иммуномодулирующей композиции для лечения и профилактики патологического расстройства. Необходимо отметить, что обогащенный анти-ЬР§-антителами иммуноглобулиновый препарат или любые его фракции распознают и связывают ЬР§ и любые его фракции. Необязательно композиция, полученная применением изобретения, может содержать комбинацию обогащенного анти-ЬР§-антителами иммуноглобулинового препара- 17 024697 та по изобретению, и по меньшей мере одного иммуноглобулинового препарата, содержащего иммуноглобулины, распознающие по меньшей мере один антиген, специфичный для указанного расстройства. Такое распознавание приводит к модуляции регуляторных Т-клеток и в результате вызывает модуляцию баланса ТЫ/ТЙ2-, Тт1/Тй3-клеток к противовоспалительному ТЬ2, Тт1/Тй3 иммунному ответу или провоспалительному ТЫ иммунному ответу, тем самым создав комбинированную иммуномодулирующую композицию, ингибирующую или активирующую иммунный ответ, специфически направленный против указанного расстройства.
Необходимо отметить, что может вовлекаться любой тип регуляторных или эффекторных клеток, в частности регуляторные Т-клетки, включая Тй3- и Тт1/ТЬ3-клетки, Т-клетки, которые предпочтительно индуцируются на слизистых и секретируют трансформирующий фактор роста (ТСР-β). Кроме того, необходимо отметить, что обогащенные анти-РРЗ-антителами иммуноглобулиновые препараты, полученные из молозива, по изобретению могут стимулировать регуляторные Т-клетки или любые другие клетки, связанные с иммунной системой, антигенспецифическим или не антигенспецифическим образом, направленным действием на случайные антигены, или воздействием на неассоциированные антигены.
Согласно одному конкретному варианту осуществления обогащенный анти-РРЗ-антителами иммуноглобулиновый препарат, полученный из молозива, может содержать мономерный, димерный или полимерный иммуноглобулин, выбранный из группы, состоящей из 1дС. 1дА и 1дМ и любых их фрагментов, смеси или комбинации.
В еще одном варианте осуществления применение по изобретению обогащенного анти-РРЗантителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, молока или молочных продуктов, предназначено для производства композиции или комбинированной композиции, которая необязательно может дополнительно содержать молозиво, компонент(ы) молока или молочных продуктов и любые адъюванты, предпочтительно алармины, дефенензины, колостринин и любой другой препарат, их смеси и комбинации. Также, очевидно, что композиция по изобретению может содержать любой дополнительный адъювант. Следовательно, подходящие адъюванты могут представлять любой антиген, антитело, гликосфинголипиды, белки, цитокины, молекулы адгезии и компонент, который может активировать или модифицировать функцию антигенпрезентирующих клеток или любых клеток, связанных с иммунной системой, прямо или опосредованно. Необходимо отметить, что согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение дополнительно относится к применению молозива или любого полученного из молозива препарата в комбинированных композициях по изобретению для повышения иммуномодулирующего действия иммуномодулирующего лекарственного средства.
Термин алармин означает ряд полифункциональных белков хозяина, различающихся в структурном отношении, которые быстро высвобождаются во время инфекции или повреждения ткани и которые обладают мобилизующим и активирующим действием на экспрессирующие рецепторы клетки, принимающие участие в защите хозяина и восстановлении ткани. Природные медиаторы иммунной системы, обладающие функцией алармина, включают нейротоксин эозинофилов, кателицидины и НМСВ1.
Дефензины представляют небольшие (15-20 остатков) богатые цистеином катионные белки, обнаруживаемые у позвоночных и беспозвоночных. Они активны против бактерий, грибов и вирусов с оболочкой. Они состоят из 15-20 аминокислот, включая 6-8 консервативных цистеиновых остатков. Клетки иммунной системы содержат данные пептиды, помогающие им уничтожать фагоцитированные бактерии, например нейтрофильные гранулоциты, и почти все эпителиальные клетки. Большинство дефензинов функционируют посредством проникновения через мембрану микробной клетки с помощью электрического привлечения и после включения образованием поры в мембране, которая обеспечивает отток.
Как используется в данном документе термин колостринин относится к полипептиду, который в его природной форме получают из молозива. Колостринин иногда известен под названием колостринин, и он имеет молекулярную массу в пределах от 16000 до 26000 Да. Колостринин может образовать димер или триммер из субъединиц (каждая с молекулярной массой в пределах от 5000 до 10000 Да, предпочтительно 6000 Да) и в основном содержит пролин (количество пролина выше по сравнению с количеством любой другой единичной аминокислоты).
Для колостринина характерно то, что он стимулирует продукцию цитокинов, в частности гамма интерферона (ΙΡΝ-γ), фактора некроза опухолей (ΓΝΡ-α), интерлейкинов (например, 1Ь-6 и 1Б-10) и различных факторов роста.
Как уже указывалось выше, необходимо отметить, что обогащенный анти-РРЗ-антителами иммуноглобулиновый препарат и другие необязательные иммуноглобулиновые препараты, используемые в изобретении, можно получить от млекопитающего, иммунизированного ЬРЗ или любым его фрагментом, и необязательно в дополнении по меньшей мере одним антигеном или смесью по меньшей мере двух антигенов, специфичных для расстройства, которое лечится. Способы и методы изобретения подходят для обеспечения высокой и продолжительной продукции антигенспецифических антител в молозиво, молоко или молочные продукты любого лактирующего млекопитающего. Предпочтительно указанное животное является сельскохозяйственным животным. Сельскохозяйственные животные представляют животных, которые используются человеком на промышленной основе для получения молока, мяса и
- 18 024697 даже антител. Сельскохозяйственные животные, которые уже используются на промышленной основе для получения молока, являются предпочтительными для настоящего изобретения, поскольку для данных животных имеются специальные линии и/или породы, оптимизированные для продукции молока.
Предпочтительно указанное сельскохозяйственное животное представляет корову или козу. Более предпочтительно указанное сельскохозяйственное животное представляет корову.
В одном из вариантов осуществления указанного применения изобретения композиция подавляет или ингибирует мукозальную транслокацию микроорганизмов. В одном варианте осуществления указанного применения изобретения композиция подавляет или ингибирует мукозальную транслокацию микроорганизмов и тем самым модулирует активацию иммунной системы.
Согласно одному варианту осуществления изобретение относится к применению обогащенного анти-ЬР§-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива млекопитающих, для производства композиции для лечения, предупреждения и профилактики острого или хронического заболевания печени, цирроза и любого заболевания или осложнения, связанного с ними, где необязательно указанная композиция дополнительно содержит дополнительный лекарственный препарат, или любой носитель, или адъювант.
Согласно одному варианту осуществления применения по изобретению данная конкретная композиция подавляет или ингибирует мукозальную транслокацию микроорганизмов и тем самым модулирует прямое действие бактерий или любых других инфекционных возбудителей на патогенез осложнений острого или хронического заболевания печени в результате портальной гипертензии или другой причины.
Конкретнее согласно изобретению острое или хроническое заболевание печени, цирроз или любое заболевание или осложнение, связанное с ними, выбрано из группы, состоящей из печеночной энцефалопатии, спонтанного бактериального перитонита (8ВР), асцита, гипердинамического состояния кровообращения, связанного с циррозом, гепаторенального синдрома, гепатопульмонарного синдрома, портопульмонарной гипертензии, кровотечения из варикозно-расширенных вен, недостаточности надпочечников и измененного состояния сознания.
Необходимо отметить, что данные осложнения могут развиться в результате хронической НСУ инфекции, алкогольного гепатита, хронического НВУ, неалкогольного стеатогепатита, индуцированного лекарственным препаратом повреждения печени или другой причины острого или хронического заболевания печени.
Согласно необязательному варианту осуществления изобретение относится к применению комбинации обогащенного анти-ЬР§-антителами иммуноглобулинового препарата по меньшей мере с одним иммуноглобулиновым препаратом, полученным из молозива, содержащим иммуноглобулины, которые распознают и связывают по меньшей мере один антиген, специфичный для указанного патологического расстройства. Согласно данному конкретному варианту осуществления применение такой комбинации предназначено для получения иммуномодулирующей композиции, которая модулирует регуляторные Тклетки, приводя к модуляции баланса ТЫ/ТН2-, Тг1/ТЬ3-клеток к противовоспалительному ТЬ2, Тг1/ТН3 иммунному ответу или провоспалительному ТЫ иммунному ответу, тем самым ингибируя или активируя иммунный ответ, специфически направленный против указанного расстройства. Необязательно такая комбинированная композиция дополнительно содержит дополнительный лекарственный препарат, или любой носитель, или адъювант. Такая композиция модулирует регуляторные Т-клетки, приводя к модуляции баланса ТЫ/ТЙ2-, Тг1/ТЬ3-клеток к противовоспалительному ТЬ2, Тг1/ТН3 иммунному ответу или провоспалительному ТЫ иммунному ответу, тем самым ингибируя или активируя иммунный ответ, специфически направленный против указанного расстройства.
В еще одном варианте осуществления связанное с иммунной системой расстройство может представлять любое заболевание, выбранное из аутоиммунного заболевания, неалкогольного стеатогепатита, жирной печени, метаболического синдрома и любого расстройства, связанного с ними, инфекционного заболевания и пролиферативного расстройства.
Согласно одному варианту осуществления применения по изобретению композицию по изобретению можно использовать для лечения острого осложнения или профилактики развития или рецидива данных осложнений.
Согласно еще одному варианту осуществления комбинированная композиция по изобретению приводит к модуляции баланса ТЫ/ТН2-, ТЫ/ТЬ3-клеток к противовоспалительному ТЬ2, Тг1/ТН3 иммунному ответу, тем самым ингибируя иммунный ответ, специфически направленный против указанного расстройства. Согласно данному конкретному варианту осуществления такая композиция может быть применима для лечения аутоиммунного заболевания.
Альтернативно, комбинированная композиция по изобретению может привести к модуляции баланса ТЫ/ТЙ2-, Тг1/ТЬ3-клеток к провоспалительному ТЫ/ТЙ2 иммунному ответу, тем самым усиливая иммунный ответ, специфически направленный против указанного расстройства. Согласно данному конкретному варианту осуществления такая композиция может быть применима для лечения инфекционных заболеваний и пролиферативных расстройств.
В еще одном дополнительном варианте указанного применения настоящего изобретения компози- 19 024697 цию по изобретению можно вводить перорально или ингаляцией в виде аэрозоля, или внутривенным, внутримышечным, подкожным, внутрибрюшинным, парентеральным, трансдермальным, интравагинальным, внутриназальным, мукозальным, сублингвальным, местным, ректальным или подкожным введением или любой их комбинацией.
Толерантность определяется, как отсутствие ответа на себя, или представляет любой механизм, посредством которого потенциально токсичный иммунный ответ предупреждается, подавляется или сдвигается в нетоксичную группу иммунных ответов. Таким образом, толерантность в большей степени относится к продуктивному самораспознаванию, чем к слепоте иммунной системы на ее собственные компоненты. Заявители настоящего изобретения показали, что воздействие связанных с заболеванием антигенов, независимо от того являются они аутоантигенам или нет, может активировать некоторые части иммунной системы, в то же время подавляя нежелательный иммунитет антигенспецифическим образом. Не желая связываться с теорией, пероральное введение антигена с одной стороны активирует специфические субпопуляции клеток, подавляя специфические клетки и ослабляя нежелательный аутоиммунитет, а с другой стороны, стимулирует иммунные ответы на антиген, связанный с вирусом или опухолью. Для многих опосредованных иммунной системой заболеваний или расстройств, в которых иммунная система играет роль, баланс между различными типами сигналов/клеток, которые стимулируются в общей иммунной системе, будет определять конечный иммунологический эффект.
Оральная толерантность является природным иммунологическим процессом, который регулируется присутствием экзогенного антигена, который, как полагают, принимает участие в обработке внешних агентов, которые получают доступ в организм естественным путем и затем становятся частью его самого. При понимании того, что пероральное воздействие антигенов в желудочно-кишечном тракте, таком как кишечник, приводит к активному иммунному ответу, антигенспецифическая терапия представляется привлекательным подходом для иммунотерапии к антигенам, присутствующим на слизистой пищеварительного тракта, где они могут справиться с нетоксичной или невоспалительной иммунологической средой. Следовательно, специфические иммунные клетки могут активироваться, и антигенспецифическая терапия может служить в качестве иммунотерапевтического подхода для хронического гепатита, инфекционных агентов, метаболического синдрома и других патологических расстройств, которые обсуждаются в данном документе.
Механизмы, ответственные за гомеостаз в желудочно-кишечном тракте, включают сложное взаимодействие различных типов Т-клеток, в том числе регуляторных Т-клеток, дендритных клеток (ГОС), природных Т-клеток-киллеров (МКТ) и микросреды кишечника.
Фолликул-ассоциированный эпителий (РАЕ) играет ключевую роль в захвате антигена и последующей индукции мукозального иммунитета. М-клетки РАЕ посредством направленного действия на доставку антигена (Ад) способствуют развитию оральной толерантности посредством снижения числа Ад-специфических С.ГО4+ Т-клеток и повышения числа СЭ25+СЭ4+ регуляторных Т-клеток (Тгед), продуцирующих трансформирующий фактор роста (ТОР-β) и 1Ь-10, в системных или мукозальных лимфоидных тканях.
Кишечные ОС являются ключевыми регуляторами патогенного иммунитета, оральной толерантности и кишечного воспаления. Соответствующие ОС могут находиться в РР, МЬЫ или ЬР виллей на слизистой. Все эти ткани содержат ряд различных субпопуляций ОС, включая некоторые субпопуляции, которые предпочтительно могут индуцировать дифференцировку Тгед. ИКТ-клетки представляют уникальное направление дифференцировки Т-клеток, которые имеют общие свойства с ΝΚ-клетками и Тклетками памяти. Данная субпопуляция лимфоцитов может представлять С.ГО4+ или двойные негативные клетки, и она является СЭЫ-реактивной. Эти клетки являются уникальными по их инвариантной να14Г/. 18 ТСК α-цепи, и их β-цепи рецептора Т-клеток (ТСК) смещается к νβ8.2, νβ2 и νβ7. ΝΚ-клетки являются уникальными клетками в отношении их реактивности к гликолипидным антигенам и высокой продукции цитокинов. Способность ИКТ-клеток генерировать ТН1 и ТЬ2 ответы указывает на их значение в качестве иммунорегуляторных клеток. Применение лигандов ИКТ-клеток индуцирует выраженный иммуномодулирующий эффект посредством изменения пластичности этих клеток.
Заявители настоящего изобретения показали роль ΝΚΓ-клеток в индукции оральной толерантности, и недавно полученные данные свидетельствуют о перекрестном разговоре между Тгед и ИКТклетками. Нежелая связываться с теорией, полагается, что ИКТ -клетки продуцируют цитокины сразу же после воздействия активирующих сигналов и могут определять дифференцировку Тгед.
Печень представляет важный орган для оральной толерантности. Печень является местом, в котором накапливаются апоптозные СЭ8+Т-клетки по время фазы клиренса периферических иммунных ответов. Печень нормальной мыши содержит необычную смесь лимфоцитов, в которой природные клеткикиллеры (ИК) и природные Т-клетки-киллеры (ИКТ) являются избыточными и также присутствуют апоптозные Т-клетки. Данные клетки являются необходимыми для внутрипеченочного захвата и гибели Т-клеток. Полагается, что продолжительное воздействие на клетки печени различных типов ЬР8 бактерий кишечника, стимулирует экспрессию цитокинов, антигенпрезентирующих молекул и костимулирующих сигналов, которые вызывают инактивацию Т-клеток. Другие возможные объяснения толероген- 20 024697 ной среды в печени включают деление клонов, специфическую презентацию антигенов эндотелиальными клетками или купферовскими клетками и способность к индукции Т-клеток.
Различные стимулы в микросреде печени связаны с праймированием Т-клеток и генерацией эффективного иммунного ответа, в то время как другие приводят к развитию толерантности. Презентация антигена в печени дендритными клетками и их миграция в печень является частью взаимодействия в оси кишечник-печень. Печеночные ОС по своей природе являются толерогенными по сравнению с ОС кожи, продуцируют ГБ-10 и экспрессируют низкие концентрации костимулирующих молекул. Локальная секреция ГБ-10 и ТСР-β купферовскими клетками и гепатоцитами может сместить функцию ОС к генерации регуляторных, а не эффекторных путей. Синусоидальные эндотелиальные клетки печени (Б8ЕС) способны переносить антигены в ранний эндосомальный компартмент для презентации МНС класса I, что объясняет их способность к презентации для СО8+Т-клеток. Результатом презентации антигена Б8ЕС обычно является толерантность с апоптозом СО8+Т-клеток и секрецией 1Ь-4 и ГБ-10 СО4+Т-клетками. Также активированные Т-клетки захватываются посредством зависимых от молекул межклеточной адгезии 1 (1САМ-1) синусоидами в качестве механизма регуляции апоптозных путей во время регуляции системных СО8 ответов. Гепатоциты сами по себе могут функционировать в качестве АРС с активацией наивных Т-клеток. В большинстве случаев активация гепатоцитами приводит к развитию антигенспецифической толерантности, но данный процесс также может включать активацию Тгед. Периферические Тгед продуцируются при активации наивных Т-клеток незрелыми ОС или в присутствии ГБ-10 и ТСР-β, которые оба находятся в печени.
Тгед являются важными компонентами в иммунной оси кишечник-печень. СО4+СО25+Тгед подавляют активацию СО4+Т-клеток при участии Ь8ЕС, купферовских клеток или гепатоцитов. Поскольку данный процесс может ослабляться при активации ТБК4, то взаимодействие Тгед, патогенов и других клеток печени определяет общий результат иммунной активации в печени. Тгед могут сдерживать нежелательные иммунные ответы и регулировать ответы на микрофлору и могут играть роль в развитии ряда хронических инфекционных заболеваний кишечника. Тгед могут предупреждать токсические иммунные ответы против микроорганизмов-комменсалов в нижнем отделе кишечника, тем самым защищая от воспалительных заболеваний кишечника. Было высказано предположение, что различные субпопуляции Тлимфоцитов обладают регуляторными функциями, включая природные Тгед, индуцированные Тгед, Тг1и Тй3-клетки. Эти клетки могут активироваться под действием цитокинов, и их индуктивная фаза может регулироваться антигеном. Полагают, что большинство СО4+регуляторных Т-клеток (Тг1, Тй3 и СО4+СО25+) взаимодействует с дендритными клетками. Другие субпопуляции Тгед, такие как СО8+ТтЕклетки, могут распознавать антигены, которые презентируются эпителиальными клетками кишечника.
Полагают, что СО4+СО25+ Тгед являются инструментами в регуляции иммунных ответов в слизистых. ТСР-β появляется как один из наиболее важных цитокинов, продуцируемых в кишечнике, и его взаимодействие с СО4+СО25+ Тгед является ключевым событием в поддержании баланса между Тклеточным иммунитетом и толерантностью. Экспрессия стабильной формы β-катенина в СО4+СО25+ Тгед приводит к заметному повышению выживаемости данных клеток. Количество Тгед, необходимых для защиты от воспалительного заболевания кишечника, может быть существенно ниже, когда используются СО4+СО25+ Тгед, стабильно экспрессирующие β-катенин. ГБ-35 представляет собой ингибирующий цитокин, продуцируемый Тгед-клетками, и он необходим для максимальной ингибирующей активности. Как обсуждается ниже, заявители настоящего изобретения показали модуляцию СО4+СО25+ Тгед-клеток композициями по настоящему изобретению.
Рохр3+ Тгед-клетки важны для установления и поддержания мукозальной толерантности. Индуцированный недостатком цитокинов апоптоз является известным механизмом, посредством которого Тгед индуцируют апоптоз эффекторных СО4+ Т-клеток.
Секреция ТСР-β Тй3-клетками или другими Тгед-клетками рассматривается в качестве основного фактора в оральной толерантности. ТСР-β-продуцирующие клетки являются ключевыми для оральной толерантности и могут быть основными регуляторами большинства механизмов, запускаемых пероральным поступлением антигена. Связанный с латентностью пептид (БАР) представляет аминоконцевой домен пептида-предшественника ТСР-β, остается нековалентно связанным с пептидом ТСР-β после расщепления и образует латентный комплекс. Присутствие связанных с мембраной ТСР-β или БАР на поверхности Тгед связывает ТСР-β с ингибирующей функцией Тгед. ТСР^-секретирующие Тй3-клетки и СО8+регуляторные клетки связаны с оральной толерантностью и зависят от ТСР-β. Как обсуждается ниже, заявители настоящего изобретения показали модуляцию БАР+ и БАР- Тгед-клеток композицией по настоящему изобретению.
Описана связанная с мембраной форма ТСР^-содержащих БАР. БАР+СО4+ клетки опосредуют супрессию в кишечнике посредством ТСР^-зависимого механизма. Заявители настоящего изобретения показали, что ТСР^-зависимые Тгед, экспрессирующие поверхностный БАР, индуцируются/стимулируются пероральным введением анти-ЕР8-антител. ТСР-β может индуцировать дифференцировку ГБ-10-продуцирующих клеток, указывая, что перекрестный разговор между различными цитокин-продуцирующими Тгед может проявляться в индукции оральной толерантности, например индукции
- 21 024697
СО4+СО25-ЕАР+ Тгед, которые подавляют аутоиммунитет.
Субпопуляции СЭ8+ лимфоцитов также вовлечены в индукцию толерантности. Эпителиальные клетки кишечника (1ЕС) могут стимулировать СЭ8+ Тгед на процессинг и презентацию антигена для Тклеток. Т-клетки, активированные 1ЕС, обладают ингибирующей функцией, в то время как 1ЕС могут индуцировать пролиферацию небольшой фракции периферических СЭ8+ Т-клеток. СЭ8+СЭ28+ субпопуляция 1ЕС-активированных СЭ8+ Т-клеток экспрессирует СЭ101 и СЭ103, взаимодействует с 1ЕС через §р180 и обладает регуляторной функцией. СЭ8+ Т-клетки с регуляторной активностью находятся в ЬР нормальных, здоровых индивидов, но не у пациентов с воспалительным заболеванием кишечника (ΙΒΌ), указывая на активную роль этих клеток в мукозальной толерантности. Также возможным механизмом является антиген-перекрестная презентация или возможность, посредством которой молекулы, представленные компетентными АРС, могут проникать в путь главного комплекса гистосовместимости класса I (МНС-Ι) и презентоваться для СЭ8+ Т-клеток. Альтернативно, перекрестное праймирование СЭ8+ под действием АРС, связанное с активацией СЭ4+ Т-клеток, может служить механизмом, ответственным за супрессию. СЭ4+ Т-клетки играют регуляторную роль посредством секреции ТСР-β. Антиген-праймированные популяции СЭ8+ Т-клеток продуцируют ГБ-4 или 1Ь-10 и могут участвовать в индукции толерантности.
Следовательно, в еще одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей обогащенный анти-ЕРЗ-антителами иммуноглобулиновый препарат, полученный из молозива, для индукции СО4+СЭ25+ Т-клеток в печени, СЭ4+СЭ25+ЕАР- Т-клеток в печени, индукции СЭ45+ЕАР+ Тклеток в печени, индукции СЭ3+ЕАР+ Т-клеток в печени, индукции СЭ45+ЕАР+ Т-клеток в селезенке, индукции СЭ8+ЕАР+ Т-клеток в селезенке, индукции СЭ3+ЕАР+ Т-клеток в селезенке, индукции СО8+СО25+ Т-клеток в селезенке, индукции СЭ4+СЭ25+ Т-клеток в жировой ткани, индукции СЭ3+ЕАР+ Т-клеток в жировой ткани, индукции СЭ4+СЭ25+ Т-клеток в стромальных сосудистых клетках, индукции СО4+СО25+ЕАР+ Т-клеток в стромальных сосудистых клетках, снижения ΟΟ3+ΝΚ1.1+ клеток в печени, снижения СЭ25+ЕАР- Т-клеток в печени, повышения СЭ25+ЕАР+ Т-клеток в печени, индукции СО4+СО25+ЕАР- Т-клеток в селезенке, индукции СО4+СО25+ЕАР- Т-клеток в жировой ткани.
Адипоциты представляют клетки, которые в основном составляют жировую ткань, специализирующуюся в сохранении энергии в виде жира. Существует два типа жировой ткани, белая жировая ткань (^АТ) и коричневая жировая ткань (ВАТ), также известные соответственно как белый жир и коричневый жир, и их составляют два типа жировых клеток. Клетки белого жира или моновакуольные клетки содержат большое количество жировых капель, окруженных слоем цитоплазмы. Ядро уплощено и расположено по периферии. Типичная жировая клетка имеет диаметр 0,1 мм, который в некоторых клетках может быть в два раза больше этого размера и в других составлять половину этого размера. Сохраняемый жир находится в полужидком состоянии, и в основном состоит из триглицеридов и холестерилового эфира. Клетки белого жира секретируют резистин, адипонектин и лептин. Клетки коричневого жира или поливакуольные клетки имеют полигональную форму. В отличие от клеток белого жира эти клетки имеют крупную цитоплазму с жировыми каплями, рассеянными по цитоплазме. Ядро округлой формы и несмотря на асимметричное расположение оно не находится на периферии клетки. Коричневый цвет является результатом большого количества митохондрий.
Как показано в примерах, композиции по изобретению достоверно снижали концентрацию триглицеридов, активность АЛТ, АСТ и уровень глюкозы в сыворотке крови. Следовательно, по одному варианту осуществления фармацевтическая композиция по изобретению приводит по меньшей мере к снижению концентрации холестерина, триглицеридов, АЛТ, АСТ и глюкозы в сыворотке крови, и снижению инсулинорезистентности у индивида, страдающего заболеванием печени или связанным с иммунной системой расстройством, например метаболическим синдромом. В том случае, когда указывается уменьшение, снижение, ингибирование, то это означает, что композиция по изобретению приводит к снижению примерно на 5-99% концентрации триглицеридов, активности АЛТ, АСТ и уровня глюкозы в сыворотке крови индивида, страдающего связанным с иммунной системой расстройством. Конкретнее, такое снижение может представлять снижение примерно на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или более 99% по сравнению с концентрацией до лечения или этим показателем у необработанного контроля. В том случае, когда указывается увеличение, повышение, усиление, индукция, то это означает, что композиция по изобретению приводит к индукции или повышению примерно на 5-99%. Конкретнее, такое увеличение может представлять увеличение примерно на 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или более 99% с концентрацией до лечения или этим показателем у необработанного контроля.
Согласно одному конкретному варианту осуществления композицию по изобретению можно использовать для профилактики и/или лечения аутоиммунного заболевания, например метаболического синдрома или любых состояний, составляющих его, любого состояния, связанного, вызванного, связанного или, как полагают, оказывающего влияние на метаболический синдром, например, по меньшей мере одного из дислипопротеинемии (гипертриглицеридемии, гиперхолестеринемии, низкого уровня холестерина высокой плотности), ожирения, ΝΙΌΌΜ (неинсулинзависимого сахарного диабета), ЮТ (нарушен- 22 024697 ной толерантности к глюкозе), свертываемости крови, нарушений фибринолизиса крови и гипертензии.
Метаболический синдром характеризуется группой метаболических факторов риска у человека, включающих абдоминальное ожирение (избыточное количество жировой ткани в и вокруг брюшной полости);
атерогенную дислипидемию (расстройство жира крови - высокий уровень триглицеридов, низкий уровень холестерина высокой плотности и высокий уровень холестерина низкой плотности - образование бляшек в стенках артерий);
повышенное кровяное давление;
инсулинорезистентность и интолерантность к глюкозе;
протромбическое состояние (например, высокий уровень фибриногена или ингибитора активатора плазминогена 1 в крови) и провоспалительное состояние (например, повышенный С-реактивный белок в крови).
Люди с метаболическим синдромом имеют повышенный риск развития коронарной болезни сердца и других заболеваний, связанных с образованием бляшек в стенках артерий (например, инсульта и заболевания периферических сосудов) и диабета типа 2.
Конкретнее, композиция по изобретению предназначена для лечения дислипопротенемии, которая может включать гиперглицеридемию, гиперхолестеринемию и низкий уровень холестерина высокой плотности, ожирение, ИГОЭМ (неинсулинзависимый сахарный диабет типа 2), 1ОТ (нарушенная толерантность к глюкозе), свертываемость крови, нарушения фибринолизиса крови и гипертензия.
Согласно одному конкретному варианту осуществления композицию по изобретению можно использовать для лечения диабета, в частности диабета типа 2. Сахарный диабет, часто просто диабет, представляет синдром, характеризующийся нарушенным метаболизмом и неадекватно высоким уровнем сахара (гипергликемией), возникающих в результате низких уровней гормона инсулина или аномальной резистентности к действию инсулина, наряду с неадекватным уровнем секреции инсулина для компенсации. Характерными симптомами является избыточное образование мочи (полиурия), большая жажда и повышенный прием жидкости (полидипсия) и нарушение зрения. Такие симптомы отсутствуют, если уровень сахара в крови повышен незначительно.
Всемирная Организация Здравоохранения признает три основных формы сахарного диабета: диабет типа 1, диабет типа 2 и диабет беременных (возникающий во время беременности), которые имеют различные причины и популяционное распространение. Несмотря на то что в конечном итоге все формы возникают за счет того, что бета-клетки поджелудочной железы не способны в достаточной мере продуцировать инсулин для предупреждения гипергликемии, причины заболевания являются различными. Как правило, диабет типа 1 возникает в результате аутоиммунного разрушения бета-клеток поджелудочной железы. Диабет типа 2 характеризуется резистентностью к инсулину в тканях-мишенях, это вызывает потребность в аномально высоких количествах инсулина, и диабет развивается, когда бета-клетки не могут удовлетворить эту потребность. Диабет беременных аналогичен диабету типа 2 в том отношении, что при нем вовлекается резистентность к инсулину, гормоны беременности могут вызвать резистентность к инсулину у женщин, генетически предрасположенных к развитию данного заболевания.
Острое осложнение диабета (гипогликемия, кетоацидоз или некетогенная гиперосмолярная кома) могут иметь место, если заболевание не контролируется адекватным образом. Серьезные продолжительные осложнения включают сердечно-сосудистое заболевание (двойной риск), хроническую почечную недостаточность, повреждение сетчатки (которое может привести к слепоте), повреждение нервов (нескольких видов) и повреждение микрососудов, которое может вызвать слабость и медленное заживление ран. Медленное заживление ран, в частности ног, может привести к гангрене, потребующей ампутации.
Согласно еще одному конкретному варианту осуществления композицию по изобретению можно использовать для лечения диабета, в частности диабета типа 1. Сахарный диабет типа 1 характеризуется потерей инсулин-продуцирующих бета-клеток островков Лангерганса в поджелудочной железе, приводящей к дефициту инсулина. Основной причиной данной потери бета-клеток является опосредованная Тклетками аутоиммунная атака.
В еще одном варианте осуществления фармацевтическую композицию по изобретению можно использовать для лечения аутоиммунного расстройства. Примеры аутоиммунных расстройств включают, не ограничиваясь этим, очаговую алопецию, красную волчанку, анкилозирующий спондилит, болезнь Меньера, антифосфолипидный синдром, смешанное соединительно-тканное заболевание, аутоиммунную болезнь Аддисона, рассеянный склероз, аутоиммунную гемолитическую анемию, тяжелую псевдопаралитическую миастению, аутоиммунный гепатит, вульгарный пемфигус, болезнь Бехчета, пернициозную анемию, буллезный пемфигоид, нодозный полиартрит, кардиомиопатию, полихондрит, целиакийный спру-дерматит, полигландулярный синдром, синдром хронической усталости (СРГОЗ), ревматоидную полимиалгию, хроническую воспалительную демиелинизацию, полимиозит и дерматомиозит, хроническую воспалительную полинейропатию, первичную агаммаглобулинемию, синдром Хурга-Штраусса, первичный биллиарный цирроз, буллезный пемфигоид, псориаз, СКЕЗТ-синдром, феномен Рейно, болезнь холодовых агглютининов, синдром Рейтера, болезнь Крона, ревматическую лихорадку, дискоидную красную волчанку, ревматоидный артрит, эссециальную смешанную криоглобулинемию, саркоидоз,
- 23 024697 фибромиалгию, склеродерму, болезнь Граве, синдром Шегрена, синдром Гуллиана-Барра, синдром ригидного человека, тиреоидит Хашимото, артериит Такаясу, идиопатический пульмонарный фиброз, темпоральный артериит/гигантоклеточный артериит, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (1ТР), язвенный колит, I§Α-нефропатию, увеит, инсулинзависимый диабет (типа I), васкулит, красный плоский лишай и витилиго. Комбинированные композиции, описанные в данном документе, можно вводить индивиду для лечения или профилактики расстройств, связанных с аномальным или нежелательным иммунным ответом, связанным с трансплантацией клеток, ткани или органа, например трансплантацией почек, печени и сердца, например синдром трансплантат против хозяина (СУНЭ) или для предупреждения отторжения аллотрансплантата.
Согласно особо предпочтительному варианту осуществления аутоиммунное заболевание, которое лечится композицией по изобретению, может быть заболеванием, выбранным из ревматоидного артрита, диабета типа 1, диабета типа 2, атеросклероза, астмы, острого и хронического синдрома трансплантат против хозяина, системной красной волчанки, склеродермы, рассеянного склероза, воспалительного заболевания кишечника, псориаза, увеита, тиреоидита и иммунного гепатита.
Согласно еще одному варианту осуществления композицию по изобретению можно использовать для лечения рассеянного склероза. Рассеянный склероз (Μδ) обычно характеризуется клинически рецидивом или хронически прогрессирующей неврологической дисфункцией, вызванной очагами поражения в ЦНС. Патологически очаги поражения включают многочисленные области демиелинизации, поражающей мозг, зрительные нервы и спинной мозг. Лежащая в основе патология не определена, но распространенно мнение о том, что Μδ, по меньшей мере, частично является аутоиммунным или опосредуемым иммунной системой заболеванием.
Таким образом, изобретение включает композиции и способы лечения, снижения или предупреждения начала развития Μδ при пероральном или мукозальном введении иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, по изобретению. Включаются способы, в которых индивиду, который страдает или у него имеется риск развития Μδ, вводят перорально композицию по изобретению.
Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления композицию по изобретению можно использовать для лечения ревматоидного артрита. Ревматоидный артрит (ΚΑ) является наиболее распространенным хроническим воспалительным артритом, и он поражает примерно 1% взрослых людей, заболевание примерно в два-три раза чаще встречается у женщин по сравнению с мужчинами. ΚΑ может начаться очень рано, в младенчестве, но как правило, начало приходится на возраст, составляющий 50-60 лет.
Диагноз можно поставить согласно Αιηοποαη КЕеитаШт Αί^οαίαΙίοη СгПепа для классификации ревматоидного артрита. Терапевтически эффективное количество будет вызывать улучшение в одном или более из следующего: количестве воспаленных суставов, степени отека и пределов подвижности сустава. Также можно провести лабораторные анализы (например, ΕδΚ и гематокрит) и оценку субъективных признаков (например, боль и ригидность утром). Изобретение также включает способы лечения аутоиммунного артрита, например ΚΑ, у индивида введением индивиду терапевтически эффективного количества композиции по изобретению, содержащей иммуноглобулиновые препараты, полученные из молозива.
Композиции по изобретению, описанные в данном документе, также можно использовать для лечения или профилактики отторжения трансплантата у реципиента. Например, композиции можно использовать в различных способах трансплантации тканей и органов, например композиции можно использовать для индукции общей толерантности у реципиента клеточного трансплантата, например стволовых клеток, таких как костный мозг, и/или ткани или органа, таких как островки Лангерганса поджелудочной железы, печень, почки, сердце, кожа, мышцы, нейрональная ткань, желудок и кишечник. Таким образом, новые способы можно использовать для лечения заболеваний или состояний, для которых требуется трансплантация клеток, тканей или органов (например, трансплантация печени для лечения гиперхолестеринемии, трансплантация мышечных клеток для лечения мышечной дистрофии или трансплантация нейрональной ткани для лечения болезни Гентингтона или болезни Паркинсона).
Согласно еще одному варианту осуществления композиция по изобретению может модулировать баланс ТН1/ТН2-, ТБ3-клеток к противовоспалительному ТЬ2, Тг1/ТБ3 иммунному ответу у индивида, страдающего 1ВЭ. Следовательно, согласно данному варианту осуществления композиция по изобретению предназначена для лечения 1ВЭ. Воспалительное заболевание кишечника (1ВЭ) представляет собой распространенное желудочно-кишечное расстройство, которое можно рассматривать в качестве последствия нарушения баланса провоспалительных ТЫ и противовоспалительных ТЬ2 субтипов иммунных ответов.
У пациентов с 1ВЭ имеются антитела против компонентов клеток ободочной кишки и некоторых других бактериальных антигенов. Данные антигены получают доступ к иммунной системе в результате повреждения эпителия. Для данных пациентов также описаны аномалии Т-клеточного иммунитета, включая кожную анергию и пониженную реактивность на Т-клеточные стимулы. Кроме того, были установлены изменения мукозального клеточного иммунитета, включая повышенные концентрации мукозальных 1§С клеток и изменения в субпопуляциях Т-клеток, на основании чего можно предположить о
- 24 024697 стимуляции антигеном.
В еще одном предпочтительном варианте осуществления композицию по изобретению можно использовать для лечения атеросклероза. Атеросклероз представляет собой медленно прогрессирующее заболевание, характеризующееся накоплением холестерина в стенке артерий. Атеросклеротический процесс начинается с того, что ЬОЬ-С становится заключенным в стенку сосудов. Окисление ЬОЬ-С приводит к связыванию моноцитов с эндотелиальными клетками стенки сосудов. Эти моноциты активируются и мигрируют в эндотелиальное пространство, где они трансформируются в макрофаги, приводя к дальнейшему окислению ЬОЬ-С. Окисленный ЬОЬ-С поступает через рецептор-акцептор на макрофагах, приводя к образованию пенистых клеток. Фиброзная чашечка образуется через пролиферацию и миграцию артериальных клеток гладкой мускулатуры, тем самым образуя атеросклеротическую бляшку. Липиды, откладывающиеся в атеросклеротических очагах, в основном происходят от апо-В-липопротеинов плазмы крови. Они включают хиломикроны, ЬПЬ-С, ГОЬ и УЪПЬ. В результате такой аккумуляции образуются объемные бляшки, которые замедляют поток крови до образования в конечном итоге сгустка, перекрывающего артерию и вызывающего сердечный приступ или инсульт.
Альтернативно, иммуноглобулиновый препарат, используемый в композиции по изобретению, может распознавать и связывать по меньшей мере один антиген, специфичный для расстройства, которое лечится, и может модулировать иммунные регуляторные клетки, в частности, регуляторные Т-клетки. Такая модуляция может привести, например, к модуляции баланса ТЫ/ТЬ2-клеток к провоспалительному ТЫ иммунному ответу, тем самым усиливая иммунный ответ, специфически направленный против указанного расстройства.
Очевидно, что провоспалительное действие иммуномодулирующей композиции по изобретению достигается активацией или стимуляцией специфических субпопуляций регуляторных клеток, антигенпрезентирующих клеток или любого типа межклеточного контакта посредством прямой или опосредованной активации цитокинов и/или хемокинов.
Согласно данному конкретному варианту осуществления модуляция баланса ТЫ/ТЙ2-, ТН3 -клеток к провоспалительному ТЫ иммунному ответу может быть особенно применимой при связанных с иммунной системой расстройствах, имеющих нежелательный, несбалансированный противовоспалительный ТЬ2, Тг1/ТН3 ответ, например злокачественном и незлокачественном пролиферативном заболевании, инфекционном заболевании, наследственном заболевании и нейродегенеративных расстройствах.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению обогащенного анти-ЬР§антителами иммуноглобулинового препарата в производстве лекарственного средства для лечения и/или профилактики патологического расстройства. Обогащенный анти-ЬР§-антителами иммуноглобулиновый препарат можно получить из молозива или яиц птиц.
В одном варианте осуществления патологическое расстройство представляет собой острое или хроническое заболевание печени, цирроз или любое заболевание или осложнение, связанное с ними.
В еще одном варианте осуществления острое или хроническое заболевание печени, цирроз или любое заболевание или осложнение, связанное с ними, выбрано из группы, состоящей из печеночной энцефалопатии, спонтанного бактериального перитонита (8ВР), асцита, кровотечения из варикознорасширенных вен, гипердинамического состояния кровообращения, связанного с циррозом, гепаторенального синдрома, гепатопульмонарного синдрома, портопульмонарной гипертензии, кровотечения из варикозно-расширенных вен, недостаточности надпочечников и измененного состояния сознания.
В еще одном варианте осуществления патологическое расстройство представляет повреждение печени.
В еще одном варианте осуществления патологическое расстройство представляет связанное с иммунной системой расстройство, выбранное из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания, неалкогольного стеатогепатита, жирной печени, атеросклероза, метаболического синдрома и любого расстройства, связанного с ними, инфекционного заболевания и пролиферативного расстройства. Альтернативно, патологическое расстройство может быть выбрано из группы, состоящей из вторичного перитонита и послеоперационной инфекции, печеночной кардиомиопатии и гипотензии, гепатоадренального синдрома, гепатоцеллюлярной карциномы, болезни Альцгеймера, любого типа потери памяти, любого типа деменции, синдрома дефицита внимания (АЭНА), любого типа неспособности к обучению, влияния алкоголя или лекарственных препаратов на головной мозг, любого типа опосредованного иммунной системой заболевания, включая астму, и перитонита.
Лекарственное средство может дополнительно содержать иммуноглобулиновый препарат, содержащий иммуноглобулины, которые распознают и связывают по меньшей мере один антиген, специфичный для указанного расстройства. Дополнительный иммуноглобулиновый препарат может быть получен из молозива или яиц птиц.
В одном варианте осуществления лекарственное средство модулирует регуляторные Т-клетки, приводя к модуляции баланса ТЫ/ТЙ2-, ТЫ/ТЬ3-клеток к противовоспалительному ТЬ2, ТЫ/ТН3 иммунному ответу или провоспалительному ТЫ иммунному ответу, тем самым ингибируя или активируя иммунный ответ, специфически направленный против указанного расстройства.
В еще одном варианте осуществления лекарственное средство модулирует баланс ТЫ/ТЙ2-,
- 25 024697
Тг1/Тк3-клеток к противоспалительному ТЬ2, Тг1/ТЬ3 иммунному ответу, тем самым ингибируя иммунный ответ, специфически направленный против указанного расстройства, и где указанная композиция предназначена для лечения любого заболевания, выбранного из аутоиммунного заболевания, неалкогольного стеатогепатита, жирной печени, атеросклероза, метаболического синдрома и любого расстройства, связанного с ними, выбранного из диабета типа 2, инсулинорезистентности, ожирения и избыточной массы тела.
В еще одном варианте осуществления лекарственное средство предназначено для лечения и/или профилактики метаболического синдрома, или неалкогольного стеатогепатита, или обоих заболеваний, для лечения и/или профилактики диабета, лечения нарушенной толерантности к глюкозе, такого как снижение толерантности к глюкозе, снижение уровня инсулина в сыворотке крови, снижение уровня триглицеридов в печени или снижение уровня холестерина.
В еще одном варианте осуществления лекарственное средство модулирует баланс ТН1/ТН2-, Тг1/ТЬ3-клеток к провоспалительному ТН1/ТН2 иммунному ответу, тем самым усиливая иммунный ответ, специфически направленный против указанного расстройства, и где указанная композиция предназначена для лечения инфекционных заболеваний и пролиферативных расстройств.
Лекарственное средство может дополнительно содержать лекарственный препарат, носитель, и/или адъювант, и/или негипериммунное молозиво.
В еще одном варианте осуществления лекарственное средство формулируют для введения перорально, ингаляцией в виде аэрозоля или для парентерального, интравагинального, внутриназального, мукозального, сублингвального, местного или ректального введения или их комбинаций.
В одном из вариантов осуществления иммуноглобулиновый препарат или любые его фракции распознают и связывают с ЬРЗ или любыми его фрагменты.
В еще одном варианте осуществления композиция ингибирует мукозальную транслокацию микроорганизмов. В еще одном варианте осуществления композиция снижает или ингибирует мукозальную транслокацию микроорганизмов и тем самым модулирует иммунную активацию.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению обогащенного анти-ЬРЗантителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива млекопитающих, в производстве лекарственного средства для модуляции иммунной толерантности у индивида или в еще одном аспекте для модуляции оральной толерантности у индивида.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению обогащенного анти-ЬРЗантителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива млекопитающих, в производстве лекарственного средства для индукции ί'Ό4+ί'Ό25+ Т-клеток в печени, индукции СО4+СО25+БАР- Тклеток в печени, индукции СО45+ЬАР+ Т-клеток в печени, индукции СО3+ЬАР+ Т-клеток в печени, индукции СО45+ЬАР+ Т-клеток в селезенке, индукции СО8+ЬАР+ Т-клеток в селезенке, индукции СО3+ЬАР+ Т-клеток в селезенке, индукции СЭ8+СЭ25+ Т-клеток в селезенке, индукции СЭ4+СЭ25+ Тклеток в жировой ткани, индукции СО3+ЬАР+ Т-клеток в жировой ткани, индукции СЭ4+СЭ25+ Тклеток в стромальных сосудистых клетках, индукции ί'Ό4+ί'Ό2 5+ЬАР+ Т-клеток в стромальных сосудистых клетках, снижения ί'Ό3+ΝΚ1.1+ клеток в печени, снижения СО25+ЬАР- Т-клеток в печени, повышения СО25+ЬАР+ Т-клеток в печени, индукции СО4+СО25+БАР- Т-клеток в селезенке, индукции СО4+СО25+ЬАР- Т-клеток в жировой ткани.
Обогащенный анти-ЬРЗ-антителами иммуноглобулиновый препарат можно получить из молозива или яиц птиц.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики патологического расстройства, включающему стадию введения индивиду, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества композиции, содержащей обогащенный анти-ЬРЗ-антителами иммуноглобулиновый препарат.
Обогащенный анти-ЬРЗ-антителами иммуноглобулиновый препарат можно получить из молозива или яиц птиц.
В одном из вариантов осуществления патологическое расстройство представляет собой острое или хроническое заболевание печени, цирроз или любое заболевание или осложнение, связанное с ними.
В еще одном варианте осуществления острое или хроническое заболевание печени, цирроз или любое заболевание или осложнение, связанное с ними, выбрано из группы, состоящей из печеночной энцефалопатии, спонтанного бактериального перитонита (ЗВР), асцита, кровотечения из варикознорасширенных вен, гипердинамического состояния кровообращения, связанного с циррозом, гепаторенального синдрома, гепатопульмонарного синдрома, портопульмонарной гипертензии, кровотечения из варикозно-расширенных вен, недостаточности надпочечников и измененного состояния сознания.
В еще одном варианте осуществления патологическое расстройство представляет повреждение печени.
В еще одном варианте осуществления патологическое расстройство представляет связанное с иммунной системой расстройство, выбранное из группы, состоящей из аутоиммунного заболевания, неалкогольного стеатогепатита, жирной печени, атеросклероза, метаболического синдрома и любого расстройства, связанного с ними, инфекционного заболевания и пролиферативного расстройства. Альтерна- 26 024697 тивно, патологическое расстройство может быть выбрано из группы, состоящей из вторичного перитонита и послеоперационной инфекции, печеночной кардиомиопатии и гипотензии, гепатоадренального синдрома, гепатоцеллюлярной карциномы, болезни Альцгеймера, любого типа потери памяти, любого типа деменции, синдрома дефицита внимания (ΛΌΗΆ), любого типа неспособности к обучению, влияния алкоголя или лекарственных препаратов на головной мозг, любого типа опосредованного иммунной системой заболевания, включая астму, и перитонита.
В еще одном варианте осуществления композиция дополнительно содержит иммуноглобулиновый препарат, содержащий иммуноглобулины, которые распознают и связывают по меньшей мере один антиген, специфичный для указанного патологического расстройства. Дополнительный иммуноглобулиновый препарат может быть получен из молозива или яиц птиц.
В еще одном варианте осуществления композиция модулирует регуляторные Т-клетки, приводя к модуляции баланса ТЫ/ТН2-. Тт1/ТЬ3-клеток к противовоспалительному ТЬ2, Тг1/ТН3 иммунному ответу или провоспалительному ТЫ иммунному ответу, тем самым ингибируя или активируя иммунный ответ, специфически направленный против указанного расстройства.
В еще одном варианте осуществления композиция модулирует баланс ТЫ/ТЙ2-, Тт1/ТЬ3-клеток к противовоспалительному ТЬ2, Тг1/ТН3 иммунному ответу, тем самым ингибируя иммунный ответ, специфически направленный против указанного расстройства, и где указанная композиция предназначена для лечения любого заболевания, выбранного из аутоиммунного заболевания, неалкогольного стеатогепатита, жирной печени, атеросклероза, метаболического синдрома и любого расстройства, связанного с ними, выбранного из диабета типа 2, инсулинорезистентности, ожирения и избыточной массы тела.
В еще одном варианте осуществления патологическое расстройство представляет метаболический синдром, или неалкогольный стеатогепатит, или оба заболевания.
В еще одном варианте осуществления патологическое расстройство представляет диабет. В еще одном варианте осуществления патологическое расстройство представляет нарушенную толерантность к глюкозе.
В еще одном варианте осуществления способ снижает толерантность к глюкозе, снижает уровень инсулина в сыворотке крови, снижает уровень триглицеридов в печени или снижает уровень холестерина.
В еще одном варианте осуществления способ модулирует баланс ТЫ/ТЙ2-, Тт1/ТЬ3-клеток к провоспалительному ТЫ/ТЙ2 иммунному ответу, тем самым усиливая иммунный ответ, специфически направленный против указанного расстройства, и где указанная композиция предназначена для лечения инфекционных заболеваний и пролиферативных расстройств.
В еще одном варианте осуществления композиция дополнительно содержит негипериммунное молозиво и/или лекарственный препарат, носитель и/или адъювант.
Композицию можно вводить перорально, ингаляцией в виде аэрозоля или парентеральным, интравагинальным, внутриназальным, мукозальным, сублингвальным, местным или ректальным введением или их комбинацией.
В одном варианте осуществления иммуноглобулиновый препарат или любые его фракции распознают и связывают с ЬР8 или любые его фрагменты.
В еще одном варианте осуществления способ подавляет или ингибирует мукозальную транслокацию микроорганизмов. В еще одном варианте осуществления способ подавляет или ингибирует мукозальную транслокацию микроорганизмов и тем самым модулирует иммунную активацию.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу модуляции иммунной толерантности у индивида, включающему стадию введения индивиду, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества композиции, содержащей обогащенный анти-ЬР8-антителами иммуноглобулиновый препарат, полученный из молозива млекопитающих. Альтернативно, способ может быть предназначен для модуляции оральной толерантности.
Способ индукции ί'.Ό4+ί'.Ό25+ Т-клеток в печени индивида, включающий стадию введения индивиду, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества композиции, содержащей обогащенный анти-ЬР8-антителами иммуноглобулиновый препарат, полученный из молозива млекопитающих. В еще одном варианте осуществления способ может быть предназначен для индукции СО4+СО25+ЬАР- Т-клеток в печени, индукции СО45+ЙАР+ Т-клеток в печени, индукции СО3+ЙАР+ Тклеток в печени, индукции СО45+ЬАР+ Т-клеток в селезенке, индукции СО8+ЙАР+ Т-клеток в селезенке, индукции СО3+ЬАР+ Т-клеток в селезенке, индукции СЭ8+СЭ25+ Т-клеток в селезенке, индукции ί'.Ό4+ί'.Ό25+ Т-клеток в жировой ткани, индукции СО3+ЙАР+ Т-клеток в жировой ткани, индукции ί'.Ό4+ί'.Ό25+ Т-клеток в стромальных сосудистых клетках, индукции СО4+СО25+ЬАР+ Т-клеток в стромальных сосудистых клетках, снижения ί'.Ό3+ΝΙ<1.1 + клеток в печени, снижения СО25+ЙАР- Т-клеток в печени, снижения СО25+ЙАР+ Т-клеток в печени, индукции СО4+СО25+ЬАР- Т-клеток в селезенке, индукции СО4+СО25+ЬАР- Т-клеток в жировой ткани.
В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к композиции для лечения и/или профилактики патологического расстройства. Способ по изобретению включает стадию введения индивиду, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества обогащенного анти-ЬР8-антителами имму- 27 024697 ноглобулинового препарата, полученного из молозива млекопитающих, или композиции, содержащей его. Необходимо отметить, что иммуноглобулиновый препарат или любые его фракции распознают и связывают ЬР§ и любые его фракции. Согласно необязательному варианту осуществления способ по изобретению включает стадию введения комбинированной композиции обогащенного анти-ЬР§антителами иммуноглобулинового препарата по изобретению по меньшей мере с одним иммуноглобулиновым препаратом, содержащим иммуноглобулины, распознающие по меньшей мере один антиген, специфичный для указанного патологического расстройства, тем самым активируя или ингибируя иммунный отчет, специфически направленный против указанного расстройства.
Согласно еще одному варианту осуществления обогащенный анти-ЬР§-антителами иммуноглобулиновый препарат, полученный из молозива, молока или молочного продукта, или любой его фрагмент или смесь, комбинация или любая его композиция, используемые в способе по изобретению, могут необязательно содержать мономерный, димерный и полимерный иммуноглобулин, выбранный из группы, состоящей из 1дО, 1дА и 1дМ, и любые их фрагменты, препараты, смеси и композиции. Конкретнее, иммуноглобулиновый препарат, используемый в способе по изобретению, может, конкретно, содержать 1дО, в частности 1дО1 и/или 1дО2 и любые их фрагменты. Альтернативно или дополнительно, иммуноглобулиновый препарат, используемый в способе по изобретению, может конкретно содержать секреторный димерный 1дА.
Согласно еще одному варианту осуществления в способе по изобретению может использоваться композиция или комбинированная композиция, содержащая обогащенный анти-ЬР§-антителами иммуноглобулиновый препарат, полученный из молозива. Такая композиция необязательно дополнительно содержит компонент(ы) молозива, предпочтительно алармины, дефенензины, колостринин и любые другие гликолипиды, углеводы или их препараты, смеси и комбинации или любой другой адъювант(ы). Необходимо отметить, что настоящее изобретение дополнительно относится к применению молозива или любых полученных из молозива препаратов для повышения иммуномодулирующего эффекта иммуномодулирующего лекарственного средства. В одном конкретном варианте осуществления композиция или комбинированная композиция, используемая в способе по изобретению, может содержать любой дополнительный адъювант. Следовательно, подходящими адъювантами может быть любой антиген, антитело, гликосфинголипиды, белки, цитокины, молекулы клеточной адгезии и компонент, который может активировать или модифицировать функцию антигенпрезентирующих клеток или любых клеток, связанных с иммунной системой, прямо или опосредованно.
В еще одном варианте осуществления обогащенный анти-ЬР§-антителами иммуноглобулиновый препарат или любой другой иммуноглобулиновый препарат, используемый в изобретении, может быть получен от млекопитающего, предпочтительно коровы, иммунизированного ЬР8 и необязательно, в дополнение по меньшей мере одним другим антигеном или смесью по меньшей мере двух антигенов, специфичных для заболевания, которое лечится.
Согласно одному варианту осуществления способ по изобретению включает стадию введения указанному индивиду, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества обогащенного анти-ЬР§-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива млекопитающих, или любой композиции, содержащей его. Необходимо отметить, что такой способ может быть применим, в частности, для лечения, предупреждения и профилактики острого или хронического заболевания печени, цирроза и любого заболевания или осложнения, связанного с ними.
Более конкретно, согласно изобретению острое или хроническое заболевание печени, цирроз или любое заболевание или осложнение, связанное с ними, выбрано из группы, состоящей из печеночной энцефалопатии, спонтанного бактериального перитонита (8ВР), асцита, гипердинамического состояния кровообращения, связанного с циррозом, гепаторенального синдрома, гепатопульмонарного синдрома, портопульмонарной гипертензии, кровотечения из варикозно-расширенных вен, недостаточности надпочечников и измененного состояния сознания.
Необходимо отметить, что данные осложнения могут развиться в результате хронической НСУ инфекции, алкогольного гепатита, хронического НВУ, неалкогольного стеатогепатита, индуцированного лекарственным препаратом повреждения печени или другой причины острого или хронического заболевания печени.
Согласно необязательному варианту осуществления изобретение относится к способу лечения связанных с иммунной системой расстройств. Согласно данному конкретному варианту осуществления способ по изобретению включает стадию введения индивиду, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества комбинации обогащенного анти-ЬР§-антителами иммуноглобулинового препарата по меньшей мере с одним иммуноглобулиновым препаратом, полученным из молозива, содержащим иммуноглобулины, которые распознают и связывают по меньшей мере один антиген, специфичный для указанного патологического расстройства, или комбинированной композиции, содержащей его и необязательно дополнительный лекарственный препарат, или любой носитель, или адъювант.
Согласно данному варианту осуществления комбинация, используемая в изобретении, модулирует регуляторные Т-клетки приводя к модуляции баланса ТЫ/ТН2-, Тг1/ТЬ3-клеток к противоспалительному ТЬ2, Тг1/ТН3 иммунному ответу или провоспалительному ТЫ иммунному ответу, тем самым ингибируя
- 28 024697 или активируя иммунный ответ, специфически направленный против указанного расстройства.
Согласно еще одному варианту осуществления способ по изобретению может быть, в частности, применим для лечения связанного с иммунной системой расстройства, например аутоиммунного заболевания, неалкогольного стеатогепатита, жирной печени, метаболического синдрома и любого расстройства, связанного с ними, инфекционного заболевания и пролиферативного расстройства.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения нарушенной толерантности к глюкозе.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу снижения толерантности к глюкозе.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу снижения уровня инсулина в сыворотке крови.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу снижения уровня триглицеридов в печени.
В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу снижения уровня холестерина.
Необходимо отметить, что способ по изобретению предназначен для лечения острых осложнений, для профилактики развития и/или рецидива данных осложнений.
Согласно одному варианту осуществления комбинированная композиция, используемая в способе по изобретению, может приводить к модуляции баланса ТЫ/ТЙ2-, Тг1/ТЬ3-клеток к противовоспалительному ТЬ2, Тг1/ТН3 иммунному ответу, тем самым ингибируя иммунный ответ, специфически направленный против указанного расстройства. Согласно данному конкретному варианту осуществления такая композиция может быть применима для лечения любого заболевания, выбранного из аутоиммунного заболевания, неалкогольного стеатогепатита, жирной печени, атеросклероза, метаболического синдрома и любого расстройства, связанного с ними, например диабета типа 2, инсулинорезистентности, ожирения и избыточной массы тела.
Альтернативно, комбинированная композиция, используемая в изобретении, может приводить к модуляции баланса ТН1/ТН2-. Тг1/ТЬ3-клеток к провоспалительному ТН1/ТН2 иммунному ответу, тем самым усиливая иммунный ответ, специфически направленный против указанного расстройства. Согласно данному конкретному варианту осуществления такая композиция может быть применима для лечения инфекционного заболевания и пролиферативного расстройства.
Согласно еще одному варианту осуществления способ по изобретению может специфически применяться для лечения вирусных заболеваний, включающих НСУ, НВУ, СМУ и ЕВУ.
В еще одном дополнительном варианте осуществления указанного способа по изобретению обогащенный анти-ЬР§-антителами иммуноглобулиновый препарат или любую композицию, содержащую его, вводят перорально или ингаляцией в виде аэрозоля, или внутривенным, внутримышечным, подкожным, внутрибрюшинным, парентеральным, трансдермальным, интравагинальным, интраназальным, мукозальным, сублингвальным, местным, ректальным или подкожным введением, или комбинацией указанных путей.
Согласно особо предпочтительному варианту осуществления способ по изобретению специфически применим для лечения млекопитающего. Термины млекопитающее или млекопитающего для целей лечения относятся к животному, определяемому как млекопитающее, включающему человека, экспериментальных животных, домашних и сельскохозяйственных животных, зоопарковых, спортивных или комнатных животных, таких как собаки, лошади, коровы и т. д. В конкретном варианте осуществления указанное млекопитающее представляет человека.
Термин лечение относится к терапевтическому лечению. Индивиды, нуждающиеся в лечении, являются млекопитающими, страдающими связанными с иммунной системой заболеваниями. Под терминами пациент или индивид, нуждающийся понимается млекопитающее, для которого требуется введение иммуномодулирующей композиции по изобретению, для профилактики, преодоления или подавления такого заболевания.
Термины эффективное количество или достаточное количество означают количество, необходимое для достижения выбранного результата. Термин эффективное для лечения количество определяется тяжестью заболевания с учетом превентивных или терапевтических целей путем введения и общим состоянием пациента (возрастом, полом, массой и другими факторами, известными лечащему врачу).
Как уже указывалось выше, как правило, дозировка, необходимая для достижения терапевтического эффекта будет зависеть от таких факторов, как возраст, масса и пол пациента и способ введения, но также от степени прогрессирования заболевания и эффективности конкретного производного, используемого для конкретного расстройства или заболевания.
Очевидно, что предупреждение или снижение риска развития связанного с иммунной системой заболевания также входит в объем изобретения. Такой способ может включать введение профилактически эффективного количества композиции по изобретению или активных ингредиентов, составляющих такую композицию, человеку с риском развития заболевания.
Термин профилактически эффективное количество означает такое количество фармацевтической
- 29 024697 комбинированной композиции, которое будет предупреждать или снижать риск развития биологического или медицинского события, которое следует предупредить в ткани, системе, у животного или человека, исследователем, ветеринарным врачом, медицинским врачом или другим клиницистом.
Необходимо отметить, что для способа лечения и профилактики, описанного в настоящем изобретении, указанное терапевтически эффективное количество или дозировка зависит от тяжести и ответной реакции болезненного состояния, которое лечится, с курсом лечения от нескольких дней до нескольких месяцев, или пока осуществится излечение или достигнется подавление болезненного состояния. Оптимальные схемы введения можно рассчитать с учетом данных по накоплению лекарственного препарата в организме пациента. Специалисты в данной области могут легко определить оптимальные дозировки, методы дозирования и кратность введения. В общем, дозировку можно рассчитать с учетом массы тела, и ее можно вводить один раз или более в сутки, неделю, месяц или год или даже один раз каждые 2 или 20 лет. Специалисты в данной области могут легко установить кратность введения, основываясь на времени пребывания и концентрации композиции по изобретению в жидкостях или тканях организма. После успешного лечения может потребоваться, чтобы пациент прошел поддерживающую терапию для предупреждения рецидива болезненного состояния, когда композицию по изобретению вводят в поддерживающих дозах, один или более раз в сутки.
Раскрытое и описанное следует понимать как то, что данное изобретение не ограничивается конкретными примерами, способами, стадиями и композициями, приведенными в данном документе, поскольку такие способы, стадии и композиции могут до некоторой степени варьировать. Также, очевидно, что терминология, использованная в данном документе, применяется только для цели описания конкретных вариантов осуществления и не предназначается для ограничения, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения и его эквивалентными вариантами.
Необходимо отметить, что используемые в данной заявке и прилагаемой формуле изобретения единственные формы включают множественные формы, если по контексту не подразумевается иначе.
В заявке, в разделе Примеры и в формуле изобретения, которая последует, если по контексту не требуется иначе, то слово содержать и его варианты, такие как содержит и содержащий следует понимать, как включение указанного целого числа или стадии или группы целых чисел или стадий, но не исключение любого другого целого числа или стадии или группы целых чисел или стадий.
Примеры
Последующие примеры представляют методы, используемые заявителями изобретения, в осуществлении аспектов настоящего изобретения. Очевидно, что несмотря на то что данные методы приводятся в качестве примера предпочтительных вариантов осуществления для практики изобретения, специалисты в данной области в свете настоящего раскрытия могут сделать многочисленные модификации, не отступая от сущности и предназначенного объема изобретения.
Пример 1. Получение обогащенных анти-ЬР§-антителами препаратов из молозива.
Продукт ВюОАКИ является запатентованным препаратом молозива производства Апабш ЫтПеб. Каждая таблетка Апабш ЫтПеб представляет таблетку без оболочки массой 1,2 г для перорального введения, которая содержит 600 мг лиофилизованного порошка коровьего молозива (ВСР) в комбинации с наполнителями. Активным веществом таблеток ВюОАКИ является лиофилизованный порошок коровьего молозива (ВСР), полученного от молочных коров в хозяйствах промышленного типа. Коровы в данных хозяйствах, помимо вакцинации против обычных патогенов крупного рогатого скота, также были вакцинированы запатентованной вакциной Апабш на основе антигенов внешней оболочки многочисленных штаммов бактерий Е. сой, основного микроорганизма в кишечнике человека. ВСР Лпаб18 представляет натуральный продукт с высоким содержанием белка (>80%) и с низким содержанием лактозы и жира, полученный при первом доении после отела молочных коров в хозяйствах промышленного типа. Перед таблетированием он представляет собой концентрированный лиофилизированный сухой порошок.
Препарат ВСР Апабш содержит примерно 40% антител (иммуноглобулинов) в сухом порошке. Иммуноглобулины в препарате ВюОАКИ ВСР обладают высокой связывающей активностью для липополисахарида (ЬР8) грамотрицательных бактерий. Связывание ЬР8 анализировано Апабш с использованием стандартных детектирующих систем на основе ЕЫ§А и иммуноблоттинга.
Трех дойных коров иммунизировали смесью ЬР8-антигенов. Вакцину на основе антигена вводили в последние восемь недель стельности. Молозиво собирали в течение первых дней лактации.
Молочный жир удаляли и снятое молоко пастеризовали при 56°С в течение 30 мин и затем коагулировали сычужным свертыванием, как описано в Нбрей, Нитап МПк Вапкшд, 1984. После удаления свернувшегося молока, содержащего казеин, сыворотку центрифугировали и мелкий преципитат отбрасывали. К супернатанту медленно добавляли равный объем насыщенного раствора сульфата аммония при осторожном перемешивании, как описано Вгапбоп е1 а1. [Вгапбоп е1 а1., АикЕ 1. Ехр. Вю1. Меб. 8с1., 49:613 (1971)]. После центрифугирования полученный осадок сохраняли, а супернатант, содержащий лактозу и соли, отбрасывали.
Осадок растворяли в 0,01М Трис-НС1 буфере с рН 8, содержащем 0,32М ИаС1 (30% от первоначального объема). Данный раствор интенсивно диализовали против пяти объемов того же буфера с ис- 30 024697 пользованием картриджа 8ΙΥ30 со спиральной мембраной Апнсоп. Затем раствор антитела концентрировали до 10%, быстро замораживали и лиофилизовали.
Получение фрагментов антител из молозива.
Фрагменты антител получали с использованием модифицированного способа на основе способов, описанных Ьопек К.О.А. и Ьапбоп 1. Цопек К.О.А. апб Ьапбоп 1., 1. 1ттипо1. Мебюбк, 263:57-74 (2002)]. Вкратце, равный объем 0,2М натриево-ацетатного буфера с рН 4,0 добавляли к объединенному молозиву, полученному от иммунизированных коров, как описано выше. рН разбавленного объединенного молозива доводили до 4,6 и инкубировали при 37°С в течение двух часов для осаждения казеинов. Затем молозиво центрифугировали и фильтровали (фильтр 0,45 мкм) для удаления казеина. рН полученной сыворотки молозива доводили до 4,0, затем добавляли пепсин (ферментный препарат с активностью 1:15000) при 5% мас./мас. и инкубировали в течение 20 ч при 45°С. Гидролиз пепсином останавливали добавлением 0,5 объема 1М Трис-буфера с рН 8, и реакционную смесь охлаждали до 4°С. рН реакционной смеси доводили до 7,0, и смесь Р (аЬ')2-фрагментов концентрировали с использованием мембраны для ультрафильтрации 30 кЭ и диафильтровали против >50 объемов буфера 20 мМ фосфата натрия/150 мМ Ν;·ιΟ с рН 6,0. Затем небольшие пептиды удаляли, и полученный раствор, содержащий Р(аЬ')2фрагменты, пепсин и крупные пептиды, наносили на анионную колонку с Ц-сефарозой, которая связывает пепсин и кислые агрегаты. Для получения очищенных Р(аЬ')2-фрагментов оставшийся Рс и нерасщепленный 1д отделяли от Р(аЬ')2-фрагментов (смешанных с оставшимися крупными пептидами и нерасщепленным 1д) хроматографией на протеин О-сефарозе или хроматографией Ртотейс МаЬкогЬеп! А1Р.
Получение РаЬ'-фрагментов с использованием 2-меркаптоэтиламина.
Для получения РаЬ'-фрагментов добавляли 50 мкл (1/9 объема) 0,1М 2-меркаптоэтиламина (МЕА) в 0,1М натриевом-фосфатном буфере с рН 6,0, содержащим свежеприготовленный 5 мМ ЭДТА-динатрий, к 0,1-3,0 мг Р(аЬ')2-фрагментов в 0,45 мл 0,1М натриево-фосфатного буфера с рН 6,0. Затем смесь инкубировали при 37°С в течение 90 мин. Далее реакционную смесь наносили на колонку РЭ-10 или подходящую колонку О25 для удаления избытка МЕА. В качестве элюирующего буфера использовали 0,1М натриево-фосфатный буфер (рН 6,0 с 5 мМ ЭДТА-динатрия). Собирали первый белковый пик, который содержал РаЬ'-фрагменты, и использовали для обработки по соответствующим различным показаниям, как описано в данном документе ниже.
Для получения обогащенного анти-ЬРЗ-антителами иммуноглобулинового препарата собирали молозиво примерно от 200 молочных коров в хозяйствах промышленного типа. Коровы в данных хозяйствах, помимо вакцинации против обычных патогенов крупного рогатого скота, также были вакцинированы запатентованной вакциной Апабй на основе антигенов внешней оболочки многочисленных штаммов бактерий Е. сой, основного микроорганизма в кишечнике человека. Полученное молозиво замораживали в отдельных пакетах для тестирования. Для обработки молозиво оттаивали, объединяли и удаляли жир. Каждую партию пастеризовали. Молозиво концентрировали ультрафильтрацией для уменьшения объема перед лиофилизацией. В результате проведения ультрафильтрации содержание лактозы в конечном порошке снижалось до концентрации ниже чем 7% (примерно с 50%).
Пример 2. Применение обогащенных анти-РРЗ-антителами иммуноглобулиновых препаратов, полученных из молозива, для лечения гепатита.
Для воспроизведения иммунного гепатита мышам самцам С57/В1 в возрасте 11-12 недель вводили в хвостовую вену 500 мкг/мышь (примерно 15 мг/кг) Соп А (МР Вютебюай, США), который растворяли в 50 мМ Трис-буфере с рН 7, 150 мМ №С1, 4 мМ СаС12, известно, что Соп А вызывает гепатит. Животным всех опытных групп перорально вводили препараты специфических антител в различных концентрациях или препарат ВюОАКЭ, подробно описанные в экспериментальных протоколах, в сравнении с необработанными контролями. Затем у животных опытных групп определяли следующие показатели: активность аспартатаминотрансферазы (АСТ) и аланинаминотрансферазы (АЛТ) в сыворотке крови, проводили гистологическое исследование образцов печени, РАСЗ анализ лимфоцитов в печени и селезенке на NΚТ-маркеры, определяли уровень сывороточных цитокинов и проводили анализ вестернблоттингом на экспрессию транскрипционных факторов ЗТАТ 1, 4 и 6 и ΝΡΡΒ, и показатели сравнивали с контрольными группами.
Пример 3. Пероральное введение молозива, обогащенного анти-ЬРЗ-антителами.
Для получения обогащенных анти-РРЗ-антителами иммуноглобулиновых препаратов собирали молозиво примерно от 200 молочных коров в хозяйствах промышленного типа. Коровы в данных хозяйствах, помимо вакцинации против обычных патогенов крупного рогатого скота, также были вакцинированы запатентованной вакциной Апабй на основе антигенов внешней оболочки многочисленных штаммов бактерий Е. сой, основного микроорганизма в кишечнике человека. Полученное молозиво замораживали в отдельных пакетах для тестирования. Для обработки молозиво оттаивали, объединяли и удаляли жир. Каждую партию пастеризовали. Молозиво концентрировали ультрафильтрацией для уменьшения объема перед лиофилизацией. В результате проведения ультрафильтрации содержание лактозы в конечном порошке снижалось до концентрации ниже чем 7% (примерно с 50%).
Две композиции, содержащие обогащенные анти-ЬРЗ-антителами иммуноглобулиновые препараты, полученные из молозива, готовили вакцинацией стельных коров антигенами клеточной стенки бактерий
- 31 024697 (например, ЙР8) из ряда штаммов Е. сой с получением антител в высокой концентрации (включая 1дО) к ЙР8 в молозиве. В последующих примерах данную композицию обозначали как Н1ВС.
Второй препарат получали вакцинацией стельных коров вакциной, содержащей ряд штаммов Е. сой, и также обогащали в отношении ЙР8 и других поверхностных антигенов с получением антител в высокой концентрации (включая 1дО) к 1.Р8 в молозиве. Затем 1дО выделяли из данного препарата молозива. В последующих примерах данную композицию обозначали как Т-1дО.
Таблица 1
Дизайн эксперимента
Группа ΏΌΝ Препарат молозива (3 мг) Введение
А N=10 30 мл РО
В N=10 30 мл РО
Опытные группы.
В опыте находилось две группы мышей (табл. 1). Мышам (10 мышей в группе) спаивали (перорально) ежедневно в течение 7 суток 30 мкл воды (контроль, группа А) или 30 мкл (примерно 3 мг) обогащенного анти-ЙР8-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива (группа В), который растворяли в воде. Через 7 суток мышей подвергали эвтаназии. При убое собирали кровь из сердца с использованием обычных методов, затем готовили сыворотку крови для последующих исследований.
Животные.
Использовали наивных мышей С57ВЙ/6 (в возрасте 11-12 недель). Мышей получали из питомника Наг1ап йаЪога!опез (1егиза1ет, Израиль) и содержали в Ап1та1 Соге Найаззай-НеЪге^ Ишуегзйу Мей1са1 8сйоо1. Мышам скармливали вволю обычный лабораторный гранулированный корм и воду и содержали при световом цикле 12 ч свет/темнота. Опыты с животными проводили, следуя указаниям 11еЪге\у Ишуегзйу Найаззай 1пзй1ийопа1 Соттй1ее Гог Саге и Изе оГ йаЪога!огу Ап1та1з и с разрешения Комитета.
Печень.
После отбора образцы печени переносили в охлажденный на льду РВ8, разрезали, измельчали и гомогенизировали с использованием гомогенизатора Даунса с 9 мл стерильного холодного лизирующего буфера 1, гомогенат разливали в пробирки Эппендорфа (по 1,5 мл в каждую пробирку), выдерживали в течение 30 мин с последующей обработкой ультразвуком (пять циклов по 25 сек) и центрифугировали (4°С, 14000 об/мин в течение 15 мин). Супернатанты объединяли в одной пробирке, определяли содержание белка с использованием метода Брэдфорда и хранили при -20°С.
Селезенка.
После извлечения образцы селезенки измельчали на сетках для разделения клеток (60 меш) в среде ЕРМ1 1640, центрифугировали (4°С, 1400 об/мин в течение 10 мин) и супернатанты отбрасывали; эритроциты лизировали добавлением 1 мл холодного лизирующего буфера для ЕВС (155 мМ хлорида аммония) с последующим трехкратным промыванием холодным РВ8 и центрифугированием.
Получение цитозольной фракции селезенки.
Холодный буфер 1 добавляли к остатку спленоцитов (в соотношении буфера к остатку 6:1) и клетки разливали во флаконы по 2 мл, выдерживали на льду в течение 30 мин, обрабатывали ультразвуком пять раз (по 25 с каждый раз) и центрифугировали (4°С, 14000 об/мин в течение 15 мин). Затем собирали супернатанты из всех флаконов, определяли содержание белка и хранили при -20°С.
Получение мембранной фракции селезенки.
К оставшемуся остатку после центрифугирования, которое использовали для получения цитозольной фракции, добавляли 100-250 мл буфера 2, встряхивали в течение 30 мин при 4°С и центрифугировали (4°С, 14000 об/мин в течение 15 мин). Затем собирали супернатанты из всех флаконов, определяли содержание белка и хранили при -20°С.
Выделение лимфоцитов селезенки и печени для определения субпопуляций Т-клеток.
Мышей, представляющих собой различные экспериментальные модели, подвергали эвтаназии на указанные сроки. Выделяли лимфоциты селезенки и NΚΤ-клетки и удаляли эритроциты. Внутрипеченочные лимфоциты выделяли следующим образом: после отсечения нижней полой вены выше диафрагмы печень промывали холодным РВ8, пока она не становилась бледной с последующим удалением соединительной ткани и желчного пузыря. Образцы печени и селезенки хранили в среде ЕРМ1 1640+РС8. Затем образцы селезенки измельчали пропусканием через нейлоновое сито 70 мкм (Ра1коп) и центрифугировали (1250 об/мин в течение 7 мин) для удаления клеточного дебриса. Эритроциты лизировали 1 мл холодного лизирующего буфера на основе 155 мМ хлорида аммония и сразу же центрифугировали (1250 об/мин в течение 3 мин). Затем спленоциты промывали и ресуспендировали в 1 мл среды ЕРМ1 1640+РС8. Остатки соединительной ткани удаляли. Жизнеспособность клеток по данным окрашивания трипановым синим составляла более 90%. Для выделения внутрипеченочных лимфоцитов образцы орга- 32 024697 на вначале измельчали пропусканием через сито из нержавеющей стали (размер 60, З1дта), и клеточную суспензию помещали в пробирку емкостью 50 мл на 5 мин для осаждения клеточного дебриса. 10 мл раствора Ьутрйоргер (Исо11, Ах1к-З1йе1б РоС АЗ, Осло, Норвегия) медленно добавляли к такому же объему клеточной суспензии в пробирках емкостью 50 мл. Затем пробирки центрифугировали при 1800 об/мин в течение 18 мин. Собирали клетки на поверхности раздела и переносили в другие пробирки, которые вновь центрифугировали при 1800 об/мин в течение 10 мин с получением осадка клеток без гепатоцитов с конечным объемом 250 мкл. Извлекали примерно 1х106 клеток/печень мыши. Жизнеспособность клеток оценивали окрашиванием трипановым синим.
Выделение адипоцитов.
Жировую ткань (прослойки висцерального жира) измельчали и инкубировали в бикарбонатном буфере Кребса-Рингера (3 мл/г жировой ткани), содержащем 10 мМ глюкозы и 2,5% бычьего сывороточного альбумина, инкубировали с 840 Е/г коллагеназы типа I (З1дта, Кейоуо!, Израиль) при 37°С при осторожном перемешивании в течение 1 ч. Затем дважды фильтровали через шифоновую сетку (100 мкм) и центрифугировали при 50хд в течение 5 мин. Затем плавающие адипоциты отделяли от осадка фракции стромальной сосудистой сети (ЗУ). Нижнюю фракцию удаляли и центрифугировали при 200хд в течение 5 мин для осаждения клеток ЗУ. Затем подсчитывали количество клеток.
Анализ проточной цитометрией (РАСЗ) для определения различных субпопуляций лимфоцитов.
После выделения лимфоцитов из крови, селезенки или любого органа 2-5х105 клеток/500 мкл РВЗ в трех параллелях помещали в пробирки Ра1соп 2052, инкубировали с 4 мл 1% ВЗА в течение 10 мин и центрифугировали при 1400 об/мин в течение 5 мин. Клетки вновь ресуспендировали в 10 мкл РСЗ с меченными первичными антителами в соотношении 1:20 (Е1ТС-, АРС- или РЕ-меченые) к следующим маркерам лимфоцитов: ί'Ό3, СЭ4, СЭ8, ΝΚΙ.1, СЭ25, РОХ рЗ, ЬАР клетки, 1Ь-17, аннексии и поверхностные маркеры активации Т-клеток. Смеси клетки-антитело перемешивали каждые 10 мин в течение 30 мин. Клетки выделяли соответственно с использованием анти-СО3-антител, анти-СО4-антител, анти-СЭ8антител и анти-ИК1.1 -антител. Клетки дважды промывали 1% ВЗА и хранили при 4°С до снятия показаний. В контрольной группе добавляли только 5 мкл 1% ВЗА. Поверхностное окрашивание проводили инкубацией клеток с антителами и анти-СО 16/32 (блокирует Рс, еВюкаепсе) при 4°С в буфере для РАСЗ, содержащем РВЗ и 0,5% ВЗА в течение 30 мин. Затем клетки дважды промывали буфером для РАСЗ, ресуспендировали в буфере для РАСЗ и анализировали проточной цитометрией. Аналитический клеточный сортинг проводили на 1х104 клеток из каждой группы с использованием флуоресцентноактивируемого клеточного сортера (РАСЗ!аг, Вес!оп Оюкшкоп). В опытах использовали контроли с соответствующим изотипом. Анализ проводили на клеточном сортере-анализаторе РАСЗСайЬиг (Вес!оп Оюкшкоп, Зап 1оке, СА). Подсчитывали только живые клетки, и фоновую флуоресценцию от необработанных антителом лимфоцитов вычитали. Дискриминационные окна устанавливали на светорассеивании в прямом и боковом направлениях для исключения погибших клеток и эритроцитов. Данные анализировали с использованием программ двухцветного контурного графика Сопкой 30 (Вес!оп Оюкткоп, Охпагб, СА, США) или Се11 Циек!.
РАСЗ анализ для определения процента ИКТ-лимфоцитов.
Сразу же после выделения лимфоцитов 2-5х104 клеток/500 мкл РВЗ в трех параллелях помещали в пробирки Ра1соп 2052, инкубировали с 4 мл 1% ВЗА в течение 10 мин и центрифугировали при 350д в течение 5 мин. Для определения процента ИКТ-лимфоцитов использовали анти-СО3-антитела и антиОХ5-антитела (РНагттдеп, США). Аналитический клеточный сортинг проводили на 1 х 104 клеток из каждой группы с использованием флуоресцентно-активируемого клеточного сортера (РАСЗТАЕ р1ик, Вес!оп Эюкткоп). Подсчитывали только живые клетки, и фоновую флуоресценцию от необработанных антителом лимфоцитов вычитали. Дискриминационные окна устанавливали на светорассеивании в прямом и боковом направлениях для исключения погибших клеток и эритроцитов. Данные анализировали с использованием программ двухцветного контурного графика Сопкой 30 (Вес!оп Оюкткоп, Охпагб, СА, США) и СеПОиек! 25.
Выделение ИКТ-лимфоцитов.
Разделение клеток проводили с использованием магнитного клеточного сортинга (МАСЗ, Мй!епу1 Вю!ес, Германия), следуя инструкциям изготовителя. Анти-СО3- и анти-ОХ5-магнитные шарики использовали для отделения ИКТ-лимфоцитов. Шарики удаляли между двумя стадиями согласно инструкциям изготовителя. При постанове РАСЗ анализа клеток достигалась точность более 95%.
Гепатоцеллярное повреждение.
Повреждение печени оценивали по активности аспартатаминотрансаминазы (АСТ) и аланинаминотрансферазы (АЛТ), которую определяли на автоматическом биохимическом анализаторе.
Анализы.
Определяли следующие показатели: содержание глюкозы, уровень общего холестерина и триглицеридов в крови. Концентрацию глюкозы определяли с использованием обычного глюкометра. Триглицериды и общий холестерин в плазме крови определяли с использованием клинического биохимического анализатора КеГ1оуе! Р1ик (Косйе Огадпокйск, ОтЬН, МаппНетг Германия).
- 33 024697
Анализ толерантности к глюкозе.
Анализ оценки толерантности к глюкозе (ОТТ) проводили на мышах на 30 сутки после голодания в течение ночи. Глюкозу вводили перорально (1,25 г на кг). Определяли глюкозу в сыворотке крови, отобранной из хвостовой вены, каждые 15 мин в течение 3 ч. Концентрацию глюкозы определяли с использованием обычного глюкометра.
Концентрация глюкозы утром.
У мышей опытных групп также определяли содержание глюкозы утром (без голодания).
Определение цитокинов.
В сыворотке крови определяли уровень ΙΡΝ-γ и ТОР-β ЕЫ8А сэндвич-типа с использованием промышленно доступных наборов (Оиапкктк, Κ&Ό 8ук1етк, МтпеароПк, ΜΝ, США). Также с помощью ЕЫ8А сэндвич-типа определяли сывороточный инсулин с использованием промышленно доступных наборов (ИрркаФ, Швеция), следуя инструкциям изготовителя.
Статистическая обработка.
Статистическую значимость определяли непарным двухсторонним ΐ-тестом Стьюдента и приведены только значения <0,05.
Определение уровня триглицеридов.
На указанные сроки определяли сывороточные триглицериды с использованием спектрофотометра (СоЬак ОР-25Р).
Оценка выраженности стеатогепатита печени.
Кусочек печени от каждой мыши фиксировали в 10%-ном формальдегиде и заливали в парафин для гистологического анализа. Пять срезов (толщиной 5 мкм) окрашивали гематоксилин-эозином, и два гистолога исследовали препараты вслепую. Гистологическое исследование и оценку стеатогепатита (шкала ΝΛ8Η) проводили с использованием оценочной шкалы для стеатогепатита.
Гистологическое исследование.
Проводили окрашивание гематоксилин-эозином залитых в парафин срезов печени. Два опытных гистолога (ΥΟ, Υ8) просматривали срезы вслепую, т. е. не зная об условиях эксперимента.
Пример 4. Пероральное введение обогащенного анти-ЬР8-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, снижает активность ферментов печени.
Заявители настоящего изобретения исследовали, насколько нормализуется активность ферментов печени, являющихся показателем повреждения печени, после перорального введения обогащенного анти-ЬР8-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива. Определяли активность аспартатаминотрансаминазы (АСТ) и аланинаминотрансаминазы (АЛТ) с использованием клинического биохимического анализатора КеЛоуе! Р1ик (Коске П1адпо8кс8, ОтЬН, Маппкеш, Германия). На фиг. 1 показано статистически достоверное снижение активности АСТ в группе мышей А по сравнению с группой мышей В (*р<0,001). Это указывает на ослабление повреждения печени, что выражается в четком и достоверном снижении активности АЛТ и АСТ в сыворотке крови опытных мышей по сравнению с контрольной группой.
Пример 5. Пероральное введение обогащенного анти-ГР8-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, повышает количество СГО4+СГО25+ регуляторных Т-клеток в печени.
Выделение лимфоцитов печени.
Внутрипеченочные лимфоциты выделяли после убоя мышей следующим образом: после извлечения печени образцы хранили в среде КРМ1 1640+РС8. Затем образцы печени измельчали пропусканием через сито из нержавеющей стали (размер 60, 81дта), и клеточную суспензию помещали в пробирку емкостью 50 мл на 5 мин для осаждения клеточного дебриса. Раствор Ьутркоргер (10 мл, Рко11, Ах1к-8кк1й РоС А8, Осло, Норвегия) медленно добавляли к такому же объему клеточной суспензии в пробирках емкостью 50 мл. Пробирки центрифугировали при 1800 об/мин в течение 18 мин. Собирали клетки на поверхности раздела и переносили в другие пробирки, которые вновь центрифугировали при 1800 об/мин в течение 10 мин с получением осадка клеток без гепатоцитов в конечным объеме 250 мкл. Приблизительно 1 χ 106 клеток/печень мыши выделяли и анализировали проточной цитометрией.
Проточная цитометрия.
Поверхностное 2-3-цветное окрашивание клеток проводили со следующими поверхностными антителами: анти-СО4-Р1ТС и анти-СЭ25-РЕ (антитела получали от еВюкскпсе, 8ап П1едо, СА). Поверхностное окрашивание проводили инкубацией только что выделенных клеток с антителами и анти-СГО16/32 (блокирует Рс, еВюкскпсе) при 4°С в буфере для РАС8, содержащем РВ8 и 0,5% В8А в течение 30 мин. Затем клетки дважды промывали буфером для РАС8, ресуспендировали в буфере для РАС8 и анализировали проточной цитометрией. Во всех опытах использовали контроли с соответствующим изотипом. Анализ проводили на клеточном сортере-анализаторе РАС8СакЬиг (ВесЮп Оккткоп, 8ап 1оке, СА) с программным обеспечением РС8 ехргекк ν.3 (Эекоуо кой^аге, Ьок Апдекк, СА).
Статистическая обработка.
Статистическую значимость определяли непарным двухсторонним ΐ-тестом Стьюдента; р<0,05 считали статистически достоверным.
- 34 024697
Для определения специфичности повышения числа регуляторных Т-клеток в печени определяли среднюю поверхностную экспрессию маркеров (Οϋ4+Οϋ25+) на лимфоцитах печени с использованием проточной цитометрии на 7 сутки (день убоя) у всех мышей, обработанных обогащенным анти-ЬР8антителами иммуноглобулиновым препаратом, полученным из молозива. На фиг. 2А показано, что обогащенный анти-ЬР8-антителами иммуноглобулиновый препарат, полученный из молозива, повышает количество Οϋ4+Οϋ25+ регуляторных Т-клеток в печени. Дискриминационные окна устанавливали на СБ4, и значения представляли среднее значение±стандартное отклонение.
Репрезентативный дот-блот, полученный РАС8, на лимфоцитах, из печени мышей, обработанных обогащенным анти-ЬР8-антителами иммуноглобулиновым препаратом, полученным из молозива (группа В) или от необработанного контроля (группа А) приведен на фиг. 2В, и он показывает, что пероральное введение обогащенного анти-ЬР8-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, повышает количество СВ4+СБ25+ регуляторных Т-клеток в печени.
Пример 6. Пероральное введение обогащенного анти-ЬР8-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, повышает количество СВ4+СВ25+ЬАР-, СВ45+ЬАР+ и СВ3+ЬАР+ регуляторных Т-клеток в печени.
Выделение внутрипеченочных лимфоцитов и РАС8 анализ проводили, как описано выше.
Проточная цитометрия.
Для ЬАР-окрашивания использовали следующие антитела: анти-СВ3-А1еха-йиог 405, анти-СИ45РегСР-Су5.5 и анти-ЬАР-АРС. Очищенные аффинной хроматографией биотинилированные козьи поликлональные специфические анти-ЬАР-антитела получали от К&Ь 8уз1ет8 (МтпеароПз, ΜΝ, США), и стрептавидин-АРС использовали в качестве вторичного антитела для детектирования биотинилированного первичного антитела (Κ&β). Для ЬАР-окрашивания клетки предварительно инкубировали с ЬАР/контрольным антителом в течение 20 мин и окрашивали анти-СВ3-А1еха-йиог 405, анти-СИ45РегСР-Су5.5 с последующим окрашиванием стрептавидином-АРС.
Для определения того, насколько пероральное введение обогащенного анти-ЬР8-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, стимулирует Тгед, заявители исследовали влияние перорального введения на тканевые субпопуляции регуляторных Т-клеток. На фиг. 3 показана средняя поверхностная экспрессия маркеров (СВ25+СВ4+ЬАР-, СВ45+ЬАР+ и СВ3+ЬАР+) на лимфоцитах печени, определенная с использованием проточной цитометрии на 7 сутки (день убоя) у всех мышей, обработанных 3,0 мг препарата. Значения представляют средние значения. На фиг. 3А и 3В показано, что пероральное введение обогащенного анти-ЬР8-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, увеличивало субпопуляции СВ25+СВ4+ЬАР-, СВ45+ЬАР+ и СВ3+ЬАР+ регуляторных Т-клеток в печени.
Пример 7. Пероральное введение обогащенного анти-ЬР8-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, повышает количество СВ45+ЬАР+ и СВ8+ЬАР+ регуляторных Тклеток в селезенке.
Для определения того, насколько пероральное введение обогащенного анти-ЬР8-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, стимулирует Тгед, заявители исследовали влияние перорального введения на тканевые субпопуляции регуляторных Т-клеток в селезенке. На фиг. 4 показана средняя поверхностная экспрессия маркеров (СВ45+ЬАР+ и СВ8+ЬАР+) на лимфоцитах селезенки, определенная с использованием проточной цитометрии на 7 сутки (день убоя) у всех мышей, обработанных 3,0 мг препарата. Значения представляют среднее значение±стандартное отклонение. На фиг. 4А и 4В показано, что пероральное введение обогащенного анти-ЬР8-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, увеличивало субпопуляцию СВ45+ЬАР+ и СВ8+ЬАР+ регуляторных Т-клеток в селезенке.
Пример 8. Пероральное введение молозива, обогащенного анти-ЬР8-антителами, мышам ОЬ/ОЬ.
Таблица 2
Дизайн эксперимента
В опыте находилось три группы мышей (табл. 2). Мышам ОЬ/ОЬ (4 мыши в группе) спаивали (перорально) ежедневно в течение 25 суток (5 раз в неделю) 30 мкл РВ8 (контроль, группа А) или 30 мкл (100 мкг) Т-1дО-молозива (группа В), которое растворяли в воде, или 30 мкл (100 мкг) обогащенного анти-ЬР8-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива (группа С). Через 4 недели мышей подвергали эвтаназии. При убое собирали кровь из сердца с использованием обычных мето- 35 024697 дов, затем готовили сыворотку крови.
Животные.
Для модели ОЬ/ОЬ использовали молодых мышей самцов С57ВЬ/6 ОЬ/ОЬ (в возрасте 6-7 недель). Мышей получали из питомника Наг1ап ЬаЬогаЮпез (США). Всех мышей содержали в Αηίιηαΐ Соге НаГаззаЬ-НеЬтете Ипщегзйу МеПса1 δαίιοοί. Мышам скармливали вволю обычный лабораторный гранулированный корм и воду и содержали при световом цикле 12 ч свет/темнота. Опыты с животными проводили, следуя указаниям НеЬтете Ипщегзйу НаГаззаЬ Ιι-ΜΠιΠίοι·^ ί,’οιηιηίΐ^ £οτ Саге и Изе ο£ ^аЬο^аΐο^у Αη^та18 и с разрешения Комитета.
Пример 9. Пероральное введение Т-1дС снижает сывороточный инсулин у мышей ОЬ/ОЬ.
Для дальнейшей оценки эффектов обогащенного анти-Ь^-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, определяли уровень инсулина натощак у мышей групп А-С через 4 недели после начала перорального введения Т-1дС или Н1ВС. Сывороточный инсулин определяли с помощью ΕΜδΑ сэндвич-типа с использованием промышленно доступных наборов Мет^Па (иррза1а, Швеция), следуя инструкциям изготовителя. Отбирали кровь и готовили сыворотку крови от мышей ОЬ/ОЬ на 30 сутки после убоя мышей. На фиг. 5 показано, что у мышей, которым вводили Т-1дС, имело место снижение уровня сывороточного инсулина, указывая на положительное влияние анти-Ь^-антител на инсулинорезистентность. Кроме того, наблюдаемое снижение обеспечивало данные, подтверждающие важную роль, какую играют адъюванты молозива в метаболическом эффекте.
Пример 10. Пероральное введение обогащенного анти-Ь^-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, снижает толерантность к глюкозе у мышей ОЬ/ОЬ.
Для исследования того, насколько пероральное введение обогащенного анти-^Рδ-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, может привести к снижению сывороточного уровня глюкозы проводили анализ толерантности к глюкозе на мышах ОЬ/ОЬ (СТТ) на 30 сутки утром натощак. Глюкозу вводили перорально (1,25 г на кг). Определяли глюкозу в сыворотке крови, отобранной из хвостовой вены, каждые 15 мин в течение 3 ч. Концентрацию глюкозы определяли с использованием обычного глюкометра.
Как показано на фиг. 6, введенное мышам Н1ВС-молозиво повышало толерантность, о чем свидетельствовали более низкие значения в анализе толерантности к глюкозе со снижением площади под кривой концентрации по сравнению с контрольной группой. В совокупности с данными, описанными в примерах 9 и 10, результаты настоящего опыта свидетельствуют о значении Н1ВС по настоящему изобретению для лечения метаболического синдрома.
Пример 11. Пероральное введение обогащенного анти-Ь^-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, снижает повреждение печени у мышей ОЬ/ОЬ.
Установив, что пероральное введение обогащенного анти-Ь^-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, нормализует различные показатели метаболического синдрома, такие как снижение толерантности к глюкозе и снижение сывороточного инсулина, далее заявители настоящего изобретения оценивали, насколько также же нормализовалась активность ферментов печени, являющихся показателями повреждения этого органа, у животных, которым скармливали препарат. Определяли активность ΑСΤ и АЛТ с использованием клинического биохимического анализатора Κеί1ονеΐ Р1из (ΡοΟ^ □(ад/юз^з, СтЬН, Маппйе1т, Германия). На фиг. 7 показано снижение активности ΑСΤ и АЛТ у мышей, обработанных Т-1§С-молозивом.
Пример 12. Пероральное введение обогащенного анти-Ь^-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, снижает уровень ТС печени у мышей ОЬ/ОЬ.
Установив, что пероральное введение обогащенного анти-Ь^-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, нормализует различные показатели метаболического синдрома, исследовали влияние обогащенного анти-Ь^-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, и Т-1§С-молозива на накопление триглицеридов в печени в конце опыта после убоя мышей. Накопление внутриклеточных триглицеридов (ТС) в печени количественно определяли с использованием метода РЫсй в модификации. ТС экстрагировали из аликвотных порций быстро замороженных образцов печени, затем определяли спектрофотометрически с использованием набора СРО-ТтшГет (δίβΗκτ Κ^Ηονοΐ, Израиль) и нормализовали к содержанию белка в гомогенате. Содержание триглицеридов рассчитывали для мышей всех опытных и контрольных групп.
На фиг. 8 показано, что пероральное введение обогащенного анти-Ь^-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, снижало содержание триглицеридов по сравнению с мышами в контрольной группе. Снижение было достоверным для Н1ВС по сравнению с контролями (*Р<0,04).
Пример 13. Пероральное введение обогащенного анти-Ь^-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, повышает количество €'03+^? регуляторных Т-клеток в селезенке.
Для определения того, насколько пероральное введение обогащенного анти-Ь^-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, стимулирует Тгед, исследовали влияние перорального введения на тканевые субпопуляции регуляторных Т-клеток в селезенке. На фиг. 9 показана средняя поверхностная экспрессия маркеров (С^3+^ΛР+) на лимфоцитах селезенки, определенная с ис- 36 024697 пользованием проточной цитометрии на 25 сутки (день убоя) у всех мышей ОЬ/ОЬ. Значения представляют среднее значение±стандартное отклонение. На фиг. 9А и 9В показано, что пероральное введение Т1дО увеличивало субпопуляцию СО3+ЬАР+ регуляторных Т-клеток в селезенке.
Пример 14. Пероральное введение обогащенного анти-ЬР§-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, повышает количество СЭ8+СЭ25+ регуляторных Т-клеток в селезенке.
Для определения того, насколько пероральное введение обогащенного анти-ЬР§-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, стимулирует Тгед, исследовали влияние перорального введения на тканевые субпопуляции регуляторных Т-клеток в селезенке. Выделение лимфоцитов селезенки, постановку проточной цитометрии и окрашивание антителами проводили, как описано выше. На фиг. 10 и 11 показана средняя поверхностная экспрессия маркеров (СЭ8+СЭ25+) на лимфоцитах селезенки, определенная с использованием проточной цитометрии на 25 сутки (день убоя) у всех мышей ОЬ/ОЬ. Значения представляют среднее значение±стандартное отклонение.
На фиг. 10 и 11 показано, что пероральное введение Т-1дО увеличивало субпопуляцию СЭ3+СЭ25+ регуляторных Т-клеток в селезенке.
Пример 15. Пероральное введение обогащенного анти-ЬР§-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, повышает количество ί'.Ό4+ί'.Ό25+ регуляторных Т-клеток в жировой ткани.
Для определения того, насколько пероральное введение обогащенного анти-ЬР§-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, стимулирует Тгед в жировой ткани, исследовали влияние перорального введения на тканевые субпопуляции регуляторных Т-клеток. Проводили РАС8 анализ на лимфоцитах, выделенных из жировой ткани. Жировую ткань выделяли у мышей ОЬ/ОЬ сразу же после убоя. Жировую ткань (прослойки висцерального жира) измельчали на мелкие кусочки. Измельченные кусочки переносили в бикарбонатный буфер Кребса-Рингера (3 мл/г жировой ткани), содержащий 10 мМ глюкозы и 2,5% бычьего сывороточного альбумина, инкубировали с 840 Е/г коллагеназы типа I (81дта, КеНоуок Израиль) при 37°С при осторожном перемешивании в течение 1 ч. Затем клетки дважды фильтровали через шифоновую сетку (100 мкм) и центрифугировали при 50хд в течение 5 мин. Затем плавающие адипоциты отделяли от осадка фракции стромальной сосудистой сети (8У). Нижнюю фракцию удаляли и центрифугировали при 200 хд в течение 5 мин для осаждения клеток 8У. На фиг. 12А и 12В показана средняя поверхностная экспрессия маркеров (ί'.Ό4+ί'.Ό25+) на лимфоцитах жировой ткани с использованием проточной цитометрии на 25 сутки (день убоя) у всех мышей ОЬ/ОЬ.
На фиг. 12 показано, что пероральное введение Т-1дО увеличивало субпопуляцию СЭ4+СЭ25+ регуляторных Т-клеток в жировой ткани.
Пример 16. Пероральное введение обогащенного анти-ЬР§-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, повышает количество СО3+ЬАР+ регуляторных Т-клеток в жировой ткани.
Для определения того, насколько пероральное введение обогащенного анти-ЬР§-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, стимулирует Тгед в жировой ткани, исследовали влияние перорального введения на тканевые субпопуляции регуляторных Т-клеток. Проводили РАС8 анализ на лимфоцитах, выделенных из жировой ткани, которые выделяли, как описано выше. На фиг. 13А и 13В показана средняя поверхностная экспрессия маркеров (СИ3+ЬАР+) на лимфоцитах жировой ткани с использованием проточной цитометрии на 25 сутки (день убоя) у всех мышей ОЬ/ОЬ.
На фиг. 13 показано, что пероральное введение Т-1дО увеличивало субпопуляцию СИ3+ЬАР+ регуляторных Т-клеток в жировой ткани.
Пример 17. Пероральное введение обогащенного анти-ЬР§-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, повышает количество ί'.Ό4+ί'.Ό25+ регуляторных Т-клеток в стромальных сосудистых клетках (содержащих преадипоциты).
Для определения того, насколько пероральное введение обогащенного анти-ЬР§-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, стимулирует Тгед в жировой ткани, исследовали влияние перорального введения на тканевые субпопуляции регуляторных Т-клеток. Проводили РАС8 анализ на лимфоцитах, выделенных из стромальных сосудистых клеток, содержащих преадипоциты, которые выделяли методом, описанным выше.
На фиг. 14А и 14В показана средняя поверхностная экспрессия маркеров (ί'.Ό4+ί'.Ό25+) на лимфоцитах жировой ткани с использованием проточной цитометрии на 25 сутки (день убоя) у всех мышей ОЬ/ОЬ.
На фиг. 14 показано, что пероральное введение Т-1дО увеличивало субпопуляцию СЭ4+СЭ25+ регуляторных Т-клеток в стромальных сосудистых клетках, содержащих преадипоциты.
Для дополнительного исследования этой популяции клеток проводили РАС8 анализ на лимфоцитах, выделенных из стромальных сосудистых клеток, для оценки экспрессии маркеров (СП4+СП25+ЬАР+) на 25 сутки (день убоя) у всех мышей ОЬ/ОЬ.
На фиг. 15А и 15В показана средняя поверхностная экспрессия маркеров (СП4+СП25+ЬАР+) на лимфоцитах жировой ткани с использованием проточной цитометрии на 25 сутки (день убоя) у всех мы- 37 024697 шей ОЬ/ОЬ.
На фиг. 15 показано, что пероральное введение Т-1дС увеличивало субпопуляцию СБ4+СБ25+ регуляторных Т-клеток в стромальных сосудистых клетках, содержащих преадипоциты.
Пример 18. Опыты с дозированным введением обогащенного анти-ЬР8-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, мышам ОЬ/ОЬ.
Таблица 3
Дизайн эксперимента
В опыте находилось шесть групп мышей (табл. 3). Мышам ОЬ/ОЬ (5 мышей в группе) спаивали (перорально) ежедневно в течение 25 суток (5 раз в неделю) 30 мкл РВ8 (контроль, группа А), или 30 мкл (1 мкг) Т-1дС-молозива (группа В), или 30 мкл (100 мкг) Т-1дС-молозива (группа С), или 30 мкл (1 мг) Т1дС-молозива (группа Б), или 30 мкл (3 мг) Т-1дС-молозива (группа Е), или 30 мкл (100 мкг) Н1ВСмолозива (группа Р). Оба препарата молозива растворяли в воде.
Через 4 недели мышей подвергали эвтаназии. При убое собирали кровь из сердца с использованием обычных методов, затем готовили сыворотку крови для последующих исследований.
Животные.
Для модели ОЬ/ОЬ использовали молодых мышей самцов (в возрасте 6-7 недель) С57ВЬ/6 ОЬ/ОЬ, которых получали из питомника Наг1ап ЬаЬога1опез (США). Всех мышей содержали в Атта1 Соге НаТаззаЬ-НеЬге^ БтуегзНу МеЛса1 8сЬоо1. Мышам скармливали вволю обычный лабораторный гранулированный корм и воду и содержали при световом цикле 12 ч свет/темнота. Опыты с животными проводили, следуя указаниям 11еЬге\г ЦшуегзНу НаТаззаЬ 1пзШи1юпа1 СоттШее Гог Саге и Цзе оГ ЬаЬога1огу Атта1з и с разрешения Комитета.
Пример 19. Пероральное введение обогащенного анти-ЬР8-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, снижает активность ферментов печени у мышей ОЬ/ОЬ.
Определяли активность АСТ и АЛТ с использованием клинического биохимического анализатора, как описано выше. На фиг. 16 показано, что Т-1дС в дозе 1 мг был наиболее эффективным в снижении активности ферментов печени.
Пример 20. Пероральное введение обогащенного анти-ЬР8-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, снижает уровень общего холестерина у мышей ОЬ/ОЬ.
Триглицериды и общий холестерин в плазме крови определяли с использованием клинического биохимического анализатора КеИоуе! Р1из (КосЬе Б1а§позИсз, СтЬН, МаппЬе1т, Германия). На фиг. 17 показано, что Т-1дС в дозе 100 мкг был наиболее эффективным в снижении уровня общего холестерина.
Пример 21. Пероральное введение обогащенного анти-ЬР8-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, снижает уровень ТС в печени мышей ОЬ/ОЬ.
Накопление внутриклеточных триглицеридов (ТС) в печени количественно определяли с использованием метода Ро1сЬ в модификации. ТС экстрагировали из аликвотных порций быстро замороженных образцов печени, затем определяли спектрофотометрически с использованием набора СРО-ТппТег (8ΐ§та, КеЬоуо!, Израиль) и нормализовали к содержанию белка в гомогенате.
На фиг. 18 показано, что Т-1дС в дозах 1, 3 мг и 100 мкг был наиболее эффективным в снижении уровня триглицеридов в печени. Снижение было статистически достоверным для группы мышей А по сравнению с группами Б, Е, Р (*р<0,05).
Пример 22. Пероральное введение Т-1дС в дозах 1 мкг, 1, 3 мг вместе с Н1ВС в дозе 100 мкг снижает количество ΟΒ3+ΝΚ1.1+ клеток в печени мышей ОЬ/ОЬ.
Проводили РАС8 анализ на лимфоцитах, выделенных из печени мышей ОЬ/ОЬ. Определяли среднюю экспрессию маркеров (Οβ3+ΝΚ1.1+) на лимфоцитах печени с использованием проточной цитометрии на 25 сутки (день убоя) у всех мышей ОЬ/ОЬ. Для проточной цитометрии использовали следующие антитела: анти-СБ3-Р1ТС и анти-КК1.1-РЕ. Поверхностное окрашивание и РАС8 анализ проводили, как описано выше.
На фиг. 19А показано, что пероральное введение Т-1дС в дозах 1 мкг, 1, 3 мг вместе с Н1ВС в дозе
- 38 024697
100 мкг снижало количество СО3+М<1.1 + клеток в печени мышей ОЪ/ОЪ. Кроме того, на фиг. 19В показано, что пероральное введение Т-1дО в дозах 1 и 100 мкг снижало количество С^3+NК1.1+ клеток в печени мышей ОЪ/ОЪ.
Пример 23. Пероральное введение Т-1дО- и Н1ВС-молозива повышает количество СО4+СО25+ЬАР/ЬАР+ клеток в печени мышей ОЪ/ОЪ.
Для установления дозировок при пероральном введении обогащенного анти-ЬР§-антителами иммуноглобулинового препарата, полученного из молозива, которые стимулируют Тгед в печени, исследовали влияние перорального введения на тканевые субпопуляции регуляторных Т-клеток. Проводили РАС8 анализ на лимфоцитах, выделенных из печени, с использованием метода, описанного выше. На фиг. 20 показана средняя экспрессия маркеров на лимфоцитах печени с использованием проточной цитометрии на 25 сутки (день убоя) у всех мышей ОЪ/ОЪ.
На фиг. 20А показано, что пероральное введение Т-1дО- и Н1ВС-молозива увеличивало субпопуляцию СП4+СП25+ЬАР-/ЬАР+ клеток в печени мышей ОЪ/ОЪ. На фиг. 20В показано, что пероральное введение Н1ВС-молозива в дозе 100 мкг повышало количество СО4+СО25+ЬАР+ клеток в печени мышей ОЪ/ОЪ.
Пример 24. Пероральное введение Т-1дО- и Н1ВС-молозива индуцирует изменения количества СП25+ЬАР-лимфоцитов в печени.
На фиг. 21 показано, что пероральное введение Т-1дО в дозах 1 мкг, 1, 3 мг вместе с Н1ВС в дозе 100 мкг индуцировало изменения количества СП25+ЬАР-лимфоцитов в печени мышей ОЪ/ОЪ.
Пример 25. Пероральное введение Т-1дО- и Н1ВС-молозива индуцирует изменения количества СО25+БАР+ лимфоцитов в селезенке.
На фиг. 22А показано, что введение Т-1дО- и Н1ВС-молозива снижало количество СО25+БАР+ лимфоцитов в селезенке. На фиг. 22В показано, что пероральное введение Т-1дО молозива повышало количество СО25+ЬАР+ лимфоцитов в селезенке.
Пример 26. Пероральное введение Т-1§О-молозива в дозах 1 и 3 мг и Н1ВС-молозива в дозе 100 мкг повышает количество СО4+СО25+ЬАР- клеток в селезенке.
Проводили РАС8 анализ на лимфоцитах, выделенных из печени мышей ОЪ/ОЪ. На фиг. 23 показана средняя экспрессия маркеров (СП4+СП25+ЬАР-) на лимфоцитах селезенки с использованием проточной цитометрии на 25 сутки (день убоя) у всех мышей ОЪ/ОЪ. На фиг. 23 показано, что пероральное введение Т-1§О-молозива в дозах 1 и 3 мг и Н1ВС-молозива в дозе 100 мкг увеличивало субпопуляцию СО4+СО25+ЬАР- лимфоцитов в селезенке.
Пример 27. Пероральное введение Т-1§О-молозива повышает количество СЭ4+СЭ25+ клеток в жировой ткани.
Проводили РАС8 анализ на лимфоцитах, выделенных из жировой ткани мышей ОЪ/ОЪ, как описано выше. На фиг. 24 показана средняя экспрессия маркеров (СО4+СО25+) на лимфоцитах жировой ткани с использованием проточной цитометрии на 25 сутки (день убоя) у всех мышей ОЪ/ОЪ. На фиг. 24 показано, что пероральное введение Т-1§О-молозива увеличивало субпопуляцию Соп А гепатита.
Введение Соп А и определение активности сывороточных трансфераз. Соп А получали от МР Вютебкак (ОМо, США). Соп А (0,5 мг, 20 мг/кг) растворяли в 200 мкл 50 мМ Трис буфера (рН 7), 150 мМ №С1, 4 мМ СаС12 и вводили мышам внутривенно. Через 8 и 20 ч после введения Соп А отбирали кровь от отельных мышей и получали сыворотку. Определяли активность аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) с использованием автоматического биохимического анализатора.
Для оценки бактериальной транслокации определяли уровень липополисахарида (ЬР8) с использованием анализа лизата ЫтШик атеЪосу!е с хромогенным субстратом (ЬАЬ-тест); ЬАЬ является показателем степени бактериальной транслокации.
В табл. 4 показано, что пероральное введение анти-ЬР§ молозива снижало бактериальную транслокацию, о чем судили по снижению средних уровней ЬАЬ.
Таблица 4
Среднее значение Стандартное отклонение Р-значение
Группа А СопА+ВСР 1,52 0,75 0, 37
Группа В СопА +ЪР5 МОЛОЗИВО 1, 18 0, 30
Важно отметить, что пониженная бактериальная транслокация была связана с нормализацией активности АЛТ, которая является показателем повреждения печени, как показано в табл. 5.
- 39 024697
Таблица 5
АЛТ Среднее значение Стандартное отклонение
Группа А СопА+ВСР А1 28170
А2 857, 6
АЗ 1356,8
А4 340, 8
А5 26340
11413,04 14480,59
Группа В В1 10992
СопА+Т-1дС В2 796, 8
вз 167,2
В4 2816
В5 12672
5492,8 5898,076
Пример 32. Получение композиций, содержащих обогащенные анти-ЬР8-антителами иммуноглобулиновые препараты, и антител против инсулина.
Для получения обогащенного анти-ЬР8-антителами иммуноглобулинового препарата собирали молозиво примерно от 200 молочных коров в хозяйствах промышленного типа. Коровы в данных хозяйствах, помимо вакцинации против обычных патогенов крупного рогатого скота, также были вакцинированы запатентованной вакциной Ληαάίδ на основе антигенов внешней оболочки многочисленных штаммов бактерий Е. сой, основного микроорганизма в кишечнике человека. Для получения иммуноглобулинового препарата, обогащенного антителами к инсулину, трех дойных коров иммунизировали инсулином, конъюгированным с КБН в качестве антигена. Вакцины на основе антигена вводили в последние восемь недель стельности. Молозиво собирали в течение первых двух дней лактации. Полученное молозиво замораживали в отдельных пакетах для тестирования. Для обработки молозиво оттаивали, объединяли и удаляли жир. Каждую партию пастеризовали. Молозиво концентрировали ультрафильтрацией для уменьшения объема перед лиофилизацией. В результате проведения ультрафильтрации содержание лактозы в конечном порошке снижалось до концентрации ниже чем 7% (примерно с 50%).
Обогащенный анти-ЬР8-антителами иммуноглобулиновый препарат и обогащенный антителами к инсулину иммуноглобулиновый препарат смешивали с получением композиции для применения, как описано ниже.
Для воспроизведения иммунного гепатита мышам самцам С57/В1 в возрасте 11-12 недель вводили в хвостовую вену 500 мкг/мышь (примерно 15 мг/кг) Соп А (МР ВютеФсаЕ, США), который растворяли в 50 мМ Трис буфере с рН 7, 150 мМ ЫаС1, 4 мМ СаС12, для индукции гепатита. Животным всех опытных групп перорально вводили (например, с помощью желудочного зонда) композицию, содержащую обогащенные анти-ЬР8-антителами и антителами против инсулина иммуноглобулиновые препараты, в различных концентрациях и сравнивали с необработанными контролями. Затем у животных опытных групп определяли следующие показатели: активность аспартатаминотрансферазы (АСТ) и аланинаминотрансферазы (АЛТ) в сыворотке крови, проводили гистологическое исследование образцов печени, РАС8 анализ лимфоцитов в печени и селезенке на ΝΚ-маркеры, определяли уровень ТС, общего холестерина, оценивали толерантность к глюкозе, определяли уровень сывороточного инсулина, цитокинов и проводили анализ вестерн-блоттингом на экспрессию транскрипционных факторов 8ТАТ 1, 4 и 6 и ΝΗ<Β. и показатели сравнивали с контрольными группами.

Claims (4)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Применение композиции, содержащей обогащенный анти-ЕР8-антителами иммуноглобулиновый препарат, полученный из молозива, для лечения индивида, страдающего заболеванием печени, выбранным из хронического гепатита С, неалкогольного стеатогепатита ^А8Н), жировой дистрофии печени или гепатоэнцефалопатии.
  2. 2. Применение по п.1, где индивид имеет повышенные уровни аспартатаминотрансферазы (А8Т) или аланинаминотрансферазы (АБТ).
  3. 3. Применение по п.1, где лечение заболевания печени включает уменьшение уровней А8Т или АБТ у индивида.
  4. 4. Применение по любому из вышеуказанных пунктов, где молозиво является молозивом коровы.
EA201171304A 2009-04-27 2010-04-27 Применение композиции, содержащей обогащенный анти-lps-антителами иммуноглобулиновый препарат, для лечения заболеваний печени EA024697B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17292209P 2009-04-27 2009-04-27
PCT/IL2010/000339 WO2010125565A2 (en) 2009-04-27 2010-04-27 Anti-lps enriched immunoglobulin preparation for use in treatment and/or prophylaxis of a pathologic disorder

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201171304A1 EA201171304A1 (ru) 2012-06-29
EA024697B1 true EA024697B1 (ru) 2016-10-31

Family

ID=42357536

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201171304A EA024697B1 (ru) 2009-04-27 2010-04-27 Применение композиции, содержащей обогащенный анти-lps-антителами иммуноглобулиновый препарат, для лечения заболеваний печени

Country Status (14)

Country Link
US (2) US10117930B2 (ru)
EP (2) EP3461840A1 (ru)
JP (1) JP5740390B2 (ru)
KR (1) KR101785120B1 (ru)
AU (1) AU2010243205B2 (ru)
BR (1) BRPI1014774A2 (ru)
CA (2) CA2760096C (ru)
DK (1) DK2424890T3 (ru)
EA (1) EA024697B1 (ru)
ES (1) ES2684696T3 (ru)
IL (1) IL215924B (ru)
MX (1) MX2011011376A (ru)
SG (1) SG175142A1 (ru)
WO (1) WO2010125565A2 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210290538A1 (en) * 2018-07-02 2021-09-23 Puretech Lyt, Inc. Milk vesicles for use in delivering biological agents

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9943597B2 (en) 2010-08-17 2018-04-17 Immuron Limited Anti-LPS enriched immunoglobulin preparation for use in treatment and/or prophylaxis of a pathologic disorder
CA2813612A1 (en) * 2010-10-04 2012-04-12 Immuron Limited Methods and compositions using anti-lps ligands for the treatment and prevention of inflammatory disorders
MX340019B (es) 2010-11-23 2016-06-22 Pantheryx Inc Composiciones y metodos para el tratamiento en aplicaciones clinicas de amplio espectro, no diferenciadas o combinadas.
DE102011006781A1 (de) * 2011-04-05 2012-10-11 Mat-Malta Advanced Technologies Limited Antikörperprodukt, umfassend n spezifische Antikörper
DE102011006809A1 (de) 2011-04-05 2012-10-11 Freistaat Bayern vertreten durch die Julius-Maximilians-Universität Würzburg Verwendung eines Mittels aus Antikörpern und/oder Insulin-like growth factor-Antagonisten
WO2012149405A2 (en) 2011-04-29 2012-11-01 Selecta Biosciences, Inc. Tolerogenic synthetic nanocarriers for regulating innate immune responses
AU2012269740A1 (en) * 2011-06-17 2013-01-31 Immuron Limited Method and composition for treatment or inhibition of mucositis associated with chemotherapy or radiation damage
WO2013009843A1 (en) * 2011-07-11 2013-01-17 Camas Incorporated Compositions against bacterial toxins
AU2013204801B2 (en) 2012-05-23 2014-11-06 Omniblend Innovation Pty Ltd Composition and method for management of diabetes or pre-diabetes
WO2013189544A1 (en) * 2012-06-21 2013-12-27 Synthon B.V. Method of purifying an antibody
WO2014111516A1 (en) 2013-01-17 2014-07-24 Arsanis Biosciences Gmbh Mdr e. coli specific antibody
ES2842206T3 (es) 2013-05-03 2021-07-13 Selecta Biosciences Inc Métodos y composiciones para potenciar linfocitos T reguladores CD4+
WO2015063693A1 (en) * 2013-10-30 2015-05-07 Hadasit Medical Research Services And Development Limited Anti-lps enriched immunoglobulin for use in treatment and/or prophylaxis of fibrosis
EA201790533A1 (ru) 2014-09-07 2017-07-31 Селекта Байосайенсиз, Инк. Способы и композиции для ослабления иммунных ответов против вирусного вектора для переноса, предназначенного для модулирования экспрессии генов
EP3452064A4 (en) * 2016-05-06 2019-11-27 Hadasit Medical Research Services And Development COLOSTRUM HYPERIMMUN FOR USE IN MODULATING AND TREATING MAMMALIAN MICROBIOMA-ASSOCIATED DISORDERS
AR109621A1 (es) 2016-10-24 2018-12-26 Janssen Pharmaceuticals Inc Formulaciones de vacunas contra glucoconjugados de expec
AU2018236123B2 (en) 2017-03-11 2024-04-18 Selecta Biosciences, Inc. Methods and compositions related to combined treatment with anti-inflammatories and synthetic nanocarriers comprising an immunosuppressant
CN112135832A (zh) 2018-03-22 2020-12-25 维京治疗公司 化合物的晶型和制备化合物的晶型的方法
JP2022513337A (ja) * 2018-10-03 2022-02-07 アヌビス バイオ コーポレーション 動物の腸管感染症及び急性下痢を治療する組成物及び方法
BR112021010916A2 (pt) * 2018-12-05 2021-08-24 Viking Therapeutics, Inc. Composições e métodos para tratamento de distúrbios hepáticos
MX2021011445A (es) 2019-03-18 2021-10-13 Janssen Pharmaceuticals Inc Bioconjugados de polisacaridos de antigenos o de e. coli, metodos de produccion y metodos de uso de los mismos.
WO2021168321A1 (en) * 2020-02-19 2021-08-26 Anubis Bio Corporation Composition and methods for treating infectious agents using pathogen-specific antibodies
MX2023012232A (es) * 2021-04-16 2023-11-22 Prodigy Biotech Ovoproducto hiperinmunizado para tratar o prevenir la enfermedad hepatica alcoholica y la enfermedad de injerto contra huesped.

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992016624A1 (en) * 1991-03-13 1992-10-01 The Common Services Agency Monoclonal antibody against lps core
EP1795204A1 (en) * 2004-09-29 2007-06-13 Asama Chemical Co., Ltd. Functional composition or food containing whey protein, antibody derived from milk, or antibody
WO2008025099A1 (en) * 2006-08-31 2008-03-06 A.C.N. 135 493 391 Pty Ltd As Trustee For Conca Unit Trust Treatment and/or prevention of non-infectious medical conditions using antibody-containing compositions

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH627079A5 (en) 1977-04-15 1981-12-31 Nestle Sa Process for preparing a protein concentrate containing immunological factors of milk origin
US4550019A (en) 1978-03-22 1985-10-29 South Africa Inventions Development Corporation Manufacture and use of fowl egg antibodies
JPS58154513A (ja) 1982-03-09 1983-09-14 Sendai Biseibutsu Kenkyusho 予防及び治療薬
US4748018A (en) 1984-02-07 1988-05-31 Stolle Research & Development Corp. Method of passive immunization of mammals using avian antibody
WO1995008562A1 (en) 1993-09-20 1995-03-30 Anadis Ltd. Method of obtaining immunoglobulins from colostrum and their use in pharmaceutical composition
DE4337654C2 (de) 1993-11-04 1996-08-08 Biotest Pharma Gmbh Verwendung boviner Kolostralmilch von nicht mit Viren hyperimmunisierten Tieren als Leberschutzpräparat
IL139339A0 (en) 1998-05-27 2001-11-25 Gemma Biotechnology Ltd The induction of antibiotic peptides by lait (scd14) protein
DE19830607C2 (de) 1998-07-09 2002-08-01 Hte Ag The High Throughput Exp Verfahren zum Nachweis eines Produktes im Abstrom eines katalytischen Materials einer Vielzahl von katalytischen Materialien
CN100571715C (zh) 2002-03-21 2009-12-23 阿纳迪斯有限公司 含有生物活性物质的组合物及其制备和处理方法
WO2003097094A1 (en) 2002-05-21 2003-11-27 Anadis Ltd Method of prophylaxis of infection
US9701737B2 (en) 2003-02-19 2017-07-11 Camas, Incorporated Immunogen adherence and method of making and using same
AU2003901008A0 (en) 2003-03-04 2003-03-20 Anadis Ltd Composition for the treatment and prevention of bacterial infections
US20090169566A1 (en) 2004-11-22 2009-07-02 Anadis Ltd. Bioactive compositions
EP2268669B1 (en) 2008-03-13 2017-10-18 Immuron Limited Bovine Colostrum comprising anti-insulin antibodies for treating Metabolic Disorder diseases.
US9943597B2 (en) 2010-08-17 2018-04-17 Immuron Limited Anti-LPS enriched immunoglobulin preparation for use in treatment and/or prophylaxis of a pathologic disorder

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1992016624A1 (en) * 1991-03-13 1992-10-01 The Common Services Agency Monoclonal antibody against lps core
EP1795204A1 (en) * 2004-09-29 2007-06-13 Asama Chemical Co., Ltd. Functional composition or food containing whey protein, antibody derived from milk, or antibody
WO2008025099A1 (en) * 2006-08-31 2008-03-06 A.C.N. 135 493 391 Pty Ltd As Trustee For Conca Unit Trust Treatment and/or prevention of non-infectious medical conditions using antibody-containing compositions

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AMARAL J.A., ET AL: "In vitro reactivity and growth inhibition of EPEC serotype O111 and STEC serotypes O111 and O157 by homologous and heterologous chicken egg yolk antibody", VETERINARY RESEARCH COMMUNICATIONS., AMSTERDAM, NL, vol. 32, no. 4, 1 April 2008 (2008-04-01), NL, pages 281 - 290, XP002611601, ISSN: 0165-7380, DOI: 10.1007/s11259-007-9029-3 *
CZAJA M J ET AL: "Lipopolysaccharide-neutralizing antibody reduces hepatocyte injury from acute hepatotoxin administration.", HEPATOLOGY, vol. 19, no. 5, 1 May 1994 (1994-05-01), pages 1282 - 1289, XP002594906, ISSN: 0270-9139 *
FEINGOLD K R ET AL: "Endotoxin rapidly induces changes in lipid metabolism that produce hypertriglyceridemia: low doses stimulate hepatic triglyceride production while high doses inhibit clearance.", JOURNAL OF LIPID RESEARCH, AMERICAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, INC., US, vol. 33, no. 12, 1 December 1992 (1992-12-01), US, pages 1765 - 1776, XP002594907, ISSN: 0022-2275 *
NAGAO A T ET AL: "Elevated levels and different repertoire profile of colostral anti-LPS antibodies may have a significant role in compensating newborn immunity.", SCANDINAVIAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY, BLACKWELL SCIENCE PUBL., OXFORD, GB, vol. 53, no. 6, 1 June 2001 (2001-06-01), GB, pages 602 - 609, XP002594908, ISSN: 0300-9475 *
PATRICIA PALMEIRA ; LEONARDO YU ITO ; CHRISTINA ARSLANIAN ; MAGDA MARIA SALES CARNEIRO-SAMPAIO: "Passive immunity acquisition of maternal anti-enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O157:H7 IgG antibodies by the newborn", EUROPEAN JOURNAL OF PEDIATRICS ;, SPRINGER, BERLIN, DE, vol. 166, no. 5, 21 October 2006 (2006-10-21), Berlin, DE, pages 413 - 419, XP019491889, ISSN: 1432-1076 *
YOKOYAMA, H. UMEDA, K. PERALTA, R.C. HASHI, T. ICATLO, F.C. KUROKI, M. IKEMORI, Y. KODAMA, Y.: "Oral passive immunization against experimental salmonellosis in mice using chicken egg yolk antibodies specific for Salmonella enteritidis and S. typhimurium", VACCINE, ELSEVIER LTD, GB, vol. 16, no. 4, 1 February 1998 (1998-02-01), GB, pages 388 - 393, XP004099299, ISSN: 0264-410X, DOI: 10.1016/S0264-410X(97)80916-4 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210290538A1 (en) * 2018-07-02 2021-09-23 Puretech Lyt, Inc. Milk vesicles for use in delivering biological agents

Also Published As

Publication number Publication date
KR20120061067A (ko) 2012-06-12
WO2010125565A3 (en) 2011-01-27
ES2684696T3 (es) 2018-10-04
IL215924B (en) 2018-01-31
CA2760096A1 (en) 2010-11-04
IL215924A0 (en) 2011-12-29
EP2424890A2 (en) 2012-03-07
EP2424890B1 (en) 2018-08-01
US10117930B2 (en) 2018-11-06
SG175142A1 (en) 2011-12-29
CA2760096C (en) 2018-10-30
DK2424890T3 (en) 2018-09-17
CA3017477A1 (en) 2010-11-04
MX2011011376A (es) 2012-04-20
EA201171304A1 (ru) 2012-06-29
AU2010243205B2 (en) 2014-09-11
JP5740390B2 (ja) 2015-06-24
BRPI1014774A2 (pt) 2019-04-16
WO2010125565A2 (en) 2010-11-04
US20120135007A1 (en) 2012-05-31
KR101785120B1 (ko) 2017-10-12
AU2010243205A1 (en) 2011-12-01
JP2012525376A (ja) 2012-10-22
US20190209681A1 (en) 2019-07-11
EP3461840A1 (en) 2019-04-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA024697B1 (ru) Применение композиции, содержащей обогащенный анти-lps-антителами иммуноглобулиновый препарат, для лечения заболеваний печени
CA2260007C (en) Method for treating gastrointestinal damage
EP2268669B1 (en) Bovine Colostrum comprising anti-insulin antibodies for treating Metabolic Disorder diseases.
US9943597B2 (en) Anti-LPS enriched immunoglobulin preparation for use in treatment and/or prophylaxis of a pathologic disorder
JP4911894B2 (ja) 関節リウマチを予防するための経口投与用組成物
MXPA99000772A (en) Method for treating gastrointestinal damage

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): RU