CN117440818A - 用于治疗或预防酒精性肝病和移植物抗宿主病的超免疫的蛋制品 - Google Patents

用于治疗或预防酒精性肝病和移植物抗宿主病的超免疫的蛋制品 Download PDF

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Abstract

在一个方面中，本公开涉及一种在有此需要的受试者中预防或治疗酒精性肝病或移植物抗宿主病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的从产蛋动物获得的超免疫的蛋制品，从而在所述受试者中预防或治疗所述酒精性肝病或所述移植物抗宿主病，其中所述超免疫的蛋制品包含治疗有效量的针对选自以下的抗原的一种或多种抗体：粪肠球菌、粪肠球菌溶细胞素毒素和屎肠球菌。本公开还涉及由动物生产的超免疫蛋和蛋制品，所述动物已用选自以下的抗原超免疫：粪肠球菌、粪肠球菌溶细胞素毒素和屎肠球菌。还公开了制备所述超免疫蛋和蛋制品的方法。

Description

用于治疗或预防酒精性肝病和移植物抗宿主病的超免疫的蛋 制品
相关申请
本申请要求于2021年4月16日提交的美国临时专利申请号63/175,603的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
序列表
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背景技术
酒精性肝病(ALD)涉及过度饮酒的肝脏表现，包括脂肪肝、酒精性肝炎和伴有肝纤维化或肝硬化的慢性肝炎。酒精性肝病最严重的形式是酒精性肝炎；1-6个月时死亡率在20％至40％之间，多达75％的患者在诊断为严重酒精性肝炎后90天内死亡。参见Duan等，2019,Nature 575:505-511。使用糖皮质激素疗法效果甚微。早期肝移植是唯一的治愈性疗法，但仅在选定的中心和有限的患者群体中提供。参见Duan等，上文引用。
移植物抗宿主病(GVHD)影响皮肤、肝脏和胃肠道，且在供体T细胞识别受体组织为外来组织并引发组织炎症和损伤时就会发生GVHD。GVHD的预防和治疗策略是研究的活跃领域。参见Garrett,2020,New England Journal ofMedicine 382(11):1064-1066。因此，有改进治疗或预防ALD和GVHD的方法的需求。
发明内容
在某些方面中，本公开涉及一种在有此需要的受试者中预防或治疗酒精性肝病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的从产蛋动物获得的超免疫的蛋制品，从而在所述受试者中预防或治疗所述酒精性肝病，其中所述超免疫的蛋制品包含治疗有效量的针对选自以下的抗原的一种或多种抗体：粪肠球菌和粪肠球菌溶细胞素毒素。
在某些方面中，本公开涉及一种在有此需要的受试者中预防或治疗移植物抗宿主病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的从产蛋动物获得的超免疫的蛋制品，从而在所述受试者中预防或治疗所述移植物抗宿主病，其中所述超免疫的蛋制品包含治疗有效量的针对选自以下的抗原的一种或多种抗体：粪肠球菌、粪肠球菌溶细胞素毒素和屎肠球菌。
在某些实施方式中，所述超免疫的蛋制品包含治疗有效量的针对粪肠球菌的一种或多种抗体，和治疗有效量的针对粪肠球菌溶细胞素毒素的一种或多种抗体。在某些实施方式中，所述方法其进一步包括使用选自粪肠球菌、分离的粪肠球菌溶细胞素毒素和屎肠球菌的抗原超免疫所述产蛋动物。在某些实施方式中，所述方法进一步包括从已被超免疫的所述产蛋动物收集超免疫的蛋，并从所述超免疫的蛋制备超免疫的蛋制品。在某些实施方式中，相对于从未经超免疫的产蛋动物获得的对照蛋制品，所述超免疫的蛋制品包含以重量计多至少20％的对选自以下的抗原有特异性的IgY抗体：粪肠球菌、粪肠球菌溶细胞素毒素和屎肠球菌。在某些实施方式中，每日向所述受试者施用所述超免疫的蛋制品1至4次。在某些实施方式中，口服或静脉内施用所述超免疫的蛋制品。在某些实施方式中，相对于未施用所述超免疫的蛋制品的受试者，向所述受试者施用所述超免疫的蛋制品在所述受试者中降低粪肠球菌的水平。在某些实施方式中，相对于未施用所述超免疫的蛋制品的受试者，向所述受试者施用所述超免疫的蛋制品在所述受试者中降低肝损伤。在某些实施方式中，所述受试者是人。
在某些方面中，本公开涉及一种由动物生产的超免疫的蛋，所述动物已用选自以下的抗原超免疫：粪肠球菌、分离的粪肠球菌溶细胞素毒素和屎肠球菌，其中相对于来自未经超免疫的动物的蛋，所述超免疫的蛋中针对所述抗原的抗体的水平增加。在某些实施方式中，所述动物已用粪肠球菌和分离的粪肠球菌溶细胞素毒素超免疫，并且其中相对于来自未经超免疫的动物的蛋，针对所述粪肠球菌和所述分离的粪肠球菌溶细胞素毒素的抗体的水平增加。
在某些方面中，本公开涉及一种从本文所述的超免疫的蛋获得的超免疫的蛋制品。在某些实施方式中，所述超免疫的蛋制品是全蛋。在某些实施方式中，所述超免疫的蛋制品是蛋黄。在某些实施方式中，所述超免疫的蛋制品是纯化的或部分纯化的针对粪肠球菌溶细胞素毒素的IgY抗体。在某些实施方式中，所述超免疫的蛋制品是纯化的或部分纯化的针对粪肠球菌的IgY抗体。在某些实施方式中，所述超免疫的蛋制品由纯化的或部分纯化的针对粪肠球菌的IgY抗体和纯化的或部分纯化的针对粪肠球菌溶细胞素毒素的IgY抗体组成。
在某些方面中，本公开涉及一种药物组合物，其包含根据权利要求14至19中任一项所述的超免疫的蛋制品和药学上可接受的载体。在某些实施方式中，所述组合物包含3至10克所述全蛋。在某些实施方式中，所述组合物包含1至3克所述蛋黄。在某些实施方式中，所述组合物包含0.05至1克所述纯化的或部分纯化的IgY。在某些实施方式中，所述药物组合物被配制为用于口服施用。在某些实施方式中，所述超免疫的蛋制品配置在纳米颗粒或在乳液中。在某些实施方式中，所述药物组合物被配制为用于静脉内施用。
在某些方面中，本公开涉及一种制备超免疫的蛋制品的方法，其包括：i)使用选自粪肠球菌、分离的粪肠球菌溶细胞素毒素和屎肠球菌的抗原超免疫产蛋动物；和ii)从所述动物产生的一个或多个蛋制备超免疫的蛋制品。在某些实施方式中，所述抗原选自分离的粪肠球菌溶细胞素毒素和屎肠球菌。在某些实施方式中，所述抗原选自粪肠球菌和分离的粪肠球菌溶细胞素毒素。在某些实施方式中，所述抗原包含粪肠球菌和分离的粪肠球菌溶细胞素毒素。在某些实施方式中，所述产蛋动物是鸡。
附图说明
图1显示了在酒精性肝病小鼠模型中评估抗粪肠球菌和抗溶细胞素IgY抗体的实验示意图。
图2显示了通过SDS-PAGE电泳分析的抗粪肠球菌和抗溶细胞素IgY抗体的纯度。IgY具有180KDa的分子量，并且由67KDa的重链和23KDa的轻链两个亚基组成，第1道是分子量梯，第2道是IgY标准品，第3道和第4道分别是1μg和2μg来自使用粪肠球菌和抗溶细胞素超免疫的鸡的总可溶性蛋白。
图3A显示了来自使用粪肠球菌+抗溶细胞素免疫的鸡的IgY的粪肠球菌特异性活性。图3B显示了来自使用粪肠球菌+抗溶细胞素免疫的鸡的IgY的抗溶细胞素特异性活性。使用来自未免疫的母鸡的IgY作为对照IgY。特异性活性由抗体反应性和效价表示。
图4显示了抗粪肠球菌和抗溶细胞素IgY对粪肠球菌生长的抑制作用。将未处理的和用15mg/ml IgY处理的完整粪肠球菌细菌在37℃下孵育24h。将培养物连续稀释，并稀释104倍，并且在BHI琼脂平板上铺板。孵育过夜后，使用ImageJ Count对菌落计数。
图5显示了未经处理的和用抗粪肠球菌+抗溶细胞素IgY处理的粪肠球菌培养物中cfu/ml的定量。计算了抑制百分比。
图6A-6E显示了在长期加过量乙醇喂养模型的无菌小鼠中施用抗粪肠球菌+抗溶细胞素IgY的影响。C57BL/6无菌小鼠用来自溶细胞素阳性的酒精性肝炎人类患者的粪便定殖，并接受长期乙醇过量喂养模型(每组n＝5)，并在液体饮食中给予载剂、对照IgY和抗粪肠球菌+抗溶细胞素IgY。(A)食物摄入。(B)体重。(C)肝脏重量。(D)血清丙氨酸转氨酶(ALT)水平。(E)肝脏甘油三酯(TAG，三酰基甘油)含量。结果以平均值±s.e.m表示。P值通过单因素方差分析和Tukey的事后检验确定。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图7显示了施用抗粪肠球菌+抗溶细胞素IgY对长期乙醇过量喂养模型的无菌小鼠的肝脏的影响。C57BL/6无菌小鼠用来自溶细胞素阳性的酒精性肝炎患者的粪便定殖，并接受长期乙醇过量喂养模型(每组n＝5)，并在液体饮食中给予载剂、对照IgY和抗粪肠球菌+抗溶细胞素IgY。显示了苏木精和伊红染色后的代表性肝脏切片。
具体实施方式
术语“超免疫”指反复暴露于一种或多种抗原，以使得免疫应答升高并保持在自然未暴露状态以上。
“超免疫状态”指在已被超免疫的产蛋动物中升高的免疫应答。
如本文所用，术语“蛋”是指全蛋(表、超免疫或其他)。如本文所用，术语“蛋制品”指全蛋或从全蛋获得的任何制品或部分。在特定实施方式中，蛋制品是蛋黄，例如，蛋黄粉。在另一个实施方式中，蛋制品是蛋清，例如，蛋清粉。在另一个实施方式中，蛋制品从全蛋获得，例如，全蛋粉(例如，喷雾干燥的全蛋粉)。
术语“对照蛋”指从未保持在超免疫状态的产蛋动物获得的蛋，即，未被超免疫的动物。术语“对照蛋制品”指对照蛋或从对照蛋获得的蛋制品。
术语“超免疫的蛋”指从保持在超免疫状态的产蛋动物获得的全蛋，即，已被超免疫的产蛋动物。
术语“超免疫的蛋制品”指超免疫的蛋或从超免疫的蛋获得的任何制品。在某些实施方式中，超免疫的蛋制品是浓缩物。如本文所用，术语“浓缩物”指至少部分纯化的超免疫的蛋制品，以使得在浓缩物中抗体的浓度高于在超免疫蛋中抗体的浓度。
术语“蛋粉”指经干燥的全蛋。在一些实施方式中，蛋粉是喷雾干燥的。
术语“产蛋动物”指任何卵生动物，包括任何产卵的动物，如鸟类、鱼类和爬行动物。
术语“鸟类”指属于鸟纲成员的动物。鸟类包括但不限于鸡、火鸡、鹅、鸭、野鸡、鹌鹑、鸽子和鸵鸟。
术语“超正常水平”指超过未被超免疫的产蛋动物的蛋中可见的那些的水平。例如，针对特定抗原的抗体的超正常水平是指抗体水平超过未用特定抗原超免疫的产蛋动物的蛋中可见的抗体水平。
术语“施用”指将物质提供给受试者的任何方法，包括口服、鼻内、胃肠外(静脉内、肌内或皮下)、直肠、局部或眼内。
术语“抗原”指能够诱导体液抗体和/或细胞介导的免疫应答而不是免疫耐受的物质。该术语表示刺激免疫应答以及与其产物(例如，抗体)反应的能力。
如本文所用，“抗体”是包括至少一个互补性决定区的蛋白，所述互补性决定区结合特异性靶抗原，例如，本文公开的粪肠球菌抗原、分离的粪肠球菌溶细胞素毒素或屎肠球菌抗原。例如，抗体可以包括重(H)链可变区(本文中缩写为VH)和轻(L)链可变区(本文中缩写为VL)。在另一个实例中，抗体包括两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。在特定实施方式中，抗体是多克隆抗体。如本文所用，术语“多克隆抗体”指能够与特定抗原上的不同表位免疫反应的抗体分子群。在特定实施方式中，抗体是IgY抗体。
如本文所用，术语“酒精性肝病”、“ALD”、“酒精相关性肝病”和“酒精相关的肝病”指过度饮酒的肝脏表现，包括脂肪肝(脂肪变性)、酒精性肝炎和伴有肝纤维化或肝硬化的慢性肝炎。如本文所用，“酒精相关病症”指与饮酒有关的疾病和病症，包括但不限于酒精诱导的精神病性障碍，伴有谵妄；酗酒；过量饮酒；重度饮酒；问题饮酒；酒精中毒；酒精戒断；酒精中毒性谵妄；酒精戒断性谵妄；酒精诱导的持续性痴呆；酒精诱导的持续性遗忘障碍；酒精依赖；酒精诱导的精神障碍，伴有幻觉；酒精诱导的情绪障碍；酒精诱导或相关的双相情感障碍；酒精诱导或相关的创伤后应激障碍；酒精诱导的焦虑症；酒精诱导的性功能障碍；酒精诱导的睡眠障碍；和未另行说明(NOS)的酒精相关病症。
如本文所用，术语“酗酒者”指符合DSM IV酗酒标准(即，“尽管反复出现不良后果，但仍反复使用”)，但不依赖酒精的受试者。
如本文所用，术语“过量饮酒者”指男性每周饮酒超过21标准杯，女性每周饮酒超过14标准杯。一标准杯是0.5盎司(15ml)无水酒精，相当于10盎司(300ml)啤酒、4盎司(120ml)葡萄酒或1盎司(30ml)的100度白酒。这些个体不依赖于酒精，但可能符合也可能不符合DSM IV酗酒标准。
如本文所用，术语“重度饮酒者”指男性每周饮酒超过14标准杯，女性每周饮酒超过7标准杯。这些个体不依赖于酒精，但可能符合也可能不符合DSM IV酗酒标准。
如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”指当向受试者施用时足以预防或治疗病症，例如，酒精性肝病(ALD)或移植物抗宿主病(GVHD)的超免疫的蛋制品的量。有效量可以根据例如待治疗受试者的年龄、体重和/或健康状况而改变。
如本文所用，术语“分离的”指从产生其的细胞中纯化或部分纯化的生物化合物(例如，蛋白)。例如，分离的粪肠球菌溶细胞素毒素是从产生其的粪肠球菌细胞中纯化或部分纯化的。在一些实施方式中，分离的粪肠球菌溶细胞素毒素是重组的粪肠球菌溶细胞素毒素，例如，粪肠球菌溶细胞素毒素是在粪肠球菌细胞以外的细胞中产生的。
酒精性肝病(ALD)
80％的酒精通过肝脏来解毒。长期饮酒会导致促炎性细胞因子(如TNF-α、白细胞介素6和白细胞介素8)的分泌、氧化应激、脂质过氧化和乙醛毒性。这些因素会引起肝细胞的炎症、凋亡，并最终导致肝细胞纤维化，从而导致酒精性肝病(ALD)。ALD包括脂肪肝(肝脂肪变性)、酒精性肝炎和伴有肝纤维化或肝硬化的慢性肝炎。
脂肪肝，或称肝脂肪变性，是脂肪酸在肝细胞中的积聚。大量饮酒会导致整个肝脏形成大脂肪球(大泡性肝脂肪变性)。酒精被乙醇脱氢酶(ADH)代谢为乙醛，然后被乙醛脱氢酶(ALDH)进一步代谢为乙酸，乙酸最终被氧化为二氧化碳和水。这个过程产生NADH，并增加NADH/NAD+的比例。较高的NADH浓度诱导脂肪酸合成，而降低的NAD水平导致脂肪酸氧化减少。随后，较高水平的脂肪酸向肝细胞发出信号，使其复合为甘油，形成甘油三酯。这些甘油三酯累积，导致脂肪肝。
酒精性肝炎的特点是肝细胞炎症，这似乎使肝脏易患纤维化。炎症细胞因子(TNF-α、IL6和IL8)被认为通过诱导细胞凋亡和坏死在肝损伤的发生和持续中至关重要。TNF-α活性增加的一个可能机制是肝脏疾病导致的肠道通透性增加。这有助于将肠道产生的内毒素吸收到门静脉循环中。肝脏的枯否细胞吞噬内毒素，刺激TNF-α的释放。然而，TNF-α通过激活半胱天冬酶触发凋亡途径，导致肝细胞死亡。
肝硬化是严重肝病的晚期，其特征是炎症(肿胀)、纤维化(细胞硬化)和受损的膜阻碍了体内化学物质的解毒，最终导致疤痕和坏死(细胞死亡)。乙醛可能通过刺激肝星状细胞的胶原沉积而导致酒精诱导的纤维化。衍生自NADPH氧化酶和/或细胞色素P-450 2E1的氧化剂的产生和乙醛蛋白加合物的形成损害细胞膜。症状包括黄疸(发黄)、肝脏肿大以及受损肝脏结构变化引起的疼痛和压痛。如果不彻底戒酒，肝硬化最终会导致肝衰竭。
酒精使用障碍引起的慢性肝病显著增加了全球疾病负担和死亡率。最严重的酒精相关肝病是酒精性肝炎(AH)；1-6个月时死亡率为20％-40％。最近有研究表明，酒精性肝炎患者(约30％)携带产生称为溶细胞素的毒素的粪肠球菌，其病情更为严重。尽管粪肠球菌在非酒精性人群的微生物组中的含量较低，约占该人群微生物组的0.1-0.5％，但在患有酒精性肝病(ALD)的患者中，其丰度显著增加到约5％。75％的酒精性肝炎患者在诊断为严重酒精性肝炎后90天内死亡，这些患者的微生物组富含溶细胞素阳性的粪肠球菌(Maddrey等，1978,Gastroenterology 75,193–199)。使用皮质类固醇的标准护理疗法效果甚微(Thursz等，2015,N.Engl.J.Med.372,1619–1628)。早期肝移植和戒酒是唯一有效的疗法，但仅适用于少数患者(Mathurin等，2012,Management of alcoholichepatitis.J.Hepatol.56,S39–S45)。
Duan等(2019,Nature 575:505-511)已发现了噬菌体在人源化小鼠中靶向溶细胞素阳性粪肠球菌的有效性，该小鼠用酒精性肝炎患者粪便中的细菌定殖，以预防疾病进展。已经证明，在这些人源化小鼠中，用裂解溶细胞素阳性粪肠球菌的噬菌体处理可以降低肝脏中的溶细胞素，并防止乙醇诱导的肝病的进展。
移植物抗宿主病(GVHD)
GVHD是实体器官和干细胞移植后的主要并发症，如骨髓移植出现的那些。留在捐赠组织(移植物)内的供体免疫系统的白细胞将受体(宿主)识别为外来物。抑制组织中存在的白细胞然后会攻击受体的体细胞，从而导致GVHD。参见Hoffmann等，2002,J.Exp.Med.196(3):389-399。GVHD可以以急性和慢性形式出现。急性形式的疾病通常在移植后的前100天内观察到，由于相关的发病率和死亡率，这对移植来说是一个重大挑战。慢性形式的GVHD通常发生在100天后。中度至重度慢性GVHD病例的出现对长期生存产生不利影响。
急性GVHD(aGVHD)影响皮肤、肝脏和胃肠道，当供体T细胞识别受体组织为外来组织并引发组织炎症和损伤时发生。具体而言，aGVHD是由同种异体反应性供体T细胞启动的，该细胞识别宿主细胞表面的MHC I类和II类分子及其呈递的肽。包括T细胞在内的供体白细胞对肠道、肝脏和皮肤等几个靶器官的浸润被认为是aGVHD早期的关键过程之一。供体T细胞的激活和扩增，导致促炎性细胞因子的分泌和其他炎性效应细胞募集到这些部位，其进一步损害受影响的组织。见上文引用的Hoffmann等。
粪肠球菌、溶细胞素和ALD
肠道微生物群促进小鼠的酒精性肝病，但对导致这一过程的微生物因素知之甚少。最近，溶细胞素，一种由粪肠球菌分泌的双亚基外毒素，已被确定为肝细胞死亡和肝损伤的原因。参见Duan等，2019,Nature 575:505-511，其全部内容通过引用并入本文。粪肠球菌是一种革兰氏阳性、不形成孢子的共生细菌，栖息在人类和其他哺乳动物的胃肠道中。粪肠球菌的高毒力菌株表达一种形成孔的外毒素，称为溶细胞素，其能裂解细菌和真核细胞，以响应群体信号。与非酒精性个体或酒精使用障碍患者相比，酒精性肝炎患者的粪便中粪肠球菌数量增加。溶细胞素阳性(溶细胞的)粪肠球菌的存在与酒精性肝病的严重程度和酒精性肝炎患者的死亡率相关。此外，在人源化小鼠中，靶向溶细胞粪肠球菌的噬菌体降低了肝脏中的溶细胞素，并消除了乙醇诱导的肝病。见上文引用的Duan等。
功能性溶细胞素毒素由大亚基和小亚基寡肽组成，分别由基因cy1LL和cy1LS编码。粪肠球菌溶细胞素成分Cy1LL和Cy1LS被归类为A型成孔抗生素，最近被归类为双组分II类抗生素。抗生素是一种复杂的多环抗菌肽，其由革兰氏阳性菌核糖体合成，其特征是脱水丝氨酸和苏氨酸残基与半胱氨酸硫醇之间存在羊毛硫氨酸和甲基羊毛硫氨酸桥。抗生素具有极其多样的结构和功能，但其特征都是经过广泛的翻译后修饰，并具有抗生素或形态发生活性。溶细胞素在抗生素中似乎是独一无二的，因为其可以裂解其他细菌以及红细胞和其他真核细胞。参见Van Tyne等，2013,Toxins 5(5):895-911。
Cy1LL和CylLS的氨基酸序列如下所示：
肠球菌和GVHD
越来越多的证据表明，患者的肠道微生物群可能在GVHD易感性中发挥作用，特别是异基因造血细胞移植引起的急性GVHD。参见，Garrett,2020,New England Journal ofMedicine 382(11):1064-1066，其全部内容通过引用并入本文。肠道中的一些肠球菌(例如，粪肠球菌和屎肠球菌)是机会性病原体，在接受异基因造血细胞移植的患者中经常导致危及生命的血液感染。研究表明，在接受异基因造血细胞移植的相当大的患者亚组中，肠球菌(Enterococci)，尤其是粪肠球菌，在粪便群落中占主导地位，这种肠球菌占主导地位与GVHD的总生存率下降和死亡率增加相关。参见Stein-Thoeringer等，2019,Science366:1143-9，其全部内容通过引用并入本文。Stein-Thoeringer等观察到，在GVHD小鼠模型中，饮食中的糖乳糖驱动肠球菌生长，而无乳糖饮食可以减轻GVHD中的肠球菌扩增和T细胞驱动的炎症。
超免疫的蛋制品
在某些方面中，本公开涉及一种制备超免疫的蛋制品的方法，其包括：i)使用选自粪肠球菌、分离的粪肠球菌溶细胞素毒素和屎肠球菌的抗原超免疫产蛋动物；和ii)从所述动物产生的一个或多个蛋制备超免疫的蛋制品。在一些实施方式中，抗原选自粪肠球菌和分离的粪肠球菌溶细胞素毒素。在一些实施方式中，抗原包括粪肠球菌和分离的粪肠球菌溶细胞素毒素。
产蛋动物在血液和蛋中产生对特定免疫原有特异性的抗体。例如，鸟纲的各个属，如家鸡、火鸡和鸭，都能产生针对与禽类疾病相关的抗原的抗体。LeBacq-Verheyden等(Immunology 27:683(1974))和Leslie,G.A.等(J.Med.130:1337(1969))定量分析了鸡免疫球蛋白。Polson,A.等(Immunological Communications 9:495-514(1980))用几种蛋白和天然蛋白混合物免疫母鸡，并在蛋黄中检测IgY抗体。Fertel,R.等(Biochemical andBiophysical Research Communications102:1028-1033(1981))用前列腺素免疫母鸡，并在蛋黄中检测抗体。Jensenius等(Journal of Immunological Methods 46:63-68(1981))提供了一种用于免疫诊断的分离蛋黄IgG的方法。Polson等(ImmunologicalCommunications 9:475-493(1980))描述了从用多种植物病毒免疫的母鸡蛋黄中分离出的抗体。
美国专利号4,748,018公开了一种哺乳动物被动免疫的方法，该方法包括胃肠外施用从已经针对相应抗原免疫的禽类的蛋获得的纯化抗体，并且其中哺乳动物已经获得了对蛋的免疫力。转让给DCV-Biologics的美国专利号5,772,999公开了一种通过向受试者施用超免疫的蛋和/或牛奶或其级分来预防、对抗或减少受试者的慢性胃肠道病症或非甾体抗炎药诱导的(NSAID诱导的)胃肠道损伤的方法。
免疫的蛋是来自用例如特定抗原或抗原混合物免疫的禽类的蛋。超免疫蛋是指通过定期强化抗原施用等方式使禽类达到特定免疫状态的蛋。已经发现，无论其禽类制造者使用了哪种抗体，超免疫蛋具有各种有益因素，包括，如上文所述，治疗慢性胃肠道病症、NSAID诱导的胃肠道损伤(参见美国专利号5,772,999)和由于抗炎组合物的存在而产生的抗炎作用(参见美国申请公开号US2004/0156857)。
超免疫的蛋制品的优点之一是与对照蛋制品或来自已经用标准免疫技术使用屎肠球菌、粪肠球菌或分离的粪肠球菌溶细胞素毒素免疫的鸡的蛋制品相比具有更高和更一直的抗体水平(例如，IgY抗体)。在一些实施方式中，超免疫的蛋制品相对于使用标准免疫程序用粪肠球菌或分离的粪肠球菌溶细胞素毒素免疫的鸡，相对于粪肠球菌和/或分离的粪肠球菌溶细胞素毒素具有更高水平的IgY抗体。通常，标准免疫为初始免疫，然后每隔30天进行一次或两次强化免疫。在一些实施方式中，超免疫包括使用如上文所述的粪肠球菌和/或分离的粪肠球菌溶细胞素毒素进行至少4、5、6、7、8、9或10次免疫。在一些实施方式中，超免疫包括以少于30天、少于25天、少于20天、少于15天、少于10天或少于5天的间隔使用屎肠球菌、粪肠球菌或分离的粪肠球菌溶细胞素毒素免疫产蛋动物。
超免疫的蛋制品可以由任何产蛋动物生产。优选地，动物是鸟纲成员，或者换言之是鸟类。在鸟纲中，驯养的家禽是优选的，但是该纲的其他成员，如火鸡、鸭和鹅，是超免疫的蛋制品的适宜来源。在特定实施方式中，产蛋动物是鸡。
这种特殊的超免疫状态优选通过给予初始免疫，然后用足够高剂量的特异性抗原或抗原混合物进行周期性强化来实现。强化的剂量可以是对产蛋动物进行初始免疫所需剂量的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。这些百分比中的任何一个都可以用于定义强化免疫的剂量范围。例如，在一些实施方式中，强化的剂量可以是对产蛋动物进行初始免疫所需剂量的20％-80％、30％-70％或50％-100％。在特定实施方式中，强化免疫的剂量是初始免疫剂量的50％。了解发展和维持超免疫状态的要求后，根据所使用的产蛋动物属和菌株来改变所施用的抗原的量，以维持动物处于超免疫状态，这在本领域的技术范围内。
可以通过单一抗原或抗原的组合产生超免疫状态。超免疫可以通过多次暴露于多种抗原或多次暴露于单一抗原来实现。
用于超免疫的抗原
在一些实施方式中，用于超免疫的抗原包括屎肠球菌、粪肠球菌和粪肠球菌溶细胞素毒素的一种或多种。在一些实施方式中，产蛋动物仅用粪肠球菌超免疫，即，未使用其他抗原超免疫。在一些实施方式中，产蛋动物仅使用分离的粪肠球菌溶细胞素毒素超免疫。在一些实施方式中，产蛋动物仅使用屎肠球菌超免疫。
在一些实施方式中，包含针对粪肠球菌的抗体超免疫的蛋制品是通过使用粪肠球菌超免疫产蛋动物制备的。在一些实施方式中，包含针对粪肠球菌溶细胞素毒素的抗体超免疫的蛋制品是通过使用粪肠球菌溶细胞素毒素超免疫产蛋动物制备的。在一些实施方式中，包含针对屎肠球菌的抗体超免疫的蛋制品是通过使用屎肠球菌超免疫产蛋动物制备的。
本文公开的抗原的任何组合可以用于超免疫产蛋动物。例如，在一些实施方式中，使用屎肠球菌、粪肠球菌和分离的粪肠球菌溶细胞素毒素超免疫产蛋动物。在一些实施方式中，使用屎肠球菌和粪肠球菌超免疫产蛋动物。在一些实施方式中，使用屎肠球菌和分离的粪肠球菌溶细胞素毒素超免疫产蛋动物。在一些实施方式中，使用粪肠球菌和分离的粪肠球菌溶细胞素毒素超免疫产蛋动物。
超免疫程序
以下步骤列表是用于使产蛋动物达到超免疫状态从而产生超免疫蛋或蛋制品的优选程序的实例，可以将其施用于鸟类：
1.选择一种或多种抗原。
2.通过初始免疫在产蛋动物中引发免疫应答。
3.施用适当剂量的一种或多种抗原的强化疫苗以诱导和维持超免疫状态。
步骤1：该步骤的关键点是一种或多种抗原在产蛋动物中必须能够诱导免疫和超免疫状态。在一些实施方式中，使用粪肠球菌免疫产蛋动物。在一些实施方式中，使用粪肠球菌溶细胞素毒素免疫产蛋动物。在一些实施方式中，使用屎肠球菌超免疫产蛋动物。在一些实施方式中，使用屎肠球菌、粪肠球菌和粪肠球菌溶细胞素毒素的两种或更多种超免疫产蛋动物。
步骤2：针对粪肠球菌和屎肠球菌，疫苗可以是灭活疫苗或减毒活疫苗。疫苗可以以引发免疫应答的任何方法使用。优选通过肌肉注射施用疫苗完成免疫接种。鸟类注射的优选肌肉是胸肌。剂量优选为0.05-5毫克的免疫原性疫苗。可使用的其他施用方法包括静脉注射、腹腔注射、皮内、直肠栓剂、气雾剂或口服施用。
可以通过免疫学领域技术人员公知的多种方法来确定疫苗是否在产蛋动物中引发了免疫应答。这些实例包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、刺激性抗原抗体的存在测试，以及旨在评价宿主免疫细胞对抗原应答能力的测试。诱导免疫应答所需的最小抗原剂量取决于所用的疫苗接种程序，包括佐剂的类型和所用一种或多种抗原的配方，以及用作宿主的产蛋动物的类型。
步骤3：优选通过在固定时间间隔重复施用适当剂量的强化剂在目标动物中诱导和维持超免疫状态。时间间隔优选为在6-12个月的时间段内的2-8周间隔。然而，至关重要的是，强化剂的施用不会导致免疫耐受。此类方法在本领域中是众所周知的。例如，在美国专利号6,803,035中描述了超免疫的蛋制品的制备方法，其全部内容通过引用并入本文。
在特定实施方式中，将抗原(例如，屎肠球菌、粪肠球菌和/或粪肠球菌溶细胞素毒素)配制成弗氏疫苗。在第一次免疫接种中，产蛋动物接受两次0.5ml剂量的每种抗原。两周后，将一次0.5ml剂量的每种抗原向产蛋动物施用，作为强化免疫接种。在第一次接种疫苗后4周进行额外的强化免疫接种。疫苗可以向胸部组织施用。
可以使用其他超免疫维持程序或程序的组合，例如，用于初始免疫的肌肉注射和用于强化注射的静脉注射。进一步的程序包括同时施用微囊化和液体抗原，或肌肉注射用于初始免疫，以及通过口服施用或通过微胶化手段胃肠外施用强化剂量。初始免疫和超免疫的几种组合是本领域技术人员公知的。
在一些实施方式中，超免疫的蛋制品包含针对屎肠球菌的抗体。在某些实施方式中，超免疫的蛋制品包含针对粪肠球菌的抗体。在一些实施方式中，超免疫的蛋制品包含针对粪肠球菌溶细胞素毒素的抗体。针对粪肠球菌溶细胞素毒素的抗体可以结合并中和毒素。在一些实施方式中，超免疫的蛋制品包含针对粪肠球菌溶细胞素毒素的抗体，以及针对不是粪肠球菌溶细胞素毒素的至少一种其他粪肠球菌抗原的抗体。
抗体可以是IgA、IgM或IgY抗体。在特定实施方式中，抗体是IgY抗体。
相对于从未用特定抗原进行超免疫的产蛋动物获得的对照蛋或对照蛋制品，超免疫蛋或超免疫的蛋制品可含有增加水平的对本文公开的特定抗原具有特异性的抗体(例如，IgY抗体)。例如，在一些实施方式中，相对于从未经超免疫的产蛋动物获得的对照蛋或蛋制品，超免疫蛋或超免疫的蛋制品含有增加水平的对粪肠球菌有特异性的抗体。在一些实施方式中，相对于从未经超免疫的产蛋动物获得的对照蛋或蛋制品，超免疫蛋或超免疫的蛋制品含有增加水平的对粪肠球菌溶细胞素毒素有特异性的抗体。在一些实施方式中，相对于从未经超免疫的产蛋动物获得的对照蛋或蛋制品，超免疫蛋或超免疫的蛋制品含有增加水平的对屎肠球菌有特异性的抗体。
在一些实施方式中，相对于从未使用特定抗原超免疫的产蛋动物获得的对照蛋或对照蛋制品，超免疫蛋或蛋制品包含以重量计至少10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、400％或500％更多的对本文公开的特异性抗原(例如，屎肠球菌、粪肠球菌或粪肠球菌溶细胞素毒素)有特异性的抗体(例如，IgY抗体)。例如，在一些实施方式中，相对于从未使用粪肠球菌超免疫的产蛋动物获得的对照蛋或对照蛋制品，超免疫蛋或超免疫的蛋制品包含至少10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、400％或500％更多的对粪肠球菌有特异性的抗体(例如，IgY抗体)。在一些实施方式中，相对于从未使用粪肠球菌溶细胞素毒素超免疫的产蛋动物获得的对照蛋或对照蛋制品，超免疫蛋或超免疫的蛋制品包含至少10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、400％或500％更多的对粪肠球菌溶细胞素毒素有特异性的抗体(例如，IgY抗体)。在一些实施方式中，相对于从未使用屎肠球菌超免疫的产蛋动物获得的对照蛋或对照蛋制品，超免疫蛋或超免疫的蛋制品包含至少10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、400％或500％更多的对屎肠球菌有特异性的抗体(例如，IgY抗体)。
相对于从未超免疫的产蛋动物获得的对照蛋或对照蛋制品，超免疫蛋或蛋制品可以包含增加水平的两种或更多种抗体(例如，IgY抗体)，其每一个对本文公开的不同抗原有特异性。例如，在一些实施方式中，相对于从未超免疫的产蛋动物获得的对照蛋或对照蛋制品，超免疫蛋或超免疫的蛋制品包含增加水平的对粪肠球菌溶细胞素毒素有特异性的一种或多种抗体和对粪肠球菌有特异性的一种或多种抗体(例如，对粪肠球菌溶细胞素毒素以外的粪肠球菌抗原有特异性的一种或多种抗体)。在一些实施方式中，相对于从未超免疫的产蛋动物获得的对照蛋或对照蛋制品，超免疫蛋或超免疫的蛋制品包含增加水平的对粪肠球菌溶细胞素毒素有特异性的抗体和增加水平的对屎肠球菌有特异性的抗体。在一些实施方式中，相对于从未超免疫的产蛋动物获得的对照蛋或对照蛋制品，超免疫蛋或超免疫的蛋制品包含增加水平的对屎肠球菌有特异性的抗体和增加水平的对粪肠球菌有特异性的抗体。
例如，在一些实施方式中，相对于从未使用粪肠球菌或粪肠球菌溶细胞素毒素超免疫的产蛋动物获得的对照蛋或对照蛋制品，超免疫蛋或超免疫的蛋制品包含至少10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、400％或500％更多的针对粪肠球菌的抗体和至少10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、400％或500％更多的针对粪肠球菌溶细胞素毒素的抗体。在一些实施方式中，相对于从未使用粪肠球菌或屎肠球菌超免疫的产蛋动物获得的对照蛋或对照蛋制品，超免疫蛋或超免疫的蛋制品包含至少10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、400％或500％更多的针对粪肠球菌的抗体和至少10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、400％或500％更多的针对屎肠球菌的抗体。在一些实施方式中，相对于从未使用粪肠球菌溶细胞素毒素或屎肠球菌超免疫的产蛋动物获得的对照蛋或对照蛋制品，超免疫蛋或超免疫的蛋制品包含至少10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、400％或500％更多的针对粪肠球菌溶细胞素毒素的抗体和至少10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、400％或500％更多的针对屎肠球菌的抗体。在一些实施方式中，相对于从未使用粪肠球菌、粪肠球菌溶细胞素毒素或屎肠球菌超免疫的产蛋动物获得的对照蛋或对照蛋制品，超免疫蛋或超免疫的蛋制品包含至少10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、400％或500％更多的针对粪肠球菌的抗体，至少10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、400％或500％更多的针对粪肠球菌溶细胞素毒素的抗体和至少10％、20％、30％、40％、50％、100％、200％、300％、400％或500％更多的针对屎肠球菌的抗体。
超免疫的蛋制品和对照蛋制品中抗体效价的比较可以通过本领域公知的方法确定。例如，在一个实施方式中，收集蛋，并通过ELISA定期监测抗体效价。为确定抗体效价，使用PierceTM Chicken IgY纯化试剂盒(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)从蛋中提取总IgY。简言之，根据生产厂商的说明书，将2mL蛋与5体积去脂质试剂混合并纯化IgY。将喷雾干燥的蛋粉样品在无菌PBS中以1mg/mL重构，并通过0.22μm膜过滤器过滤。通过ELISA测量在分离的IgY或蛋粉样品中的特定抗体效价。将平底96孔酶标板( Corning,NY)用10μg/mL(100μL/孔)抗原(例如，粪肠球菌抗原、分离的粪肠球菌溶细胞素毒素或屎肠球菌抗原)包被，并在4℃下孵育过夜。将板用含有0.05％吐温20(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)的PBS洗涤两次，以100μL/孔用含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS封闭，并在RT下孵育1h。将来自蛋粉样品的系列稀释(在含0.1％ BSA的PBS中)的IgY样品以三复孔(100μL/孔)添加到板中，并且以恒定震荡在RT下孵育2h。然后用PBS-T洗板并用过氧化物酶缀合的家兔抗-鸡IgY(IgG)抗体(1:500；Sigma)处理，孵育30分钟，随后用0.01％四甲基联苯胺底物(Sigma)在0.05M磷酸盐柠檬酸盐缓冲液(pH 5.0)中显色10分钟。通过使用酶标仪(Bio-Rad,Hercules,CA)通过测量在450nm(OD450)处的光密度检测结合抗体。抗体效价可以通过仍含有可检测抗体的蛋制品的最高倍稀释度来表示，如通过如上所述的光密度测量的。例如，抗体效价为1000表明1000倍稀释的蛋制品含有可检测的抗体，但更高稀释度的蛋制品不含有可检测的抗体。在一些实施方式中，在超免疫的蛋制品中的抗体效价(例如，针对粪肠球菌溶细胞素毒素、粪肠球菌和/或屎肠球菌的抗体)是至少1000、至少2000、至少4000、至少8000、至少16,000、至少32,000、至少64,000、至少100,000、至少128,000、至少250,000、至少500,000或至少100万、200万，300万、400万、500万、600万、700万、800万、900万、1000万、1100万、1200万、1300万、1400万、1500万、1600万、1700万、1800万、1900万或2000万。在特定实施方式中，在超免疫的蛋制品中的抗体效价(例如，针对粪肠球菌溶细胞素毒素、粪肠球菌和/或屎肠球菌的抗体)是至少16,000。在另一个特定实施方式中，在超免疫的蛋制品中针对粪肠球菌溶细胞素毒素的抗体效价和针对粪肠球菌的抗体效价是至少16,000。
在一些实施方式中，超免疫蛋或蛋制品包含以重量计至少0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％或0.1％针对特异性抗原(例如，屎肠球菌抗原、粪肠球菌抗原或粪肠球菌溶细胞素毒素)的IgY抗体。通常，无壳的完整鸡蛋重量约60克，蛋黄重约20克和蛋清重约40克。在一些实施方式中，3克蛋黄含有约20-30毫克总IgY，这样全蛋含有约150-200mg总IgY。在一些实施方式中，在超免疫蛋或蛋制品中，总IgY的至少1％,2％,3％,4％,5％,6％,7％,8％,9％,10％,11％,12％,13％,14％,15％,16％,17％,18％,19％,20％,25％or 30％对用于超免疫的抗原之一(例如，屎肠球菌、粪肠球菌或分离的粪肠球菌溶细胞素毒素)是特异性的。
组合物和施用
在某些方面中，本公开涉及一种在有此需要的受试者中预防或治疗酒精性肝病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的从产蛋动物获得的超免疫的蛋制品，从而在所述受试者中预防或治疗酒精性肝病，其中所述超免疫的蛋制品包含治疗有效量的针对选自以下的抗原的一种或多种抗体：粪肠球菌和粪肠球菌溶细胞素毒素。在一些实施方式中，超免疫的蛋制品包含治疗有效量的针对粪肠球菌溶细胞素毒素的一种或多种抗体和针对粪肠球菌的一种或多种抗体。在一些实施方式中，针对粪肠球菌的抗体包括针对不是粪肠球菌溶细胞素毒素的一种或多种粪肠球菌抗原的抗体。
在某些方面中，本公开涉及一种在有此需要的受试者中预防或治疗移植物抗宿主病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的从产蛋动物获得的超免疫的蛋制品，从而在所述受试者中预防或治疗移植物抗宿主病，其中所述超免疫的蛋制品包含治疗有效量的针对选自以下的抗原的一种或多种抗体：粪肠球菌、粪肠球菌溶细胞素毒素和屎肠球菌。一旦产蛋动物被充分超免疫，则优选的是收集和处理来自这些动物的蛋，以产生可施用形式的超免疫的蛋制品。超免疫的蛋制品可以通过对全蛋、蛋黄或纯化的IgY级分进行脱水、喷雾干燥或冷冻干燥来制备。可以将干燥的超免疫的蛋制品与诸如硅或硅衍生物的试剂混合，以改善流动性质。干燥的超免疫的蛋制品可以包含干燥剂。超免疫的蛋制品可以在环境温度下或冷藏保存，例如，在4℃下。
在一些实施方式中，向受试者施用超免疫的蛋制品降低受试者中粪肠球菌的水平，例如，相对于施用超免疫的蛋制品之前受试者中的粪肠球菌水平，或者相对于未施用超免疫的蛋制品的受试者中的粪肠球菌水平。在一些实施方式中，向受试者施用超免疫的蛋制品降低受试者中的肝损伤(例如，降低血清中的丙氨酸转氨酶(ALT)水平)，例如，相对于施用超免疫的蛋制品之前的肝损伤水平，或者相对于未施用超免疫的蛋制品的受试者的肝损伤水平。
在一些实施方式中，超免疫的蛋制品是包封的。包封抗体和其他蛋白的方法是本领域公知的，并且例如描述在美国专利号7,105,158中。可生物降解且不产生抗原的材料可用作包封材料。包封材料包括但不限于白蛋白、PLGA、球蛋白、天然和合成聚合物以及热塑性聚合物。任何具有生物相容性和生物可降解性的聚合物都可以用于包封。很多可用的交联剂，如戊二醛，可用于交联包封材料。此外，药物递送材料可以包含包封药物的微球，由此微球具有不同浓度的交联剂，从而产生抗体的延长的连续释放。
在一些实施方式中，超免疫的蛋制品是微粒或纳米粒形式，例如，包封的微粒或包封的纳米粒。微粒和纳米粒可以具有任何形状。通常，微粒和纳米粒是球形。其他适宜的形状包括但不限于薄片、三角形、椭圆形、棒、多边形、针、管、立方体和长方体结构。在某些实施方式中，微粒的直径小于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1微米。任何这些值可用于定义微粒直径的范围。例如，微粒的直径可以是从约0.1至约10微米、从约0.1至约1微米或从约0.1至约2微米。在其他实施方式中，可以使用更大的微粒或粒子。例如，微粒可以具有范围从10微米至1000微米的直径。在某些实施方式中，纳米粒具有小于1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100或10nm的直径。任何这些值可用于定义纳米粒直径的范围。例如，纳米粒的直径可以是从约10至约1000nm、从约100至约1000nm或从约10至约100nm。
有几种方法可以包封微粒或纳米粒，包括，例如，多壁微胶囊、热熔包封、相分离包封、自发乳液、溶剂蒸发微囊化、溶剂去除微囊化和凝聚。这些方法是本领域公知的。在Mathiowitz等，“Microencapsulation”，Encyclopedia of Controlled Drug Delivery，第2卷，pp.495-546,1999,John Wiley&Sons,Inc..New York,N.Y.中讨论了对方法的详细描述，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方式中，对本文公开的抗原(例如，屎肠球菌、粪肠球菌或粪肠球菌溶细胞素毒素)特异性的IgY抗体以浓缩形式向受试者施用。例如，在一些实施方式中，在向受试者施用前，将IgY抗体纯化和浓缩。从蛋制品中纯化和浓缩IgY抗体的方法是本领域公知的并且例如描述在美国专利号5,367,054中，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，超免疫的蛋制品包含纯化的或部分纯化的针对粪肠球菌溶细胞素毒素的IgY抗体或由其组成。在一些实施方式中，超免疫的蛋制品包含纯化的或部分纯化的针对粪肠球菌的IgY抗体或由其组成。在一些实施方式中，超免疫的蛋制品包含纯化的或部分纯化的针对屎肠球菌的IgY抗体或由其组成。在一些实施方式中，超免疫的蛋制品包含纯化的或部分纯化的针对粪肠球菌的IgY抗体和纯化的或部分纯化的针对粪肠球菌溶细胞素毒素的IgY抗体或由其组成。
在一些实施方式中，本文所述的超免疫的蛋制品用于在已经发展成该疾病的受试者中治疗酒精性肝病。例如，在一些实施方式中，在施用超免疫的蛋制品时受试者患有酒精性肝病。据观察，与没有饮酒障碍的患者相比，酒精性肝病(例如，酒精性肝炎)患者中肠球菌种的比例有所增加。例如，在酒精性肝炎患者中，5.59％的粪便细菌是肠球菌种，而相比之下，在没有酒精使用障碍的对照受试者中几乎没有(0.023％)。参见Duan等，2019,Nature575:505-511。因此，在一些实施方式中，在施用超免疫的蛋制品时，在受试者中至少0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％或5％的粪便细菌是肠球菌种。酒精性肝炎患者的粪便样本中的粪肠球菌含量是没有酒精使用障碍的对照受试者的约2,700倍，如通过定量PCR(qPCR)所测量的，并且约80％的酒精性肝炎患者的粪便中粪肠球菌呈阳性。见上文引用的Duan等。因此，在一些实施方式中，受试者的粪便样本中的粪肠球菌是未患有酒精性肝病的受试者的至少100倍、500倍、1000倍、1500倍、2000倍或2500倍。
在一些实施方式中，本文所述的超免疫的蛋制品在受试者中用于预防酒精性肝病的发展。例如，在一些实施方式中，在施用超免疫的蛋制品时，受试者未患有酒精性肝病。在一些实施方式中，在施用超免疫的蛋制品时，受试者患有酒精性肝病以外的酒精相关病症。在一些实施方式中，受试者是酗酒者、过度饮酒者或重度饮酒者。在特定实施方式中，施用超免疫的蛋制品的受试者是人。
在一些实施方式中，本文所述的超免疫的蛋制品用于在已经发展成该疾病的受试者中治疗GVHD。例如，在一些实施方式中，在施用超免疫的蛋制品时，受试者患有GVHD。如上所述，已观察到GVHD患者的肠球菌种(例如，屎肠球菌)粪便水平增加。见上文引用的Garrett。因此，在一些实施方式中，在施用超免疫的蛋制品时，患有GVHD的受试者相对于健康受试者(例如，不具有GVHD的受试者)表现出一种或多种肠球菌种(例如，粪肠球菌或屎肠球菌)的粪便水平增加。在一些实施方式中，患有GVHD的受试者接受了器官移植、干细胞移植、骨髓移植或异基因造血细胞移植。在一些实施方式中，受试者患有急性GVHD。在一些实施方式中，受试者患有慢性GVHD。
在一些实施方式中，本文所述的超免疫的蛋制品用于在受试者中预防GVHD的发展。例如，在一些实施方式中，在施用超免疫的蛋制品时，受试者未患有GVHD。在一些实施方式中，受试者已接受移植(例如，器官移植、干细胞移植、骨髓移植或异基因造血细胞移植)，但是尚未发展成GVHD。在特定实施方式中，施用超免疫的蛋制品的受试者是人。
通过在受试者中治疗或预防酒精性肝病或GVHD的任何手段向受试者(例如，人)施用本发明的超免疫的蛋制品。在某些实施方式中，施用通过口服施用进行。蛋和蛋黄是天然食品成分并且无毒和安全。在其他实施方式中，可以通过注射施用超免疫的蛋制品，例如，静脉内、皮下或肌内注射。在特定实施方式中，超免疫的蛋制品是纯化的或部分纯化的IgY，其是通过静脉内注射施用的。
几种已知的药物载体中的任何一种都可以用于制备可注射或以其他方式施用的制剂，包括磷酸盐缓冲盐水、盐水、乙醇、丙二醇等。在一些实施方式中，超免疫的蛋制品通过饮水施用。
在某些实施方式中，超免疫的蛋制品以组合物形式施用，所述组合物包含一种或多种其他化合物，例如，营养素或益生菌。例如，在一个实施方式中，将本发明的超免疫的蛋制品整合到膳食补充剂中。用于将本发明的蛋掺入膳食补充剂的一种制备方法涉及将蛋干燥成蛋粉。尽管已知有多种方法用于干燥蛋，但喷雾干燥是优选的方法。喷雾干燥蛋的方法是本领域众所周知的。在一些实施方式中，组合物是包含超免疫的蛋制品的水溶液。
在某些实施方式中，将全蛋分成不同部分，如蛋黄和蛋清。例如，本领域通常公知IgY抗体存在于蛋黄中。因此，本领域普通技术人员将清楚地认识到，蛋黄的分离可以提供更有效的组分或消除不需要的组分，并且将允许其他施用模式，如胃肠外、皮下、静脉内、肌内、腹腔内、鼻内、口服或局部施用超免疫的蛋制品。这种进一步的分离将提供制备包含所述蛋或其部分的包封产品和组合物的能力。
超免疫的蛋制品优选以在治疗或预防酒精性肝病或GVHD方面具有免疫有效性的量向受试者施用。施用的剂量和持续时间将取决于受试者的特定状况。在一些实施方式中，向受试者施用超免疫的蛋制品至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、60、90、180或365天。超免疫的蛋制品可以每天向受试者施用1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。任何这些值可以用于定义每天可以向受试者施用的超免疫的蛋制品的次数范围。例如，在一些实施方式中，超免疫的蛋制品每天向受试者施用1-2次、1-3次或1-4次。在一些实施方式中，超免疫的蛋制品每天向受试者施用至少两次。在一些实施方式中，超免疫的蛋制品每天向受试者施用至少一次。在一些实施方式中，超免疫的蛋制品每天向受试者施用。在一些实施方式中，超免疫的蛋制品每两天向受试者施用一次。在一些实施方式中，超免疫的蛋制品每三天向受试者施用一次。在一些实施方式中，超免疫的蛋制品每周向受试者施用一次。在特定实施方式中，每天向受试者施用一次超免疫的蛋制品，持续超过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天。
在一些实施方式中，根据病情的具体情况，可以向受试者每天施用少于一个到几个完整的超免疫蛋(或含有相当于少于一个至几个完整的超免疫蛋的超免疫蛋产品)。可以通过本领域众所周知的方法从几百个蛋中分离和浓缩更有效的组分。在某些实施方式中，每天向受试者(例如，人)施用的超免疫的蛋制品的有效量是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、20、6、7、8、9、10、20、30、40或50克。例如，在一些实施方式中，每天向受试者施用0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50克全蛋。在一些实施方式中，每天向受试者施用0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50克蛋黄。在一些实施方式中，每天向受试者施用0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10克干燥的蛋黄或干燥的全蛋。任何这些值可以用于定义向哺乳动物施用的超免疫的蛋制品的有效量的范围。例如，在一些实施方式中，每天的超免疫的蛋制品的有效量是0.1至10克之间、0.5至6克之间或1至5克之间。在特定实施方式中，每天向受试者(例如，人)施用3克蛋黄。
在某些实施方式中，组合物包含至少0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％w/w的超免疫的蛋制品。任何这些值可以用于定义组合物中超免疫的蛋制品的浓度范围。例如，在一些实施方式中，组合物包含0.01％至50％之间、0.1％至50％之间或1％至50％w/w之间的超免疫的蛋制品。
实施例
实施例1：抗粪肠球菌和抗溶细胞素IgY抗体的制备和评价
本研究旨在评价当向人源化小鼠ALD模型口服施用时含有针对粪肠球菌溶细胞素毒素和粪肠球菌的靶向IgY抗体的超免疫蛋的作用，所述人源化小鼠ALD模型使用来自酒精性肝炎患者粪便的细菌定殖。表图1中提供了实验示意图。
方法
超免疫蛋粉的制备
从甘油储备物中复苏两(2)mL粪肠球菌的原代培养物。通过在500mL培养瓶中接种0.2％的原代培养物，并在37℃下以180rpm震荡生长过夜，形成大批量培养物。通过在4℃下以6000rpm离心将细菌形成球团。使用冰冷PBS洗涤球团一次。将球团再次重悬在冰冷PBS中，转移到玻璃试管中，并在最高设置下超声处理10个循环，每个循环30分钟。将所得裂解物在4℃下以10,000rpm离心15min，并收集上清液。通过BCA蛋白测定对总蛋白定量。
重组溶细胞素的制备
由Genscript USA,Piscataway,NJ制备纯的重组粪肠球菌溶细胞素毒素。
超免疫方案
在PBS中将粪肠球菌细菌裂解物和粪肠球菌溶细胞素毒素的混合物分别稀释至2mg/mL和1mg/mL，并用作接种物。使用每种抗原对单独的鸡免疫，使用接种物和弗氏完全佐剂1:1混合物。在0、4、7、14和28天进行免疫接种并收集蛋。
用于评价效价和中和的抗体的提取
使用水稀释法从超免疫的蛋中提取IgY抗体。将100μL蛋黄在10ml水中稀释，充分混合，离心以沉淀脂质，同时将抗体和其他可溶性蛋蛋白提取到水相中。水相用于通过ELISA评估效价测定，如下所述。
对于中和测定，通过水稀释和NaCl沉淀法从超免疫蛋黄中提取IgY。用利用0.5MHCl酸化至pH 5的水以1:10的比例稀释4-5个蛋黄，并冷冻过夜。稀释的蛋黄在37℃下解冻，并以6000rpm离心20分钟以分离脂质。将上清液过滤并在pH 4下与8.8％ NaCl混合，使其沉淀2小时。通过离心从沉淀物中分离IgY，并通过在PBS中透析除去过量的盐。使用NanoDropTMOne Microvolume UV-Vis分光光度计(Thermo Scientific)通过A280(在280nm处的吸收)值对总IgY定量。在SDS-PAGE凝胶上分析IgY的纯度。
通过ELISA检测抗体特异性和效价
通过ELISA确定抗体特异性和效价。简言之，为确定抗粪肠球菌抗体的效价，将96孔板用含1mg/mL粪肠球菌裂解物的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH 9.3)包被，并在4℃下孵育过夜。使用PBS洗板一次，并用含1％ BSA的PBS在37℃下封闭1小时。用含有0.05wt％吐温-20(PBST)的PBS洗板一次，并用在板上系列稀释的抗粪肠球菌一抗在37℃下处理1小时。洗涤板并用山羊抗鸡HRP二抗处理。添加TMB底物以产生信号，并通过HCl终止反应。在酶标仪上在450nm处读板。为确定抗溶细胞素抗体效价，将另一96孔板用0.5mg/ml溶细胞素包被，并使用抗溶细胞素抗体进行类似实验。
IgY中和能力测试
将粪肠球菌在BHI肉汤中培养过夜至OD600为1.5，并在肉汤中以1:50稀释并孵育至OD600为3.0。在BHI肉汤中将培养物进一步稀释至103cfu/ml并用15mg/ml的抗体处理。在37℃下孵育24小时后，将培养物连续稀释104倍，在无菌板上铺板，并在37℃下孵育12小时。通过使用ImageJ计数粒子函数计数菌落数来定量Cfu/mL。计算细菌菌落形成的抑制百分比。
结果
采用水稀释法和NaCl法从超免疫鸡蛋黄中提取包含IgY的总可溶性蛋白。通过在还原条件下的SDS-PAGE电泳分析IgY的纯度。IgY的分子量是180KD，由两个亚基组成，67kDa的重链和23KD的轻链。从超免疫蛋黄中提取的IgY的电泳图谱与IgY标准品的电泳图谱相似。见图2。
靶点特异性抗体效价的评价
通过间接ELISA测量IgY抗体对粪肠球菌和溶细胞素抗原的特异性活性。ELISA结果表明，与具有1:32,000的高效价的对照IgY相比，IgY与特异性抗原阳性结合。见图3A和图3B。
靶点中和和评价
研究了IgY抗体对粪肠球菌的生长抑制作用。将全细胞粪肠球菌细菌与15mg/mlIgY孵育，并在孵育24h后进行cfu分析。用15mg/ml IgY处理可抑制粪肠球菌生长>70％，如琼脂平板上菌落数量减少所示。见图4。
定量IgY对粪肠球菌的生长抑制作用，并绘制抑制百分比。见图5。以15mg/ml浓度的抗粪肠球菌+溶细胞素IgY抗体处理粪肠球菌导致粪肠球菌生长75％抑制，表明成功产生了对粪肠球菌的中和抗体。见图5。
实施例2：在酒精性肝病小鼠模型中口服给予抗粪肠球菌和抗溶细胞素IgY抗体的作用
结果
用于临床前研究的蛋粉的制备
将蛋清和蛋黄均化并冷冻干燥，制成蛋粉。将蛋粉在4℃下保存。如上文实施例1中所述分析冷冻干燥蛋粉的抗体活性，然后在下文所述的酒精性肝病(ALD)人源化模型中进行评价。
将来自患有酒精性肝炎的溶细胞素阳性人患者的粪便样品用于在无菌小鼠中的粪便移植。小鼠从5-6周龄开始灌胃给予100μl粪便样品(1g粪便在厌氧条件下溶解在含有15％甘油的30ml Luria-Bertani(LBS)培养基中)，两周后重复。第二次灌胃后两周，将小鼠置于乙醇或对照(等热量)饮食中，如Duan等，2019,Nature575:505-511所描述的。定期评价小鼠的血清ALT、肝脏病理学和其他参数，如体重增加、肝脏重量和饲料摄入量。
酒精性肝病(ALD)模型
繁育雄性和雌性C57BL/6无菌小鼠，在5-6周龄时用来自一名患有酒精性肝炎的溶细胞素阳性人患者的粪便样品进行粪便移植并且在2周后重复，如Duan等，2019,Nature575:505-511所述。用Lieber-DeCarli饮食喂养小鼠，从乙醇摄入的热量在第1-5天为0％，从第6天到研究期结束为36％。在第16天，小鼠在清晨用单剂量乙醇(5g/kg体重)灌胃，9小时后处死。成对喂养的对照小鼠接受葡萄糖等热量替代饮食。
在酒精施用开始时，将含有来自未经免疫母鸡的蛋的对照IgY(15mg/天)或抗粪肠球菌+抗溶细胞素IgY(每天1、5或15mg)的蛋粉添加到液体饮食(含有脂肪、碳水化合物、蛋白和乙醇/等热量葡萄糖)中。干燥蛋粉的重量见下表1。每三天更换一次饮食。在研究开始时，将小鼠随机分组。在乙醇喂养期间，任何一组都没有死亡。
表1：用于小鼠ALDridge模型的IgY剂量
治疗组 IgY剂量(mg) 全蛋粉剂量(g)
抗粪肠球菌+抗溶细胞素IgY 1 0.18
抗粪肠球菌+抗溶细胞素IgY 5 0.88
抗粪肠球菌+抗溶细胞素IgY 15 2.63
对照IgY 15 2.24
生物化学分析
使用Infinity ALT试剂盒(Thermo Scientific)测量血清丙氨酸氨基转移酶(ALT；肝损伤测试)水平。使用甘油三酯液体试剂盒(Pointe Scientific)测量肝甘油三酯水平。
染色程序
将甲醛固定的组织样品包埋在石蜡(Paraplast plus,McCornick)中，并用苏木精-伊红(Surgipath)染色。
统计学分析
结果以平均值±s.e.m表示。在每个含乙醇的饮食组中，生物重复次数为n＝5。使用单因素方差分析(ANOVA)结合Tukey事后检验评价显著性。将P值<0.05认为具体统计学显著性。使用R统计软件(R版本1.3.1093,2020版R Foundation for Statistical Computing以及GraphPad Prism v8.4.3)进行统计分析。
结果
为确定在乙醇诱导的肝病小鼠模型中抗粪肠球菌+抗溶细胞素IgY的作用，用来自患有酒精性肝炎的溶细胞素阳性患者的粪便定植无菌C57BL/6小鼠，并使其接受长期乙醇过量喂养模型。乙醇喂养组的食物摄入量、体重和肝脏重量没有显著性差异。见图6A-6C。在抗粪肠球菌+抗溶细胞素IgY治疗小鼠中具有体重降低的趋势，这与在研究开始时该组小鼠体重更低有关。在长期乙醇喂养后，与接受对照IgY的小鼠相比，如血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平降低所示，接受5mg或15mg抗粪肠球菌+抗溶细胞素IgY的小鼠显示出显著更少的肝损伤(见图6D)。甘油三酯未见显著性差异，但是抗粪肠球菌+抗溶细胞素IgY治疗小鼠具有降低的肝脏脂肪变性趋势(见图6E)。组织学分析表明，抗粪肠球菌+抗溶细胞素IgY治疗小鼠显示出显著更低的乙醇诱导的肝损伤和肝脏脂肪变性(见图7)。

Claims (31)

1.一种在有此需要的受试者中预防或治疗酒精性肝病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的从产蛋动物获得的超免疫的蛋制品，从而在所述受试者中预防或治疗所述酒精性肝病，其中所述超免疫的蛋制品包含治疗有效量的针对选自以下的抗原的一种或多种抗体：粪肠球菌和粪肠球菌溶细胞素毒素。
2.一种在有此需要的受试者中预防或治疗移植物抗宿主病的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的从产蛋动物获得的超免疫的蛋制品，从而在所述受试者中预防或治疗所述移植物抗宿主病，其中所述超免疫的蛋制品包含治疗有效量的针对选自以下的抗原的一种或多种抗体：粪肠球菌、粪肠球菌溶细胞素毒素和屎肠球菌。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述超免疫的蛋制品包含治疗有效量的针对粪肠球菌的一种或多种抗体，和治疗有效量的针对粪肠球菌溶细胞素毒素的一种或多种抗体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其进一步包括使用选自粪肠球菌、分离的粪肠球菌溶细胞素毒素和屎肠球菌的抗原超免疫所述产蛋动物。
5.根据权利要求4所述的方法，其进一步包括从已被超免疫的所述产蛋动物收集超免疫的蛋，并从所述超免疫的蛋制备超免疫的蛋制品。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中相对于从未经超免疫的产蛋动物获得的对照蛋制品，所述超免疫的蛋制品包含以重量计多至少20％的对选自以下的抗原有特异性的IgY抗体：粪肠球菌、粪肠球菌溶细胞素毒素和屎肠球菌。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中每日向所述受试者施用所述超免疫的蛋制品1至4次。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中口服或静脉内施用所述超免疫的蛋制品。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中相对于未施用所述超免疫的蛋制品的受试者，向所述受试者施用所述超免疫的蛋制品在所述受试者中降低粪肠球菌的水平。
10.根据权利要求1和3至9中任一项所述的方法，其中相对于未施用所述超免疫的蛋制品的受试者，向所述受试者施用所述超免疫的蛋制品在所述受试者中降低肝损伤。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
12.一种由动物生产的超免疫的蛋，所述动物已用选自以下的抗原超免疫：粪肠球菌、分离的粪肠球菌溶细胞素毒素和屎肠球菌，其中相对于来自未经超免疫的动物的蛋，所述超免疫的蛋中针对所述抗原的抗体的水平增加。
13.根据权利要求12所述的超免疫的蛋，其中所述动物已用粪肠球菌和分离的粪肠球菌溶细胞素毒素超免疫，并且其中相对于来自未经超免疫的动物的蛋，针对所述粪肠球菌和所述分离的粪肠球菌溶细胞素毒素的抗体的水平增加。
14.一种从根据权利要求12或权利要求13所述的超免疫的蛋获得的超免疫的蛋制品。
15.根据权利要求14所述的超免疫的蛋制品，其中所述超免疫的蛋制品是全蛋。
16.根据权利要求14所述的超免疫的蛋制品，其中所述超免疫的蛋制品是蛋黄。
17.根据权利要求14所述的超免疫的蛋制品，其中所述超免疫的蛋制品是纯化的或部分纯化的针对粪肠球菌溶细胞素毒素的IgY抗体。
18.根据权利要求14所述的超免疫的蛋制品，其中所述超免疫的蛋制品是纯化的或部分纯化的针对粪肠球菌的IgY抗体。
19.根据权利要求14所述的超免疫的蛋制品，其中所述超免疫的蛋制品由纯化的或部分纯化的针对粪肠球菌的IgY抗体和纯化的或部分纯化的针对粪肠球菌溶细胞素毒素的IgY抗体组成。
20.一种药物组合物，其包含根据权利要求14至19中任一项所述的超免疫的蛋制品和药学上可接受的载体。
21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述组合物包含3至10克所述全蛋。
22.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述组合物包含1至3克所述蛋黄。
23.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述组合物包含0.05至1克所述纯化的或部分纯化的IgY。
24.根据权利要求20所述的药物组合物，其被配制为用于口服施用。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述超免疫的蛋制品配制在纳米颗粒或在乳液中。
26.根据权利要求20所述的药物组合物，其被配制为用于静脉内施用。
27.一种制备超免疫的蛋制品的方法，其包括：i)使用选自粪肠球菌、分离的粪肠球菌溶细胞素毒素和屎肠球菌的抗原超免疫产蛋动物；和ii)从所述动物产生的一个或多个蛋制备超免疫的蛋制品。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述抗原选自分离的粪肠球菌溶细胞素毒素和屎肠球菌。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述抗原选自粪肠球菌和分离的粪肠球菌溶细胞素毒素。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述抗原包含粪肠球菌和分离的粪肠球菌溶细胞素毒素。
31.根据权利要求27至30中任一项所述的方法，其中所述产蛋动物是鸡。
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