CN105120896B

CN105120896B - 多重抗药性大肠杆菌特异性抗体

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Publication number: CN105120896B
Application number: CN201480004831.4A
Authority: CN
Inventors: E·纳吉; G·纳吉; V·西亚尔托; Z·毛焦里奇; I·米尔基娜; L·瓜查利亚; A·巴达罗; G·曹纳; J·卢卡谢维奇
Original assignee: Arsanis Biosciences GmbH
Current assignee: Janssen Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2013-01-17
Filing date: 2014-01-17
Publication date: 2019-11-12
Anticipated expiration: 2034-01-17
Also published as: AU2018204437A1; ZA201503282B; DK2945651T3; PT2945651T; IL273685A; MX2019001795A; JP2019068842A; CA2895327A1; TR201807924T4; EP3167903B1; RU2015134413A; JP6643454B2; IL273685B2; EP2945651A1; EP2945651B1; US20210162034A1; US11529405B2; ES2718051T3; MX2015008653A; CA2895327C

Abstract

本发明主题涉及与多重抗药性(MDR)大肠杆菌菌株O25b抗原特异性结合的分离抗体，其医疗和诊断用途，抗体的制备方法，包括在抗体制备中使用的分离核苷酸序列、质粒和宿主细胞；进一步涉及识别所述特异性抗体的分离表位。

Description

多重抗药性大肠杆菌特异性抗体

技术领域

本发明涉及一种与多重抗药性(MDR)大肠杆菌菌株的LPS O25b抗原特异性结合的抗体。

背景技术

脂多糖(LPS)是大肠杆菌病原体表面上数量最多的抗原。一般说来，LPS具有三个结构部分：I)脂类A(亦称为内毒素)，ii)核心寡糖，及iii)O-抗原。后者由3-6个糖的重复亚单位组成(取决于血清型)。脂类A和核心OS在一种单个肠道杆菌种中是相对地非常保守的，但是，抗体接近它们是有限制的。另一方面，O-抗原是极易接近的，但是，其结构多样(在大肠杆菌中，有大约180种不同的O-型)。

O-抗原的抗体能够与大肠杆菌表面结合，因此，它们用于诊断(如流行病学研究的O-型)以及作为治疗措施。但是，由于结构变化多样，O-抗原特异性抗体的广谱保护非常麻烦。

大肠杆菌引起的肠胃外感染很常见，导致发病率和死亡率较高。最近发现的大肠杆菌多重抗药性(MDR)菌株导致的感染占大肠杆菌感染的很大一部分。

由于这些MDR菌株已经进化为对临床使用的大多数抗生素具有耐药性，因此，针对它们的治疗方案很受限制。因此，替代的治疗方案，如单克隆抗体(mAbs)被动免疫法在将来具有良好的前景。

过去几年里，出现了定义明确的MDR大肠杆菌克隆谱系ST131-O25b:H4，该谱系导致的感染占所有肠胃外大肠杆菌感染的大约10％，以及占MDR大肠杆菌感染的大约一半(Peirano et al.Int J Antimicrob Agents 2010Apr；35(4):316-21；Rogers et al.JAntimicrob Chemother 2011Jan；66(1):1-14；Woodford et al.FEMS MicrobiolRev2011Sep；35(5):736-55.)。属于该谱系的菌株表现出有限的异质性，因此，可认为与抗原库非常类似。属于这一簇的大多数菌株表达O25b抗原，因此，采用编码合成此抗原的酶的特异性基因(LPS合成位点内)来鉴定此克隆(Clermont et al.J Antimicrob Chemother2008May；61(5):1024-8.)。或者，可以利用O25分型血清的凝集作用，但是，正如基因差异所示，这种谱系的O抗原(因此，被称为O25b)与标准的O25抗原不同。但是，O25分型血清无法区分非-MDR O25和MDR O25b克隆。

Rogers et al.(J Antimicrob Chemother 2011Jan；66(1):1-14)描述了利用三个主要特点，即其血清组(O25b)、其系统发育组(B2)和其ST(ST131)检测大肠杆菌O25b-ST131菌株。这三个特点被公开用于协助检测。描述了各种分子技术，即MLST、基于PCR的快速检测法、重复序列PCR和PFGE。包括各种免疫球蛋白的多克隆抗血清(抗O25a菌株)用于测定O25抗原，不区分亚型。

Jadhav et al.(PLOS ONE 2011；6(3):e18063)描述了对O25b亚群呈阳性的菌株的毒性特点和基因亲和力，所述O25b亚群与B2-O25b-ST131-CTX-M-15有毒的/多重抗药性型连接。对人类临床分离菌进行了分析，并划分为各种血清型，得到了毒性标记谱。采用抗O-抗原多克隆抗血清-O1至O173，通过血清型鉴定了O25阳性菌株。O25阳性菌株进一步通过靶向rfbO25b亚群基因位点的等位基因特异性PCR进行基因分型。

Mora et al.(Int.J.Antimicrobial Agents 2011；37(1):16-21)描述了产CTX-M-14大肠杆菌临床分离菌中的某些克隆组的出现，其中有O25b：H4-B2-ST131。O型用特异性O抗血清处理(多克隆)。

Clermont et al.(J Antimicrob Chemother 2008May；61(5):1024-8)公开了O25b ST131大肠杆菌的等位基因特异性pabB PCR试验。

Szijarto et al,(FEMS Microbiol Lett 2012；332:131-6)描述了以LPS分子核心结构为基础的大肠杆菌分离菌的分子分型。分离菌的核心类型采用分别靶向核心操纵子中的基因和对R1-4和K-12核心类型具有特异性的引物，采用PCR进行测定。

发明内容

本发明的目的是提供特异性改善的大肠杆菌MDR菌株的抗体，用于预防或治疗由携带LPS O25b的菌株引起的大肠杆菌感染。本发明进一步的目的是提供能够快速、可靠的诊断MDR大肠杆菌的手段和方法。

本发明的目的通过本发明的主题实现。

根据本发明，提供了一种与多重抗药性(MDR)大肠杆菌菌株的O25b抗原特异性结合的分离抗体。

特别地，所述抗体是单克隆抗体。

特别地，所述抗体只与O25b抗原特异性结合，或与O25a和O25b抗原共享的表位交叉特异性结合。

根据本发明一个具体的方面，例如，所述抗体与O25b和O25或O25a抗原交叉特异性结合的亲和力相等、大于相等、类似或不同。

特别地，相对大肠杆菌的O25a抗原，本发明的抗体优选与O25b抗原结合，或与这种两种抗原结合的亲和力至少相等。

根据本发明的一个具体实施例，抗体与O25b抗原结合的亲和力比与O25a抗原结合的亲和力至少大2倍，特别是结合O25b或O25a时，两者的亲和力和/或亲合力差别至少是两倍，或至少是三倍，至少是四倍，至少是五倍，或甚至至少是10倍。

根据本发明的一个具体方面，与O25b特异性结合的特征在于，采用免疫测定法，优选免疫印迹法、ELISA或其它免疫学方法进行测定时，与O25b抗原结合的亲和力大于抗O25或O25a大肠杆菌菌株的多克隆血清与O25b抗原结合的亲和力。亲和力更高，特别地相差至少两倍，或至少三倍、至少四倍、至少5-倍，或甚至至少10-倍。

特别地，本发明抗体靶向的O25b抗原在一个或多个，及特别是在大多数ST131菌株中普遍存在。

特别地，抗体识别的表位存在于胶囊化(encapsulated)和非胶囊化ST131-O25b:H4菌株的表面上，如突变株的表面上。

根据本发明进一步的方面，抗体具有全长单克隆抗体或其抗体片段的结合位点，包括至少一个掺入结合位点的抗体域，其中，抗体优选是选自鼠科动物抗体、美洲驼马(lama)抗体、兔抗体、羊抗体、牛抗体、嵌合抗体、人源化的或人抗体、重链抗体、Fab、Fd、scFv和单域抗体，如VH、VHH或VL，优选是人IgG抗体或鼠源性IgG抗体。

根据本发明进一步的方面，抗体结合O25b抗原的亲和力Kd小于10^-7M，优选小于10^-8M，特别是在单体状态。

根据本发明进一步的具体方面，抗体在包含活的野生型MDR大肠杆菌菌株的血清样品中显示具有体外杀菌效用。

根据本发明进一步的具体方面，抗体在体外刺激吞噬细胞吸收活的野生型MDR大肠杆菌菌株。

根据本发明进一步的具体方面，所述抗体与命名为8D5-1G10或8D10-C8的抗体结合的表位相同。

根据本发明进一步的具体方面，所述抗体包括与命名为8D5-1G10或8D10-C8的抗体相同的结合位点。

根据本发明的具体方面，本发明提供特异性结合到多重抗药性(MDR)大肠杆菌菌株的O25b抗原的分离单克隆抗体，其包括抗体8D5-1G10，或源自抗体8D5-1G10，或抗体8D5-1G10的功能活性变体的抗原-结合位点，优选其中所述抗体8D5-1G10具有以下特点：

a)以保藏号DSM 26763保藏的宿主细胞产生的抗体轻链可变区；与/或

b)以保藏号DSM 26762保藏的宿主细胞产生的抗体重链可变区；

c)或采用(a)与/或(b)的功能活性变体。

根据具体的实施例，所述抗体是8D5-1G10抗体或其功能活性变体。

本发明其它抗体在此列出，命名为6D1-1B2和8A1-1G8。这些抗体是具有类似8D5-1G10的CDR序列的克隆，在此本发明中亦理解为功能活性CDR变体。

特别地，命名为8D5-1G10的抗体由抗体轻链和抗体重链组成，抗体轻链包括以保藏号DSM 26763保藏的大肠杆菌宿主细胞中包含的质粒编码序列所编码的可变区，抗体重链包括以保藏号DSM 26762保藏的大肠杆菌宿主细胞中包含的质粒编码序列所编码的可变区。

根据本发明进一步的具体方面，抗体源自8D5-1G10抗体，其中

-抗体轻链的可变区是通过以保藏号DSM 26763保藏的大肠杆菌宿主细胞中包含的质粒进行编码，或其功能活性变体；与/或；

-抗体重链的可变区是通过以保藏号DSM 26762保藏的大肠杆菌宿主细胞中包含的质粒进行编码，或其功能活性变体。

根据本发明进一步的具体方面，所述抗体源自一个抗体，其中

-抗体轻链的可变区是通过以保藏号DSM 26763保藏的宿主细胞产生，或其功能活性变体；与/或

-抗体重链的可变区是通过以保藏号DSM 26762保藏的宿主细胞产生，或其功能活性变体。

根据本发明的另一个具体方面，本发明提供一分离的单克隆抗体，所述抗体与O25a和O25b抗原共享的表位特异性结合，以及所述抗体包括抗体8D10-C8，或源自抗体8D10-C8，或是抗体8D10-C8的功能活性变体的抗原结合位点，优选其中抗体8D10-C8的特征是：

a)以保藏号DSM 28171保藏的宿主细胞产生的抗体轻链可变区；与/或

b)以保藏号DSM 28172保藏的宿主细胞产生的抗体重链可变区；

c)或采用(a)与/或(b)的功能活性变体。

根据具体的实施例，抗体是8D10-C8抗体或其功能活性变体。

特别地，命名为8D10-C8的抗体由抗体轻链和抗体重链组成，抗体轻链包括保藏号DSM28171的大肠杆菌宿主细胞中包含的质粒编码序列所编码的可变区，抗体重链包括保藏号DSM 28172的大肠杆菌宿主细胞中包含的质粒编码序列所编码的可变区。

根据本发明进一步的具体方面，抗体源自8D10-C8抗体，其中

-抗体轻链的可变区是通过保藏号DSM 28171的大肠杆菌宿主细胞中包含的质粒进行编码，或其功能活性变体；与/或

-抗体轻链的可变区是通过保藏号DSM 28172的大肠杆菌宿主细胞中包含的质粒进行编码，或其功能活性变体。

-抗体轻链的可变区是通过保藏号DSM 28171的宿主细胞产生，或其功能活性变体；与/或

-抗体重链的可变区是通过保藏号DSM 28172的宿主细胞产生，或其功能活性变体。

具体地说，功能活性变体是CDR变体，例如，该变体包括CDR，更具体地是包括CDR环序列，含序列一致性至少60％，优选至少70％、80％或90％的氨基酸序列。

特别地，抗体源自这样的抗体，采用各自的CDR序列，或CDR突变体，包括功能活性的CDR变体，如一个CDR环内具有1、2或3个点突变。

具体地说，功能活性变体与母抗体在氨基酸序列中，优选在CDR中，至少有一个点突变不同，其中每个CDR氨基酸序列中点突变的数量是0、1、2或3个。

根据进一步的具体方面，本发明提供包含以下核苷酸序列的质粒：

A

-对保藏号DSM 26763的宿主细胞中包含的命名为8D5-1G10-LC的抗体轻链可变区进行编码；与/或

-对保藏号DSM 26762的宿主细胞中包含的命名为8D5-1G10-HC的抗体重链可变区进行编码；

或B

-对保藏号DSM 28171的宿主细胞中包含的命名为8D10-C8-LC的抗体轻链可变区进行编码；与/或

-对保藏号DSM 28172的宿主细胞中包含的命名为8D10-C8-HC的抗体重链可变区进行编码。

根据本发明进一步的具体方面，本发明提供一种表达盒，包括表达本发明抗体轻链与/或重链的编码序列，所述表达盒或编码序列源自选自由本发明质粒组成的群组中的质粒。

根据本发明进一步的具体方面，本发明提供一种制备本发明抗体的方法，其中宿主细胞采用本发明的质粒或表达盒转化。

根据本发明进一步的具体方面，本发明提供包含本发明质粒或表达盒的宿主细胞。

特别地，宿主细胞保藏号为

A

DSM 26763与/或DSM 26762；

或B

DSM 28171与/或DSM 28172。

具体的实施例涉及一种制备本发明抗体的方法，其中本发明的宿主细胞在一定条件下培养或保持，从而制备所述抗体。

根据本发明进一步的具体方面，本发明提供鉴定候选抗体的方法，包括：

(a)提供包含抗体或抗体产生细胞的样品；及

(b)对样品中的抗体或样品产生的抗体与命名为8D5-1G10或8D10-C8的抗体识别的表位的结合进行评价，其中抗体和表位之间的阳性反应鉴定该抗体为候选抗体。

(a)提供包含抗体或抗体产生细胞的样品；及

(b)对样品中的抗体或样品产生的抗体与ST131-O25b:H4菌株的O25b抗原及非-MDR大肠杆菌菌株的O25b抗原，或O25a抗原的结合进行评价，其中相对于O25抗原或O25a抗原，抗体与O25b抗原之间的特异性阳性反应鉴定该抗体为候选抗体。

特别地，候选抗体是一种候选保护性抗体，如用于治疗，或候选诊断抗体。

此外，根据本发明进一步的具体方面，本发明提供一种制备本发明抗体的方法，包括

(a)提供一种根据本发明鉴定的候选抗体；及

(b)制备一种候选抗体的单克隆抗体，或人源化抗体或人源抗体，或它们的衍生物，所述衍生物与候选抗体具有相同表位结合特异性。

根据本发明另一个具体方面，本发明提供一种制备本发明抗体的方法，包括

(a)采用命名为8D5-1G10或8D10-C8的抗体识别表位对非人动物进行免疫；

(b)从分离的B-细胞形成永生化细胞系；

(c)筛选b)中获得的细胞系，鉴定细胞系产生与表位结合的单克隆抗体；及

(d)产生所述单克隆抗体，或该抗体的人源化抗体或人源抗体，或它们的衍生物，该衍生物其与所述单克隆抗体具有相同表位结合特异性。

(a)采用ST131-O25b:H4菌株的O25b抗原对非人动物进行免疫，并分离产生抗体的B-细胞；

(b)从分离的B-细胞形成永生化细胞系；

(c)筛选细胞系，鉴定产生单克隆抗体的细胞系，相对于大肠杆菌的O25抗原或O25a抗原，所述单克隆抗体优选与O25b抗原结合；及

(d)产生所述单克隆抗体，或该抗体的人源化抗体或人源抗体，或它们的衍生物，该衍生物与所述单克隆抗体具有相同表位结合特异性。

根据本发明进一步的方面，本发明提供本发明抗体的医疗用途。具体地说，抗体提供用于处理承受MDR大肠杆菌感染风险或遭受MDR大肠杆菌感染的对象的用途，包括使对象服用有效剂量的抗体，限制对象的感染或使所述感染引起的病情好转，优选用于治疗或预防肾盂肾炎、第二次菌血症、脓毒病、腹膜炎、脑膜炎和呼吸机相关性肺炎。

特别地，抗体用于消灭MDR大肠杆菌，优选ST131-O25b:H4菌株，而不考虑该菌株表达的荚膜多糖。

根据具体的方面，本发明进一步提供一种处理方法，其中处理承受MDR大肠杆菌感染风险或遭受MDR大肠杆菌感染的对象，方法包括，使对象服用有效剂量的抗体，以限制对象的感染或使所述感染引起的病情好转，优选用于治疗或预防肾盂肾炎、第二次菌血症、脓毒病、腹膜炎、脑膜炎和呼吸机相关性肺炎的方法。

特别地，所述处理方法用于消灭MDR大肠杆菌，优选ST131-O25b:H4菌株，而不考虑菌株表达的荚膜多糖。

根据具体的一方面，采用本发明抗体的免疫疗法可以有效防御活细菌挑战，如各种动物模型中测定的挑战。

抗体可以特异性中和致命的内毒素血症。这种功能活性可以在合适的体内模型中(采用纯化LPS挑战)测定。

所述抗体在通过补体介导杀灭MDR大肠杆菌方面特别有效，例如，如体外血清杀菌试验(SBA)测定的那样，例如，杀灭细菌比对照样品(不加入抗体或不相关对照mAb)至少高20％。

所述抗体在通过抗体介导吞噬作用杀灭MDR大肠杆菌方面特别有效，例如，如体外调理吞噬杀菌试验(OPK)测定的那样，例如，输入细菌的吸收量比对照样品(不加入抗体或加入不相关对照mAb)至少高20％，或最终cfu数比对照样低20％。

所述抗体在通过中和内毒素功能杀灭MDR大肠杆菌方面特别有效，例如，如体外LAL试验所测定的那样，或Toll样受体4(TLR4)报告试验测定的那样，与对照样品(不加入抗体或加入不相关对照mAb)相比，内毒素活性下降至少20％。

根据一个具体实施例，抗体以肠胃外或粘膜制剂施用。

根据本发明进一步的方面，本发明提供本发明抗体的药物制剂，优选包括肠胃外或粘膜制剂，可选包含药学上可接受的载体或赋形剂。

根据本发明进一步的方面，本发明提供本发明抗体的诊断用途，用于检测或测定对象中表达LPS O25b抗原的MDR菌株导致的大肠杆菌感染，如上下尿路感染，包括膀胱炎或尿道炎，上行性或血源性肾盂肾炎，特别是糖尿病患者中的，以及菌血症、脓毒病、腹膜炎或肠道定植。

特别地，提供本发明所述用途的抗体，其中通过在体外用所述抗体接触对象的体液样品，测定所述对象的全身性MDR大肠杆菌感染，其中抗体的特异性免疫反应确定感染。

特别地，测试体液样品的特异性免疫反应，样品选自尿液、血液、血液分离物或血液培养、抽出物、唾液、插管患者灌洗液和大便。

特别地，本发明的诊断用途指的是根据临床标本中回收的纯大肠杆菌，体外测定大肠杆菌的血清型。

根据另一方面，本发明提供本发明抗体的诊断制剂，可选包含带标记的抗体与/或其它带标记的诊断试剂，如利用各自的靶抗原特异性识别抗体或抗体免疫复合物的试剂，与/或固定至少其中一种抗体和诊断试剂的固相。诊断制剂可以是组合物的形式提供或作为试剂盒部分提供，例如，包含各组分，如包括以下各项的组分：

a)诊断抗体制剂，与/或

b)其它诊断试剂，

与/或固定至少一种抗体和诊断试剂的固相，固相作为独立的组分，或作为以上a)与/或b)任一组分的载体。

本发明优选的诊断分析包括将本发明的抗体固定在固相上，例如，乳胶珠粒、金颗粒等，例如，通过利用待试样品得到的表达O25b抗原或游离(或分离的)O25b抗原的细菌抗体来测试凝集作用。

有些诊断分析可能涉及以不同特异性与/或亲和力与O25b与/或O25a结合的两种不同抗体，因此，可能区分O25b和O25a抗原。

根据本发明的一个具体方面，本发明提供伴随诊断，利用本发明的诊断或诊断方法，确定对象是否感染MDR大肠杆菌，以提供治疗这种感染的治疗基础，例如，采用免疫疗法，如采用本发明的抗体治疗。

根据本发明一个具体的方面，本发明提供一种灵敏的床边诊断，通过测定游离LPS，例如，根据活细菌数量受到限制的临床标本，诊断对象是否感染MDR大肠杆菌。这种分析的灵敏度尤其低于100ng LPS，优选低于10ng LPS。

根据本发明进一步的方面，本发明提供命名为8D5-1G10或8D10-C8的抗体识别的分离表位。所述表位由单一表位组成或包含表位变体的表位混合物组成，每个表位变体由命名为8D5-1G10或8D10-C8的特异性抗体识别。特别地，8D10-C8抗体的表位是O25b和O25a抗原上共享的且占优势地位的一个表位，因此，所述抗体被认为是交叉特异的，但是，优选与O25b抗原结合，至少是与O25a抗原结合相同。

根据本发明进一步的方面，本发明提供一种免疫原，包括：

(a)本发明的表位；

(b)可选其它与(a)中所述表位非天然相关的表位；及

(c)载体。

特别地，载体是药学上可接受的载体，优选包含缓冲物质与/或佐剂。

本发明的免疫原优选在疫苗配方中提供，优选肠胃外使用。

特别地，本发明的免疫原提供用于医疗用途，特别地通过施用有效剂量的所述免疫原处理对象，保护对象不被MDR大肠杆菌感染，或预防所述感染引发的疾病。

特别地，本发明的免疫原用于引发保护性的免疫应答。

根据本发明的一个具体方面，进一步提供一种处理承受MDR大肠杆菌感染风险的对象的方法，所述方法包括给对象施用有效剂量的免疫原，预防对象感染，尤其是预防病原性MDR大肠杆菌。

根据本发明的另一方面，本发明提供一种编码本发明抗体或本发明表位的分离核酸。

附图说明

图1：O25b-特异性(对O25a抗原具有或不具有交叉-反应性)mAbs对表达O25b、O25a或O2抗原的不同ST131:O25b菌株的表面染色；

图2：免疫印迹法中不同mAbs和O25兔子血清对纯化O25a和O25b LPS分子的反应性；

图3：(a):大肠杆菌O25b抗原重复单元的结构，(b)：大肠杆菌O25a(亦称为O25，有时为了比较，称为O25(a))重复单元的结构(Kenne et al,1985)；

图4：采用结合到乳胶珠粒上的mAb 8D5-1G10，通过凝集试验，检测表达O25b抗原的大肠杆菌菌株；

图5：采用结合到乳胶珠粒上的mAb 8D5-1G10，通过凝集试验，检测可溶的O25b抗原；

图6：采用O25b-特异性鼠源性mAbs，对小鼠进行被动免疫接种，应对随后的ST131:O25b临床分离菌引起的静脉内致死挑战，对其进行保护；

图7：O25b特异性mAbs介导的补体依赖性杀菌。

具体实施方式

本发明中使用的词语“抗体”指的是由抗体域组成或包括抗体域的多肽或蛋白质，抗体域理解为具有或不具有连接序列的免疫球蛋白的重链与/或轻链的恒定区与/或可变区。如果多肽包含β-桶状结构，而β-桶状结构由环序列连接的抗体域结构的至少两个β-链组成，则多肽理解为抗体域。抗体域可以是天然结构，或通过突变或衍生修饰，例如，修饰抗原的结合性质或任何其它性质，如稳定性和功能性，例如，与Fc受体FcRn与/或Fcγ受体结合。

本发明抗体具有与一个或多个抗原结合或所述抗原的一个或多个表位结合的特异性结合位点，特别是包括单一可变抗体域的CDR结合位点，如VH、VL或VHH，或一对可变抗体区的结合位点，如VL/VH对，包含VL/VH区对和抗体恒定域的抗体，如Fab、F(ab')、(Fab)2、scFv、Fv或全长抗体。

本发明所述“抗体”特别指的是包含单一可变抗体域或由单一可变抗体域组成的抗体格式，如VH、VL或VHH或可变与/或恒定抗体域的组合，带或不带连接序列或铰链区，包括可变抗体域对，如VL/VH对，包含VL/VH区对和恒定抗体域或由VL/VH区对和恒定抗体域组成的抗体，如重链抗体、Fab、F(ab')、(Fab)₂、scFv、Fd、Fv或全长抗体，例如IgG型(例如lgG1、lgG2、lgG3或lgG4亚型)、lgA1、lgA2、IgD、IgE或IgM抗体。词语“全长抗体”可用于指任何包括至少大多数Fc域及其它天然抗体单体中通常发现的其它域的任何抗体分子。本发明使用此术语用于强调具体的抗体分子并非抗体片段。

词语“抗体”应特别包括分离形式的抗体，如基本上不含其它针对不同靶抗原的抗体或包含抗体域的不同结构排列。但是，分离抗体可包含在组合制剂中，包含分离抗体，例如，与至少一种其它抗体，如具有不同特异性的单克隆抗体或抗体片段的组合。

词语“抗体”应适用于动物来源抗体，包括人类，如哺乳动物，包括人类、鼠科动物、兔子、山羊、美洲驼马、牛和马或鸟类，如母鸡。

词语“抗体”进一步适用于具有不同物种来源序列(如鼠科动物和人类序列)的嵌合抗体。

谈到抗体时使用的词语“嵌合”指的是，那些其中重链和轻链的每个氨基酸序列的一部分与源自特定物种的抗体或属于特定纲的抗体中的对应序列是同源，而链的其它部分与另一物种或纲的对应序列是同源。一般说来，轻链和重链的可变区模仿源自一种哺乳动物的抗体的可变区，而恒定区与源自另一种动物的抗体序列同源。例如，可变区源自目前已知的源，其容易地从非人宿主生物中获得的B-细胞或杂交瘤，以及与来源于如人细胞制剂的恒定区组合。

词语“抗体”进一步适用于人源化抗体。

谈及抗体时的词语“人源化”指的是具有抗原结合位点的分子，该抗原结合位点基本上源自非人类物种的免疫球蛋白，其中所述分子的其它免疫球蛋白结构是基于人类免疫球蛋白的结构与/或序列。抗原结合位点可以包括融合到恒定区上的完整可变区，或仅为接枝到可变区合适构架区上的互补决定区(CDR)。抗原结合位点可以是野生型或修饰的，例如，被一个或多个氨基酸替换修饰，优选经修饰后更接近人类免疫球蛋白。人源化抗体的某些形式保留了所有CDR序列(例如，人源化小鼠抗体，包含来自小鼠抗体的所有六个CDR)。其它形式则具有相对原抗体一个或多个被更改的CDR。

词语“抗体”进一步适用于人源抗体。

谈及抗体时使用的词语“人源”理解为包括源自人类种系免疫球蛋白序列的、具有可变区和恒定区的抗体。本发明的人源抗体包括并非由人类种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，体外随机或定点诱导突变或体内体细胞突变引入的突变体)，例如，在CDR中。人源抗体包括从人免疫球蛋白文库中分离的抗体，或从动物转基因得到的一个或多个人免疫球蛋白分离的抗体。

该词语特别适用于任何类别或子类别的抗体。根据其重链恒定区的氨基酸序列，抗体可以分为抗体IgA、IgD、IgE、IgG和IgM主类，这些主类中的几个类别可以进一步分为几个子类(同种型)，例如lgG1、lgG2、lgG3、lgG4、IgA和lgA2。

该词语进一步适用于单克隆或多克隆抗体，特别是重组抗体，重组抗体包括通过重组手段制备、表达、创造或分离的所有抗体和抗体结构，例如，源自动物的抗体，如哺乳动物，包括人类，包括来自不同来源的基因或序列，例如，嵌合抗体、人源化抗体或杂交瘤衍生抗体。进一步的实例涉及从经转化用于表达抗体的宿主细胞分离的抗体，或从重组体、抗体或抗体域组合文库分离的抗体，或通过其它涉及将抗体基因序列拼接到其它DNA序列上的方法制备、表达、创造或分离的抗体。

词语“抗体”还应理解为指的是抗体的衍生物，尤其是功能活性的衍生物。抗体衍生物理解为一种或多种抗体域或抗体与/或融合蛋白的任何组合，其中抗体的任何区可在一种或多种其它蛋白，如其它抗体的任何位置融合，如结合包含CDR环、受体多肽，还有配体、支架蛋白、酶、毒素等的结构。抗体的衍生物可通过各种化学方法，如共价偶联、静电相互作用、二硫键连接等与其它物质缔合(association)或结合(binding)。与抗体结合的其它物质可以是脂类、糖类、核酸、有机和无机分子或它们的任何组合(例如PEG、药物前体或药物)。在具体实施例中，抗体是包含允许与生物学上接受的化合物特异性相互作用的其它标记的衍生物。本发明可以使用的标记并没有特别的限制，只要标记对靶向抗体的结合没有任何不良影响或不良影响可以忍受即可。合适的标记实例包括His-标记、Myc-标记、FLAG-标记、Strep-标记、Calmodulin-标记、GST-标记、MBP-标记和S-标记。在本发明的另一个具体实施例中，抗体是包含标记的衍生物。词语“标记”指的是可以检测的化合物或组合物，其与抗体直接或间接结合，从而产生“标记的”抗体。标记可以是本身被检测到的，例如，放射性同位素标记或荧光标记，或者，在酶标记时，是可以催化可被检测到的底物化合物或组合物发生化学变化。

本发明优选的衍生物在抗原结合方面是功能活性的，优选具有抗MDR大肠杆菌和其内毒素的效力，例如，正如SBA、OPK或LAL试验中测定的那样，或者应对细菌挑战或中和致命的内毒素血症。

源自母抗体或抗体序列的抗体尤其理解为例如，通过在硅片上(in silico)或重组工程或通过化学衍生作用或合成得到的突变体或变体。

特别是，源自本发明抗体的抗体可以包括至少一个或多个CDR区，或其与O25b抗原结合不同的功能活性的CDR变体，例如，与O25b抗原特异性或选择性结合。

词语“抗体”还应理解为指的是抗体的变体。

词语“变体”应尤其指的是抗体，例如，通过突变方法得到的突变抗体或抗体片段，尤其是通过删除、交换、引入插入特异性抗体氨基酸序列中或区域中或化学衍生氨基酸序列，如通过亲和力成熟技术，如在恒定区中操纵抗体稳定性、效应子功能或半衰期，或在可变区中，改善抗原结合性质。可以采用人们熟悉的任何突变方法，包括所需位置的点突变，如通过随机化方法得到。在某些情况下，随机选择位置，例如，采用任何可能的氨基酸或选择优选的氨基酸来随机化抗体序列。词语“突变”指的是本技术领域认可的改变多核苷酸或多肽序列的任何方法。优选的突变类型包括易错PCR突变、饱和突变或其它定点突变。

词语“变体”应特别包括功能活性变体。

本处使用的抗体的“功能活性变体”指的是，例如，通过插入、删除或替换一个或多个氨基酸，例如，通过重组方法或化学衍生氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基，或核苷酸序列中的核苷酸，或在序列的任一端或两个远端序列，对序列进行修饰得到的序列，所述修饰并不影响所述序列的活性(尤其是不会损失)。

若为对选定靶抗原具有特异性的结合位点，则抗体的功能活性变体将仍然具有预定的结合特异性，虽然这可能被更改，例如，更改对特异性表位的精细特异性、亲和力、亲合力、Kon或Koff率等。特别是，本发明抗体的功能活性变体具有结合O25b抗原的效力及相对大肠杆菌其它抗原优选特异性或选择性地结合O25b抗原，例如，与大肠杆菌的O25b抗原结合而不与O25a抗原结合，或者不显著与O25a抗原结合，或与O25b和O25a两种抗原交叉特异性结合，但不与大肠杆菌的其它抗原结合。

功能活性变体可以通过以下方法得到：例如通过改变母抗体的序列，例如，包含与命名为6D1-1B2、8A1-1G8、8D5-1G10或8D10-C8的抗体相同的结合位点的抗体，但除结合位点之外，抗体域内有改动，或源自母抗体，所述母抗体是6D1-1B2、8A1-1G8、8D5-1G10或8D10-C8抗体中的任何一个抗体，通过改变结合位点，但是这种改变并不对抗原结合造成不良影响，并且优选与母抗体具有类似的生物活性，包括特异性或选择性地结合O25b抗原的能力，例如，结合大肠杆菌的O25b抗原，不结合O25a抗原，或者不显著与O25a抗原结合，或与O25b和O25a两种抗原交叉特异性结合，但不与大肠杆菌的其它抗原结合。任选地，所述功能活性变体可以进一步包括SBA方法测定的补体介导杀菌效力，与/或任选进一步包括OPK方法测定的抗体介导噬菌作用的效力，与/或任选进一步包括LAL方法测定的内毒性中和功能，例如，基本上具有相同的生物活性，生物活性采用针对靶标MDR大肠杆菌的特异性结合方法或功能试验测定。

例如，抗体6D1-1B2和8A1-1G8的功能活性变体的结合亲和力与8D5-1G10抗体基本上相同和类似(参见下表)。

此处所用的词语“基本上具有相同的生物活性”指的是基本上具有相同的生物活性是母抗体测定活性的至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少98％或甚至至少100％，或至少110％，或至少120％，或至少130％，或至少140％，或至少150％，或至少160％，或至少170％，或至少180％，或至少190％，例如，不超过200％。本发明所述的优选变体或衍生物是在抗原结合方面具有功能活性，优选具有与大肠杆菌O25b抗原而不与其它抗原结合的效力，例如，与大肠杆菌的O25b抗原结合而不与O25a抗原结合，或者不显著与O25a抗原结合，或与O25b和O25a两种抗原交叉特异性结合，例如，相对O25a，优选与O25b抗原结合，或与目前抗O25(O25a)菌株的多克隆分型血清相比，与O25b结合的亲和力更高。优选的变体不与大肠杆菌的其它抗原结合，Kd值相差至少2个log，优选相差至少3个log，及任选进一步包括SBA方法测定的补体介导杀菌效力，例如，与不含抗体的对照样品相比，显著降低细菌数，与/或任选进一步包括OPK方法测定的抗体介导噬菌作用效力，如，与不含抗体的对照样品相比，显著降低细菌数，与/或任选进一步包括LAL或TLR4信号分析测定的内毒素中和功能，如与不含抗体的对照样品相比，显著降低游离LPS，例如，具有基本上相同的生物活性，生物活性采用针对靶标MDR大肠杆菌的特异性结合方法或功能试验测定。各种方法中分析物显著减少通常指的是至少减少50％，优选至少减少60％、70％、80％、90％、95％或98％直到完全减少大约100％(+/-1％)。

在优选的实施例中，母抗体的功能活性变体

a)是抗体的生物活性片段，所述片段包括分子序列的至少50％，优选至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，或至少95％，及最优选至少97％、98％或99％；

b)是源自至少一个氨基酸替换、加入与/或删除的抗体，其中功能活性变体与分子或分子的一部分具有序列一致性，如序列一致性至少50％的抗体，优选至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，及最优选至少97％、98％或99％；与/或

c)由抗体或其功能活性变体及另外地，至少一个与多肽或核苷酸序列异源的氨基酸或核苷酸组成。

在本发明一个优选的实施例中，本发明抗体的功能活性变体基本上与上面描述的变体相同，但是，其多肽或核苷酸序列分别不同，不同之处在于它是源自不同种属的同源序列。这些都称为天然变体或类似物。

词语“功能活性变体”还包括天然产生的等位基因变异体，以及突变体或任何其它非天然变体。正如本技术领域熟悉的那样，等位基因变异体是一种(多)肽的替代形式，其特征在于替换、删除或加入一个或多个氨基酸，基本上不改变多肽的生物功能。

功能活性变体可通过改变多肽或核苷酸序列中的序列，如通过一个或多个点突变得到，其中，当与本发明一起使用时，其中所述序列改变保留了未变动多肽或核苷酸序列的功能。此种序列改变包括但不限于，(保守)替换、加入、删除、突变和插入。

具体的功能活性变体有CDR变体。CDR变体包括修改CDR区中至少一个氨基酸的氨基酸序列，其中所述修改可以是氨基酸序列的化学或部分变化，所述修饰使变体保留未修饰序列的生物学特性。CDR氨基酸序列的部分更改可以是删除或替换一个至几个氨基酸，例如，1、2、3、4或5个氨基酸，或加入或插入一个至几个氨基酸，例如1、2、3、4或5个氨基酸，或通过化学衍生一个至几个氨基酸，例如，1、2、3、4或5个氨基酸，或它们的组合。氨基酸残基的替换可以是保守替换，例如，以一个疏水氨基酸替换一个替代的疏水氨基酸。

保守替换是那些在其侧链和化学性质方面相关的氨基酸族内发生的替换。这些氨基酸族的实例有具有碱性侧链的氨基酸、具有酸性侧链的氨基酸、具有非极性脂肪族侧链的氨基酸、具有非极性芳香烃铡链的氨基酸、具有不带电极性侧链的氨基酸、具有小侧链的氨基酸及具有大侧链的氨基酸等。

点突变尤其理解为多核苷酸工程，得到的氨基酸序列的表达与非工程氨基酸序列的表达不同，其中，非工程设计的氨基酸序列是通过在一个或多个单(非保守)或双氨基酸的替换或交换、删除或插入，得到不同的氨基酸。

优选的点突变指的是同极性与/或电荷的氨基酸的交换。在此方面，氨基酸指的是六十四个三联体密码子编码的20种天然氨基酸。这20种氨基酸可以划分为具有中性电荷、正电荷和负电荷的氨基酸：

下面给出了“中性“氨基酸及其各自的三字母和单字母的代码和极性：

丙氨酸：(Ala，A)非极性，中性；

天冬酰胺：(Asn，N)极性，中性；

半胱氨酸：(Cys，C)非极性，中性；

谷氨酰胺：(Gln，Q)极性，中性；

甘氨酸：(Gly，G)非极性，中性；

异亮氨酸：(Ile，I)非极性，中性；

亮氨酸：(Leu，L)非极性，中性；

蛋氨酸：(Met，M)非极性，中性；

苯丙氨酸：(Phe，F)非极性，中性；

脯氨酸：(Pro，P)非极性，中性；

丝氨酸：(Ser，S)极性，中性；

苏氨酸：(Thr，T)极性，中性；

色氨酸：(Trp，W)非极性，中性；

酪氨酸：(Tyr，Y)极性，中性；

缬氨酸：(Val，V)非极性，中性；及

组氨酸：(His，H)极性，带正电荷(10％)，中性(90％)。

带“正”电荷的氨基酸有：

精氨酸：(Arg，R)极性，带正电荷；及

赖氨酸：(Lys，K)极性，带正电荷。

带“负”电荷的氨基酸有：

天冬氨酸：(Asp，D)极性，带负电荷；及

谷氨酸：(Glu，E)极性，带负电荷。

谈及抗体序列和同系物时所称“氨基酸序列一致性的百分数(％)”定义为必要时，为了得到最大的序列一致性百分数，在序列比对和引入缺口后，候选序列中与特定多肽序列中氨基酸残基一致的氨基酸残基百分数，任何保守替换并不视为序列一致性的一部分。本领域技术人员能够确定衡量比对的合适参数，包括与待比较序列全部长度相比，实现最大比对所需的任何算法。

抗体变体特别理解为包括同系物、类似物、片断、具有特定糖基化模式的修饰或变体，例如，通过糖工程产生，是具有功能的和可以作为功能相当物，例如，与特异性靶标结合和具有功能性质。

本发明的抗体可以具有或不具有Fc效应子功能。优选抗体具有Fc效应子功能，在SBA与/或OPK试验中呈功能活性。特异性抗体可以缺乏活性Fc单元，因此，由不含抗体Fc部分的抗体域组成或不包含Fcγ受体结合位点，或包括缺乏Fc效应子功能的抗体域，例如，通过修饰，减少Fc效应子功能。可以工程设计替代抗体，引入修饰，增加Fc效应子功能，尤其是增强OPK与/或SBA活性。

这种修饰可能受突变，例如，Fcγ受体结合位点中的突变的影响，或受衍生物或试剂的影响，干扰抗体格式的ADCC与/或CDC活性，从而减少或增加Fc效应子功能。

Fc效应子功能显著降低通常理解为指的是以ADCC与/或CDC活性衡量的Fc效应子功能低于未修饰(野生型)格式的10％，优选低于5％。Fc效应子功能显著增加通常理解为指的是以ADCC与/或CDC活性衡量的Fc效应子功能至少是未修饰(野生型)格式的10％，优选至少是20％、30％、40％或50％。

谈及抗体序列时使用的词语“糖基化工程”变体应指的是因糖基化工程而具有修饰免疫原特性的ADCC与/或CDC的糖基化变体。所有抗体在重链恒定区的保守位置含有糖类结构，每个同型具有N-连接糖类结构的不同阵列，这不一地影响蛋白质组装、分泌或功能活性。IgG1型抗体是每个CH2域中Asn297处具有保守的N-连接糖基化位点的糖蛋白。与Asn297连接的两个复合双触角低聚糖隐蔽在CH2域之间，与多肽骨架形成广泛的接触，它们的存在对抗体介导效应子功能是必不可少的，例如，抗体依赖性补体介导杀菌或吞噬细胞吸收。通过使N297突变，例如，突变到A，脱除N-聚糖，或使T299突变，通常得到效应子功能下降的无糖基化抗体格式。

抗体糖基化的主要区别在于细胞系之间，甚至在不同培养条件下给定细胞系也会出现小的区别。细菌细胞中表达的通常是提供无糖基化的抗体。据报道，具有β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII)(催化平分型GlcNAc形成的糖基转移酶)的四环素调控表达的CHO细胞，具有改善的功能(ADCC)活性(Umana et al.,1999,Nature Biotech.17:176-180)。除宿主细胞选择之外，影响抗体重组产生期间糖基化的因素包括增长模式、基质配方、培养密度、氧合作用、pH、纯化方案等。

词语“抗原结合位点”或“结合位点”指的是抗体参与抗原结合的部分。抗原结合位点是由重链(“H”)与/或轻链(“L”)N-端可变区(“V”)或其可变域的氨基酸残基形成的。

重链和轻链V区内的三个高度差异性伸展(divergent stretches)，称为“超变区”，插在更保守的侧翼伸展(flanking stretches)(称为构架区)之间，抗原结合位点提供与结合表位或抗原三维表面互补的表面，超变量区被称为“互补－决定区”或“CDRs”。CDR中掺入的结合位点在本发明中亦称为“CDR结合位点”。

本发明所用词语“抗原”可与词语“靶标”或“靶标抗原”互换，指的是抗体结合位点识别的整个靶标分子或所述分子的片段。特别是，抗原的子结构，例如，多肽或糖类的结构，通常称为“表位”，例如，B-细胞表位或T-细胞表位，这些表位是免疫相关的，可由所述结合位点识别。O25b或O25a等特异性抗原是以分离抗原提供，或者是以大肠杆菌细胞或细胞碎片的形式提供。

本发明所用的词语“表位”应特别指的是完全构成抗体结合位点的特异性结合配体或特异性结合配体一部分的分子结构。表位可以是天然的或人工的，由糖类、肽结构、脂肪酸、有机物质、生化物质或无机物质或它们的衍生物和它们的任何组合组成。如果表位包括在肽结构中，如肽、多肽或蛋白质中，它通常包括至少3个氨基酸，优选5至40个氨基酸，更优选大约10-20个氨基酸。表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由多肽或糖链一级序列的单片段组成。线性表位可以是连续的或重叠的。构象表位由氨基酸或糖类组成，通过折叠多肽形成三级结构，而氨基酸在线性序列中不一定彼此相邻。特别是，关于多肽抗原，构象或非连续表位的特征在于存在两个或多个在一级序列中被分开的离散氨基酸残基，但是，当多肽折叠成天然蛋白质/抗原时，它们在分子表面上组装形成一致的结构。

此处词语“表位”应尤其指的是抗体识别的单一表位，或包括表位变体的表位混合物，每个表位被特异性识别靶标的抗体识别，例如，表位被选自命名为6D1-1B2、8A1-1G8、8D5-1G10和8D10-C8的抗体特异性识别。特别是，被选自6D1-1B2、8A1-1G8、8D5-1G10和8D10-C8的抗体靶向的表位是糖类表位。

词语“表达”应按下述方式理解。含表达产物(如本发明所述抗体)所需编码序列和控制序列(如可操作连锁中的启动子)的核酸分子可用于表达目的。利用这些序列转化或转染的宿主能够产生编码蛋白质。为了有效转化，表达系统可以包括在载体中；但是，相关DNA也可以整合到宿主染色体内。特别是，该词语指的是在合适的条件下，宿主细胞和相容的载体，例如，通过载体携带且引入到宿主细胞内的外源DNA，表达编码的蛋白质。

编码DNA是一种DNA序列，对特定多肽或蛋白质，如抗体的特定氨基酸序列进行编码。启动子DNA是启动、调节或介导或控制编码DNA表达的DNA序列。启动子DNA和编码DNA可以来自同一基因或不同基因，可以来自同一有机体或不同有机体。重组克隆载体通常包括一种或多种用于克隆或表达的复制系统，一种或多种用于宿主中选择的标记，例如，抗生素抗性，及一种或多种表达盒。

此处使用的词语“载体”定义为合适的宿主有机体中克隆重组核苷酸序列转录所需的DNA序列，即重组基因转录及其mRNA翻译所需的DNA序列。

“表达盒”指的是在确定限制位点处插入到载体内的表达产物进行编码的DNA编码序列或DNA片段。表达盒限制位点设计用于确保表达盒插在合适的阅读框内。通常，外源DNA在载体DNA的一个或多个限制位点处插入，然后，随同遗传载体DNA一起由载体携带进入到宿主细胞内。具有插入或增加DNA，如表达载体的DNA片段或序列也可以称为“DNA构建体”。

表达载体包括表达盒和另外地，通常包括宿主细胞自主复制的起始点或基因组整合位点、一个或多个可选择的标记(例如，氨基酸合成基因或抗生素抗性基因，如zeocin(博来霉素)、卡那霉素、G418或潮霉素)、多个限制性酶切位点、合适的启动子序列和转录终止子，这些组件是可以操作连锁在一起的。此处所用词语“载体”包括自主复制核苷酸序列以及基因组整合核苷酸序列。载体的常见类型是“质粒”，质粒通常是双链DNA的独立分子，容易接受其它(外源)DNA和容易被引入到合适的宿主细胞内。质粒载体通常包含编码DNA和启动子DNA，具有一个或多个适合插入外源DNA的限制位点。特别是，词语“载体”或“质粒”指的是一种运载工具，DNA或RNA序列(例如，外源基因)通过该运载工具可以被引入到宿主细胞内，从而转化宿主和促进引入序列的表达(例如，转录和翻译)。

此处使用的词语“宿主细胞”应指的是转化产生特定重组蛋白质(如本发明所述的抗体)的原代对象细胞，及其任何子代。应该理解的是，并非所有子代都与亲本细胞完全相同(由于有意或无意的突变或环境差异)，但是，只要子代保留了与原转化细胞相同的功能性，这些词语包括这些改变的子代。词语“宿主细胞系”指的是用于表达重组基因，产生重组多肽，如重组抗体的宿主细胞的细胞系。此处使用的词语“细胞系”指的是已经获得了长期增殖能力的特定细胞类型构建的克隆。这种宿主细胞或宿主细胞系可以在细胞培养中保持与/或培养以产生重组多肽。

针对组合物，例如免疫原组合物，此处亦称为“免疫原”(包括此处所述的抗原或表位，或疫苗)的“免疫应答”是在宿主或对象中引发针对感兴趣的组合物或疫苗的细胞与/或抗体介导的免疫应答。

通常，这种应答由对象特异性针对抗原或包括在感兴趣的组合物或疫苗中的抗原产生的抗体、B细胞、辅助T细胞、抑制T细胞、与/或细胞毒性T细胞组成。

“保护性免疫应答”理解为治疗性免疫应答，指的是针对源自病原体的抗原的免疫应答，以某种方式预防、改善、治疗或至少部分阻止疾病症状、副作用或进程。特别地，与未免疫群体相比，对于诱导的或自然的感染或毒素的挑战，保护性免疫应答被启动以提供显著改善的结果。

免疫原或免疫原组合物通常包括抗原或表位，以及载体，特别是可以包含佐剂。词语“佐剂”指的是一种化合物，当其与抗原一起施用时增强与/或重新定向抗原的免疫应答，但是，当其单独施用时，并不会产生针对抗原的免疫应答。佐剂可以通过几种机制增强免疫应答，包括淋巴细胞募集、刺激B细胞与/或T细胞及刺激巨噬细胞。示例性载体有脂质体或阳离子肽；示例性佐剂有磷酸铝或氢氧化铝、MF59或CpG寡核苷酸。

此处谈到核酸、抗体或其它化合物时使用的词语“分离的”或“分离”应指的是此种化合物已经与其自然相关的环境充分分离，从而以“基本上纯净”的形式存在。“分离”并不一定指的是不包括与其它化合物或材料的人工或合成混合物，或存在不干扰基本活性的杂质，以及，如由于不完全纯化，可能存在杂质。特别是，本发明的分离核酸分子还包括那些化学合成的核酸分子。

谈及本发明的核酸时，有时采用词语“分离的核酸”。该词语应用于DNA时，指的是与源生物的天然基因组邻接的序列中分离的DNA分子。例如，“分离核酸”包括插入到载体内的DNA分子，如质粒或病毒载体，或整合到原核或真核细胞或寄助物基因组DNA内的DNA分子。当应用于RNA时，词语“分离核酸”主要指的是由上文定义的分离DNA分子编码的RNA分子。或者，该词语指的是在其自然状态(即在细胞中或组织中)与其缔合的其它核酸充分分离的RNA分子。“分离核酸”(或DNA或RNA)进一步指的是采用生物或合成手段直接产生并与其产生期间存在的其它组分中分离的分子。

谈到多肽或蛋白质，如本发明的抗体或表位时，词语“分离”特别指的是不含或基本不含其自然相关的材料，如在其自然环境中，或其制备环境(如细胞培养)中发现的其它化合物，制备是采用重组DNA技术在体外或体内进行。分离化合物可以采用稀释剂或佐剂配制，但对于实际用途来说仍然是分离的–例如，用于诊断或治疗时，多肽或多核苷酸可以与药学上可接受的载体或赋形剂混合。特别是，本发明的分离抗体与抗O25(a)菌株的多克隆血清制剂不同，因为本发明的分离抗体是以分离的、纯化的形式提供，优选以包含分离的抗体作为唯一活性物质的制剂形式提供。但是，这并不排除以包括有限数量其它明确的(分离的)抗体的组合产品形式提供分离抗体。分离抗体也可以在固体、半液体或液体载体上提供，如珠粒。

此处所用词语“中和”或“中和作用”指的是广义，指的是不考虑实现中和的机制，阻止病原体的任何分子，如阻止MDR大肠杆菌感染对象，或阻止病原体通过产生有效的蛋白质毒素促进感染，或阻止毒素损害对象的靶细胞。中和可以通过抑制MDR大肠杆菌内毒素与其靶细胞上的同源受体结合与/或相互作用(例如，与TLR4受体结合)而实现。可以通过利用Fc介导功能从循环消除内毒素分子而实现中和。

中和效力通常采用标准试验方法测定，如LAL试验，在此试验中，例如，利用比色法测定内毒素的生物活性抑制情况。

词语“MDR大肠杆菌”应按下述方式理解。多重抗药性大肠杆菌感染占感染的很大一部分，其感染是由于ST131-O25b:H4克隆谱系引起的，ST131-O25b:H4克隆谱系仅在近十年才出现，并成为全球扩散的主要耐药克隆。多重抗药性大肠杆菌尤其理解为那些对三类或更多类抗生素具有耐药性的菌株，例如下述试剂/组：盘尼西林、头孢菌素、碳青霉烯类、氨基糖苷类、四环素、氟喹诺酮、呋喃妥英、三甲氧苄二氨嘧啶(及其组合)、磷霉素、多粘菌素、氯霉素、氨曲南、替加环素(tigecyciine)。

酸性荚膜多糖(CPS)是一种环绕大多数病原体大肠杆菌的粘稠的类似粘液的多糖层。因此，令人吃惊的是，本发明抗体识别的特异性表位在胶囊化和非胶囊化MDR大肠杆菌菌株上将是可以特异性被接近的。

抵抗或中和MDR大肠杆菌的抗体干扰病原体和病原反应，从而能够限制或预防感染与/或改善这种感染引起的病情，或者抑制MDR大肠杆菌病程，尤其是散播和复制到无菌的身体各室内/宿主位点内，或在身体各室内/宿主位点内散播和复制。在此方面“保护性抗体”理解为在主动或被动免疫中观察到的负责感染源免疫的抗体。特别是，本发明所述的保护性抗体可用于治疗目的，例如，用于预防或治疗，从而预防、改善、治疗或至少部分抑制病原体诱导的疾病症状、副作用或进程。特别是，保护性抗体能够通过，例如，诱导血清杀菌或调理吞噬活动消灭或阻止活大肠杆菌的复制，或在治疗应用后(例如，在建立的感染上施用)，从无菌的体内位点清除全部菌细胞或其LPS分子。或者，预防施用的保护性抗体通过上面提到的其中一种机制或其它机制，阻止感染的建立(即大肠杆菌从非无菌位点扩散到无菌的身体各室)。

此处的词语“O25b抗原”理解为结构如实例2和图3(a)所示的LPS O-抗原。其结构与O25(a)抗原类似，但是，明显不同。

此处的O25b理解为与O25a类似，但明显不同的血清型(参见图3(a))。

此处的词语“O25抗原”理解为由Kenne等人(Kenne L,Lindberg B,Madden JK,Lindberg AA,Gemski P Jr.Structural studies of the Escherichia coli O-antigen25.Carbohydr Res.28；122(2):249-56,1983)描述的戊多糖重复单元组成的抗原。在鉴定O25b抗原之前，词语O25代表此处所述的O25a(参见图3(b))。

此处的词语“O25a抗原”理解为O25抗原的同义词。

此处使用的词语“重组”应指的是“基因工程制备的或基因工程导致的”。重组宿主特别包括表达载体或克隆载体，或其已经通过基因工程改造而包含重组核酸序列，尤其是采用宿主外源核苷酸序列。重组蛋白通过在宿主内表达各自的重组核酸制备。此处使用的词语“重组抗体”包括采用重组手段制备、表达、创建或分离的抗体，如(a)从转基因或染色体转移得到人免疫球蛋白基因的动物(如小鼠)分离的抗体，或从其制备的杂交瘤，(b)从转化而表达抗体的宿主细胞分离的抗体，如转染瘤，(c)从重组体、组合人源抗体文库分离的抗体，及(d)采用任何其它涉及剪接人免疫球蛋白基因序列到其它DNA序列的手段所制备、表达、创建或分离的抗体。这种重组抗体包括经工程设计而包括，例如在抗体成熟期间发生的重排和突变的抗体。

此处使用的词语“特异性”或“特异性结合”指的是分子异质群体中感兴趣的同源配体的决定性结合反应。因此，在指定条件下(例如，免疫分析条件下)，一个抗体与其特定靶特异性结合，并不大量与样品中的其它分子结合。特异性结合指的是，就靶标识别而言，结合是选择性的，根据选择，具有高、中或低的结合亲和力或亲合力。如果结合常数或结合动力学至少相差10倍(理解为至少相差1log)，优选相差至少100倍(理解为至少相差2log)，更优选至少相差1000倍(理解为至少相差3log)，通常能实现选择性结合。词语“特异性”或“特异性结合”还理解为适用于与一个或多个分子结合的结合物，如交叉-特异性结合物。

特别地，本发明的抗体仅在结合O25b抗原方面具有选择性，或相对O25a抗原，优先结合O25b抗原，或与抗O25a菌株的多克隆血清相比，与O25b结合的亲和力更高，所述血清与O25b抗原结合的亲和力较低。因此，本发明的抗体可理解为与那些抗原的结合具有不同之处，例如，至少具有相同的亲和力，或亲和力更大，如不同的亲和力，Kd相差至少1log，优选相差至少2log，更优选相差至少3log。相对O25a抗原，所述抗体与O25b抗原选择性结合，优选用于诊断或治疗目的。对于某些诊断目的，抗体特别以仅与O25b抗原结合且可以检测的方式使用。

词语“具有相同的特异性”、“具有相同的结合位点”或“结合相同的表位”指的是等价单克隆抗体表现出相同的或基本相同，即类似的免疫反应(结合)特点，与预先选择的靶结合序列竞争结合。适用于特定靶的抗体分子的相对特异性可以通过竞争试验相对测定，例如，Harlow,et al.,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988)所述的试验。

此处使用的词语“对象”应指的是温血哺乳动物，特别应指的是人类。特别是，本发明的医疗用途或各治疗方法适用于需要预防或治疗与MDR大肠杆菌感染有关的疾病或患有此类疾病，包括早期或晚期疾病的对象。词语“患者”包括接受预防或治疗的人类和其它哺乳动物对象。因此，词语“处理(treatment)”包括预防和治疗。

对对象进行处理，以预防或治疗MDR大肠杆菌疾病。特别是，对处于感染风险或患有此类疾病或疾病复发的对象，或患有此类感染与/或与此类感染有关疾病的对象进行处理。

特别是，词语“预防”指的是预防发病开始的预防措施或降低发病风险的预防措施。

特别是，此处所述处理、预防或延迟对象疾病的方法，是通过干扰作为疾病病因的MDR大肠杆菌发病机理实现的。

词语“基本上纯”或“纯化”应指的是制剂包含至少50％(w/w)，优选至少60％、70％、80％、90％或95％的化合物，如核酸分子或抗体。纯度采用适合所述化合物的方法测定(例如，色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、HPLC分析等)。

化合物，例如，本发明的抗体或免疫原的“治疗有效剂量”与词语“有效剂量”或“足够剂量”可以互换，它是指施用于对象时，能足够产生有效益处或达到要求结果，包括临床效果的量或活性，同样，就这点而论，有效剂量或其同义词取决于其应用的语境。

有效剂量指的是足够治疗、预防或抑制疾病或病症的化合物的量。在疾病语境中，此处所述的抗体的治疗有效剂量特别用于治疗、调节、减弱、逆转或影响疾病或状况，从抑制MDR大肠杆菌发病机理(例如，粘附和定植在粘膜表面，在无菌体内部位不受控的复制，及细菌产物对宿主细胞的毒性)中受益。

与有效剂量对应的化合物的量将根据各种因素而变化，如给定药物或化合物、药物剂型、给药途径、疾病或状况类型、治疗的对象或宿主特性等，但是，这些都是熟悉本领域的技术人员日常确定的。

本发明的抗体或免疫原可预防性用于抑制MDR大肠杆菌感染发作，或用于治疗MDR大肠杆菌感染，特别是治疗难治的MDR大肠杆菌感染，或在特定对象时，治疗其它传统抗生素难治的MDR大肠杆菌感染。

此处所述抗体的治疗有效剂量，如提供给需要治疗的人类患者的有效剂量，可以特别是0.5-500mg，优选是1-400mg，甚至更优选是不超过300mg，不超过200mg，不超过100mg或不超过10mg，但是，治疗急性疾病时，可能需要更高的剂量。

此外，采用治疗有效剂量的本发明抗体治疗或预防对象的方案可由单次施用组成，或由一系列施用组成。例如，抗体可以至少每年施用一次，至少半年施用一次或至少一个月施用一次。但是，在另一个实施例中，对于给定治疗，对象从大约每周一次至大约每天一次施用抗体。治疗期长短取决于各种因素，例如，疾病的严重程度，是急性还是慢性疾病，患者的年龄、抗体格式的浓度和活性。还应该理解的是，在特定治疗或预防方案期间，用于治疗或预防的有效剂量可以增加或减少。剂量的变化通过本领域熟知的标准诊断试验可以得到和显而易见的。在某些情况下，需要长期给药。

此处所述免疫原的有效剂量，如提供给患上与MDR大肠杆菌感染有关疾病风险的患者，可能每次剂量具体是1-15mg/kg的范围内。

例如，根据初免-加强免疫方案，免疫原可能作为第一剂施用，紧接着在某一时间框架内施用一种或多种加强剂量，诱导对MDR大肠杆菌感染长期有效的免疫应答。优选的接种方案将包括施用三剂，例如，第0天施用第1剂，在第5-40天施用第2剂，在第10-100天施用第3剂，优选三剂分别在第0天、28天和90天施用。根据优选的加快方案，施用可在第0天、7天和14天进行。加快方案可用于预防，例如，针对面临选择性外科手术的患者。通常明矾被作为佐剂使用，例如，磷酸盐或氢氧化物。

因此，本发明主题物质是以对O25b具有高度特异性的鼠源性mAbs的发现为基础。这些抗体作为诊断剂用于鉴定属于ST131谱系的MDR菌株具有很大的潜力。此外，特别是在人源化以后，这些mAbs适合用于预防(例如，用于高风险群体)和治疗ST131-O25b:H4菌株导致的大肠杆菌感染。

根据抗O25的免疫血清常规用于诊断鉴定O25b抗原表达的大肠杆菌菌株的这一事实，人们认为，O25b和O25(O25a)糖类抗原是相同的或非常类似的。人们对ST131菌株中O－抗原合成的遗传学背景未进行充分阐明，但是，rfb簇内的特定基因(编码O－抗原合成)构成了基于PCR的O25b菌株鉴定的基础。此外，迄今为止，没有结构数据支持O25(a)和O25b抗原之间存在任何差异。

因此，令人吃惊的是，本发明的抗体可以特异性结合O25b抗原，并特异性区分O25b抗原和O25a抗原。

为了证实表达大肠杆菌的O25b抗原和O25a抗原之间的遗传差异，采用从对保守的侧翼基因：gnd和galF具有特异性的寡核苷酸开始的引物步移法，从商业可以获得的菌株81009(Szijarto et al,FEMS Microbiol Lett,2012,332:131-6)对编码O-抗原合成的rfb簇进行测序。得到的rfb操作子的重叠群长11,300bp，与编码O25抗原合成的酶(NCBI登录号GU014554)仅部分同源。结果证明，O25b rfb操作子3'端长2043bp的片段与O25rfb操作子的对应区不同源，其中该片段被编码岩藻糖合成和运输的长6267bp的序列代替。

对纯化组分中从大肠杆菌ST131分离的LPS中存在的O-特异性PS生物学重复单元(RU)的结构进行了详细分析，该纯化组分由以一个重复单元(RU)替换的核心OS组成。LPSST131的RU是结构如图3所示的O-乙酰化戊多糖。

实际上，据Kenne et al.(Kenne,Lindberg et al.,Carbohydr Res.1983Oct 28；122(2):249-56)报道，ST131O-PS的RU结构与LPS O25RU不同，据我们所知，它是大肠杆菌脂多糖的一种新O-血清型(Stenutz et al.FEMS Microbiol Rev.2006May；30(3):382-403.Review)。

此外，从LPS ST131分离的核心寡糖的MALDI-TOF质谱法和组合物分析(糖及甲基化分析)的初步结果支持K-12型，这是以前Szijarto V.et al.等在遗传学分析的基础上报道过的(Szijarto et al,FEMS Microbiol Lett,2012,332:131-6)。已经证明，LPS ST131由两种主要核心寡糖(OS)糖型组成。糖型的类型取决于存在或不存在O-特异性多糖(PS)。未取代核心寡糖的主要糖型是截短型的K-12核心寡糖，去掉了→7)-α-Hepp-(1→6)-α-Glcp二糖。该二糖的存在是O-PS取代核心OS和未取代核心OS之间的区别。

根据本发明的一个具体方面，提供一种与O25b特异性表位选择性结合的抗体，例如，与8D5-1G10抗体相同的表位结合或与命名为6D1-1B2或8A1-1G8或8D10-C8抗体中的任一抗体相同的表位结合，该词语包括与基本上相同的表位结合的变体；或者包含与8D5-1G10抗体或命名为6D1-1B2或8A1-1G8或8D10-C8抗体中任一抗体相同的结合位点，该词语包括包含基本上相同的结合位点的变体。命名为6D1-1B2、8A1-1G8、8D5-1G10的抗体将尤其包括特异性区分O25b抗原和O25a抗原的结合位点，且仅结合O25b抗原。命名为8D10-C8的抗体将尤其包括交叉特异性结合O25b抗原和O25a抗原的结合位点，及与O25a抗原相比，优选结合O25b抗原。

如果抗体交叉竞争，从而在给定时间点，仅一种抗体与表位结合，即一种抗体阻止另一种抗体的结合或调节效应，则称抗体为“相同的表位结合”或“包括相同的结合位点”或具有“基本上相同的结合”特点。

此处谈及抗体时使用的词语“竞争”或“交叉竞争”指的是第一抗体，或其抗原-结合部分，以一种与第二抗体，或其抗原-结合部分的结合足够类似的方式与表位结合，从而在第二抗体存在下，第一抗体与其同源表位的结合结果，与不存在第二抗体时第一抗体的结合相比，其结合减少，这种减少是可以检测的。或者，其中在第一抗体的存在下，第二抗体与其表位的结合也减少，这种减少是可以检测的，但是，并不一定要求如此。

也就是说，第一抗体可以抑制第二抗体与其表位的结合，第二抗体并不抑制第一抗体与其各表位的结合。但是，若每个抗体可以检测地抑制另一个抗体与其同源表位的结合，不管其程度是相同、更大或更少，都称抗体为了与其各表位的结合而彼此“交叉竞争”。竞争和交叉竞争抗体均包括在本发明之内。

此处的竞争指的是采用竞争性ELISA分析，例如，如实例部分所述测定的相对抑制大于大约30％。希望的是在特定的环境中，例如，在竞争分析用于选择或筛选设计具有结合O25b指定功能的新抗体时，设定更高的相对抑制阈值作为竞争合适水平的标准。因此，例如，可以设定竞争性结合的标准，其中在抗体被视为具有足够竞争性之前，检测到至少40％相对抑制，或至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或甚至至少100％。

特别是，提供一种抗体，所述抗体包括命名为6D1-1B2、8A1-1G8、8D5-1G10或8D10-C8的抗体中的任何一个抗体的可变区，特别是选自6D1-1B2、8A1-1G8、8D5-1G10和8D10-C8的抗体的CDR序列的至少其中一个，优选至少两个，至少3个，至少4个，至少5个或至少6个CDR序列，或其功能活性的CDR变体。更具体地说，提供命名为6D1-1B2、8A1-1G8、8D5-1G10或8D10-C8中的任何一个抗体。

特别是，命名为8D5-1G10抗体或8D10-C8抗体的抗体或其任何功能活性变体可以采用保藏材料或其中包含的各核苷酸序列，如其中一个质粒与/或其中一个保藏宿主细胞制备。

根据一个具体的方面，8D5-1G10抗体或其功能相当的变体可以来源于包含由任何质粒进行编码的可变区的抗体，所述质粒掺入到保藏号为DSM 26763和/或DSM 26762的宿主细胞中；例如，采用保藏材料的部分或(点)突变的CDR序列来工程改造特异性抗体或其任何功能活性变体。

根据本发明另一个具体方面，8D5-1G10抗体或其功能相当变体来源于或采用在以保藏号DSM 26763与/或DSM 26762保藏的宿主细胞制备的抗体可变区；例如，采用部分序列，例如，保藏材料的一个或多个CDR序列，从而工程改造特异性抗体或其任何功能活性变体。

具体地，6D1-1B2或8A1-1G8抗体变体是功能活性的8D5-1G10抗体的CDR变体，例如，至少其中一个CDR序列有部分变化。

根据一个具体的方面，8D10-C8抗体或其功能相当的变体可以来源于包含由任何质粒进行编码的可变区的抗体，所述质粒掺入到保藏号为DSM 28171与/或DSM 28172；例如，采用保藏材料的部分或(点)突变的CDR序列来工程改造特异性抗体或其任何功能活性变体。

根据本发明另一个具体方面，8D10-C8抗体或其功能相当变体来源于或采用以保藏号DSM 28171与/或DSM 28172号保藏的宿主细胞制备的抗体可变区；例如，采用部分序列，例如，保藏材料的一个或多个CDR序列，从而工程改造特异性抗体或其任何功能活性变体。

在某些方面，本发明提供变体抗体，优选单克隆抗体，更优选鼠源性、人源化或人源抗体，包括重链和轻链，其中重链或VH可变区或各自的CDR中任一个包包括来源于各自保藏质粒与/或各自保藏宿主细胞的氨基酸序列。

在某些方面，本发明提供变体抗体，优选单克隆抗体，更优选鼠源性、人源化或人源抗体，包括重链和轻链，其中轻链或VL可变区或各自的CDR中任一个包括来源于各自保藏质粒与/或各自保藏宿主细胞的氨基酸序列。

在某些方面，本发明提供变体抗体，优选单克隆抗体，更优选鼠源性、人源化或人源抗体，包括重链和轻链，其中重链和轻链或VH/VL可变区或各自的CDR中任一个包括来源于各自保藏质粒与/或各自保藏宿主细胞的氨基酸序列。

在某些方面，本发明还提供变体抗体，包括来源于保藏材料的各自的结合序列，如可变序列与/或CDR序列，其中所述结合序列，例如，任何CDR序列，包括与来源于保藏材料的氨基酸序列的一致性是至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％或至少99％的序列，其中变体是功能活性的变体。

正如本发明所述，一方面，本发明提供抗体分子，所述抗体分子的特征在于，例如，与单克隆抗体8D5-1G10或8D10-C8竞争结合O25b抗原的能力。6D1-1B2、8A1-1G8、8D5-1G10抗体中的任何一个抗体是鼠源性lgG3抗体，8D10-C8抗体是携带κ(kappa)轻链的鼠源性lgG2b抗体，是发明人分离和表征的。8D5-1G10抗体或8D10-C8抗体的可变区由此处谈到的保藏材料表达。因此，本发明充分公开了轻链和重链决定的结合特点，及8D5-1G10抗体或8D10-C8抗体的VL/VH域，使其作为母抗体，或与本发明功能活性变体或竞争性抗体对比。

8D5-1G10重链(8D5-1G10-HC)的成熟可变区是，例如，利用保藏号为DSM 26762的宿主细胞制备的，或者是利用掺入其内的编码质粒的各序列信息制备的。

8D5-1G10轻链(8D5-1G10-LC)的成熟可变区是，例如，利用保藏号为DSM 26763的宿主细胞制备的，或者是利用对掺入其内的编码质粒的各序列信息制备的。

8D10-C8重链(8D10-C8-HC)的成熟可变区是，例如，利用保藏号为DSM 28172的宿主细胞制备的，或者是利用对掺入其内的编码质粒的各序列信息制备的。

8D10-C8轻链(8D10-C8-LC)的成熟可变区是，例如，利用保藏号为DSM 28171的宿主细胞制备的，或者是利用对掺入其内的编码质粒的各序列信息制备的。

相对其它大肠杆菌抗原，例如除O25抗原以外的任何糖类抗原或任何核心抗原，优选结合O25b抗原的亲和力差异优选至少高10-倍，即Kd至少相差10，优选至少高100-倍，更优选至少高1000倍。

与商业分型血清，如Statens Serum Institut提供的高滴度大肠杆菌O25抗血清(#81369)相比，优选结合O25b抗原的结合亲和力差异特别是至少高5倍，或至少高6-倍，或至少高7-倍，或至少高8-倍，或至少高9-倍，或至少高10-倍。

相对O25a抗原，优先结合O25b抗原的结合亲和力差异特别是至少等于或大于，例如，至少高1.5倍或至少高2-倍，或至少高3-倍，或至少高4-倍，或至少高5倍，或至少高6-倍，或至少高7-倍，或至少高8-倍，或至少高9-倍，或至少高10-倍。

本发明的优选抗体与任何所述单个抗原，特别是O25b抗原结合具有较高亲和力，特别是具有较高结合速率与/或较低解离速率，或较高结合亲和力。抗体的结合亲和力的通常以抗体的浓度表征，即一半抗源结合位点被占据时的浓度，被称为解离常数(Kd或KD)。通常，Kd<10^-7M的结合物被视为高亲和力结合物，在一些情况下，例如，用于较高亲和力的治疗目的时，如，Kd<10^-8M，优选Kd<10^-9M，甚至更优选Kd<10^-10M时。

然而，在特别优选的实施例中，单一抗原的结合亲和力是中等亲和力，例如，当与至少两个抗原结合时，Kd小于10^-6M和不超过10^-7M，。

本发明可以提供中等亲和力结合物，优选连同亲和力成熟过程，如果必要的话。

亲和力成熟是抗体和靶抗原产生亲和力增加的过程。随着抗体结构的变化，包括氨基酸突变发生或体细胞免疫球蛋白基因片段突变的结果，产生和选择抗原结合位点变体，实现更大的亲和力。亲和力成熟的抗体比母抗体的亲和力大几个对数倍(log)。

单一母抗体可以经历亲和力成熟。或者，与靶标抗原具有类似结合亲和力的抗体文库可以视为母体结构，这些母体结构经过变化得到亲和力成熟的单一抗体或亲和力成熟的抗体文库。

本发明优选的亲和力成熟的抗体变体，其结合亲和力至少增加10倍，优选至少增加100倍。在采用各母分子文库的竞争性筛选(selection campaign)中，可以采用亲和力成熟，采用具有中等亲和力的抗体，得到本发明具有特异性靶结合性质、结合亲和力Kd<10^-7M的抗体。或者，可以通过本发明的抗体亲和力成熟，甚至更加提高亲和力，得到亲和力较高的抗体，对应的Kd小于10^-8M或小于10^-9M，优选小于10^-10M，或甚至小于10^-11M，最优选处于皮摩尔范围。

一个具体方面涉及本发明的一种抗体，其特征在于特异性抗菌功能活性，如补体介导杀菌和调理吞噬吸收和杀灭细菌。

吞噬效应细胞可以通过采用补体活化的另一种途径活化。与微生物表面抗原结合的抗体吸引补体的第一组分，与它们的Fc区发生级联反应，并启动激活“经典”补体系统。这导致刺激吞噬效应细胞，通过补体和抗体依赖机制(CDC)，最终杀灭靶标细菌。

根据一个具体实施例，本发明的抗体在免疫效应细胞存在下具有标准SBA或OPK试验测定的细胞毒性活性。如果与对照相比，细菌杀灭百分数明显增加的话，可以表明本发明抗体的SBA或OPK试验测定的细胞毒性活性。与SBA或OPK相关的细菌活性优选以绝对百分数增加量衡量，优选高于5％，更优选高于10％，甚至更优选高于20％、30％、40％或50％。

本发明的抗体可以采用杂交瘤方法鉴定或获得。在这种方法中，小鼠或其它合适的宿主动物，如仓鼠，经免疫引出淋巴细胞，产生或能够产生与用于免疫的蛋白质特异性结合的抗体。或者，淋巴细胞可以体外免疫。然后，采用合适的融合剂，如聚乙二醇，淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。

为产生抗抗原的单克隆抗体，对杂交瘤在其中生长的培养基进行分析。优选杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀法或通过体外结合试验，如放射免疫法(RIA)或酶联免疫吸附剂法(ELISA)进行测定。

例如，本发明的抗体可以通过源(母)抗体得到，例如，以编码卡那霉素抗性的盒代替kps簇(编码胶囊合成)，利用代表性ST131-O25b:H4菌株81009(如81009△kps::kan)的非-胶囊突变体来免疫小鼠得到。然后，分析从小鼠得到的血清样品，显示最高IgG抗O25b抗原滴度(ELISA和蛋白质印迹法)的小鼠脾脏可用于产生杂交瘤。在亚克隆之后，可以选择杂交瘤克隆，其分泌对O25b抗原具有特异性的抗体及与表达O25b抗原的活的野生型大肠杆菌表面结合。然后，这些mAbs可以从杂交瘤上层清液提纯，用于进一步测试其O25b抗原的特异性结合，及可能测试其相对O25a抗原优先结合O25b抗原的结合亲和力差异，和工程改造抗体，例如，用于不同诊断或治疗用途。

差异结合抗体，本发明亦称为选择性抗体，在某些情况下，通过针对单一抗原进行筛选而得到。为了增加分离差异结合克隆的可能性，应针对不同的抗原通过采用几种选择性压力来开展进行性筛选。特殊的mAb选择策略以交替的方式采用O25b和O25a成分或其它大肠杆菌抗原。

重组抗原可用于从抗体文库选择抗体，例如，酵母展示抗体文库。

在任一事件中，采用本领域熟悉的抗体优化方法，可以进一步改善选择性结合。例如，此处所述免疫球蛋白链可变区的某些区域可以采用一种或多种优化策略，包括轻链替换、目标突变形成、CDR融合及选定CDR与/或框区域的定向突变。

鉴定具有要求的选择性结合特性的抗体的筛选方法可以通过展示技术实现(使用噬菌、细菌、酵母菌或哺乳动物细胞)。反应性可以根据ELISA、蛋白质印迹法或流式细胞术的表面染色法，例如，采用标准试验进行评价。

一旦鉴定出具有要求性质的差异结合抗体，可以测定抗体识别的优势表位。表位作图的方法是本领域所熟悉和公开的，例如，Epitope Mapping:A Practical Approach,Westwood and Hay,eds.,Oxford University Press,2001中所述。

表位作图涉及抗体结合表位的鉴定。对于熟悉本领域的技术人员来说，有许多种测定蛋白质上表位位置的方法，包括抗体-抗原复合物的结晶学分析、竞争试验、基因片段表达试验和基于合成肽的试验。谈到抗体时所称“结合相同表位”的抗体此处应按下述方式理解。当两个抗体识别相同或空间上重叠的表位时，抗体被称为结合相同或基本上相同或大体上相同的表位。测定两个抗体是否与相同或空间上重叠的表位结合的常用方法是竞争试验，该试验采用标记抗原或标记抗体，可以配置成不同形式的所有数量。通常，抗原定植在96-孔板上，采用放射性或酶标记方法测定未标记抗体阻断标记抗体结合的能力。

一旦鉴定出抗体具有要求的差异结合性质，可以采用本领域熟悉的方法包括，例如，杂交瘤技术或重组DNA技术制备这种抗体，包括抗体片段。

例如，可以采用熟悉的重组表达载体，例如，本发明的质粒或包括编码抗体序列的核苷酸序列的表达盒，通过分离DNA编码要求抗体链并转染到编码序列转染重组宿主细胞中表达，从而重组单克隆抗体。重组宿主细胞可以是原核细胞和真核细胞，如前文所述的那些细胞。

根据具体的方面，核苷酸序列可用于基因操作来对抗体进行人源化或改善亲和力，或抗体的其它特点。例如，如果抗体在临床试验中使用和治疗人类时，恒定区可以工程改造，使其与人类恒定区更类似，从而可以避免免疫应答。期望的是，基因操作抗体序列使其与靶O25b的亲和力更大及抗MDR大肠杆菌的功效更大。显然，对于熟悉本领域的技术人员来说，可以对抗体进行一种或多种多核苷酸变化，却仍然保持其对靶O25b的结合能力。

采用各种方法产生抗体分子，通常是人们熟悉的。例如，美国专利6331415(Cabilly et al)描述了一种重组制备抗体的方法，其中重链和轻链从单一细胞中单一载体或两个独立的载体同时表达。Wibbenmeyer等人(1999,Biochim Biophys Acta 1430(2):191-202)和Lee和Kwak(2003,J.Biotechnology 101:189-198)描述了采用独立培养的大肠杆菌中表达的质粒，从独立制备的重链和轻链制备单克隆抗体的方法。与抗体制备有关的其它各种方法在，例如，Harlow,et al.,ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(1988)中进行了描述。

如果要求的话，可以对本发明的抗体，例如，8D5-1G10抗体或8D10-C8抗体，或各自的结合位点或CDR进行测序，然后，多核苷酸序列或其序列变体或突变体可以克隆到载体中表达或传播。编码抗体的序列可以保持在宿主细胞的载体内，然后，宿主细胞可以扩大和冷冻供将来之用。细胞培养中重组单克隆抗体的制备可以采用本领域熟悉的方法通过B细胞抗体基因克隆进行。

另一方面，本发明提供一种分离核酸，所述分离核酸包括编码制备本发明重组抗体的序列。

另一方面，本发明提供一种分离核酸，所述核酸包括编码制备本发明重组表位的序列，或一种包括本发明所述表位的分子。但是，本发明的表位也可以合成制备，例如，采用本领域熟悉的任何合成方法制备。

编码核酸的抗体或表位可以具有任何合适的特点和包括任何合适的特点或其组合。因此，例如，编码抗体或表位的核酸可以是DNA、RNA或它们的混合物的形式，可以包括非天然碱基、修饰过的骨架，例如，促进核酸稳定性的硫代磷酸酯骨架，或它们两者。核酸掺入到本发明的表达盒、载体或质粒内比较有利，包括促进靶标宿主细胞中所需表达、复制与/或选择的特点。所述特点实例包括复制组件的起点(origin)、选择基因组件、启动子组件、增强子组件、聚腺苷酸化序列组件、终止组件等，其中许多合适的实例是人们熟悉的。

本发明进一步提供包含本发明所述一种或多种核苷酸序列的重组DNA构建体。这些重组构建体与载体一起使用，例如，质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体，其中插入编码任何本发明抗体的DNA分子。

利用培养基中的连续细胞系采用产生抗体分子的任何方法制备单克隆抗体。制备单克隆抗体的合适方法实例包括Kohler et al.(1975,Nature 256:495-497)描述的杂交瘤方法和人源B-细胞杂交瘤方法(Kozbor,1984,J.Immunol.133:3001；和Brodeur et al.,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications pp 51-63(MarcelDekker,Inc.,1987))。.

此外，本发明提还供药物组合物，包括本发明所述的抗体或免疫原及药学上可接受的载体或赋形剂。

这些药物组合物可以按照本发明以弹丸注射或输注或连续输注的方式施用。适合促进这种施用手段的药物载体是本领域熟悉的。

药学上可接受的载体通常包括与本发明抗体或相关组合物或组合生理上相容的任何和所有合适的溶剂、分散介质、涂料、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的其它实例包括无菌水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的任何组合。

一方面，抗体可与适合要求的施用途径的一种或多种载体结合，抗体可以是，例如与乳糖、蔗糖、淀粉、链烷酸的纤维素酯、硬脂酸、滑石粉、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、阿拉伯树胶、明胶、海藻酸钠、聚维酮、聚乙烯醇中的任何混合，以及可选地，进一步片剂化或胶囊化用于传统施用。或者，抗体可以溶于盐水、水、聚乙二醇、丙二醇、羧基甲基纤维素胶体溶液、乙醇、玉米油、花生油、棉籽油、麻油、黄蓍胶与/或各种缓冲溶液。其它载体、佐剂和施用方式是药学领域熟悉的。载体可以包括控释材料或时间延迟材料，如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯单独使用或与蜡，或本领域熟悉的其它材料一起使用。

其它药学上可接受的载体是本领域熟悉的，例如，REMINGTON'S PHARMACEUTICALSCIENCES中进行了描述。液体配方可以是溶液、乳液或悬浮液，可以包括赋形剂，如悬浮剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂和螯合剂。

本发明还提供药物组合物，其中配制本发明的抗体或免疫原及一种或多种治疗活性剂。将具有要求纯度的所述免疫球蛋白与任选药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，配制本发明抗体或免疫原的稳定制剂，以冻干制剂或水溶液的形式贮存。

体内施用配方特别是无菌的，优选是无菌水溶液形式。通过无菌过滤膜过滤或其它方法，很容易实现这一点。本发明公开的抗体和其它治疗活性剂还可以配制为免疫脂质体，与/或装在微胶囊中。

包含本发明抗体或免疫原的药物组合物的施用可以采用各种方式，包括口服、皮下施用、静脉施用、鼻内施用、耳内施用、经皮施用、粘膜施用、局部施用，例如，凝胶、软膏、洗液、乳膏等，腹膜内、肌肉内、肺内施用，例如，采用可吸入技术或肺部输送系统、阴道、肠胃外、直肠或眼内施用。

肠胃外给药所用示例性剂型包括那些适合皮下、肌肉内或静脉注射的剂型，例如，无菌溶液、乳液或悬浮液。

在一个实施例中，本发明的抗体或免疫原是给对象施用的唯一的治疗活性剂，例如，作为疾病改善或预防单一疗法。

或者，本发明的抗体或免疫原与一种或多种其它治疗或预防剂一起使用，包括但不限于标准疗法，例如，抗生素、类固醇和非-类固醇炎症抑制剂，与/或其它基于抗体的治疗，如采用抗菌剂或消炎剂。

一种综合治疗是特别采用标准治疗方案，例如，用于治疗MDR大肠杆菌感染的方案。这种方案可能包括抗生素，例如替加环素(tygecycline)、利奈唑胺、甲氧苯青霉素与/或万古霉素。

在综合治疗中，抗体以混合物施用，或与一种或多种其它治疗方案共用，例如，联合治疗之前、同时或之后使用。

在某些情况下，免疫原的预防性施用可以采用包括本发明免疫原的疫苗，即单价疫苗。

但是，可以采用包括不同免疫原的多价疫苗，诱导对抗相同或不同靶标病原体的免疫应答。

本发明抗体、免疫原或各药物制剂的生物学特性可以以活体外细胞、组织和整个有机体实验进行表征。正如本领域熟悉的那样，为了测量药物治疗疾病或疾病模型的效力，或测量药物的药代动力学、药效动力学、毒性和其它特性，药物通常在动物体内测试，包括但不限于小鼠、大鼠、兔子、狗、猫、猪和猴子。动物可指的是疾病模型。治疗通常在小鼠中试验，包括但不限于裸鼠、严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠、异种移植小鼠和转基因小鼠(包括敲除或敲入)。这种实验可以提供确定抗体用于治疗或预防的效力的有意义的数据，包括合适的半衰期、效应子功能、(交叉-)中和活性与/或主动或被动免疫治疗的免疫应答。任何有机体，优选哺乳动物，可用于试验。例如，由于与人类的遗传相似性，灵长类动物、猴子是适合的治疗模型，因此，可用于试验试剂或组合物的功效、毒性、药代动力学、药效动力学、半衰期或其它特性。药物要获得批准，最终需要在人体内进行试验，因此，当然需要设计这些实验。因此，本发明的抗体、免疫原和各药物组合物可以在人体内试验，确定其治疗效果或预防效果、毒性、免疫原性、药代动力学与/或其它临床特性。

本发明还提供本发明的抗体用于诊断目的，例如，在检测和定量测定生物流体样品中细菌负荷或作为免疫试剂的抗体或靶标的浓度的方法中使用。

本发明还提供检测生物标本，例如，包含MDR大肠杆菌的标本，如体液中脓毒病程度或MDR大肠杆菌感染程度的方法，包括将标本与本发明的抗体接触的步骤。本发明的抗体可以在任何熟悉的试验方法中使用，如竞争结合试验、直接或间接夹心法、免疫沉淀法和酶联免疫吸附法(ELISA)。

优选的诊断分析执行如下。将靶标抗原特异性抗体定植在乳胶珠粒上，其与体液中存在的或从体液分离的细菌一起培养。在细菌表面上表达的对应同源抗原存在的情况下，由于彩色乳胶珠粒聚集，裸眼可以检测到阳性反应。

本发明使用的体液包括对象的生物标本，如组织提取液、尿液、血液、血清、大便和粘液。

在一个实施例中，所述方法包括在允许抗体附着到固相支持体表面的条件下，采用与靶标特异性形成复合物的过量的某种类型的抗体片段接触载体。得到的附着有抗体附在的固体支持体随后用生物流体标本接触，从而生物流体中的靶标与抗体结合，形成靶标-抗体复合物。所述复合物可以采用可检测的标记物进行标记。或者，靶标或抗体可以在形成复合物之前进行标记。例如，可检测的标记(标签)可以与抗体结合。然后，所述复合物可以检测和定量测定，从而检测和定量测定生物流体样品中靶标的浓度。

针对具体应用，本发明的抗体与标记或报告分子结合，标记或报告分子选自有机分子、酶标记、放射性标记、彩色标记、荧光标记、显色标记、发光标记、半抗原、地高辛配基、生物素、金属络合物、金属、胶体金以及它们的混合物。与标记或报告分子结合的抗体可用于，例如，试验系统中或诊断方法中，例如，用于诊断MDR大肠杆菌感染或与其有关的病情。

本发明的抗体可以与其它分子结合，可以在，例如，结合试验(如ELISA)和结合研究中简单检测出所述结合。

本发明的另一个方面提供一种包括抗体的试剂盒，所述试剂盒除一种或多种抗体之外，还可以包括各种诊断剂或治疗剂。试剂盒还可以包括诊断方法或治疗方法的说明书。所述说明书可以，例如，提供在试剂盒中包含的装置上，例如，用于以诊断目的用于准备生物标本的工具或装置，如在测定MDR大肠杆菌负荷以诊断疾病之前，分离含细胞与/或蛋白质的组分。

有利地，所述试剂盒包括抗体和诊断剂或试剂，其可在本发明所述的一种或多种诊断方法中使用。在另一个优选的实施例中，试剂盒包括抗体，例如，冻干形式的抗体，任选包括说明书和重建冻干产物的介质与/或药学上可接受的载体，可在使用之前将它们混合，形成近期施用的注射组合物。

命名为8D5-1G10和8D10-C8的抗体，特别是任何抗体轻链与/或重链，进一步通过保藏在DSMZ(德国微生物菌种保藏中心)-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen,Mascheroder Weg 1b/Inhoffenstraβe 7B,38124Braunschweig(DE)中的生物材料表征。

保藏涉及转化的大肠杆菌培养基，每个培养基包含克隆有感兴趣的基因插入的质粒。感兴趣的基因是小鼠单克隆抗体8D5-1G10(lgG3)的重链和轻链的可变区，及小鼠单克隆抗体8D10-C8(lgG2b)的重链和轻链。

DSM 26763是采用含8D5-1G10轻链(8D5-1G10-LC)可变区编码序列的质粒转化的大肠杆菌宿主细胞。大肠杆菌8D5-1G10-VL＝DSM 26763，保藏日期：2013年1月15日；保藏人：Arsanis Biosciences GmbH，奥地利，维也纳。

DSM 26762是采用含8D5-1G10重链(8D5-1G10-HC)可变区编码序列的质粒转化的大肠杆菌宿主细胞。大肠杆菌8D5-1G10-VH＝DSM 26762，保藏日期：2013年1月15日；保藏人：Arsanis Biosciences GmbH，奥地利，维也纳。

DSM 28171是采用含8D10-C8轻链(8D10-C8-LC)可变区编码序列的质粒转化的大肠杆菌宿主细胞。大肠杆菌8D10-C8-VL＝DSM 28171，保藏日期：2013年12月11日；保藏人：Arsanis Biosciences GmbH，奥地利，维也纳。

DSM 28172是采用含8D10-C8重链(8D10-C8-HC)可变区编码序列的质粒转化的大肠杆菌宿主细胞。大肠杆菌8D10-C8-VH＝DSM 28172，保藏日期：2013年12月11日；保藏人：Arsanis Biosciences GmbH，奥地利，维也纳。

下述定义的主题被视为是本发明的实施例：

1.与多重抗药性(MDR)大肠杆菌菌株的O25b抗原特异性结合的分离抗体。

2.根据定义1所述的抗体，所述抗体与大肠杆菌的O25b抗原和O25抗原交叉特异性结合，与/或与O25a抗原相比，优先与O25b抗原结合，优选地，采用免疫测定法测定时，其与抗O25(此处称为O25a)大肠杆菌菌株的多克隆血清结合O25b抗原相比亲和力更高，与抗O25a菌株的多克隆分型血清相比亲和力更高，优选所述抗体与O25b抗原和O25a抗原的结合亲和力至少相等，结合亲和力采用免疫测定法，优选采用蛋白质印迹法、ELISA或其它免疫学方法测定。

3.根据定义1或2所述的抗体，其中O25b抗原在一个或多个ST131-O25b:H4菌株中占优势地位。

4.根据定义1至3任一项所述的抗体，其中所述抗体识别的表位位于胶囊和非胶囊ST131-O25b:H4菌株表面上。

5.根据定义1至4任一项所述的抗体，所述抗体具有全长单克隆抗体或其抗体片段的结合位点，包括至少一个掺入到结合位点的抗体域，抗体优选是选自鼠科动物、美洲驼马、兔子、羊、牛、嵌合抗体、人源化抗体或人源抗体、重链抗体、Fab、Fd、scFv和单域抗体，如VH、VHH或VL，优选是人IgG1抗体。

6.根据定义1至5任一项所述的抗体，所述抗体与O25b抗原结合的亲和力Kd小于10^-7M，优选小于10^-8M。

7.根据定义1至6任一项所述的抗体，所述抗体在包含活的野生型MDR大肠杆菌菌株的血清标本中显示具有体外杀菌效力，与/或刺激吞噬细胞对活的野生型MDR大肠杆菌菌株的体外吸收。

8.根据定义1至7任一项所述的抗体，其中所述抗体结合的表位与命名为8D5-1G10或8D10-C8的抗体相同。

9.根据定义1至8任一项所述的抗体，其中所述抗体包含与命名为8D5-1G10或8D10-C8的抗体相同的结合位点。

10.根据定义1至9任一项所述的抗体，其中所述抗体来源于抗体，其特征是可变区，所述抗体

-从保藏号为DSM 26763与/或DSM 26762的宿主细胞或其功能活性变体获得；或

-从保藏号为DSM 28171与/或DSM 28172的宿主细胞或其功能活性变体获得；或

11.根据定义10的抗体，包括A

(a)利用保藏号为DSM 26763的宿主细胞制备或得到的抗体轻链可变区；与/或

(b)利用保藏号为DSM 26762的宿主细胞制备或得到的抗体重链可变区；

(c)或(a)与/或(b)的功能活性变体，

或B

(a)利用保藏号为DSM 28171的宿主细胞制备或得到的抗体轻链可变区；与/或

(b)利用保藏号为DSM 28172的宿主细胞制备或得到的抗体重链可变区；

(c)或(a)与/或(b)的功能活性变体。

12.根据定义10或11所述的抗体，其中所述功能活性变体包括氨基酸序列一致性至少60％的CDR。

13.根据定义10至12任一项所述的抗体，其中所述功能活性变体与母抗体在氨基酸序列中的至少一个点突变不同，优选在CDR中，其中每个CDR氨基酸序列中点突变的数量是0、1、2或3。

14.包含核苷酸序列的质粒，A

-对保藏号为DSM 26763的宿主细胞中包含的命名为8D5-1G10-LC的抗体轻链可变区编码；与/或

-对保藏号为DSM 26762的宿主细胞中包含的命名为8D5-1G10-HC的抗体重链可变区编码；

或B

-对保藏号为DSM 28171的宿主细胞中包含的命名为8D10-C8-LC的抗体轻链可变区编码；与/或

-对保藏号为DSM 28172的宿主细胞中包含的命名为8D10-C8-HC的抗体重链可变区编码；

15.包含编码序列的表达盒，用于表达权利要求1至13中任一项所述抗体的轻链与/或重链，所述表达盒或编码序列来源于定义14所述的质粒。

16.定义1至13中任一项所述抗体的制备方法，其中利用权利要求14的质粒或定义15所述的表达盒转化宿主细胞。

17.包含定义14所述质粒或定义15所述表达盒的宿主细胞。

18.根据定义17所述的宿主细胞，所述宿主细胞的保藏号是

A

-DSM 26763与/或DSM 26762；

或B

-DSM 28171与/或DSM 28172。

19.根据定义1至13中任一项所述抗体的制备方法，其中权利要求17或18所述的宿主细胞在一定条件下培养或保持，以制备所述抗体。

20.一种鉴定候选抗体的方法，包括：

(a)提供包含抗体或抗体产生细胞的样品；及

21.一种鉴定候选抗体的方法，包括：

(a)提供包含抗体或抗体产生细胞的样品；及

(b)对样品中的抗体或样品产生的抗体与ST131-O25b:H4菌株的O25b抗原及非-MDR大肠杆菌菌株的O25a抗原的结合进行评价，其中相对O25a抗原，抗体与O25b抗原之间的特异性阳性反应鉴定该抗体为候选抗体。

22.一种制备定义1至13任一项所述抗体的方法，包括

(a)提供一种根据权利要求20或21所述鉴定的候选抗体；及

(b)制备一种单克隆抗体，或人源化候选抗体或人源候选抗体，或其与候选抗体具有相同表位结合特异性的衍生物。

23.一种制备定义1至13任一项所述抗体的方法，包括

(a)采用命名为8D5-1G10或8D10-C8识别的表位对动物进行免疫；

(b)从分离的B-细胞形成永生化细胞系；

(c)筛选b)中获得的细胞系，鉴定产生与表位结合的单克隆抗体的细胞系；及

(d)产生所述单克隆抗体，或人源化抗体或人源抗体，或其与所述单克隆抗体具有相同表位结合特异性的衍生物。

24.一种制备定义1至13任一项所述抗体的方法，包括

(b)从分离的B-细胞形成永生化细胞系；

(c)筛选细胞系，鉴定产生单克隆抗体的细胞系，相对于大肠杆菌的O25a抗原，所述单克隆抗体优先与O25b抗原结合；及

25.根据定义1至13任一项所述的抗体，用于处理承受MDR大肠杆菌感染风险或遭受MDR大肠杆菌感染的对象，包括使对象服用有效剂量的抗体，限制对象的感染或使所述感染引起的病情好转，优选用于治疗或预防肾盂肾炎、第二次菌血症、脓毒病、腹膜炎、脑膜炎和呼吸机相关性肺炎。。

26.根据定义25所述的抗体用途，用于消灭MDR大肠杆菌，优选ST131-O25b:H4菌株，而不考虑该菌株表达的荚膜多糖。

27.根据定义25或26所述的抗体用途，其中所述抗体以肠胃外或粘膜剂型施用。

28.根据定义1至13中任一项所述抗体的药物制剂，优选包含肠胃外或粘膜剂型，任选包含药学上可接受的载体或赋形剂。

29.根据定义1至13中任一项所述抗体的诊断用途，用于测定表达LPS O25b抗原的MDR菌株导致的大肠杆菌感染，如上下尿路感染，包括膀胱炎或尿道炎，上行性或血源性肾盂肾炎，特别是糖尿病患者中的，以及菌血症、脓毒病、腹膜炎或肠道定植。

30.根据定义29所述的抗体用途，其中通过用所述抗体接触对象的体液样品，体外测定对象的全身性MDR大肠杆菌感染，其中抗体的特异性免疫反应确定该感染。

31.根据定义29或30所述的抗体用途，其中测试体液样品的特异性免疫反应，样品选自尿液、血液、血液分离物或血液培养、抽出物、唾液、插管患者灌洗液和大便。

32.根据定义29至31中任一项所述的抗体用途，其中根据临床标本中回收的纯大肠杆菌培养物，体外测定大肠杆菌的血清型。

33.根据定义1至13中任一项所述抗体的诊断制剂，任选包含带标记的抗体与/或其它带标记的诊断试剂，与/或固定至少一种抗体和诊断试剂的固相。

34.命名为8D5-1G10或8D10-C8的抗体识别的分离表位。

35.一种免疫原，包括：

(a)定义34所述的表位；

(b)任选其它与(a)中所述表位非天然相关的表位；及

(c)载体。

36.根据定义35所述的免疫原，其中所述载体是药学上可接受的载体，优选包含缓冲物质与/或佐剂。

37.根据定义35或36所述的免疫原，所述免疫原在疫苗配方中，优选肠胃外使用。

38.根据定义35至37中任一项所述的免疫原，用于通过施用有效剂量的所述免疫原处理对象，以保护对象免被MDR大肠杆菌感染，或预防所述感染引发的疾病。

39.根据定义38所述的免疫原，用于引发保护性的免疫应答。

40.编码定义1至13中任一项所述抗体或定义35所述表位的分离核酸。

参照下述实例将更充分地理解前述说明。但是，这些实例仅仅只是本发明实践一个或多个实施例的方法代表，不应视为限制本发明的范围。

实例

实例1：O25b特异性抗体

我们通过用盒编码卡那霉素抗性代替kps簇(编码胶囊合成)，产生了代表性ST131-O25b:H4菌株81009(81009△kps::kan,[Szijarto et al,FEMS Microbiol Lett,2012,332:131-6])的非胶囊化突变体。这种突变体菌株的亚致死剂量的活细胞或甲醛-灭活细胞用于免疫小鼠4次，间隔时间为两周。然后，对从小鼠获得的血清样品进行分析，而具有抗O25b抗原最高IgG滴度的小鼠脾脏(ELISA、免疫蛋白印迹法和表面染色)用于杂交瘤产生。在亚克隆之后，选择几个杂交瘤克隆，所述克隆分泌对纯化O25b抗原具有特异性且与表达O25b抗原的活的野生型大肠杆菌菌株表面结合的抗体。这些从杂交瘤上清液纯化的mAbs用于进一步测试。

如图1所示，所有抗体与确定为ST131-O25b:H4菌株的几种不同临床分离菌结合，与表达的荚膜多糖无关(K5、K2或未知K类型)。关于与表达O25a抗原的菌株结合，鉴定了两种mAbs类型。一类由mAb 8D5-1G10表示，未与O25a菌株表面结合，另一类以8D10-C8表示的mAbs对O25a菌株具有交叉反应性。但是，这些mAbs中没有一种可与表达不相关抗原，即O2(图1)或其它O-型(未画出)的任何大肠杆菌菌株结合。

采用纯化LPS，通过免疫印迹分析，进一步证实了mAbs的特异性(图2)。这些mAbs从含有O25b抗原的ST131菌株中识别LPS分子，但是，它们对O25a LPS抗原的交叉反应潜力不同。虽然mAb 8D5-1G10只与O25b抗原反应，但mAb 8D10-C8对O25a具有交叉反应性。将这种观察的交叉反应性与日常用于检测ST131:O25b菌株的商业O25分型血清(Statens SerumInstitut,high titer E.coli O25antiserum,#81369)显示的交叉反应性进行了对比。与O25b LPS相比，商业兔子血清显示出明显偏向结合O25a抗原。相比之下，鼠源性mAb 8D10-C8与O25b LPS分子反应，强度与O25a分子至少相同。随后的定量分析表明，mAb 8D10-C8与商业分型血清相比时，O25b和O25a的结合强度比至少高10倍。

上述数据共同表明，有两种类型的O25b-特异性mAbs，这些mAbs对O25b具有高度特异性，并识别O25a和O25b抗原共享的表位。因此，我们的数据证明，O25b的结构确实与经典O25(即O25a)抗原不同。O25b亚单位的新结构将在实例2中进行阐明。

采用RT-PCR，以及变性的重链和轻链引物，从杂交瘤克隆中扩增出O25b-特异性mAbs的重链(VH)和轻链(VL)的可变区，并测序。采用Ig数据库的BLAST以及IMGT/V-QUEST分析序列，而CDR区根据Kabat命名法定义。

将mAb 8D5-1G10的可变轻链和重链序列克隆到各自的载体内，用于转化保藏在DSMZ中的保藏号为DSM 26763和DSM 26762的大肠杆菌宿主细胞。

将mAb 8D10-C8的可变轻链和重链序列被克隆到各自的载体内，用于转化保藏在DSMZ中的保藏号DSM 28171和DSM 28172的大肠杆菌宿主细胞。

实例2：O25b抗原的结构分析

采用热酚/水法分离大肠杆菌ST131的LPS，并采用透析、蛋白酶K消化和超速离心法对其进行纯化。LPS制剂的平均收率是干细菌质量的2.61％。采用SDS-PAGE分析LPS，表明组分由不同数量寡糖重复单元(RU)取代的核心寡糖(OS)及未取代核心寡糖组成。O-特异性多糖(O-PS)和不同的寡糖成分通过弱酸水解释放，并通过在Bio-Gel P-10上进行凝胶过滤分离。通过糖分析和甲基化分析、NMR光谱分析和MALDI-TOF质谱(MS)分析各组分。

O-PS RU的结构采用一个单RU取代的核心OS组成的组分测定。单糖分析表明，存在Rha、Glc、Gal、Hep和更少量的GlcN。鉴别了等摩尔数量的末端Rhap、末端Glcp、3,6-取代Glcp、3-取代Rhap及痕量3-取代GlcpN的衍生物，并命名为O-PS RU。7-取代Hepp、6-取代Glcp、2-取代Glcp、末端Galp、3,6-取代Glcp和末端Hepp的余下部分甲基化糖醇乙酸酯构成了K-12型的核心寡糖。由于分别被P和PPEtn取代及存在羧基，在标准甲基化和糖分析中无法检测出3,4-取代Hepp、3,4,7-取代Hepp和Kdo的衍生物。

LPS ST131的O-特异性PS的RU结构采用NMR光谱法测定。O-PS ¹H和¹³C共振的全面归属通过综合COSY、TOCSY和NOESY得到的信息以及HSQC-DEPT、HMBC和HSQC-TOCSY实验获得。

¹H、¹³C HSQC-DEPT光谱包含13个端基质子和碳，以及一个Kdo自旋系统的信号。这些信号来源于核心寡糖以及O-特异性PS的一个RU。高电场区包含O-乙酰基的一个CH3的信号、N-乙酰基的一个CH3的信号，以及两个6-脱氧糖的CH3特有的高磁场信号(Rha)。光谱表明研究的寡糖具有十四糖结构。由于与P、PP和PEtn相关的高异质性，对非-还原端的八糖的全面自旋系统进行了全面的分辨，重点是RU结构及其与K-12核心OS的连接。

HMBC谱图显示，相邻糖残基之间的残基间连接性采用NOESY和HMBC实验观察。连接位置处端基质子和碳之间以及连接位置处端基碳和质子之间出现交叉峰，这证明多糖的非还原区中糖残基的序列。

根据这些测定，确定了O25b-特异性PS的重复单元(图3(a))，所述重复单元是戊多糖，其中以→3)-β-GlcpNAc(残基K)作为RU的残基，取代了核心OS：→7)-α-Hepp(残基L)的第一个残基。由于更长PS组分的可能污染，通过O-特异性链后面的RU无法鉴定第一个RU的取代位置。此外，不需要对这些组分进行进一步详细的结构分析，可以排除后面重复单元中存在作为α-端基异构体的GicNAc(据之前报道，某些大肠杆菌脂多糖存在GicNAc)。

采用MALDI-TOF MS确认了核心OS、被一个RU取代的核心OS及最终O-PS RU(数据未显示)的分子量。所有谱图都根据此处阐明的LPS ST131的RU结构及前面鉴定的K-12核心OS的糖型进行解释(Duda et al.Microbiology.2011Jun；157(Pt 6):1750-60.doi:)10.1099/mic.0.046912-0.Epub 2011Mar 3；Muller-Loennies et al.J BiolChem.2003Sep 5；278(36):34090-101.Epub 2003Jun 20)。低分辨率谱图的MALDI-MS分析显示，由更短O-PS取代的核心OS组成的组分具有下述优势离子的离子簇：m/z 2797.2、m/z3659.6、m/z 4522.0和m/z 5383.6，属于分别被1、2、3和4个RU取代的核心OS(具有P和PPEtn)。这些离子的平均质量差是862.1Da，并与O-特异性PS RU计算的平均质量匹配(861.8Da，RU-H20)。

考虑到RU的分子量，并对比其它组分的MS结果，我们证明了作为第一RU取代地点的外核心区中存在由→7)-α-Hepp-(1→6)-α-Glcp二糖组成的更长核心OS糖型(图3(a))。已经证明，LPS ST131由两种主要核心寡糖(OS)糖型组成。糖型的类型取决于存在或不存在O-特异性PS。未取代的核心寡糖的主要糖型是截短型的K-12核心寡糖，去掉了→7)-α-Hepp-(1→6)-α-Glcp二糖。这种二糖是O-PS取代核心OS和未取代核心OS之间的区别。

实例3：大肠杆菌O25b特异性诊断分析

遵照生产商的说明，将O25b-特异性mAb 8D5-1G10与直径1μm的乳胶珠粒(Polysciences)结合。测定结合的乳胶珠粒凝集不同大肠杆菌菌株的潜力。将一菌环细菌(大约10⁸cfu)与10μl PBS中1％的mAb-结合的乳胶珠粒悬浮液混合。如图4所示，在温和地搅拌几秒钟后，表达O25b抗原的大肠杆菌显示强烈的凝集模式。相反，表达O25a或O2抗原的大肠杆菌不与同一试剂凝集。因此，这种推定诊断剂被认为比本领域目前用于检测O25b(和O25a)-阳性大肠杆菌的凝集试剂(即多克隆抗O25兔子血清)更具特异性。

此外，由于在凝集分析中推荐将商业抗-O25血清与加热杀灭(即细胞溶解)的大肠杆菌细胞一起使用，我们测试了，纯化或与乳胶珠粒结合的O25b mAbs是否具有更高的灵敏度，即其在完整的荚膜多糖存在下，是否能够凝集活的大肠杆菌细胞。对多种O25b临床分离菌进行测试，某些代表性菌株的结果在表I中给出。发现下述两方面的灵敏度得到改进：i)代表性菌株#1和#2与游离的或结合珠粒的非加热杀灭形式(直接从琼脂板取的活细菌)的O25b-特异性mAbs可以凝集，而采用商业O25兔子血清的凝集要求事先加热溶解细菌)，ii)代表性菌株#3和#4即使在热杀灭形式时也不能够与商业血清凝集，而采用纯化mAb 8D5-1G10时，同样的溶菌产物得到阳性结果。重要的是，当同样的抗体与乳胶颗粒结合时，甚至与天然细菌细胞也存在凝集作用。这些结果表明了凝集分析中珠粒-结合mAbs优异的灵敏度，这一点得到了以下事实的证明：采用这种试剂时，即使不进行任何预处理(即不产生加热杀灭的溶菌产物)，目前测试的所有O25b阳性大肠杆菌菌株都呈阳性凝集。此外，采用这种试剂作为检测O25b-表达细菌的诊断工具，与基于PCR的技术相比更具优势，而基于PCR的技术仅给出实际表达靶标抗原的细菌的阳性结果。例如，表I中的代表性菌株#5对诊断中日常使用的O25b特异性基因呈PCR阳性，但是，在任何凝集分析中均呈阴性。这种菌株已经证明显示出粗糙的LPS显型(没有表达O-抗原)，因此，PCR结果可视为假阳性。当这种试验用于伴随诊断时，即用于选择可从O25b特异性治疗方法中受益的感染表达O25b的大肠杆菌菌株的患者时，避免这种假阳性非常重要。

还对用乳胶珠粒-结合mAbs检测游离O25b LPS分子的潜力进行了试验。将1-1000ng不同量的高度纯化O25b LPS与10ul PBS中1％的珠粒悬浮液进行培养。如图5所示，可以看到剂量依赖性凝集模式：100ng游离LPS时的结果最好，在1000或10ng时仍能检测到凝集作用，而在1ng游离O25b LPS时检测不到凝集作用。

表I：利用商业O25分型血清和O25b特异性mAb 8D5-1G10得到的不同O25b菌株的凝集结果对比

实例4：O25b特异性mAbs的抗菌作用

在致命的鼠源性菌血症模型中对O25b-特异性mAbs(对O25a具有或不具有交叉反应性)的潜在保护作用进行了测试。对各组的5只小鼠腹膜内接受100μg纯化8D5-1G10或8D10-C8。24小时后，小鼠挑战静脉内注射(之前在预试验中确定的)致死剂量的表达O25b抗原的大肠杆菌菌株81009(2x10⁸CFU/小鼠)。每天对小鼠的致死率进行监测，监测3周。图6显示了2个独立实验的组合结果，两个实验的结果类似。在监测的3-周感染后期间，采用PBS免疫的90％的小鼠模拟死于感染，两种试验的mAbs的存活率呈统计学(时序检验(Logranktest))上显著增加。

为了确证这种体内数据，还对纯化mAbs的杀菌作用进行了体外试验。将2ml对数生长中期的大肠杆菌81009培养基用PBS清洗2次，重新悬浮至最终浓度为5x10⁵CFU/ml。将10μl这种细菌悬浮液在4℃用4μg各mAbs培养15分钟，mAbs用40μl RPMI-1640缓冲液稀释，其中补充3％人白蛋白。然后，将50μl合并的人血清(前面吸收了大肠杆菌菌株81009)加入到反应中，在37°培养1、2和3小时。反应中最终的CFU和抗体浓度分别是5x10⁴CFU/ml和40μg/ml，总体积是100μl。将10μl等分样放到TSB板上，在规定时间点进行菌落计数。

如图7所示，在3小时研究期内，测试的两种mAbs能够显著地降低CFU。与此相反，与不相关mAb混合或无抗体混合的细菌在此介质中显示恒定的增长。补体在血清标本中是失活时(在56℃培养30分钟)，未观察到任何mAbs杀灭任何细菌(数据未显示)。这些结果证明，这两种O25b-特异性mAbs可以启动补体介导杀菌作用。

Claims

1.一种分离单克隆抗体，所述抗体特异性识别多重抗药性(MDR)大肠杆菌菌株的O25b抗原，

其中所述抗体结合的表位与命名为8D5-1G10或8D10-C8的抗体相同，其中，

A

抗体8D5-1G10包括：

a)以保藏号DSM 26763保藏的宿主细胞产生的抗体轻链可变区；和

b)以保藏号DSM 26762保藏的宿主细胞产生的抗体重链可变区；

以及

B

抗体8D10-C8的包括：

a)以保藏号DSM 28171保藏的宿主细胞产生的抗体轻链可变区；和

b)以保藏号DSM 28172保藏的宿主细胞产生的抗体重链可变区。

2.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体具有全长单克隆抗体或其抗体片段的结合位点，包括至少一个掺入到结合位点的抗体域。

3.根据权利要求2所述的抗体，所述抗体具有全长单克隆抗体或其抗体片段的结合位点，包括至少一个掺入到结合位点的抗体域，其结合O25b抗原的亲和力Kd小于10^-7M。

4.包含核苷酸序列的质粒，所述序列编码权利要求1-3中任一项所述的抗体。

5.包含编码序列的表达盒，用于表达权利要求1至3中任一项所述抗体的轻链与重链。

6.包含权利要求4所述质粒或权利要求5所述表达盒的宿主细胞。

7.制备权利要求1至3中任一项所述抗体的方法，其中权利要求6所述的宿主细胞在一定条件下培养或保持，以制备所述抗体。

8.一种鉴定候选抗体的方法，包括：

(a)提供包含抗体或抗体产生细胞的样品；及

(b)评价抗体与指定为8D5-1G10或8D10-C8的抗体的相同表位的结合，其中

A

抗体8D5-1G10包括：

b)以保藏号DSM 26762保藏的宿主细胞产生的抗体重链可变区；

以及

B

抗体8D10-C8的包括：

b)以保藏号DSM 28172保藏的宿主细胞产生的抗体重链可变区，

其中抗体与表位之间的阳性反应鉴定该抗体为候选抗体。

9.一种制备权利要求1至3中任一项所述抗体的方法，包括

(a)提供一种根据权利要求8所述的方法鉴定的候选抗体；及

(b)制备一种单克隆抗体，或人源化候选抗体或人源候选抗体，或与候选抗体具有相同表位结合特异性的抗体。

10.生产根据权利要求1至3中任一项所述的抗体的方法，所述抗体用于承受MDR大肠杆菌感染风险或遭受MDR大肠杆菌感染的对象的处理，所述处理包括使对象服用有效剂量的抗体，限制对象的感染或使所述感染引起的病情好转，用于治疗或预防肾盂肾炎、第二次菌血症、脓毒病、腹膜炎、脑膜炎和呼吸机相关性肺炎。

11.一种权利要求1至3中任一项所述抗体的药物制剂，包含肠胃外或粘膜剂型。

12.权利要求1至3中任一项所述的抗体在制备诊断制剂中的用途，所述抗体用在诊断分析中以测定表达LPS O25b抗原的MDR菌株在对象中导致的大肠杆菌感染。

13.根据权利要求12所述的用途，其中诊断分析用于测定上尿路感染或下尿路感染、菌血症、脓毒病、腹膜炎或肠道定植。

14.根据权利要求13所述的用途，其中所述上尿路感染或下尿路感染是膀胱炎或尿道炎，上行性或血源性肾盂肾炎中的任一种。

15.一种适于皮下或肌内注射给药的药物制剂，包括：

(a)LPS O-抗原，所述LPS O-抗原是O25b抗原，所述O25b抗原包括O25b重复单元的结构

(b)任选其它与(a)中所述LPS O-抗原非天然相关的表位；及

(c)药学上可接受的载体。

16.一种疫苗，包含多重抗药性(MDR)大肠杆菌ST131-O25b：H4菌株的LPS O-抗原和佐剂，所述LPS O-抗原由权利要求1至3中任一项所述的抗体特异性识别。

17.一种疫苗，包含LPS O-抗原和佐剂，所述LPS O-抗原是O25b抗原，所述O25b抗原包括O25b重复单元的结构

18.编码权利要求1至3中任一项所述的抗体的分离核酸分子。