ES2285419T3 - Uso de anticuerpos aviares. - Google Patents

Abstract

Uso de IgY que se origina de un huevo de un ave hiper-inmunizada con Enterobacter cloacae para la producción de un compuesto farmacéutico para el tratamiento y/o prevención de infecciones entéricas en bebés recién nacidos, bebés nacidos prematuramente, bebés que tienen un sistema inmune inmaduro, pacientes que padecen inmunodeficiencia temporal y enfermedades de inmunodeficiencia tales como SIDA.

Description

Uso de anticuerpos aviares.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un método para la profilaxis o terapia en infecciones entéricas en bebés recién nacidos, bebés prematuros, bebés que tienen un sistema inmune inmaduro, pacientes que padecen inmunodeficiencia temporal y enfermedades de inmunodeficiencia tales como SIDA. Más específicamente a un método para la profilaxis o terapia de infecciones causadas por Enterobacter cloacae.

Antecedentes de la invención

Todos los tipos de infecciones son graves y algunas veces amenazantes de la vida en bebés recién nacidos - especialmente en aquellos que han nacido prematuramente. Un sistema inmune eficaz es de suma importancia para combatir las infecciones. La producción de inmunoglobulina es muy inmadura en bebés recién nacidos. Por tanto, tienen que depender solamente de las inmunoglobulinas transportadas a ellos desde su madre a través de la placenta. En bebés nacidos prematuramente (antes de la 32ª semana de embarazo) estas inmunoglobulinas están casi totalmente ausentes.

El único tratamiento de las infecciones en los bebés recién nacidos que existe hoy en día es el uso de antibióticos contra infecciones bacterianas y antimicóticos contra infecciones fúngicas. Dichos tratamientos tienen muchos inconvenientes. Los antibióticos y antimicóticos muy a menudo son tóxicos, por ejemplo, perniciosos para el sentido del oído, para el sistema neurológico, para los riñones y para la médula ósea, y el bebé recién nacido es más susceptible a estos efectos tóxicos que niños mayores y adultos. Los antibióticos pueden incluso causar infecciones alternativas, especialmente infecciones fúngicas, que son más graves que la infección original. El inconveniente más alarmante con respecto a los antibióticos y antimicóticos es, sin embargo, que varias bacterias y hongos pueden muy rápidamente llegar a ser resistentes contra estos fármacos antimicrobianos. Por tanto, el uso repetido de cualquier agente antimicrobiano es indeseable.

La respuesta natural por los seres humanos a cualquier infección es la producción de anticuerpos de la clase IgG dirigidos contra infecciones sistémicas e IgA de secreción dirigida contra infecciones de la membrana mucosa, incluyendo la cavidad oral, el tracto digestivo y el tracto genitourinario. Como el sistema inmune no está maduro para producir anticuerpos en el recién nacido, la capacidad de usar una fuente extraña de inmunoglobulinas es un objetivo deseable en el caso del tratamiento y profilaxis en bebés recién nacidos.

Las fuentes extrañas convencionales de anticuerpos policlonales a granel se obtienen de suero de mamíferos después de que se haya inmunizado al mamífero con un microbio específico. Estos anticuerpos policlonales son antigénicos en sí mismos y por lo tanto son inadecuados para una aplicación a largo plazo en seres humanos. La producción de anticuerpos anti-IgG causará la pérdida de actividad de la IgG. IgY administrada por vía oral no provoca ningún anticuerpo anti-IgY. Por tanto IgY no perderá actividad incluso después de que se haya usado durante un largo período. La producción de anticuerpos IgG requiere una gran cantidad de animales, que tienen que sangrarse repetidamente. Por tanto, existen objeciones éticas y de protección animal al uso de IgG.

Además de los bebés prematuros, los bebés recién nacidos y los bebés que tienen un sistema inmune inmaduro, también son otros pacientes que necesitan tratamientos nuevos y mejorados. Hay por ejemplo pacientes que padecen inmunodeficiencia temporal o enfermedades de inmunodeficiencia tales como SIDA.

Yoshinori Mine et al (Chicken egg yolk antibodies as therapeutics in enteric infectious disease: a review, J Med Food, Vol. 5, nº 3, 2002, páginas 159-167) describe el uso de anticuerpos de la yema del huevo de pollo en el tratamiento de infecciones entéricas, tales como las causadas por Escherichia coli. La diarrea se ha tratado por ejemplo en niños.

Marquardt Ronarld R. et al (Passive protective effect of egg-yolk antibodies against enterotoxigenic Escherichia coli. K88+infection in neonatal and early-weaned piglets, FEMS Immunol Med Microbiol, vol. 23, 1999, páginas 283-288) describe el uso de IgY de huevos de pollo en el tratamiento de Escherichia coli en crías de cerdo neonatas y destetadas tempranamente.

Ninguno de estos documentos menciona el tratamiento de bebés neonatos o pacientes inmunodeficientes, o el tratamiento de infecciones causadas por Enterobacter cloacae.

Sumario de la invención

En vista de los inconvenientes asociados con los métodos de la técnica anterior para el tratamiento y profilaxis de infecciones entéricas en bebés recién nacidos, bebés prematuros, bebés que tienen un sistema inmune inmaduro, pacientes que padecen inmunodeficiencia temporal y enfermedades de inmunodeficiencia tales como SIDA, existe una necesidad de un método nuevo y mejorado para el tratamiento y profilaxis de dichas infecciones.

La presente invención se refiere a un nuevo método para el tratamiento y profilaxis de dichas infecciones entéricas, que sea tanto seguro como eficaz. Esto se consigue usando IgY dirigido contra bacterias entéricas, y en particular contra Enterobacter cloacae, y Candida albicans, que se han obtenido de la yema del huevo de aves, que se han hiperinmunizado con un antígeno (=microbio) para estimular la producción de inmunoglobulinas (IgY) contra este microbio.

El modo convencional para tratar dichos pacientes con infecciones entéricas previamente ha sido usando antibióticos. Este modo tiene varias desventajas como se ha mencionado anteriormente. Los estudios intensivos de los solicitantes de los problemas relacionados con el tracto gastrointestinal les han conducido al sorprendente descubrimiento de que, debido a las propiedades únicas de los bebés recién nacidos y bebés prematuros con respecto a su tracto gastrointestinal y sistema inmune, un tratamiento muy eficaz de infecciones entéricas en bebés recién nacidos, bebés prematuros y bebés que tienen un sistema inmune inmaduro puede conseguirse usando IgY aviar dirigida contra bacterias entéricas. Nadie ha considerado previamente esta posibilidad.

La presente invención también se refiere a un producto farmacéutico de huevos de aves que contienen inmunoglobulina o una fracción de la misma, que puede combinarse con otras preparaciones o compuestos farmacéuticos para uso simultáneo, separado o secuencial en la profilaxis o terapia de infecciones gastrointestinales en bebés recién nacidos.

La presente invención se refiere adicionalmente a un producto de IgY farmacéutico que incluye un agente nutricional tal como leche humana o un sustituto de la misma. La presente invención también pertenece a un método de profilaxis o terapia que incluye la administración de IgY junto con dicho agente nutricional.

La presente invención se refiere adicionalmente a un producto de IgY farmacéutico que incluye un agente tamponante. La presente invención también se refiere a un método de profilaxis o terapia que incluye la administración de IgY junto con dicho agente tamponante.

La presente invención se refiere a la profilaxis o terapia de todos los tipos de infecciones en bebés recién nacidos, bebés prematuros, y bebés que tienen un sistema inmune inmaduro, pacientes que padecen inmunodeficiencia temporal y enfermedades de inmunodeficiencia tales como SIDA. La infección puede ser cualquier infección causada por un antígeno tal como una bacteria, virus, hongo o parásito, que son infecciones en general, preferiblemente infecciones bacterianas, más preferiblemente infecciones entéricas y mucho más preferiblemente infecciones causadas por Enterobacter cloacae y Candida albicans.

Descripción detallada de la invención

El bebé humano en los primeros seis meses de vida es particularmente vulnerable a diarrea. La vulnerabilidad a procesos diarreicos está asociada con el estado de desarrollo del tracto gastrointestinal, no solamente de sus procesos digestivos y de absorción sino también de su sistema de defensa local único y elaborado, compuesto por elementos tanto inmunes como no inmunes. La protección de una enfermedad entérica, y de sensibilización a antígenos de los alimentos es una función de la integración de la secreción de ácido gástrico y biliar, actividad motora intestinal y mecanismos inmunes locales. El desarrollo de estas funciones se controla por un programa específico de especie, en el que el potencial para el desarrollo acelerado es muy limitado.

Un bebé recién nacido difiere de muchos modos esenciales de niños mayores y adultos. Como se ha mencionado anteriormente, el sistema inmune, especialmente con respecto a las inmunoglobulinas derivadas de células B, es muy inmaduro en los bebés recién nacidos, y tienen que depender de las inmunoglobulinas que se han transportado a ellos desde la madre a través de la placenta. Las inmunoglobulinas están casi totalmente ausentes en bebés nacidos prematuramente antes de la 32ª semana de embarazo.

La presente invención se basa en el descubrimiento de que IgY anti-Enterobacter tiene una capacidad inesperadamente buena de curar a los bebés recién nacidos prematuramente que tienen una mala capacidad de combatir infecciones debido a su sistema inmune inmaduro. La cantidad de ácido gástrico, que es un factor importante en la protección contra bacterias en el canal intestinal, es baja en bebés recién nacidos. El efecto inesperadamente bueno de la presente invención se debe probablemente al pH relativamente elevado en el estómago de los recién nacidos, es decir, aproximadamente 2-4. El pH normal del estómago, es decir, aproximadamente 1, probablemente de otro modo habría inactivado la IgY.

IgY es el anticuerpo de pollo que corresponde a IgG de mamífero. IgY consta de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas y tiene un peso molecular de aproximadamente 180000 Da. IgY se transporta de forma activa desde la gallina al huevo y la yema del huevo, que por tanto contiene elevadas concentraciones de IgY.

Una yema de huevo contiene aproximadamente 100 - 200 mg de anticuerpos IgY. La mayoría de los humanos consume regularmente ^{1}/_{2} - 1^{1}/_{2} huevo por día y ha conseguido tolerancia frente a proteínas de los huevos (incluyendo la inmunoglobulina (IgY)). Estos pacientes no obtendrán ninguna reacción alérgica cuando se traten con IgY. Por tanto, no existe riesgo de una respuesta alérgica cuando se trata a estos pacientes con IgY. Sin embargo, los pacientes con alergia al huevo conocida no deben tratarse con IgY. Una dosis del orden de 2 mg de IgY probablemente sería suficiente para conseguir los efectos profilácticos o de cura deseados.

Las gallinas, que se han inmunizado con microbios, responden produciendo anticuerpos específicos, policlonales contra el microbio. Los anticuerpos pueden purificarse de la yema del huevo. Varios estudios in vitro muestran que infecciones bacterianas, virales y fúngicas pueden prevenirse con IgY. Muchos estudios también han demostrado que la administración peroral de IgY específica se usa satisfactoriamente para tratar infecciones bacterianas y virales en animales.

En comparación con anticuerpos policlonales de mamífero IgY reacciona con diferentes epítopos en el antígeno que los anticuerpos de mamífero. Esto da acceso a un diferente repertorio de anticuerpos que el anticuerpo de mamífero. El modo de acción del anticuerpo específico está relacionado con la cantidad de organismos presentes en un momento dado. Se apreciará que hay una correlación molecular directa entre las entidades de anticuerpo que se unen a cada microbio y las cantidades de microbios presentes. El nivel de dosis también estará relacionado con el área superficial total del tejido afectado y los parámetros biológicos que afectan a las proporciones "de eliminación".

Cuando tiene que administrarse la inmunoglobulina por vía oral, preferiblemente contendrá un agente tamponante para evitar la desactivación a valores bajos de pH que puede opcionalmente administrarse en forma de un complemento nutricional.

Los anticuerpos IgY también tienen propiedades bioquímicas que los hacen ventajosos sobre IgG para inmunoterapia peroral: Ni activan el sistema del complemento humano ni reaccionan con factores reumatoides, anticuerpos humanos anti-IgG de ratón (HAMA) o receptores Fc humanos. Todos son activadores celulares bien conocidos y mediadores de la inflamación.

Como IgY es un componente de la dieta normal no hay riesgo de reacciones tóxicas en el paciente, excepto para los que tienen una alergia conocida a los huevos.

La inmunoglobulina del huevo se clasifica como IgY aviar que es similar a la IgA de secreción de mamífero, y por lo tanto una parte natural del entorno epitelial mucoso.

Uno de los objetos de acuerdo con la invención es proporcionar una composición farmacéutica de huevos de ave que comprende inmunoglobulina a una fracción de la misma para su uso en la profilaxis o terapia de infecciones en el bebé recién nacido.

Como se ha indicado anteriormente, las infecciones en bebés recién nacidos pueden atribuirse a una multiplicidad de factores, incluyendo exposición a largo plazo a antibióticos, que altera el equilibrio normal de la microflora intestinal. La preparación se diseñará para restituir el equilibrio normal de la microflora de los bebés recién nacidos. Las formulaciones de acuerdo con la presente invención pueden usarse como alternativa o suplemento a dichos tratamientos.

De acuerdo con una realización básica de la presente invención, mezclando IgY de acuerdo con la presente invención con cualquier vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable, se obtiene una composición farmacéutica o medicamento. El medicamento que contiene IgY puede formularse como un polvo secado por congelación o liofilizado, una solución, una gragea, un comprimido o como una cápsula. Este medicamento farmacéutico se administra preferiblemente en una forma adecuada para administración oral, junto con cualquier otro vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En otra realización, el medicamento farmacéutico de acuerdo con la presente invención se formula como una formulación de liberación controlada o sostenida.

De acuerdo con otra realización de la presente invención, la IgY puede administrarse sin ningún diluyente convencional o receptor en un agente nutricional tal como leche humana o un sustituto de la misma.

Durante los experimentos, en la presente invención se ha descubierto que la composición de leche humana e IgY, administrada como una emulsión, protege a la IgY que conserva su actividad. Se cree que esto se debe a la emulsión que se forma entre IgY y la leche. Esto también puede ser un efecto de la capacidad tamponante de la leche, que potencia la vida de la IgY.

Una realización de la presente invención se refiere a un método de profilaxis o tratamiento de bebés recién nacidos que tienen un pH en sus estómagos por encima de 1,5, particularmente entre 1,5 y 4. Este método comprende administrar IgY, que se origina de un huevo de un ave hiper-inmunizada con un microbio, al bebé. El método se refiere particularmente a la profilaxis o tratamiento de bebés prematuros, y más particularmente a bebés que tienen un peso por debajo de 2500 g.

En la presente solicitud se han usado diferentes términos que se definirán a continuación.

Por las expresiones "inmunoglobulina" o "fragmento de una inmunoglobulina" se entiende un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo, o precursor de anticuerpo capaz de unirse a un microbio específico o fragmento del mismo para volverlo no patogénico.

El producto farmacéutico de acuerdo con la presente invención también puede usarse junto con, o incluir, un agente antimicrobiano del tipo usado en terapia convencional de infecciones de los bebés recién nacidos.

Los productos y métodos de IgY para la profilaxis o tratamiento de acuerdo con la presente invención han estado funcionando en pacientes que padecen inmunodeficiencia temporal, por ejemplo, pacientes inmunosuprimidos con leucemia que se han tratado satisfactoriamente con IgY anti-candida. Dicha administración se refiere a aplicación oral para prevenir o tratar infecciones de candidiasis oral y faríngea causadas por Candida albicans. Dicho tipo de administración para el propósito de prevención o tratamiento de infecciones orales y faríngeas se describe en otra solicitud presentada previamente por los mismos inventores que no es parte de la materia de la presente invención. Sin embargo, estudios previos de administración de IgY anti-candida a pacientes inmunosuprimidos para retirar candida del canal gastrointestinal para evitar infecciones entéricas e infecciones en otras partes del cuerpo, tales como la vagina, parecen prometedores. Para tratar infecciones entéricas, como en el caso de IgY anti-Enterobacter, la IgY anti-candida tiene que tamponarse o combinarse con un agente nutricional de acuerdo con la presente invención, si no se administra a un bebé recién nacido o nacido prematuramente. Por tanto, la presente invención también se refiere a la profilaxis o tratamiento de pacientes con inmunodeficiencia temporal y enfermedades de inmunodeficiencia tales como SIDA.

Ejemplos Preparación de Enterobacter cloacae

Se usó Enterobacter cloacae aislada de heces de bebés recién nacidos infectados en un experimento in vitro para demostrar el potencial profiláctico de la inmunoglobulina del huevo aislada de gallinas domésticas hiper-inmunizadas con antígeno Enterobacter cloacae.

Las bacterias se cultivaron en matraces de 500 ml que contenían 100 ml de glucosa al 2%, base de nitrógeno de levaduras al 0,15%, sulfato amónico al 0,5% suplementado, cuando fue necesario, con aminoácidos. Los matraces se agitaron a 200 r.p.m. en un incubador rotatorio a 37ºC durante 24 horas.

Preparación de inmunoglobulina IgY anti-Enterobacter cloacae

Se lavó una suspensión de Enterobacter cloacae inactivada con formalina en solución salina y se secó por congelación en ampollas; 2,0 x 10^{8} células bacterianas por ampolla. Dos veces a la semana, se realizaron inoculaciones por vía intramuscular en gallinas domésticas, usando 1,0 ml de agua purificada para resuspender cada ampolla. Las yemas de los huevos recogidas de las gallinas hiper-inmunizadas se analizaron para determinar el pico del título del anticuerpo usando un ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas) específico para IgY contra Enterobacter cloacae.

Después de 3 a 4 semanas, cuando se hubo conseguido el pico del título, se recogieron las yemas de los huevos por separación de la clara del huevo y retirando los contenidos del saco vitelino usando una jeringa hipodérmica. La fracción de inmunoglobulina se purificó usando un patrón industrial de un equipo de CO_{2} supercrítico para disolver el lípido. Dejando la inmunoglobulina policlonal proteica en un estado purificado. La fracción de inmunoglobulina se diluyó usando agua destilada a una concentración de 10 mg/ml y se liofilizó en bandejas. Esta solución se usó para evaluar el potencial profiláctico de la IgY anti-Enterobacter indicada a continuación en el ejemplo Tratamiento de bebés recién nacidos con IgY anti-Enterobacter.

Ensayo de adhesión celular

La adhesión a las células epiteliales de la mucosa se considera la fase principal en una infección. En este ejemplo se usaron células epiteliales y pseudomonas aeruginosa (como representante para bacterias) para evaluar la adhesión.

Se lavaron células recientes cultivadas durante 24 horas por centrifugación en PBS, se resuspendieron en PBS y se mezclaron con medio que contenía IgY de huevos de gallinas inmunizadas con pseudomonas o IgY de gallinas no inmunizadas a una proporción de 100:1 o sin IgY y se incubaron a 37ºC durante 2 horas. Después de la incubación, se filtró el cultivo a través de un filtro de 45 gm para retirar cualquier célula no adherida, se lavó en PBS y se resuspendió.

La adherencia se evaluó por examen microscópico a 400 aumentos usando una rejilla micrométrica en fase para facilitar el recuento exacto. La adherencia se expresó como un porcentaje de células con bacterias pseudomonas aeruginosa visiblemente adherentes.

Los resultados mostraron que la adhesión de P. aeruginosa a las células epiteliales se redujo en más del 50% en el caso de bacterias tratadas con inmunoglobulina de gallinas inmunizadas, en comparación con bacterias no tratadas y bacterias tratadas con extracto de huevo normal.

Los anteriores experimentos in vitro demuestran que fracciones de inmunoglobulina purificadas extraídas del saco vitelino de los huevos puestos por gallinas previamente hiper-inmunizadas con antígeno de P. aeruginosa inhiben la adhesión a células epiteliales. Estos experimentos posibilitan que se concluya que puede usarse la inmunoglobulina de huevo específica en la profilaxis o terapia de infecciones en los bebés recién nacidos.

Tratamiento de bebés recién nacidos con IgY anti-Enterobacter

Las infecciones causadas por Enterobacter cloacae son extremadamente peligrosas para bebés prematuros. De acuerdo con la bibliografía el 20 - 50% de los bebés prematuros de este peso, que obtienen una infección con Enterobacter cloacae, morirán o les quedarán secuelas graves.

En el experimento se usó IgY anti-Enterobacter para tratar bebés prematuros de menos de 2500 g, que se habían infectado por Enterobacter cloacae. A diez bebés se les dio diariamente IgY con un título elevado específico contra Enterobacter en leche humana. El tratamiento comenzó tan pronto como el cultivo de las heces o sangre dieron positivo para Enterobacter cloacae. En nueve de estos pacientes se erradicó Enterobacter cloacae de sus heces. Solamente un paciente, que ya tenía bacteremia con Enterobacter antes de que comenzara el tratamiento, continuó teniendo cultivos de heces y sangre positivos para Enterobacter durante casi un mes. Ninguno de los pacientes murió y ninguno tuvo ninguna secuela. Ninguno de ellos desarrolló ninguna alergia a los huevos.

La invención no se limita a las realizaciones descritas anteriormente que pueden modificarse y/o variarse sin alejarse del alcance de la invención.

Claims (13)

1. Uso de IgY que se origina de un huevo de un ave hiper-inmunizada con Enterobacter cloacae para la producción de un compuesto farmacéutico para el tratamiento y/o prevención de infecciones entéricas en bebés recién nacidos, bebés nacidos prematuramente, bebés que tienen un sistema inmune inmaduro, pacientes que padecen inmunodeficiencia temporal y enfermedades de inmunodeficiencia tales como SIDA.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la IgY se formula como un polvo secado por congelación o liofilizado, una solución, una emulsión, una gragea, un comprimido o como una cápsula junto con cualquier otro vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

3. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el compuesto farmacéutico comprende adicionalmente un agente tamponante.

4. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende adicionalmente un agente nutricional.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, en el que el agente nutricional o agente tamponante es leche humana o un sustituto de la misma.

6. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la infección entérica es una infección intestinal.

7. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dichos bebés recién nacidos o bebés prematuros tienen un peso por debajo de 2500 g.

8. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dichos bebés recién nacidos tienen un valor de pH entre 1,5 y 4 en su estómago.

9. Una composición farmacéutica que comprende IgY que se origina de un huevo de un ave hiper-inmunizada con Enterobacter cloacae.

10. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9, en la que la composición farmacéutica se formula como un polvo secado por congelación o liofilizado, una solución, una emulsión, una gragea, un comprimido o como una cápsula junto con cualquier otro vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

11. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10, en la que el compuesto farmacéutico comprende adicionalmente un agente tamponante.

12. La composición farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-11, que comprende adicionalmente un agente nutricional.

13. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11 ó 12, en la que el agente nutricional o agente tamponante es leche humana o un sustituto de la misma.