JP5740390B2 - 病的障害の治療および/または予防において使用するための抗lps強化免疫グロブリン製剤 - Google Patents
病的障害の治療および/または予防において使用するための抗lps強化免疫グロブリン製剤 Download PDFInfo
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Description
(2008)]。興味深いことに、最近の研究は、HCV非構造タンパク質NS5AはToll様受容体(TLR)4を活性化し、これはまた、LPSによっても活性化されることを示している。[Machida, K. et al. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 106(5):1548-53 (2009]。
G. et al. J. Viral. Hepatitis (March 11,
2009)]。このように、消化管微生物産物のトランスロケーション、免疫活性化および肝疾患の進行は密接に関係するように見えるが、因果関係の証拠は欠如している。さらに、LPSレベルとウイルス排除の間には関係があるようにみえるが、これは解明する必要がある。このように、これらの関係を明らかにすることを目的とする研究が必要である。微生物トランスロケーションが免疫活性化および肝疾患の進行を推進するなら、微生物トランスロケーションを減少させ、または防止する戦略が免疫活性化、よって慢性HCV感染の自然歴に対し著しい影響を有し得る。
K.H. et al. BMC Infect Dis. 9(1): 41 (2009)]。慢性抗生物質を使用するSBP予防のための方法は、議論の余地があり、抗生物質耐性種の出現と関連する[Cohen,
M.J. et al. Cochrane Database Syst Rev. 2: CDO04791 (2009)]。
M.M. 'et al. J. Med. Microbiol. 57(Pt 12):1533-8 (2008)]。
K.V. et al. J. Exp. Med. 199:1467-77 (2004); Bluestone, J.A. and Tang, Q. J.
Autoimmun 24:55-62 (2005); Putnam, A.l. et al J.Autoimmun. 24:55-62 (2005)]、そのうち、IgGクラスが80〜90%を占める。
B.K. and Furuta, G.T. J. Allergy Clin. Immunol. 121:S380-3; quiz S415 (2008);
Faria, A.M. and Weiner, H.L. Clin. Dev. Immunol. 13:143-57 (2006)]。このように、主な試みは、経口および経鼻投与に好適な安定な初乳由来の生成物を生成するためになされた。例えば、本発明者らの幾人かによるWO95/08562号は、抗体を豊富に含む初乳から高純度免疫グロブリンを得る方法および活性の実質的な損失なしでこれらの初乳−抗体を錠剤形態に圧縮する可能性を記載する。特異抗体は毒素原性細菌、例えば大腸菌、サルモネラ菌および赤痢菌に対する特異抗原でほ乳類を免疫化することにより得ることができる。本発明者らの幾人かによるWO06/053383号は、高免疫初乳、ラクトフェリンまたはラクトフェリシンの生理活性剤組成物に、様々な胃pH値下での安定性を付与するカルボン酸およびアルカリ化部分を記載する。最後に、本発明者らの幾人かによるWO03/080082号は、生理活性物質ならびにほ乳類初乳および初乳抽出物の混合物を形成させることを含む、不安定な生理活性物質、好ましくは免疫グロブリンまたはそれらの断片あるいは酵素の胃環境内での生存率を改善する方法を記載する。このコンジュゲーションは抗体または抗体断片を酵素または低pH条件により引き起こされるタンパク質分解から保護し、胃またはルーメンあるいは他の不適な環境でそれらの機能を保持する。
R. et al. Am. J. Gastroenterol. 98(11): 2505-15 (2003)]。
C.O. et al. N. Engl. J. Med. 318(19): 1240-3 (1988)]。別の研究では、腸管毒素原性大腸菌コロニー形成因子に対する乳由来の抗体の投与により、プラセボが摂取させた10人中7人の被験者に比べ、15人中14人の被件者が下痢から保護された[Freedman,
D.J. et al. J. Infect. Dis. 177(3): 662-7 (1998)]。
Dissel, J.T. et al. J. Med. Microbiol. 54(2):
197-205 (2005)].
値は平均±標準偏差である。AST;アスパラギン酸トランスアミナーゼ、およびALT;アラニンアミノトランスフェラーゼ。
【図2】経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤は肝臓においてCD4+CD25+制御性T細胞の発現を増加させる。
A;リンパ球上でのマーカーの平均表面発現。値は平均±標準偏差である。B;FACS分析から得られた代表的なドットブロット。
【図3】経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤は、肝臓においてCD25+CD4+LAP−、CD45+LAP+およびCD3+LAP+制御性T細胞の発現を増加させる。値は平均である。
A;リンパ球上でのマーカーの平均表面発現。B;FACS分析から得られた代表的なドットブロット。
【図4】経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤は、脾臓においてCD45+LAP+およびCD8+LAP+制御性T細胞の発現を増加させる。
A;リンパ球上でのマーカーの平均表面発現。値は平均±標準偏差である。B;FACS分析から得られた代表的なドットブロット。
【図5】経口T−IgG−初乳はOb/Obマウスにおいて血清インスリンを減少させる。
値は平均±標準偏差である。
【図6】経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤は、Ob/Obマウスにおいて耐糖能を減少させる。
【図7】抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤の経口投与は、Ob/Obマウスにおいて肝損傷を減少させる。
値は平均±標準偏差である。AST;アスパラギン酸トランスアミナーゼ、およびALT;アラニンアミノトランスフェラーゼ。
【図8】抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤の経口投与は、Ob/Obマウスにおいて肝臓トリグリセリド(TGs)を減少させる。
値は平均±標準偏差である。
【図9】抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤の経口投与は、脾臓においてCD3+LAP+制御性T細胞の発現を増加させる。
A;リンパ球上でのマーカーの平均表面発現。値は平均±標準偏差である。B;FACS分析から得られた代表的なドットブロット。
【図10】抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤の経口投与は、脾臓においてCD8+CD25+制御性T細胞の発現を増加させる。
値は平均±標準偏差である。
【図11】抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤の経口投与は、脾臓においてCD8+CD25+制御性T細胞の発現を増加させる。
FACS分析から得られた代表的なドットブロット。
【図12】経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤は脂肪組織においてCD4+CD25+制御性T細胞の発現を増加させる。
A;リンパ球上でのマーカーの平均表面発現。値は平均±標準偏差である。B;FACS分析から得られた代表的なドットブロット。
【図13】経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤は脂肪組織においてCD3+LAP+制御性T細胞の発現を増加させる。
A;リンパ球上でのマーカーの平均表面発現。値は平均±標準偏差である。B;FACS分析から得られた代表的なドットブロット。
【図14】経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤は、間質血管細胞(前脂肪細胞を含む)において、CD4+CD25+制御性T細胞の発現を増加させる。
A;リンパ球上でのマーカーの平均表面発現。値は平均±標準偏差である。B;FACS分析から得られた代表的なドットブロット。
【図15】経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤は、間質血管細胞(前脂肪細胞を含む)において、CD4+CD25+LAP+リンパ球の発現を増加させる。
A;リンパ球上でのマーカーの平均表面発現。値は平均±標準偏差である。B;FACS分析から得られた代表的なドットブロット
【図16】経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤はOb/Obマウスにおいて肝臓酵素を減少させる。
値は平均±標準偏差である。AST;アスパラギン酸トランスアミナーゼ、およびALT;アラニンアミノトランスフェラーゼ。
【図17】経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤は、Ob/Obマウスにおいて総コレステロールを減少させる。
値は平均±標準偏差である。
【図18】経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤はOb/Obマウスにおいて肝臓TGを減少させる。
T−IgGおよびHIBC初乳の経口投与はOb/Obマウスにおいて肝臓TGを減少される。値は平均±標準偏差である。減少は、D、E、Fに対して群Aで有意であった(*p<0.05)。
【図19】経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤はOb/Obマウスの肝臓においてCD3+NK1.1+細胞を減少させた。
A.1μg、1mg、3mgのT−IgGを、100μgHIBCと共に経口投与すると、Ob/Obマウスの肝臓においてCD3+NK1.1+細胞が減少した。リンパ球上でのマーカーの平均表面発現。値は平均±標準偏差である。B:1μgおよび100μgのT−IgGの経口投与は、Ob/Obマウスの肝臓においてCD3+NK1.1+細胞を減少させた。FACS分析から得られた代表的なドットブロット。
【図20】経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤はOb/Obマウスの肝臓においてCD4+CD25+LAP−/LAP+細胞を増加させる。
A;リンパ球上でのマーカーの平均表面発現。値は平均±標準偏差である。B;FACS分析から得られた代表的なドットブロット。
【図21】経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤はCD25+LAP−肝臓リンパ球の変化を誘導する。
T−IgGおよびHIBC−初乳の経口投与は、CD25+LAP−肝臓リンパ球の変化を誘導する。FACS分析から得られた代表的なドットブロット。
【図22】経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤はCD25+LAP+脾臓リンパ球を減少させる。
A.T−IgGおよびHIBC−初乳経口投与は、CD25+LAP+脾臓リンパ球を減少させる。リンパ球上でのマーカーの平均表面発現。値は平均±標準偏差である。B:FACS分析から得られた代表的なドットブロット。
【図23】経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤は、CD4+CD25+LAP−脾臓リンパ球を増加させる。
A.1および3mgのT−IgGならびに100mgのHIBC−初乳の経口投与は、CD4+CD25+LAP−脾臓リンパ球を増加させる。
【図24】経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤は脂肪組織においてCD4+CD25+を増加させる。
A.T−IgG−初乳の経口投与は脂肪組織においてCD4+CD25+を増加させる。リンパ球上でのマーカーの平均表面発現。値は平均±標準偏差である。
【図25】経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤は脂肪細胞においてCD4+CD25+を増加させる。
A.100mgのT−IgG−初乳の経口投与は脂肪細胞においてCD4+CD25+を増加させる。リンパ球上でのマーカーの平均表面発現。値は平均±標準偏差である。B.1μg、100mgおよび1mgのT−IgG−初乳の経口投与は脂肪細胞においてCD4+CD25+を増加させる。FACS分析から得られた代表的なドットブロット。
【図26】経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤は脂肪細胞においてCD3+LAP+を増加させる。
A.T−IgG−初乳の経口投与は脂肪細胞においてCD3+LAP+を増加させる。リンパ球上でのマーカーの平均表面発現。値は平均±標準偏差である。B:FACS分析から得られた代表的なドットブロット。
【図27】経口用抗LPS濃縮初乳由来免疫グロブリン製剤は、脂肪細胞のCD4+CD25+LAP−を増加させる。
A.T−IgG−初乳の経口投与は脂肪細胞においてCD4+CD25+LAP−を増加させる。リンパ球上でのマーカーの平均表面発現。値は平均±標準偏差である。B:FACS分析から得られた代表的なドットブロット。
Exp. Immunol. 138:47-53 (2004); Admyre, C. et al. J. Immunol. 179:1969-78
(2007); Oppenheim, J. J. and Yang, D. Curr. Opin. Immunol. 17:359-65 (2005)]。これらは、自然および獲得免疫系を活性化することができる。これらのタンパク質のいくつかは、免疫系を起動する際のそれらの役割により「アラーミン」とも呼ばれる[Oppenheim (2005)前記]。アラーミンはAPCに対する走化性および活性化効果の両方を有し、よって、危険シグナルに対する自然およびAg−特異免疫応答を増幅することができる[Yang, D. et al. J.
Immunol. 173:6134-42 (2004); Oppenheim, J. J. et al. Adv. Exp. Med. Biol.
601:185- 94 (2007)]。BC(ウシ初乳)は高レベルのβ−スフィンゴ糖脂質(BGS)を含み[Martin, M.J. et al. Lipids 36:291-8 (2001);
SaIa-Vila, A. et al. Nutrition 21:467-73 (2005); Van, Y.H.
et al. Diabetes 58:146-55 (2009); Nagatomo, T. et al. Clin. Exp. Immunol.
138:47-53 (2004)]、その組成物は消化管−免疫系のAPCまたは他の成分の効果を決定することができる[Novak, J. et al. Int.
Kev. Immunol. 26:49-72 (2007); Nowak, M. and Stein-Streilein, J. Int. Rev.
Immunol. 26:95-119 (2007); Nikoopour, E. and Schwartz, J.A. Inflamm. Allergy
Drug Targets 7:203-10 (2008); Admyre, C. et al. J. Immunol. 179:1969-78 (2007);
Oppenheim, J. J. and Yang, D. Curr. Opin. Immunol. 17:359-65 (2005); Yang, D.
et al. J. Immunol. 173:6134-42 (2004); Oppenheim, J. J. et al. Adv. Exp. Med.
Biol. 601:185-94 (2007)]。これらのメディエーターのいくつかは、粘膜アジュバントとして機能することができ、腸粘膜においてAPCのサブセットとTregの間のクロストークを増強させる[Vignali, D.A. et al. Nat. Rev. Immunol. 8:523-32 (2008); Margalit, M. et al. J.
Pharmacol. Exp. Ther. 319:105-10 (2006); Godfrey, D.I. and Berzins, S.P.
Immunol. 7:505-18 (2007; Margalit, M. and Ilan, Y. 肝臓
Int. 25:501-4 (2005); Novak, J. et al. Int.
Rev. Immunol. 26:49-72 (2007); Nowak, M. and Stein-Streilein, J. Int. Rev.
Immunol. 26:95-119 (2007); Nikoopour, E. and Schwartz, J.A. Inflamm. Allergy
Drug Targets 7:203-10 (2008)]。Treg細胞の誘導により、膵臓流入領域リンパ節(PLN)において局所免疫調節により媒介される、β細胞抗原への持続性寛容性が得られ得る[Homann, D. et al. J.
Immunol. 163:1833-8 (1999); Homann, D. et al. Immunity 11:463-72 (1999)]。この介入は動物モデルにおいてかなり有望であるが、ヒト試験ではほとんど効力を有さなかった。糖尿病予防試験では、処置された患者の一部のみが、膵島自己抗原による免疫化により有益な効果を示した[Skyler, J.S. et al. Diabetes Care 28:1068-76 (2005)]。1型糖尿病の防止は、患者が前糖尿病性段階中に免疫化された場合にのみ見られ、免疫化は最近発症した糖尿病を復帰させることはできなかった[Larche, M. and Wraith, D. C. Nat. Med. ll:S69-76 (2005)]。したがって、抗原特異介入は、ヒト、とりわけ最近発症した糖尿病における使用を成功させるために追加のアジュバントを必要とする可能性がある[Harlan (2005) 前記]。
Pharmaceutical Sciences, Gennaro A. R. 編, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990、およびとりわけその中の pp. 1521-1712(参照により完全に本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
NKT細胞はNK細胞およびメモリーT細胞の両方と特性を共有するT細胞の独特の系列である。このリンパ球のサブセットは、CD4+またはダブルネガティブとすることができ、CD1d反応性である。これらの細胞は、インバリアントVα14−Jα18TCR α−鎖が独特であり、それらのT−細胞受容体(TCR)β−鎖は、Vβ8.2、Vβ2、およびVβ7に偏っている。NKT細胞は、それらの糖脂質抗原反応性および優れたサイトカイン産生が独特である。NKT細胞がTh1およびTh2応答の両方を生成させることができることは、それらの免疫制御性細胞としての重要性を示す。NKTリガンドの使用は、これらの細胞の柔軟性を変化させることにより重大な免疫調節効果を誘導する。
*腹部肥満(腹部内またはその周囲の過剰脂肪組織);
*アテローム生成的脂質異常症(血液脂肪障害−高トリグリセリド、低HDLコレステロールおよび高LDLコレステロール−動脈壁においてプラーク蓄積を助長する);*血圧上昇;*インスリン抵抗性または耐糖能障害;*血栓形成促進性状態(例えば、血液中の高フィブリノーゲンまたはプラスミノーゲン活性化因子インヒビター−1);および*炎症誘発性状態(例えば、血液中の上昇したC−反応性タンパク質)。メタボリックシンドロームを有する人々は、冠動脈心疾患および動脈壁中のプラーク蓄積に関連する他の疾患(例えば、脳卒中および末梢血管疾患)および2型糖尿病の危険が増加している。
下記実施例は、本発明の態様を実施する際に本発明者らに使用される技術を表す。これらの技術は本発明を実施するための好ましい実施形態の例示でるが、当業者であれば、本開示を考慮すると本発明の精神および意図された範囲から逸脱せずに多くの改変が可能であることを認識するであろうことが理解されるべきである。
製品「BioGARD」は、Anadis Limitedから供給される専売の初乳調製物である。各Anadis BioGARD錠剤は、無コート1.2g経口錠剤であり、これは600mgの凍結乾燥されたウシ初乳粉末(BCP)を、賦形剤と共に含む。BioGARD錠剤中の活性物質は、民間の乳牛飼いにより搾乳された凍結乾燥ウシ初乳粉末である。これらの群れ中のウシは、所定のウシ病原体に対しワクチン接種されると共に、ヒト消化管ミクロフローラ中の主生物である複数の大腸菌の菌株の細胞外壁抗原に対する専売Anadisワクチンでワクチン接種される。Anadis BCPは、分娩後に集められた民間の乳牛の最初の搾乳由来の、高−タンパク質(>80%)、ラクトース−および脂肪低減天然産物である。これは濃縮された凍結乾燥粉末として錠剤化前に提供される。
49:613 (1971)]におけるように、上清に連続混合しながら徐々に添加した。遠心分離後、得られた沈殿物を確保し、ラクトースおよび塩を含む上清を廃棄した。
抗体断片は、Jones R.G.A.およびLandon J.により記載される方法に基づく改良法に従い調製される[Jones R.G.A. and Landon J. J. Immunol. Methods 263: 57-74
(2002)]。簡単に言うと、等量の0.2M酢酸ナトリウム緩衝液pH4.0を、上で記載されるように免疫化動物から獲得された初乳プールに添加する。希釈初乳プールのpHを、4.6に調節し、37℃で2時間インキュベートし、カゼインを沈殿させる。その後、初乳を遠心分離し、濾過して(0.45μm)カゼインを除去する。得られた初乳乳清のpHをpH4.0に調節し、続いて、ペプシン(1:15,000活性を有する酵素溶液)を5.0%w/wで添加し、20時間45℃でインキュベートする。ペプシン消化を、0.5体積のIM Tris pH8を添加し、反応濃混合物を4℃まで冷却することにより停止させる。反応物のpHを7.0に調節し、F(ab’)2混合物を、30kD限外濾過膜および50体積超の20mMリン酸ナトリウム/150mM NaCl pH6.0緩衝液に対する透析濾過液を用いて濃縮する。その後、小ペプチドを除去し、F(ab’)2、ペプシンおよび大ペプチドを含む得られた溶液を、ペプシンおよび酸性凝集物に結合するQセファロースアニオン交換カラムに供した。精製されたF(ab’)2を得るために、残りのFcおよび未消化IgをF(ab’)2(残りの大ペプチドおよび未消化Igとの混合)から、タンパク質Gにより、またはPrometic Mabsorbent AlPクロマトグラフィーにより除去する。
Fab1を調製するために、新たに調製した5mM EDTA−二ナトリウムを含む50μl(1/9体積)の0.1M2−メルカプトエチルアミン(MEA)の0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液pH6.0を、0.1〜3.0mgのF(ab’)2を含む0.45mlの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.0に添加する。混合物をその後、37℃で90分間インキュベートする。その後、反応混合物をPD−10カラム、または好適なG25カラム上に適用し、過剰なMEAを除去するために、0.1Mリン酸ナトリウム(pH6.0、5mM EDTA−二ナトリウムを有する)をランニング緩衝液として使用する。Fab’を含む第1のタンパク質ピークを収集し、本発明書において下で示される対応する異なる適応症を治療するために使用する。
免疫媒介肝炎モデルでは、11〜12週齢の雄C57/blマウスに、肝炎を誘発することが知られている、50mM Trig pH7、150mM NaCl、4mM CaCl2に溶解されたCon A(MP Biornedicals、USA)の500μglinouse(約15mg/kg)の用量を尾静脈注射する。試験されたすべての群の動物は、未処置対照に比べ、異なる濃度の特異抗体調製物または、実験手順で記載されるBioGARD調製物を用いて経口投与する。試験されたすべての群の動物を、以下のパラメータについて追跡し、対照群と比較する:血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)およびアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)レベル、肝臓標本の組織学的検査
、NKTマーカーのための肝内および脾臓内リンパ球のFACS分析、血清サイトカインレベルの測定ならびに転写因子STAT1、4および6ならびにNFκBの発現に対するウエスタンブロット分析。
抗LPS強化免疫グロブリン製剤の調製のために、初乳を約200の民間の乳牛飼いから収集した。これらの群れ中のウシは、所定のウシ病原体に対しワクチン接種されていると共に、ヒト消化管ミクロフローラ中の主生物である複数の大腸菌の菌株の細胞外壁抗原に対する専売Anadisワクチンでワクチン接種されている。得られた初乳を試験のための個々のバッグ内で凍結させた。処理のために、初乳を解凍し、プールし、脂肪を除去した。各バッチを低温殺菌した。初乳を限外濾過により濃縮し、凍結乾燥前に体積を減少させた。限外濾過工程により最終粉末中のラクトースが7%未満まで(約50%から)減少した。
2つの群のマウス(表11)を研究した。マウス(1群あたり10匹)に毎日7日間(経口的に)、30μlの水(対照、A群)または30μl(約3mg)の、水に溶解させた抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤(B群)を与えた。7日後、マウスを屠殺した。屠殺日に、心臓血液を標準技術により収集し、その後、さらなる目的のために血清を獲得した。
未処置のC57Bl/6マウス(11−12週齢)を使用した。マウスは、Harlan Laboratories(Jerusalem、Israel)から入手し、Animal Core of the Hadassah−Hebrew University Medical Schoolで維持した。マウスには、標準の飼料および水を自由に与え、12時間明/暗サイクルで維持した。動物実験は、Hebrew University−Hadassah Institutional Committee for Care and Use of Laboratory Animals(実験動物の世話および使用のための組織委員会)のガイドラインに従い、委員会の承認を得て実施した。
収集した後、肝臓を氷冷PBSに移し、切り、刻んで、Dounceホモジナイザーを用いて9mlの滅菌冷溶解緩衝液1と共にホモジナイズし、エッペンドルフ管に分割し(各管中1.5ml)、氷上で30分間維持し、続いて、超音波処理し(25秒の5サイクル)、遠心分離する(4℃、14,000RPMで15分間)。上清を収集して1つの管に入れ、タンパク質定量のためにBradford技術を用いてサンプリングし、−20℃で貯蔵する。
切除後、脾臓を細胞解離グリッド(60メッシュ)上RPMI1640媒質中で刻み、遠心分離し(4℃、14,000RPMで10分間)、上清を廃棄する;赤血球を、1mlの冷RBC溶解緩衝液(155mM塩化アンモニウム)を添加することにより溶解させ、続いて3回冷PBSですすぎ、遠心分離する。
冷緩衝液1を脾臓細胞のペレットに添加し(6:1の緩衝液対ペレット比)、細胞を2mlのバイアルに分割し、氷上で30分間維持し、5回超音波処理し(毎回25秒)、遠心分離する(4℃、14,000RPMで15分間);その後、上清をすべてのバイアルから収集し、タンパク質定量のためにサンプリングし、−20℃で維持する。
細胞質分別の上記遠心分離工程から得られる残りのペレットに、100〜250mlの緩衝液2を添加し、30分間4℃で撹拌し、遠心分離する(4℃、14,000RPMで15分間)。その後、上清をすべてのバイアルから収集し、タンパク質定量のためにサンプリングし、−20℃で維持する。
異なる実験モデルのマウスを指示された日に屠殺する。脾臓リンパ球およびNKT細胞を単離し、赤血球を除去する。肝内リンパ球を以下のように単離する:横隔膜上方の下大静脈を切断した後、肝臓を冷PBSで、色が薄くなるまでフラッシングし、続いて、結合組織および胆嚢を除去する。肝臓および脾臓を、RPMI−1640+FCS中で維持した。その後、脾臓を、70μmナイロンセルストレイナー(Falcon)を通して粉砕し、細胞残屑を除去するために遠心分離した(1250rpmで7分)。赤血球を1mlの冷155mM塩化アンモニウム溶解緩衝液で溶解させ、直ちに遠心分離した(1250rpmで3分)。その後、脾細胞を洗浄し、1ml RPMI+FCSで再懸濁させた。結合組織の残りを除去した。トリパンブルー染色による生存率は、90%超であった。肝内リンパ球に対しては、肝臓を最初にステンレスメッシュ(サイズ60、Sigma)を通して粉砕させ、細胞懸濁液を50ml管に5分間入れ、細胞残屑を降下させた。10mlのLymphoprep(Ficoll、Axis−Shield PoC AS、Oslo、Norway)を徐々に、50ml管内の同じ体積の細胞懸濁液下に入れた。管をその後、1800rpmで18分間遠心分離した。界面中の細胞を収集し、新しい管に取り出し、これを再び1800rpmで10分間遠心分離し、肝細胞が激減した細胞ペレットを得、250μlの最終体積とした。約1×106細胞/マウス肝臓を収集した。細胞生存率はトリパンブルー染色により検出した。
脂肪組織(内臓脂肪体)を刻み、10mMグルコースおよび2.5%ウシ血清アルブミンを含むKrebs−Ringer重炭酸塩緩衝液(3mL/g脂肪組織)中でインキュベートし、840U/gコラーゲナーゼ1型(Sigma、Rehovot、Israel)と共に、37℃で、穏やかに撹拌しながら1時間インキュベートした。その後、2回、シフォンメッシュ(100μm)を通して濾過し、50×gで5分間遠心分離した。その後、浮遊脂肪細胞を間質血管系(SV)画分のペレットから分離した。下方画分を除去し、200×gで5分間遠心分離し、SV細胞をペレット化した。その後、細胞数を計数した。
血液、脾臓または任意の臓器からリンパ球を単離した後、3組の2〜5×105細胞/500μL PBSをFalcon 2052管に入れ、4mLの1%BSAと共に10分間インキュベートし、1400rpmで5分間遠心分離する。細胞を10μL FCS中に、下記リンパ球マーカー:CD3、CD4、CD8、NKl.1、CD25、FOXp3、LAP細胞、IL−17、アネキシンおよびT細胞活性化のための表面マーカーに対し誘導される1:20標識(FITC、APCまたはPE−標識)1次抗体と共に再懸濁させる。細胞−抗体混合物を、10分毎に、30分間混合する。細胞を、それぞれ、抗CD3および抗CD4、抗CD8、ならびに抗NKl.lを使用して単離する。細胞を2回1%BSA中で洗浄し、4℃で、読み取りまで維持する。対照群では、5μLの1%BSAのみを添加する。表面染色は、細胞を、抗体および抗CD16/32(Fcブロック、eBioscience)と4℃で、PBSおよび0.5%BSAを含むFACS緩衝液中、30分間インキュベートすることにより実施した。細胞をさらに2回FACS緩衝液で洗浄し、FACS緩衝液中に再懸濁させ、フローサイトメトリーにより分析した。分析細胞選別を、各群由来の1×I04細胞に対し、蛍光活性化細胞選別機(FACStar Plus、Becton Dickinson)を用いて実施する。適切なアイソタイプ対照を、すべての実験で使用した。分析は、FACSCalibur機器(Becton Dickinson、San Jose、CA)を用いて実施した。生細胞のみを計数し、非抗体処理リンパ球からのバックグラウンド蛍光を減算した。ゲートを前方および側方散乱に対し設定し、死細胞および赤血球を排除した。データはConsort30 2色輪郭プロット(Becton Dickinson、Oxnard、CA、USA)またはCell Questプログラムにより解析した。
リンパ球単離後直ちに、3組の2〜5×105細胞/500μL PBSをFalcon 2052管に入れ、4mLの1%BSAと共に10分間インキュベートし、350gで5分間遠心分離する。NKTリンパ球パーセンテージを決定するために、抗CD3および抗DX5抗体を使用する(Pharmingen、USA)。分析細胞選別を、各群由来の1×I04細胞に対し、蛍光活性化細胞選別機(FACSTAE plus、Becton Dickinson)を用いて実施する。生細胞のみを計数し、非抗体処理リンパ球からのバックグラウンド蛍光を減算する。ゲートを前方および側方散乱に対し設定し、死細胞および赤血球を排除する。データはConsort30 2色輪郭プロット(Becton Dickinson、Oxnard、CA、USA)またはCell Questプログラムにより解析する。
細胞分離を製造者の指示に従い、磁気細胞選別(MACS、Miltenyi Biotec、Germany)を用いて実施する。抗CD3および抗DX5磁気ビーズをNKTリンパ球の分離のために使用する。ビーズを、製造者の指示に従い2つの工程の間で除去する。細胞のFACS分析により、95%を超える精度が達成される。
肝損傷を、血清アスパラギン酸トランスアミナーゼ(AST)およびアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)活性により評価し、これらは自動分析器を用いて決定された。
以下のパラメータを測定した:血糖、総コレステロールおよびトリグリセリド。血糖値は、標準グルコメーターを用いて測定した。血漿トリグリセリドおよび総コレステロール値は、臨床化学分析器Reflovet Plus機器(Roche Diagnostics、GmbH、Mannheim、Germany)により測定した。
マウスを第30日に、一晩の絶食後、耐糖能試験(GTT)に供した。グルコースを経口で(1.25g/kg)投与した。血清グルコース測定を、尾静脈血液に対して、15分毎に3時間実施した。グルコースレベルは、標準グルコメーターにより測定した。
研究群はまた、安静時(非絶食時)朝グルコースレベルにより評価した。
血清に対し「サンドイッチ」ELISAにより、市販のキット(Quantikine、R&D Systems、Minneapolis、MN、USA)を用いて、IFN−γおよびTGF−βレベルを決定した。血清インスリンもまた、製造者の指示に従い、「サンドイッチ」ELISAにより、Mercodia ABの市販のキット(Uppsala、Sweden)を用いて決定した。
統計的有意性を対応のない両側スチューデントt検定により決定し、p<0.05の値のみを示す。
示される日に、分光光度計(Cobas DP−25P)を用いて血清トリグリセリドレベルを測定する。
各マウス由来の肝臓セグメントを、10%ホルムアルデヒド中で固定し、組織学的分析のためにパラフィン中に埋め込んだ。5つの切片(5μm)をヘマトキシリン/エオシンで染色し、2人の病理学者により盲検方式で検査する。組織学的検査および脂肪性肝炎グレードスコアリング(NASHスコア)を脂肪性肝炎スコアリングシステムを用いて実施する。
パラフィンに埋め込まれた肝臓切片のヘマトキシリン/エオシン染色を実施する。切片を実験条件に対しては知らされていない2人の熟練した病理学者(VD、YS)により検査する。
本発明者らは、抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤が経口投与された動物の、肝損傷を示す肝臓酵素レベルが治療により改善されるかどうかを評価した。アスパルチルトランスアミナーゼ(AST)およびアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)活性のレベルを、臨床化学分析器、Reflovet Plus(Roche Diagnostics、GmbH、Mannheim、Germany)により決定した。図1は、減少がAST群A対B(*p<0.001)に対し有意であったことを示す。これは、対照群に対するALTおよびAST血清レベルの明確で有意な減少により明らかにされるように、肝損傷の寛解を証明する。
肝内リンパ球の単離
マウスを屠殺した後、以下のように、肝内リンパ球を単離した:肝臓を除去した後、媒質(RPMI−1640+FCS)中で維持した。その後、肝臓をステンレスメッシュ(サイズ60、Sigma)を通して粉砕し、細胞懸濁液を50ml管に5分間入れた。Lymphoprep(10ml、Ficoll、Axis−Shield PoC AS、Oslo、Norway)を、50ml管内の同様の体積の細胞懸濁液下に入れた。管を1800rpmで18分間遠心分離した。界面中の細胞を収集し、1800rpmで10分間遠心分離し、肝細胞が激減した細胞ペレットを得、250μlの最終体積とした。約1×106細胞/マウス肝臓を収集し、フローサイトメトリーにより分析した。
細胞の2〜3色表面染色を下記表面抗体:抗CD4−FITCおよび抗CD25−PEを用いて実施した。(抗体は、eBioscience、San Diego、CAから購入した)。表面染色は、新たに単離した細胞を抗体および抗CD16/32(Fcブロック、eBioscience)と4℃で、PBSおよび0.5%BSAを含むFACS緩衝液中、30分間インキュベートすることにより実施した。細胞を2回FACS緩衝液で洗浄し、FACS緩衝液中に再懸濁させ、フローサイトメトリーにより分析した。適切なアイソタイプ対照をすべての実験において使用した。分析は、FACSCalibur機器(Becton Dickinson、San Jose、CA)を使用し、FCS express V.3ソフトウェア(DeNovo software、Los Angeles、CA)を用いて実施した。
統計分析を、スチューデントt検定を用いて実施した。P≦0.05は有意であるとみなした。
肝内リンパ球の単離およびFACS分析を上記のように実施した。
LAP染色では、以下の抗体を使用した:抗CD3−Alexa−fluor405、抗CD45−PerCP−Cy5.5および抗LAP−APC。アフィニティ精製されたビオチン化ヤギ抗LAP特異ポリクローナル抗体をR&D Systems(Minneapolis、MN、USA)から購入し、ストレプトアビジン−APCをビオチン化1次抗体(R&D)を検出するための2次試薬として使用した。LAP染色では、細胞をLAP/対照抗体と20分間プレインキュベートし、CD3−Alexa−fluor405またはCD45−PerCP−Cy5.5で染色し、続いて、ストレプトアビジン−APC染色を実施した。
経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤がTregを促進するかどうかを決定するために、本発明者らは、脾臓における、組織由来の制御性T細胞のサブセットに対する経口投与の効果を検査した。図4は、フローサイトメトリーを用いて、第7日に(屠殺日)3.0mgで処置したすべてのマウスにおいて測定した、脾臓リンパ球上でのマーカー(CD45+LAP+およびCD8+LAP+)の平均表面発現を示す。図4AおよびBは、抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤の経口投与が、脾臓においてCD45+LAP+およびCD8+LAP+制御性T細胞のサブセットを増加させることを証明する。
3つの群のマウス(表2)を試験した。Ob/Obマウス(4匹/群)に、毎日、25日間(1週につき5日)、30μlのPBS(対照、群A)または水に溶解した30μl(=100μg)のT−IgG初乳(群B)、または30μl(=100ug)の抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤(群C)を与えた(PO)。4週後、マウスを屠殺した。屠殺日に、心臓血液を標準技術により収集し、血清を得た。
Ob/Obモデルでは、Harlan Laboratories (USA)から購入した若い(6〜7週齢)雄C57BL/6 Ob/Obマウスを使用した。すべてのマウスを、Animal Core of the Hadassah−Hebrew University Medical Schoolで維持した。マウスには、標準の飼料および水を自由に与え、12時間明/暗サイクルで維持した。動物実験は、Hebrew University−Hadassah Institutional Committee for Care and Use of Laboratory Animals(実験動物の世話および使用のための組織委員会)のガイドラインに従い、委員会の承認を得て実施した。
経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤の効果をさらに評価するために、絶食血清インスリンのレベルを、4週のT−IgGまたはHIBCを経口投与後に、群A〜Cのマウスで決定した。血清インスリンを、製造者の指示に従い、「サンドイッチ」ELISAにより、Mercodia ABの市販のキット(Uppsala、Sweden)を用いて決定した。血清を、マウスを30日に屠殺後Ob/Obマウスから収集した。図5は、マウス投与されたT−IgGは、血清インスリンレベルの減少を示し、インスリン抵抗性に対する抗LPS抗体の有益な影響が示される。さらに、観察された減少は、代謝的効果における初乳由来のアジュバントの重要な役割を支持するデータを提供する。
経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤が血清グルコースレベルを減少させることができるかどうかを検査するために、Ob/Obマウスは、第30日に、一晩の絶食後耐糖能試験(GTT)を受けた。グルコースを経口で(1.25g/kg)投与した。血清グルコース測定を、尾静脈血液に対して、15分毎に3時間実施した。グルコースレベルは、標準グルコメーターにより測定した。
抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤の経口投与は様々なメタボリックシンドロームマーカーを改善する、例えば、耐糖能を減少させる、および血清インスリンを減少させることを示してきたので、本発明者らは次に、調製物を与えられた肝臓酵素レベル(肝損傷を示す)もまた、治療により改善されるかどうかを評価した。ASTおよびALT活性のレベルを、臨床化学分析器、Reflovet Plus(Roche Diagnostics、GmbH、Mannheim、Germany)により決定した。図7はT−IgG−初乳処置マウスにおけるASTおよびALTレベルの減少を証明する。
抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤の経口投与は様々なメタボリックシンドロームマーカーを改善することを示してきたので、肝臓トリグリセリド蓄積に対する抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤およびT−IgG初乳の経口投与の効果を、研究の最後に、マウスを屠殺した後決定した。肝臓内での細胞内トリグリセリド(TG)の蓄積を、Folch法の改変型を使用して定量した。TGを瞬間凍結肝臓のアリコートから抽出し、その後、GPO−Trinderキット(Sigma、Rehovot、Israel)を用いて分光光度的にアッセイし、ホモジネート中のタンパク質量に正規化させた。肝臓トリグリセリド量を、すべての処置および対照群に対し計算した。
経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤がTregを促進するかどうかを決定するために、本発明者らは、脾臓において組織由来の制御性T細胞のサブセットに対する経口投与の効果を検査した。図9は、フローサイトメトリーを用いて、第25日に(屠殺日)すべてのOb/Obマウスにおいて測定した、脾臓リンパ球上でのマーカー(CD3+LAP+)の平均表面発現を示す。値は平均±標準偏差である。図9AおよびBは、T−IgGの経口投与が、脾臓においてCD3+LAP+制御性T細胞のサブセットを増加させることを証明する。
経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤がTregを促進するかどうかを決定するために、本発明者らは、脾臓において組織由来の制御性T細胞のサブセットに対する経口投与の効果を検査した。脾臓リンパ球の単離、フローサイトメトリー手順および分析ならびに染色抗体は上記で記載したものと同じである。図10および11は、フローサイトメトリーを用いて、第25日に(屠殺日)すべてのOb/Obマウスにおいて測定した、脾臓リンパ球上でのマーカー(CD8+CD25+)の平均表面発現を示す。値は平均±標準偏差である。
経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤が脂肪組織においてTregを促進するかどうかを決定するために、本発明者らは、組織由来の制御性T細胞のサブセットに対する経口投与の効果を検査した。FACS分析を、脂肪組織から単離したリンパ球に対し実施した。脂肪組織は、屠殺直後に、Ob/Obマウスから単離した。組織(内臓脂肪体)を刻んで微細断片とした。刻んだ試料を10mMグルコースおよび2.5%ウシ血清アルブミンを含むKrebs−Ringer重炭酸塩緩衝液(3mL/g脂肪組織)に入れ、840U/gコラーゲナーゼ1型(Sigma、Rehovot、Israel)と共に、37℃で、1時間インキュベートした。細胞を、2回、シフォンメッシュ(100μm)を通して濾過し、50gで5分間遠心分離した。浮遊脂肪細胞をペレット化した脂肪組織関連間質血管(S/V)細胞画分から分離した。下澄画分を除去し、200gで5分間遠心分離し、S/V細胞をペレット化した。図12Aおよび12Bは、フローサイトメトリーを用いて、第25日に(屠殺日)すべてのOb/Obマウスにおいて測定した、脂肪組織リンパ球上でのマーカー(CD4+CD25+)の平均表面発現を示す。
経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤が脂肪組織においてTregを促進するかどうかを決定するために、本発明者らは、組織由来の制御性T細胞のサブセットに対する経口投与の効果を検査した。FACS分析を、上記の方法に従い、単離した脂肪組織から単離したリンパ球に対し実施した。図13Aおよび13Bは、フローサイトメトリーを用いて、第25日に(屠殺日)すべてのOb/Obマウスにおいて測定した、脂肪組織リンパ球上でのマーカー(CD3+LAP+)の平均表面発現を示す。
経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤が脂肪組織においてTregを促進するかどうかを決定するために、本発明者らは、組織由来の制御性T細胞のサブセットに対する経口投与の効果を検査した。FACS分析を、上記の方法に従い、単離した前脂肪細胞を含む間質血管細胞から単離したリンパ球に対し実施した。
6つの群のマウス(表3)を試験した。Ob/Obマウス(5匹/群)に、毎日、25日間(1週につき5日)、30μlのPBS(対照、群A)または30μl(=1μg)のT−IgG初乳(群B)、または30μl(=100μg)のT−IgG初乳(群C)、または30μl(=1mg)のT−IgG初乳(群D)、または30μl(=3mg)のT−IgG初乳(群E)、または30μl(=1mg)のHIBC初乳(群F)を与えた(PO)。初乳調製物はどちらも水に溶解した。
Ob/Obモデルでは、Harlan Laboratories(USA)から購入した若い(6〜7週齢)雄C57BL/6 Ob/Obマウスを使用した。すべてのマウスを、Animal Core of the Hadassah−Hebrew University Medical Schoolで維持した。マウスには、標準の飼料および水を自由に与え、12時間明/暗サイクルで維持した。動物実験は、Hebrew University−Hadassah Institutional Committee for Care and Use of Laboratory Animals(実験動物の世話および使用のための組織委員会)のガイドラインに従い、委員会の承認を得て実施した。
ASTおよびALT活性のレベルを、上記のように、臨床化学分析器により決定した。図16は1mgのT−IgGが、肝臓酵素を減少させるのに最も有効な用量であったことを証明する。
血漿トリグリセリドおよび総コレステロールを、上記のように、臨床化学分析器、Reflovet Plus(Roche Diagnostics、GmbH、Mannheim、Germany)により決定した。図17は、100μgのT−IgGが、総コレステロールを減少させるのに最も有効な用量であったことを証明する。
肝臓内での細胞内トリグリセリド(TG)の蓄積を、Folch法の改変型を使用して定量した。TGを瞬間凍結肝臓のアリコートから抽出し、その後、GPO−Trinderキット(Sigma、Rehovot、Israel)を用いて分光光度的にアッセイし、ホモジネート中のタンパク質量に規準化させた。
FACS分析を、Ob/Obマウスの肝臓から単離したリンパ球に対し実施した。肝臓リンパ球上のマーカー(CD3+NK1.1+)の発現の平均を、フローサイトメトリーを用いて、第25日に(屠殺日)すべてのOb/Obマウスにおいて測定した。フローサイトメトリーでは、下記抗体を使用した:抗CD3−FITCおよび抗NK1.1−PE。表面染色およびFACS分析は、上記のように実施した。
肝臓においてTregを促進する経口抗LPS強化初乳由来免疫グロブリン製剤の用量を決定するために、本発明者らは、組織由来の制御性T細胞のサブセットに対する経口投与の効果を検査した。FACS分析を、上記の方法に従い、肝臓から単離したリンパ球に対し実施した。図20は、フローサイトメトリーを用いて、第25日に(屠殺日)すべてのOb/Obマウスにおいて測定した、肝臓リンパ球上でのマーカーの発現の平均を示す。
図21は、1μg、1mg、3mgのT−IgGを100μgのHIBCと共に経口投与すると、Ob/Obマウスの肝臓においてCD25+LAP−リンパ球の変化を誘導することを証明する。
図22Aは、T−IgGおよびHIBC−初乳の経口投与が、CD25+LAP+脾臓リンパ球を減少させることを証明する。図22Bは、T−IgG−初乳の経口投与が、CD25+LAP+脾臓リンパ球を増加させることを証明する。
FACS分析を、Ob/Obマウスの肝臓から単離したリンパ球に対し実施した。図23は、フローサイトメトリーを用いて、第25日に(屠殺日)すべてのOb/Obマウスにおいて測定した、脾臓リンパ球上でのマーカー(CD4+CD25+LAP−)の発現の平均を示す。図23は、1および3mgのT−IgGならびに100μgのHIBC−初乳の経口投与が、CD4+CD25+LAP−脾臓リンパ球を増加させることを証明する。
FACS分析を、上記のように、Ob/Obマウスの脂肪組織から単離したリンパ球に対し実施した。図24は、フローサイトメトリーを用いて、第25日に(屠殺日)すべてのOb/Obマウスにおいて測定した、脂肪組織細胞上でのマーカー(CD4+CD25+)の発現の平均を示す。図24は、T−IgG−初乳の経口投与が、脂肪組織においてCD4+CD25+リンパ球を増加させることを証明する。
FACS分析を、上記のように、Ob/Obマウスの脂肪組織から単離した脂肪細胞に対し実施した。図25Aは、フローサイトメトリーを用いて、第25日に(屠殺日)すべてのOb/Obマウスにおいて測定した、脂肪細胞でのマーカー(CD4+CD25+)の発現の平均を示す。
FACS分析を、上記のように、Ob/Obマウスの脂肪組織から単離した脂肪細胞に対し実施した。図26は、フローサイトメトリーを用いて、第25日に(屠殺日)すべてのOb/Obマウスにおいて測定した、脂肪細胞上でのマーカー(CD3+LAP+)の発現の平均を示す。
図27Aは、T−IgG−初乳の投与が、脂肪細胞においてCD4+CD25+LAP−を増加させることを証明する。
細菌トランスロケーションおよび肝炎を検査するために、マウス群を下記のように処置した:
群A:BCP:抗体を含まない初乳で処理
群B:抗LPS含有初乳
マウスに初乳を4日間与えた後、Con A肝炎を誘導した。
Con Aは、MP Biomedicals(Ohio、USA)から購入した。Con A(0.5mg、20mg/kg)を200μLの50mM Tris(pH7)、150mM NaCl、4mM CaCl2に溶解し、マウスに静脈注射した。個々のマウス由来の血清を、Con A注射後8または20時間に得た。アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)の血清活性を、自動分析器を用いて測定した。
抗LPS強化免疫グロブリン製剤を調製するために、初乳を約200の民間の乳牛飼いから収集した。これらの群れ中のウシは、所定のウシ病原体に対しワクチン接種されていると共に、ヒト消化管ミクロフローラ中の主生物である複数の大腸菌の菌株の細胞外壁抗原に対する専売Anadisワクチンでワクチン接種されている。抗インスリン強化免疫グロブリン製剤を調製するために、3匹の乳牛を抗原としてKLHにコンジュゲートされたインスリンで免疫化する。抗原ワクチンを妊娠期間の最後の8週の間に投与する。初乳の乳を授乳の最初の2日間中に回収する。得られた初乳を試験のための個々のバッグ内で凍結させた。処理のために、初乳を解凍し、プールし、脂肪を除去した。各バッチを低温殺菌した。初乳を限外濾過により濃縮し、凍結乾燥前に体積を減少させた。限外濾過工程により最終粉末中のラクトースが7%未満まで(約50%から)減少した。
Claims (4)
- 慢性C型肝炎感染症、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、脂肪肝、又は肝性脳症に罹患した対象の処置及び/又は予防で使用するための、初乳由来抗LPS強化免疫グロブリン製剤を含む組成物。
- 前記対象が、上昇したレベルのアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)又はアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)を有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記処置及び/又は予防が、対象のAST又はALTのレベルを減少させることを含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記初乳がウシ初乳である、請求項1乃至4のいずれか一つに記載の組成物。
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