TR201807924T4 - MDR e. koli spesifik antikor. - Google Patents

Abstract

Konu, çoklu ilaca dirençli (MDR) E. koli suşlarının O25b antijenine spesifik olarak bağlanan izole edilmiş bir antikora, onun tıbbi ve diagnostik kullanımına, antikorun üretiminde kullanılan izole edilmiş bir nükleotid dizisi, plazmidler ve konakçı hücreleri içeren antikoru üretme yöntemi; ve ayrıca, spesifik antikoru tanıyan izole edilmiş bir epitope ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME MDR E. KOLI SPESIFIK ANTIKOR Bulus, çoklu ilaca dirençli (MDR) E. Koli susun LPS 025b antijenine spesifik olarak baglanan bir antikoru ile ilgilidir.

BULUSUN ARKA PLANI Lipopolisakkarit (LPS), enterobakteriyel patojenlerin yüzeyindeki en bol miktarda antijendir. Tipik olarak, LPS üç yapisal parçaya sahiptir: i) Lipid A (endotoksin olarak da bilinir), ii) çekirdek oligosakkarit ve iii) O-antijen. Ikincisi, 3-6 sekerin tekrarli alt birimlerinden olusur (serotipe bagli olarak). Lipit A ve çekirdek OS, tek bir enterobakteriyel tür içinde nispeten iyi korunmustur, ancak antikorlara erisimleri sinirlidir. Diger taraftan, O-antijenleri oldukça erisilebilirdir, fakat yapilarina göre çok çesitlidir (E.koli de -180 farkli 0 tipi vardir).

O-antijenlerine karsi antikorlar, E.koli yüzeyine baglanabilmektedir, dolayisiyla hem teshis için (örnegin epidemiyoloji çalismalari için O-tipi) hem de terapötik önlemler olarak önerilmektedir. Fakat, büyük yapisal degiskenlik göz önüne alindiginda, O- antijene özgü antikorlarla genis spektrumlu koruma zahmetlidir.

E. koli'nin neden oldugu ekstraintestinal enfeksiyonlar yaygin morbidite ve mortaliteye neden olur. E.koli nin çoklu ilaca dirençli (MDR) suslari, son zamanlarda ortaya çikan önemli bir oranda E. koli enfeksiyonlarina neden olur.

Bu MDR suslarina karsi tedavi seçenekleri, klinik olarak ilgili birçok antibiyotik sinifina direnç gelistirdiklerinden, çok sinirli olmaktadir. Bu nedenle, alternatif bir tedavi seçenegi, örn. Monoklonal antikorlarla pasif immünizasyon (mAbs), gelecek için büyük bir vaattir.

Geçmis yillarda, tüm ekstraintestinal E. koli enfeksiyonlarin yaklasik % 10'una ve MDR E.k01i. enfeksiyonlarin (Peirano ve arkadaslari Int J Antimicrob Agents 2010 yarisina neden olan MDR E.k01i nin iyi tanimlanmis bir klonal soyu ST131-025b: H4 ortaya çikmistir. Bu soya ait suslar sinirli heterojenlik gösterdiginden, antijenik repertuar açisindan çok benzer olarak düsünülebilir. Bu soya ait suslarin büyük çogunlugu 025b antijenini ve dolayisiyla bu antijeni sentezleyen enzimleri kodlayan spesifik bir gen (LPS sentez lokusunda) bu klonun tanimlanmasi için kullanilir olarak, 025 tipli serum ile aglütinasyon kullanilabilir, ancak bu soyunun O antijeni genetik farkliliklar tarafindan önerilen klasik 025 antijenden (dolayisiyla 025b olarak adlandirilmisti) farklidir. Fakat, 025 tipli serum, MDR olmayan 025 ve MDR 025b klonlari arasinda ayrim yapamaz.

STl3l susnun üç ana özelliklerini, yani serogrup (025b), filogenetik grubu (B2) ve ST (ST131) ile saptanmasini tanimlar. Bu özelliklerin her biri, saptamaya yardimci olmak için açiklanmistir. Çesitli moleküler teknikler açiklanmaktadir, yani MLST, PCR-bazli hizli tespit yöntemleri, tekrarlayan dizi PCR ve PFGE. Çesitli immünoglobulinler içeren poliklonal antisera (bir 025a susuna karsi yükseltilmistir), alt tiplerin ayristirilmasinda degil, 025 antijenini belirlemek için kullanilmistir. virülan / mulezeztant tipine bagli 025b alt grubu için pozitif olan suslarin soyulma özelliklerini ve genetik afinitelerini tanimlamaktadir. Insan klinik izolatlari analiz edilmis ve serotipler olarak siniflandirilmis ve virülans marker profilleri elde edilmistir. 025 pozitif suslar, poliklonal antiseranin O-antijenleri - 01 ila 0173`e karsi serotiplenmesi ile tanimlanmistir. 025 pozitif suslar ayrica, therfb025b altgrup gen lokusunu hedef alan bir allel-spesifik PCR ile genotiplemeye tabi tutulmustur. arasinda bazi klonal gruplarin ortaya çikisini tarif etmektedir. 0 yazimi spesifik O antisera (poliklonal) ile yapildi.

E. koli için spesifik bir allele özgün pabBPCR analizini açiklar. çekirdek yapisina dayanarak izole eden E. koli sus'nun moleküler tiplendirmesini tarif etmektedir. Izolatlarin çekirdek tipi, çekirdek operondaki genleri hedefleyen ve sirasiyla Rl-4 ve K-12 çekirdek tiplerine spesifik olan primerler kullanilarak PCR ile belirlenmistir.

BULUSUN ÖZETI Mevcut bulusun amaci, LPS 025b tasiyan suslarin neden oldugu E. koli enfeksiyonlarinin önlenmesi veya tedavisi için kullanilacak olan gelismis spesifite sahip E. kolinin MDR suslarina yönelik bir antikor saglamaktir. Ayrica, MDR E. koli bakterilerini hizli ve güvenilir bir sekilde teshis edebilen araçlar ve yöntemler saglama amaci da vardir.

Amaç, mevcut bulusun konusuyla çözülmektedir.

Bulusa göre, çoklu ilaca dirençli (MDR) E. koli suslarin 025b antijenini spesifik olarak taniyan bir antijen baglama bölgesi içeren izole edilmis bir antikor temin edilmistir.

Spesifik olarak, antikor bir m0n0klonal antikordur. antijenleri tarafindan paylasilan bir epitopu baglamak için çapraz spesifiktir. çapraz spesifiktir, örn. esit, esit, benzer veya farkli yakinliklar ile. Özellikle burada tarif edilen, tercihen, E. koli'nin 025a antijenine göre 025b antijenine veya en azindan her iki antijene karsi esit afiniteye baglanan bir antikordur.

Spesifik bir düzenege göre antikor, 025a antijeni ile 025b antijenine, özellikle en az iki kat farkla, veya 025b veya 025a antijenin baglanmasinda, ör. yakinlik ve / veya avidite farki, en az iki kat, veya en az üç kat, veya en az dört kat, en az bes kat, hatta en az 10 kat fark için en az iki kat daha yüksek bir afiniteye sahiptir.

Spesifik bir özellige göre, 025b'ye spesifik baglanma, 025b antijeninin, 025b antijeninin immunoassay olarak, tercihen immünoblotlama, ELISA veya diger immünolojik yöntemlerle belirlendigi gibi 025 veya O25a E. koli suslarina karsi yükseltilmis bir poliklonal serum ile baglanmasi ile karsilastirildiginda daha yüksek afinite ile karakterize edilir. Daha yüksek baglanma afinitesi, özellikle, en az iki kat fark veya en az üç kat, en az dört kat, en az 5 kat, hatta en az 10 kat farklidir.

Spesifik olarak, burada tarif edilen antikor ile hedeflenen 025b antijeni, bir veya daha fazla yaygindir ve daha spesifik olarak ST131 suslarinin büyük çogunlugunda Spesifik olarak, antikor tarafindan taninan epitop, kapsüllenmis ve kapsüllenmemis STl3l-O25b: H4 suslarinin yüzeyinde bulunur, öm. mutant suslar.

Daha spesifik bir özellige göre, antikorun, bir baglanma bölgesini içeren en az bir antikor alanini içeren tam uzunlukta bir monoklonal antikorun veya bunun bir antikor fragmaninin bir baglanma bölgesi vardir, bu antikor tercihen, murin, lama, tavsan, keçi, inek, kimerik, hümanize veya insan antikorlari, agir zincir antikorlari, Fab, Fd, scFv ve VH, VHH veya VL gibi tek alanli antikorlarin, tercihen bir insan IgG antikorunun veya bir murin IgG antikoru içeren gruptan seçilen bir antikordur.

Daha özel bir yönüne göre, antikor, 025b antijeni, özellikle monomerik bir durumda, `7 M'den daha az, tercihen 10 `8 M'den daha düsük bir Kd'ye baglamak için bir afiniteye sahiptir.

Daha spesifik bir özellige göre, antikor, canli yabani tipte MDR E.koli suslari içeren bir serum örneginde vitrobacterisidal potens sergiler.

Daha özel bir yönüne göre, antikor canli vahsi tip MDR E. koli suslarinin alimini fagositik hücrelerin in vitro olarak uyarir.

Daha spesifik bir özellige göre, antikor, 8D5-lGlO veya 8DlO-C8 olarak adlandirilan Daha özel bir yönüne göre, antikor, 8D5-lGIO veya 8D10-C8 olarak adlandirilan antikorla ayni baglanma bölgesini içerir.

Belirli bir özellige göre, 8D5-1G10 antikorunun antijen baglama bölgesini içeren veya 8D5-1GlO antikorundan türetilen kolistinler veya 8D5-lG10 antikorunun islevsel olarak aktif bir varyantinda türetilen çoklu ilaca dirençli (MDR) E. koli suslarin O25b antijenine spesifik olarak baglanan burada izole edilmis bir monoklonal antikor tarif edilir, tercihen özelligi a) DSM 26763 altinda biriktirilen konakçi hücre tarafindan üretilen antikor hafif zincirinin degisken bölgesi; ve b) DSM 26762 altinda biriktirilen konakçi hücre tarafindan üretilen antikor agir zincirinin degisken bölgesi; c) veya (a) ve/ veya (b) 'nin fonksiyonel olarak aktif bir varyantinin kullanilmasidir. Özel bir düzenlemeye göre, antikor, 8D5-1G10 antikoru veya bunun fonksiyonel olarak aktif bir varyantidir.

Burada 6Dl-lB2 ve 8Al-1G8 olarak adlandirilan baska antikorlar örneklenmistir.

Bunlar, 8D5-1G10`a benzer CDR sekanslarina sahip olan ve ayrica islevsel olarak aktif CDR varyantlari olarak anlasilan klonlardir.

Ekoli konakçi hücrede bulunan plazmidin kodlama dizisi tarafindan kodlanan degisken bölge içeren bir antikor hafif zincirinden ve, DSM 26762 altinda biriktirilen Ekoli konakçi hücrede bulunan plazmid kodlama dizisi tarafindan kodlanan degisken bölge içeren bir antikor agir zincirinden olusur.

Daha özel bir yönüne göre, antikor, 8D5-1G10 antikorundan türetilir, burada - antikor hafif zincirinin degisken bölgesi, DSM 26763 altinda birakilan E. koli konakçi hücresinde veya bunun fonksiyonel olarak aktif bir varyantinda bulunan bir plazmid tarafindan kodlanir; ve/ veya -antikor agir zincirinin degisken bölgesi, DSM 26762'ye yatirilmis E. koli konakçi hücresinde veya bunun fonksiyonel olarak aktif bir varyantinda yer alan bir plazmid tarafindan kodlanir.

Daha özel bir yönüne göre, antikor, bir antikordan türetilir; burada -antikor hafif zincirinin degisken bölgesi, DSM 26763 ya da islevsel olarak aktif bir varyanti altinda biriktirilmis bir konakçi hücre tarafindan üretilir; ve / veya -antikor agir zincirinin degisken bölgesi, DSM 26762 ya da onun fonksiyonel olarak aktif bir varyanti altinda biriktirilen bir konakçi hücre tarafindan üretilir.

Bir baska özel yönüne göre, burada tarif edilen, O25a ve O25b antijenleri tarafindan paylasilan bir epitopu baglamak için çapraz-spesifik olan ve antikor 8D10-C8'un antijen baglanma bölgesini içeren veya antikor 8D10-C8'den türetilmis veya antikor 8D10-C8'nin islevsel olarak aktif bir varyanti olan izole monoklonal antikorudur, a) DSM 28171 altinda biriktirilen konakçi hücre tarafindan üretilen antikor hafif zincirinin degisken bölgesi; ve/ veya b) DSM 28172 altinda biriktirilen konakçi hücre tarafindan üretilen antikor agir zincirinin degisken bölgesi; c) veya (a) ve / veya (b) 'nin fonksiyonel olarak aktif bir varyanti kullanilmasiyla karakterize edilir. Özel bir düzenlemeye göre, antikor, 8DlO-C8 antikoru veya bunun fonksiyonel olarak aktif bir varyantidir.

Spesifik olarak, 8D10-C8 olarak adlandirilan antikor, DSM 28171 altinda birakilan E. koli konakçi hücrede bulunan plazmidin kodlama sekansi tarafindan kodlanan varyantidi içeren bir antikor hafif zincirinden ve DSM 28172 altinda birakilan E. koli konakçi hücrede bulunan plazmidin kodlama dizisi tarafindan kodlanan degisken bölgeyi içeren bir antikor agir zincirinden olusur.

Daha özel bir yönüne göre, antikor, 8D10-C8 antikorundan türetilir, burada -antikor hafif zincirinin degisken bölgesi, DSM 28171 altinda biriken E. koli konakçi hücrede veya bunun fonksiyonel olarak aktif bir varyantinda bulunan bir plazmid tarafindan kodlanir; ve/ veya -antikor agir zincirinin degisken bölgesi, DSM 28172 altinda biriken E. koli konakçi hücrede veya bunun fonksiyonel olarak aktif bir varyantinda bulunan bir plazmid tarafindan kodlanir.

Daha Spesifik bir Özellige göre, antikor, bir antikordan türetilir; - antikor hafif zincirinin degisken bölgesi, DSM 28171 altinda biriktirilen bir konakçi hücre tarafindan veya bunun fonksiyonel olarak aktif bir varyanti tarafindan üretilir; - antikor agir zincirinin degisken bölgesi, DSM 28172 altinda biriktirilen bir konakçi hücre tarafindan veya bunun fonksiyonel olarak aktif bir varyanti tarafindan üretilir.

Spesifik olarak, islevsel olarak aktif varyant, bir CDR varyantidir, örn. bir CDR, daha özel olarak bir CDR döngü dizisi, en az % 60 dizi özdesligine sahip bir amino asit dizisi, tercihen en az % 70, % 80 veya % 90 dizi özdesligi içerir.

Spesifik olarak, antikor, ilgili CDR dizilerini veya CDR mutantlarini, örnegin fonksiyonel olarak aktif CDR varyantlarini içeren, bu gibi antikorlardan türetilmektedir. Bir CDR döngüsünde l, 2 veya 3 nokta mutasyonlari ile.

Spesifik olarak, fonksiyonel olarak aktif varyant, ana CD'den amino asit dizisinde, tercihen CDR içinde en az bir nokta mutasyonunda farklidir; burada CDR amino asit dizilerinin her birinde nokta mutasyonlarinin sayisi, 0, l, 2 veya 3 dür.

Bir baska özel yönüne göre, burada saglanan bir nükleotit sekansi içeren bir plazmiddir, A adlandirilan antikor hafif zincirinin degisken bölgesini kodlayan; ve / veya adlandirilan antikor agir zincirinin degisken bölgesini kodlayan; -DSM 28171 altinda biriktirilmis bir konakçi hücrede bulunan 8D10-C8-LC kodlu antikor hafif zincirinin degisken bölgesini kodlayan; ve / veya -DSM 28172 altinda biriktirilen bir konakçi hücrede bulunan 8D10-C8-HC olarak adlandirilan antikor agir zincirinin degisken bölgesini kodlayan.

Bir baska özel yönüne göre, bulus, bir hafif zinciri ve bulusun bir antikorunun agir zincirini ifade etmek için bir kodlama sekansi içeren bir ekspresyon kaseti saglar; kodlama sekansi: adlandirilan antikor hafif zincirinin degisken bölgesini kodlayan bir nükleotid dizisi; adlandirilan antikor agir zincirinin degisken bölgesini kodlayan bir nükleotid dizisi Burada açiklanan bir baska özel yönüne göre, burada tarif edilen bir antikorun üretilmesi için bir yöntem olup, burada bir konakçi hücre burada tarif edilen bir plazmid veya burada tarif edilen ekspresyon kasedi ile transforme edilir.

Bir baska özel yönüne göre, konakçi hücre, burada açiklanan bir plazmid veya bulusun ekspresyon kasetini içerir. Özellikle, konakçi hücrenin altina A Spesifik bir uygulama, bulusun bir antikorunun, adi geçen antikoru üretmek için kosullar altinda yetistirildigi veya muhafaza edildigi, bulusun bir antikorunun üretilmesi için bir yötem anlamina gelir.

Daha özel bir yönüne göre, burada tarif edilen bir aday antikoru tanimlamak için bir yöntem tarif edilmektedir, yöntem: (a) bir antikor veya antikor üreten hücre içeren bir numune temin etmek; ve (b) bir antikorun 8D5-1G10 veya 8DlO-C8 olarak adlandirilan antikor tarafindan taninan bir epitop ile numunenin içerdigi veya üretildigi bir antikorun baglanmasinin degerlendirilmesini içerir, burada antikor ve epitop arasinda pozitif bir reaksiyon antikoru aday antikor olarak tanimlar.

Bir baska özel yönüne göre, bulus, asagidakileri içeren bir aday antikoru tanimlamak için bir yöntem saglar, yöntem: (a) bir antikor veya antikor üreten hücre içeren bir numune temin etmek; ve koli susunun 025b antijeni veya 025a antijeni ile numuneye baglanmasi veya degerlendirilmesini içerir, burada antikor ve 025b antijeni ile 025 antijeni veya 025a antijeni arasindaki spesifik bir pozitif reaksiyon, antikoru aday antikor olarak tanimlar.

Spesifik olarak, aday antikor, terapötik kullanim için bir aday koruyucu antikor veya bir aday teshis antikorudur.

Yine, bir baska Özel yönüne göre, bulus, bulusun bir antikorunun üretilmesi için bir yöntem saglar; yöntem (a) bulusa göre tanimlanan bir aday antikorun saglanmasi; ve (b) aday antikor ile ayni epitop baglanma spesifisitesine sahip bir monoklonal antikor veya aday antikorun hümanize veya insan formunun veya bunun bir türevinin üretilmesini içerir.

Burada açiklanan bir baska özel yönüne göre, burada tarif edilen ve burada açiklanan bir antikorun üretilmesi için bir yöntem olup, yöntem (a) insan olmayan bir hayvanin, 8D5-lGIO veya 8D10-C8 olarak adlandirilan antikor tarafindan taninan bir epitop ile immünize edilmesi; (b) izole edilmis B hücrelerinden ölümsüzlestirilmis hücre çizgileri olusturmak; (c) epitopa baglanan bir monoklonal antikor üreten bir hücre hattinin tanimlanmasi için b) 'de elde edilen hücre çizgilerinin taranmasi; ve (d) monoklonal antikoru veya antikorun insanlastirilmis veya insan formunu veya bunun monoklonal antikorla ayni epitop baglanma spesifikligine sahip bir türevini üretmeyi içerir.

Burada açiklanan bir baska özel yönüne göre, burada tarif edilen ve burada açiklanan bir antikorun üretilmesi için bir yöntem olup, yöntem: (a) insan olmayan bir hayvanin bir STl3l-025b: H4 susnun 025b antijeni ile bagisiklilastirilmasi ve B-hücrelerinin antikor üreten izolasyonu; (b) izole edilmis B hücrelerinden ölümsüzlestirilmis hücre çizgileri olusturmak; (c) E. koli'nin 025a antijenine veya 025a antijenine göre 025b antijenine tercihli olarak baglanan bir monoklonal antikor üreten bir hücre dizisini tanimlamak için hücre çizgilerinin taranmasi; ve (d) monoklonal antikoru veya antikorun insanlastirilmis veya insan formunu veya bunun monoklonal antikorla ayni epitop baglanma spesifikligine sahip bir türevini üretmeyi içerir.

Bir baska yönüne göre, bulus, bulusun bir antikorunun tibbi kullanimini saglar.

Spesifik olarak, antikor, bir MDR E. koli'den kaynaklanan veya bunlardan muzdarip bir denegin tedavi bir MDR E. koli enfeksiyonundan muzdarip olan veya bu hastaliktan muzdarip bir denegin tedavi edilmesinde kullanim için antikor temin edilir; bu da, SÖZ konusu enfeksiyondan, tercihen piyelonefrit, ikincil bakteriyemi, sepsis, peritonit, menenjit ve vantilatörün tedavisi veya profilaksisi için denege iliskili pnömoni, kaynaklanan bir hastalik durumunu iyilestirmek veya hastaliga yakalanan enfeksiyonu sinirlandirmak için etkili bir antikor miktarinin uygulanmasini içeren bir tedavidir.

Spesifik olarak, antikor, sus tarafindan ifade edilen kapsüler polisakkaritten bagimsiz olarak, MDR E. koli`nin, tercihen bir STl3l-025b H4 susunun bakterisidal öldürülmesi için saglanir. Özel bir yönüne göre, ayrica, bir MDR E. koli enfeksiyonu riski tasiyan veya bu hastaliktan muzdarip bir öznenin tedavi edildigi bir tedavi yöntemi de sunulmaktadir, bu yöntem, hastadaki enfeksiyonu sinirlandirmak veya söz konusu enfeksiyondan, tercihen piyelonefrit, ikincil bakteriyemi, sepsis, peritonit, menenjit ve ventilatör iliskili pnömoni, kaynaklanan bir hastalik durumunu iyilestirmek için denege etkili bir miktarda antikor verilmesini içerir.

Spesifik olarak, MDR E. koli'nin, tercihen, sus tarafindan ifade edilen kapsüler polisakkaritten bagimsiz olarak bir ST131- 025b H4 susu, bakterisidal öldürülmesi için tedavi yöntemi saglanmistir.

Belirli bir özellige göre, burada tarif edilen antikoru kullanan immünoterapi, canli bakteriyel zorluga karsi etkili bir sekilde koruma saglayabilir, öm. çesitli hayvan modellerinde belirlendigi gibi.

Antikor, öldürücü endotoksemiyi spesifik olarak nötralize edebilir. Bu fonksiyonel aktivite bir uygun vivomodelde (saflastirilmis LPS ile meydan okuma) belirlenebilir.

Antikor, tamamlayici aracili öldürme, ör. bir in vitro serum bakterisidal analizi ile belirlendigi gibi, örn. Kontrol numunelerinin üzerinde en az % 20 oraninda bakterinin öldürülmesiyle, ile MDR E. koli'ye karsi etkilidir (antikor veya ilgisiz kontrol mAb ilave edilmemistir).

Antikor, antikor aracili fagositoz, örn. bir in vitro opsonofagositotik öldürme tahlili (OPK) ile belirlendigi gibi, öm. kontrol örneklerinin üzerinde en az % 20 giris bakteri alimi veya % 20 daha düsük uç cfu sayimi, ile MDR E. koli'ye karsi etkilidir, (antikor veya ilgisiz kontrol mAb eklenmemistir).

Antikor, antikor, in vitro bir LAL deneyi veya toll benzeri reseptör 4 (TLR4) raportör deneyi ile belirlendigi gibi endotoksin fonksiyonlarini nötralize ederek, Kontrol numunelerine kiyasla endotoksin aktivitelerinde en az % 20 azalma ile, MDR E. koli'ye karsi özellikle etkilidir. (antikor veya ilgisiz kontrol mAb ilave edilmemistir). Özel bir düzenlemeye göre, antikor bir parenteral veya mukoza] formülasyonda uygulanir.

Bir baska yönüne göre, bulus, tercihen bir farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici veya eksipiyan içeren bir parenteral veya mukozal formülasyon içeren, bulusun bir antikorunun farmasötik bir preparasyonunu saglar.

Bir baska yönüne göre, bulus, teshis etmek veya belirlemek için tanisal kullanim için bulusun bir antikorunu saglar. LPS 025b antijenini eksprese eden MDR suslarinin neden oldugu bir hastada koli enfeksiyonlari, örnegin üst ve alt idrar yolu enfeksiyonlari gibi sistit veya üretrit, artan veya hematojenöz piyelonefrit dahil olmak üzere, özellikle diyabetik hastalarda ve ayrica bakteriyemi, sepsis, peritonit veya bagirsak kolonizasyonu, bulusun antikoru kullanilarak, buradaki enfeksiyon, antikor ile spesifik bir immün reaksiyonunun, enfeksiyonu belirledigi, antikor ile bahsedilen denegin vücut sivisi örneginin temas ettirilmesiyle belirlenir.

Spesifik olarak, antikor, bulusa göre kullanim için saglanmistir, burada bir denekte MDR E. koli ile sistemik bir enfeksiyon, antikor ile söz konusu denegin vücut sivisi örneginin temas ettirilmesiyle ex viv0 olarak belirlenir, burada antikorun spesifik bir immün reaksiyonu enfeksiyonu belirler.

Spesifik olarak, bir vücut sivisi numunesi, spesifik bagisiklik reaksiyonu için test edilir; bu numune, idrar, kan, kan izolatlari veya kan kültürü, aspirat, balgam, entübe edilmis süjelerin lavaj sivisi ve diskidan olusan gruptan seçilir.

Spesifik olarak, burada tarif edilen diyagnostik kullanim, klinik bir örnekten elde edilen saf bir E. koli kültüründen E. koli'nin in vitro serotipinin belirlenmesini ifade Bir baska yönüne göre, Bulus, istege bagli olarak bir etiketi ve / veya bir etiketli, antikoru veya ilgili hedef antijeni olan antikorun bir bagisiklik kompleksini spesifik olarak taniyan bir reaktif ve / veya antikorun ve diagnostik reaktifin en az birisini hareketsiz kilmak için bir kati faz gibi, baska bir teshis reaktifi içeren antikoru içeren, bulusun bir antikorunun bir diyagnostik preparasyonunu saglar. Teshis preparati, bir bilesim olarak veya parçalarin bir kiti olarak, örn. bilesenleri içeren a) teshis antikoru preparasyonu ve/ veya b) ayri bir bilesen olarak veya yukaridaki a) ve / veya b) bilesenlerinin herhangi birinin bir tasiyicisi olarak antikorun ve diyagnostik reaktiften en az birinin hareketsizlestirilmesi için ilave teshis reaktifi ve / veya bir kati faz içeren bilesenler gibi, saglanir.

Burada tarif edilen tercih edilen diagnostik deneyler, burada açiklanan bir kati faz, örn. lateks boncuklar, altin parçaciklari, ör. Test edilecek bir örnekten elde edilen 025b antijenini veya serbest (veya izole edilmis) 025b antijenini eksprese eden bakterinin antikoru ile aglütinasyonun test edilmesi, üzerinde hareketsizlestirilen antikoru içerir.

Bazi diagnostik deneyler 025b ve / veya O25a'yi baglamak için farkli spesifite ve / veya afiniteye sahip iki farkli antikor içerebilir, bu yüzden 025b ve 025a antijenleri arasinda muhtemelen farklilasir. Özel bir yönüne göre, burada tarif edilen diyagnostikler veya burada tarif edilen diyagnostik yöntem ile bir denegin MDR E. koli ile enfeksiyonunu, ör. burada tarif edilen bir antikor ile tedavi etmek gibi immünoterapinin kullanilmasi, belirlemek için bu tür bir enfeksiyona karsi bir terapötik tedavi saglamak için yardimci tanilamadir.

Burada açiklanan belirli bir yönüne göre, burada tarif edilenler, bir denegin MDR E. koli ile enfekte edilmesini teshis etmek için duyarli yatak basi teshislerdir.

LPS, Ör. Canli bakteri miktarinin sinirli oldugu klinik örneklerden. Bu tahlilin hassasiyeti, 100 ng'den az, tercihen 10 mg LPS'den daha azdir.

Burada açiklanan bir baska yönüne göre, 8D5-1G10 veya 8D10-C8 olarak adlandirilan antikor tarafindan taninan izole edilmis bir epitoptur. Bu epitop, her biri 8D5-1G10 veya 8D10-C8 olarak adlandirilan spesifik antikor tarafindan taninan epitop varyantlarini içeren tek bir epitop veya epitoplarin bir karisimindan olusabilir.

Spesifik olarak, 8DIO-C8 antikorunun epitopu, hem 025b hem de 025a antijenleri üzerinde ortak olan ve yaygin olan, dolayisiyla, antikorun, en azindan 025a antijenini baglarken esit olarak 025b antijeni çapraz-spesifik, fakat tercihen baglayiciligi olarak kabul edilir.

Bir baska yönüne göre, burada tarif edilen: (a) burada tarif edilen bir epitop; (b) istege bagli olarak (a) 'nin bahsedilen epitopu ile dogal olarak iliskili olmayan diger epitoplar; ve (c) bir tasiyici. içeren bir immünojendir. Özellikle, tasiyici, tercihen tampon ve / veya adjuvan maddeler içeren, farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyicidir.

Burada tarif edilen immünojen tercihen tercihen parenteral kullanim için bir asi formülasyonunda saglanir. Özellikle burada tarif edilen immünojen, özellikle bir denegin bir MDR E.koli enfeksiyonundan veya adi geçen enfeksiyondan kaynaklanan bir hastalik durumunun önlenmesinden korunmasi için söz konusu immünojenin etkili bir miktarinin uygulanmasiyla bir öznenin tedavi edilmesinde kullanim için tibbi kullanim için saglanmistir. Özellikle burada tarif edilen immünojen, koruyucu bir bagisiklik tepkisini ortaya çikarmak için saglanmistir. Özel bir yönüne göre, bir MDR E.koli riskine sahip bir öznenin tedavi yöntemi de saglanmistir. Bu yöntem, hastaya enfeksiyonun önlenmesi için, özellikle patojen MDR E. koli'ye karsi koruma saglamak için, denege etkili bir miktarda immünojenin uygulanmasini içerir.

Bir baska yönüne göre, bulus, bulusun bir antikorunu kodlayan izole edilmis bir nükleik asit saglar.

SEKILLER suslarinin OZSa'ya özgü (0253 antijenine karsi çapraz reaktivite ile veya reaksiyon olmadan) yüzey boyamasi.

Sekil 2: Farkli mAb'lerin ve 025 tavsan serumunun bir immünoblot deneyinde saflastirilmis 025a ve 025b LPS moleküllerine karsi reaktivitesi.

Sekil 3: (a): E. koli 025b antijeninin tekrarlayan biriminin yapisi. (b): karsilastirma için E. koli 025a'nin tekrarlanan biriminin yapisi (bazen 025 (a) olarak da adlandirilan O25'e deginilir) (Kenne ve arkadaslari, 1985).

Sekil 4: Lateks küreciklerine baglanmis mAb 8D5-1G10 kullanilarak aglutinasyon analizi ile 025b antijen eksprese eden E. koli suslarinin saptanmasi.

Sekil 5: Lateks boncuklarina baglanmis mAb 8D5-1G10 kullanilarak aglütinasyon analizi ile çözünebilir 025b antijeninin saptanmasi.

Sekil 6: Bir ST131: 025b klinik izolati ile bir sonraki intravenöz ölümcül tehdide karsi 025b`ye özgü siçan mAb'leri ile farelerin pasif immünizasyonu ile saglanan koruma.

Sekil 7: 025b'ye özgü mAb'lerin aracilik ettigi kompleman bagimli bakteriyel öldürme.

DETAYLI AÇIKLAMA Burada kullanildigi sekliyle "antikor” terimi, baglayici dizisi ile yada olmadan, immünoglobulinlerin agir ve / veya hafif zincirlerinin sabit ve / veya degisken alanlari olarak anlasilan, antikor alanlarindan olusan veya içermeyen polipeptidleri veya proteinleri ifade eder. Polipeptidler, bir döngü dizisi ile baglanmis bir antikor alan yapisinin en az iki beta-dizisinden olusan bir beta-varil yapisi ihtiva ediyorsa, antikor alanlari olarak anlasilir. Antikor alanlari, dogal yapiya sahip olabilir veya mutajenez veya türevlendirme ile modifiye edilebilir, örn. antijen baglanma özelliklerini veya Fc reseptörleri FeRn ve / veya Fcgamma reseptörüne baglanma gibi stabilite veya fonksiyonel özellikler gibi herhangi bir baska özelligi modifiye etmek için kullanilir.

Burada kullanilan antikor, spesifik olarak tek bir degisken antikor alaninin, VH, VL veya VHH veya bir VL / VH çifti gibi degisken antikor alanlarinin çiftlerinin bir baglanma bölgesi, Fab, F (ab ') gibi bir VL / VH alan çifti ve sabit antikor alanlarini içeren bir antikor gibi, (Fab) 2, scFV, FV veya tam uzunlukta bir antikor, bir CDR baglama bölgesini içeren bir veya daha fazla antijeni veya bu antijenlerin bir veya daha fazla epitopunu baglamak için spesifik bir baglanma bölgesine sahiptir.

Burada kullanildigi sekliyle "antikor" terimi, VH, VL veya VHH veya bir VL / VH çifti gibi degisken antikor alanlarinin çiftleri de dahil olmak üzere bir baglanti dizisi veya mentese bölgesi içeren veya içermeyen degisken ve / veya sabit antikor alanlarinin kombinasyonlari veya bir VL / VH alan çifti içeren veya bunlardan olusan bir antikor ve sabit antikor alanlari gibi özellikle tek degiskenli antikor alani içeren veya bunlardan olusan antikor biçimlerine atifta bulunacaktir. "Tam uzunluklu antikor" terimi, dogal olarak olusan bir antikor monomerinde yaygin olarak bulunan Fe alaninin ve diger alanlarin en azindan çogunu içeren herhangi bir antikor molekülünü belirtmek için kullanilabilir. Bu ifade, belirli bir antikor molekülünün bir antikor fragmani olmadigini vurgulamak için kullanilir. karsi yöneltilen veya antikor alanlarinin farkli bir yapisal düzenlemesini içeren diger antikorlardan büyük ölçüde bagimsizdir. Yine de, izole edilmis bir antikor, izole antikorun bir kombinasyonunu içeren, monoklonal antikorlar veya farkli özelliklere sahip antikor fragmanlari gibi ör. en az bir baska antikor içeren bir kombinasyon preparasyonundau olusabilir. dahil olmak üzere memeliler gibi insan türlerini kapsayan hayvan kaynakli antikorlar için geçerli olacaktir. dizileri olan kimerik antikorlar için de geçerlidir.

Bir antikora göre kullanilan "kimerik" terimi, zincirin kalan kismi baska tür veya siniftaki karsilik gelen dizilere homolog iken, agir ve hafif zincirlerin amino asit sekanslarinin her birinin bir kisminin, belirli bir türden türetilen veya belirli bir sinifa ait olan antikorlardaki karsilik gelen sekanslara homolog oldugu antikorlari belirtir.

Tipik olarak, hem hafif hem de agir zincirlerin degisken bölgesi, bir memeli türünden türetilen antikorlarin degisken bölgelerini taklit ederken, sabit kisimlar, bir digerinden türetilen antikor dizileriyle homologdur. Örnegin, degisken bölge, insan hücresi preparatlarindan türetilen sabit bölgelerle kombinasyon halinde insan olmayan konakçi organizmalardan kolaylikla temin edilebilen B-hücreleri veya hibridomalari kullanarak hali hazirda bilinen kaynaklardan türetilebilir.

Bir antikora göre kullanilan "hümanize" terimi, insan olmayan bir türden bir immünoglobulinden büyük ölçüde türetilen bir antijen baglanma alanina sahip bir moleküle karsilik gelir, burada molekülün kalan immünoglobulin yapisi, bir insan immünoglobulininin yapisina ve / veya sekansina dayanir. Antijen baglanma bölgesi, sabit alanlara kaynastirilan tam degisken bölgeleri veya degisken alanlardaki uygun çerçeve bölgeleri üzerine asilanmis sadece tamamlayieilik belirleme bölgelerini (CDR) içerebilir. Antijen baglanma siteleri, vahsi tipte olabilir veya modifiye edilebilir, örn. bir veya daha fazla amino asit ikamesi ile, tercihen insan immünoglobülinlerine daha yakindan benzeyecek sekilde modifiye edilir.

Insanlastirilmis antikorlarin bazi formlari, tüm CDR dizilerini (örnegin, fare antikorundan alti CDR'nin tamamini içeren bir hümanize fare antikoru) korur. Diger formlar, orijinal antikora göre degistirilmis bir veya daha fazla CDR'ye sahiptir.

Bir antikora göre kullanilan "insan" terimi, insan germ hatti immünoglobulin sekanslarindan türetilen degisken ve sabit bölgelere sahip antikorlari kapsadigi anlasilmalidir. Bulusun insan antikoru, örnegin CDR'lerde, insan germ hatti immünoglobulin sekanslari tarafindan kodlanmamis amino asit tortulari (örn., In vitro olarak rastgele veya bölgeye özgü mutagenez veya in vivo somatik mutasyon yoluyla eklenen mutasyonlar) içerebilir Insan antikorlari, insan immünoglobulin kütüphanelerinden veya bir veya daha fazla insan immünoglobulini için transgenik olan hayvanlardan izole edilmis antikorlari içerir.

Terim, herhangi bir sinif veya alt sinifin antikorlari için özel olarak geçerlidir. Agir zincirlerinin sabit alaninin amino asit dizisine bagli olarak, antikorlar IgA, IgD, IgE, (izotipler) öm., IgGl, lgG2, lgG3, IgG4, IgA ve IgA2, ayrilabilir.

Terim ayrica, monoklonal veya poliklonal antikorlar, özellikle de rekombinant bir antikor için geçerlidir; bu terim, hayvanlardan, ör. insan dahil olmak üzere memeliler, farkli menseli genler veya diziler, örn. kimerik, insanlastirilmis antikorlar veya hibridomadan türetilmis antikorlar, kaynaklanan antikorlar gibi rekombinant araçlar ile hazirlanan, ifade edilen, olusturulan veya izole edilen tüm antikorlari ve antikor yapilarini kapsar. Diger örnekler, antikoru eksprese eden bir konakçi hücreden izole edilmis antikorlari veya antikorlarin veya antikor alanlarinin bir araya getirici, birlestirici kütüphanesinden izole edilen antikorlari veya antikor gen sekanslarinin diger DNA sekanslarina yapismasini içeren baska herhangi bir yolla hazirlanmis, ifade edilen, yaratilan veya izole eden antikorlari ifade eder. türevlerine de degindigi anlasilmaktadir. Bir antikor türevi, bir veya daha fazla antikor domeninin veya antikorunun ve / veya bir füzyon proteininin herhangi bir kombinasyonu olarak anlasilir; burada antikorun herhangi bir alani, örnegin, diger antikorlar gibi, ör. CDR halkalarini, bir reseptör polipeptidini, fakat ayni zamanda ligandlari, iskele proteinlerini, enzimleri, toksinleri ve benzerlerini içeren bir baglanma yapisi, bir veya daha fazla baska proteinin herhangi bir yerinde kaynasabilir. Antikorun bir türevi, kovalent baglanma, elektrostatik etkilesim, di- sülfür bagi vb. gibi çesitli kimyasal tekniklerle baska maddelere baglanma veya baglanma yoluyla elde edilebilir. Antikora baglanan diger maddeler lipitler, karbonhidratlar, nükleik asitler, organik ve inorganik moleküller veya bunlarin herhangi bir kombinasyonu (Öm. PEG, ön ilaçlar veya ilaçlar) olabilir. Spesifik bir düzenekte antikor, biyolojik olarak kabul edilebilir bir bilesik ile spesifik etkilesime izin veren ek bir etiket içeren bir türevdir. Antikorun hedefine baglanmasi üzerinde hiç veya toleranssiz bir olumsuz etkiye sahip oldugu sürece, bu bulusta kullanilabilen etikete iliskin spesifik bir sinirlama yoktur. Uygun etiketlerin örnekleri His-tag, Myc- tag, FLAG-tag, Strep-tag, Calmodulin-tag, GST-tag, MBP-tag ve S-tag içerir. Bir baska spesifik düzenekte antikor, bir etiket içeren bir türevdir. Burada kullanilan antikora konjuge edilen saptanabilir bir bilesik veya bilesime karsilik gelir. Etiket kendi basina algilanabilir, örn. radyoizotop etiketleri veya floresan etiketler veya bir enzimatik etiket durumunda, saptanabilen bir substrat bilesiginin veya bilesiminin kimyasal degisimini katalize edebilir.

Burada tarif edilen tercih edilen türevler, tercihen, MDR Ekoli ve onun endotoksini, ör. bir SBA, OPK veya LAL tahlilinde belirlendigi gibi, ile mücadele etmek için veya bakteriyel zorluga karsi korumak veya ölümcül endotoksemi nötralize etmek için bir güce sahip olan antijen baglanmasina göre islevsel olarak aktiftir.

Bir ana antikordan veya antikor sekansindan türetilen antikorlar, özellikle, örnegin silicoor rekombinant mühendisligi veya kimyasal türevlendirme veya sentez yoluyla elde edilen mutantlar veya varyantlar olarak anlasilir.

Spesifik olarak, bulusun bir antikorundan türetilen bir antikor, CDR bölgelerinin veya CDR varyantlarinin en az bir veya daha fazlasini, 025b antijenine, örnegin; 025b antijenini spesifik olarak veya seçici olarak baglar. anlasilmaktadir. belirli bir antikor amino asit dizisi veya bölgesine insertler eklenmesi, degistirilmesi, bir amino asit dizisinin kimyasal olarak türetilmesi, örnegin; antijen baglanma özelliklerini gelistirmek için antikor stabilitesini, efektör fonksiyonunu veya yari ömrünü ya da degisken alanlarini kontrol etmek için sabit alanlarda, ör. afinite olgunlasma teknikleri ile, ör. mutagenez yöntemleriyle elde edilen antikorlara karsilik gelir. Istenen pozisyonlarda nokta mutasyonlari dahil olmak üzere bilinen mutagenez yöntemlerinden herhangi biri kullanilabilir; rastgelelestirme teknikleri ile elde edilir.

Bazi durumlarda pozisyonlar rasgele seçilir, örn. antikor sekanslarini randomize etmek için olasi amino asitlerin herhangi biri veya tercih edilen amino asitlerin bir seçilmesi ile. "Mutagenez" terimi, bir polinükleotit veya polipeptid dizisini degistirmek için bilinen herhangi bir teknik anlamina gelir. Tercih edilen mutagenez türleri, hata egilimli PCR mutagenezi, doygunluk mutajenezi veya baska bir bölgeye yönelik mutagenezi içerir.

Burada kullanildigi sekliyle bir antikorun "islevsel olarak aktif varyanti" terimi, nükleotid içindeki nükleotidler veya amino asit sekansindaki bir veya daha fazla amino asit tortusunun rekombinasyon teknikleri veya kimyasal türevlendirilmesi gibi ör. bir veya daha fazla amino asitin eklenmesi, silinmesi veya ikamesi ile bu sekansin (bir ana antikor veya bir ana dizi) modifikasyonundan kaynaklanan bir dizi anlamina gelir, dizinin veya dizinin uzak uçlarinin herhangi birinde veya her ikisinde ve bu modifikasyon bu dizinin aktivitesini etkilemez (özellikle bozuldugu). Seçilen bir hedef antijene özgü bir baglanma bölgesi durumunda, ör. bir antikorun islevsel olarak aktif varyanti, belirli bir epitopa, afiniteye, aviditeye, Kon veya Koff oranina ince spesifisiteyi degistirmek için, bu degistirilebilmesine ragmen, önceden belirlenmis baglanma spesifitesine sahip olacaktir. Spesifik olarak, burada tarif edilen bir antikorun fonksiyonel olarak aktif varyantlari, 025b antijenine baglanma potansiyeline ve E. koli'nin diger antijenlerine göre 025b antijenine tercihli olarak baglanmaya, ör. O25b'ye baglanma ve E. koli'nin 025a antijenine baglanma, veya çapraz olarak spesifik olarak baglayan, fakat E. koli'nin diger antijenlerine baglanmayan baglanma, yönelik spesifite veya seçicilige sahiptir.

Fonksiyonel olarak aktif varyantlar, ör. bir ana antikorun sekansi, 6Dl-l B2, 8A1- 1G8, 8D5-lGlO veya 8DlO-C8 olarak adlandirilan antikor ile ayni baglama bölgesini, ki baglanma bölgesinden baska bir bölge veya 6Dl-1B2, 8A1-lG8, 8D5-lGlO veya 8DlO-C8 antikorlarindan herhangi biri olan bir ana antikordan, baglanma bölgesi içinde bir modifikasyonla elde edilir, ancak antijeni bozmaz, baglanma, ve tercihen, 025b antijenine spesifik olarak veya seçici olarak baglanma, 025b'ye baglanma ve E. koli'nin 025a antijenine baglanma veya 025a antijenini önemli ölçüde baglamayan çapraz baglanma yetenegi dahil olmak üzere ana antikora benzer bir biyolojik aktiviteye sahip olacaktir, her ikisi de, 025b ve 025a antijenlerini spesifik olarak baglar, ancak Ecol'un diger antijenlerine baglanmaz, içeren bir antikorun, ancak bir antikor içinde modifikasyonlarin degistirilmesiyle elde edilebilir. Opsiyonel olarak, varyantlar ayrica bir SBA analizinde komplement aracili Öldürme potansiyeli içerebilir ve/Veya istege bagli olarak ayrica bir OPK analizinde antikor aracili fagositozun bir potensini içerir ve/veya istege bagli olarak bir LAL tahlilinde endotoksin nötralizasyon fonksiyonunu içerir, ayni biyolojik aktiviteye, MDR E. koli'yi hedeflemek için spesifik baglama tahlili ve/veya fonksiyonel test ile belirlendigi gibi, sahiptir. Örnegin, 6Dl-1B2 ve 8A1-1G8 antikorlarinin islevsel olarak aktif varyantlari, 8D5- 1G10 antikoru ile büyük ölçüde ayni ve benzer baglanma afinitelerine sahiptir (asagidaki tabloya bakiniz). 6Dl-1B2 8Al-1G8 8D5- Burada kullanildigi sekliyle "büyük ölçüde ayni biyolojik aktivite" terimi, esas olarak en az % 180 veya en az % 190, ör. ebeveyn antikoru için belirlenen aktivitenin % 200`üne kadar oldugu aktivite anlamina gelir.

Burada tarif edilen tercih edilen varyantlar veya türevler, tercihen, spesifik olarak 025b antijeni baglama ve E. koli'nin diger antijenlerine baglanma gücü, örnegin; O25b'ye baglanan ve E. koli`nin 025a antijenine baglanmayan veya 025a antijenini önemli ölçüde baglayan veya her iki, 025b ve 025 antijeni çapraz olarak baglayan, ör. yükseltilmis mevcut poliklonal tipleme serumuna kiyasla daha yüksek afinite ile baglanmasi tercih edilir, antijen baglanmasi açisindan fonksiyonel olarak aktiftir.

Tercih edilen varyantlar, en az 2 log olan bir Kd degeri farki, tercihen en az 3 log olan ve istege bagli olarak bir SBA tahlilinde komplement aracilikli öldürme potansiyeli dahil olmak üzere, E.k01i'nin diger antijenlerine baglanmaz; antikor içermeyen kontrol numunelerine göre bakteriyel sayimda önemli bir azalma saglamak ve / veya istege bagli olarak bir OPK analizinde antikor aracili fagositozun bir potensi dahil olmak üzere, bakteri sayimlari içermeyen kontrol örneklerine göre bakteriyel sayimlarda önemli bir azalma saglamak gibi antikoru içermeyen kontrol numunelerine göre serbest LPS'de önemli bir azalma elde etmek için, örnegin bir LAL veya TLR4 sinyalleme deneyinde endotoksin nötralizasyon fonksiyonunu içeren ve / veya istege bagli olarak spesifik baglama tahlili veya MDR E.k01i'yi hedetlemek için fonksiyonel test ile belirlenen büyük ölçüde ayni biyolojik aktiviteye sahiptir. Çesitli analizlerde analitlerin önemli ölçüde azaltilmasi tipik olarak en az % 50, tercihen en az % 60, % azalma anlamina gelir.

Tercih edilen bir düzenlemede, bir ana antikorun islevsel olarak aktif varyanti a) antikorun biyolojik olarak aktif bir fragmani olup, fragman molekülün sekansinin veya en az % 95'ini içeren fragman ve en çok tercihen en az % 97, % 98 veya % 99 b) antikordan en az bir amino asit sübstitüsyonu, ekleme ve / veya çikartma ile türetilir, burada fonksiyonel olarak aktif varyant, molekül veya en azindan % 50, tercihen en az % 60, daha tercihen en az % 70, daha tercihen en az % 80, yine daha tercihen en az % 90, daha da tercihen en az % 95 ve en çok tercihen en az % 97, % 98 veya % 99 dizi özdesligine sahip bir antikor gibi bir kismina bir dizi özdeslige sahiptir; ve/ veya C) antikordan veya bunun fonksiyonel olarak aktif bir varyantindan ve ek olarak polipeptide veya nükleotit sekansina en az bir amino asit veya nükleotid heterologdan Bulusun tercih edilen bir düzenlemesinde, bulusa göre olan antikorun islevsel olarak aktif varyanti, esas olarak, yukarida açiklanan varyant ile özdestir, ancak farkli bir türün homolog dizisinden türetilen, sirasiyla bir polipeptid veya nükleotit sekansindan farklidir. Bunlar dogal olarak ortaya çikan varyantlar veya analoglar olarak adlandirilir. varyantlarin yani sira, mutantlar veya diger dogal olarak olusmayan varyantlari da içerir. Teknikte bilindigi gibi, bir alelik varyant, polipeptidin biyolojik islevini esasen degistirmeyen bir ya da daha fazla amino asidin bir ikamesi, silinmesi ya da eklenmesi ile karakterize edilen bir (poli) peptidin alternatif bir seklidir.

Fonksiyonel olarak aktif varyantlar, polipeptit veya nükleotit sekansi, örn. bir veya daha fazla nokta mutasyonla, burada dizi degisimleri, bulusun kombinasyonunda kullanildiginda degistirilmemis polipeptidin veya nükleotit sekansinin bir fonksiyonunu muhafaza eder. Bu sekans degisiklikleri, bunlarla sinirli olmamak kaydiyla (konservatif) ikameler, eklemeler, delesyonlar, mutasyonlar ve eklemeleri içerebilir.

Fonksiyonel olarak aktif varyantlar CDR varyantlaridir. Bir CDR varyanti, CDR bölgesinde en az bir amino asit tarafindan modifiye edilen bir amino asit dizisini içerir, burada adi geçen modifikasyon, amino asit dizisinin bir kimyasal veya kismi bir degisimi olabilir; bu modifikasyon, varyantin, modifiye edilmemis sira olanin biyolojik özelliklerini muhafaza etmesine izin verir. CDR amino asit sekansinin kismi bir degisikligi, bir ila birkaç amino asidin, örn. 1, 2, 3, 4 ya da 5 amino asit ya da bir ila birkaç amino asidin eklenmesi ya da sokulmasi ile, örn. l, 2, 3, 4 ya da 5 amino asit ya da bir ila birkaç amino asidin kimyasal olarak türetilmesi ile, örn. 1, 2, 3, 4 ya da 5 amino asit ya da bunlarin bir kombinasyonu ile olabilir. Amino asit kalintilarindaki sübstitüsyonlar, alternatif bir hidrofobik amino asit için örnegin bir hidrofobik amino asidin ikame edilmesi gibi konservatif sübstitüsyonlar olabilir.

Konservatif sübstitüsyonlar, yan zincirleri ve kimyasal özellikleri ile iliskili olan bir amino asit ailesi içinde yer alanlardir. Bu tür familyalara ait örnekler, asidik yan zincirlere, asidik yan zincirlere, polar olmayan alifatik yan zincirlere, polar olmayan yan zincirlere, yüksüz kutupsal yan zincirlere, küçük yan zincirlere, büyük yan zincirlere Vb sahipdir.

Bir nokta mutasyon, farkli amino asitler için bir ya da daha fazla tek (ardisik olmayan) ya da iki amino asit çiftinin sübstitüsyonu veya degisimi, silinmesi ya da sokulmasi sirasinda tasarimsiz amino asit sekansindan farkli olan bir amino asit sekansinin ekspresyonu ile sonuçlanan polinükleotidin tasarimi olarak anlasilir.

Tercih edilen nokta mutasyonlari ayni polarite ve / veya yükün amino asitlerinin degisimini ifade eder. Bu baglamda, amino asitler, altmis dört üçlü kodonlar tarafindan kodlanan yirmi dogal olarak olusan amino aside deginmektedir. Bu 20 amino asit, nötr sarjlari, pozitif ücretleri ve negatif ücretleri olanlara bölünebilir: gösterilmistir: Alanin: (Ala, A) polar olmayan, nötr; Asparajin: (Asn, N) polar, nötr; Sistein: (Cys, C) polar olmayan, nötr; Glutamin: (Cin, Q) polar, nötr; Glisin: (Gly, G) polar olmayan, nötr; Lösin: (Leu, L) polar olmayan, nötr; Metionin: (Met, M) polar olmayan, nötr; Fenilalanin: (Phe, F) polar olmayan, nötr; Prolin: (Pro, P) polar olmayan, nötr; Serin: (Ser, S) polar, nötr; Triptofan: (Trp, W) polar olmayan, nötr; Valin: (Val, V) polar olmayan, nötr; ve Histidin: (His, H) polar, pozitif (% 10) nötr (% 90).

Arginin: (Arg, R) polar, pozitif; ve Lisin: (Lys, K) polar, pozitif.

Aspartik asit: (Asp, D) polar, negatif; ve Glutamik asit: (Glu, E) polar, negatif.

”Burada tarif edilen antikor sekanslari ve homologlari ile ilgili" yüzde (%) amino asit sekans özdesligi, sekansi hizaladiktan ve eger gerekliyse, maksimum yüzde sekans özdesligini elde etmek için ve sekans özdesliginin bir parçasi olarak herhangi bir konservatif sübstitüsyonlari göz önüne almamak için bosluklari yerlestirdikten sonra, spesifik polipeptit sekansindaki amino asit tortulari ile özdes olan bir aday sekanstaki amino asit tortularinin yüzdesi olarak tanimlanir. Teknikte uzman kisiler, karsilastirilan dizilerin tam uzunlugu boyunca maksimum hizalama elde etmek için gereken herhangi bir algoritma dahil olmak üzere hizalamanin ölçülmesi için uygun parametreleri belirleyebilir.

Bir antikor varyantin, fonksiyonel olan ve fonksiyonel esdeger olarak islev görebilen, ör. spesifik hedeflere ve fonksiyonel özelliklere sahip olan glikotasarim ile üretilen, spesifik bir glikosilasyon paterniyle homologlar, analoglar, fragmanlar, modifikasyonlar veya varyantlari içerdigi özellikle anlasilir.

Bu bulusun bir antikoru FC efektör fonksiyonunu sergileyebilir veya göstermeyebilir.

Tercihen antikor, FC efektör fonksiyonunu sergiler ve fonksiyonel olarak bir SBA ve / veya OPK analizinde aktiftir. Spesifik antikorlar, aktif bir FC parçasindan yoksun olabilir, bu nedenle ya bir antikorun bir FC parçasini içermeyen ya da bir Fcgamma reseptör baglanma bölgesi içermeyen ya da FC efektör fonksiyonunu azaltmaya yönelik modifikasyonlar ile FC efektör fonksiyonundan yoksun antikor alanlarini içeren antikor alanlarindan olusur. Alternatif antikorlar, özellikle OPK ve / veya SBA aktivitesini gelistirmek için FC efektör fonksiyonlarini arttirmak için modifikasyonlari içerecek sekilde tasarlanabilir.

Bu modifikasyonlar, modifikasyonlar, ör. FC efektör fonksiyonunun azaltilmasi veya arttirilmasi için, Fcgamma reseptör baglanma sahasindaki mutasyonlar veya bir antikor formatinin ADCC ve / veya CDC aktivitesine müdahale etmek için türevler veya maddeler ile gerçeklestirilebilir.

Fc efektör fonksiyonunda önemli bir azalma tipik olarak, ADCC ve / veya CDC aktivitesi ile ölçüldügünde, modifiye edilmemis (yabani tip) formatin % lO'undan daha az, tercihen % 5'ten daha az olan FC efektör fonksiyonuna deginmektedir. FC efektör fonksiyonunun önemli bir artisinin tipik olarak, modifiye edilmemis (vahsi tip) formatin, ADCC ve / veya CDC aktivitesi ile ölçüldügünde, en az % lO'unun FC efektör fonksiyonundaki bir artisi, tercihen en az % 20, % 30, % 40 veya % 50'yi ifade ettigi anlasilmaktadir.

Antikor dizilerine göre "gliko-tasarlanmis" varyantlar, gliko-yürütücünün bir sonucu olarak modifiye edilmis immünojenik özelliklere, ADCC'ye ve / veya CDC'ye sahip olan glikosilasyon varyantlarini ifade edecektir. Tüm antikorlar, agir zincir sabit bölgelerinde korunmus pozisyonlarda karbonhidrat yapilari içerir, her bir izotip, protein montajini, salgilanmasini veya fonksiyonel aktivitesini degisken bir sekilde etkileyen N-bagli karbonhidrat yapilarinin ayri bir dizisine sahiptir. IgGl tipi antikorlar, her CH2 domeninde Asn297'de korunmus N bagli glikozilasyon bölgesine sahip olan glikoproteinlerdir. Asn297'ye baglanan iki kompleks iki antenli oligosakkarit, polipeptit omurgasi ile genis temaslar olusturan CH2 alanlari arasinda gömülüdür ve bunlarin antikorun, antikor bagimli komplement aracili bakteriyel öldürme veya fagositik hücreler tarafindan alinma gibi efektör fonksiyonlara aracilik etmesi için varligi Önemlidir. N-Glycan'in N297'de çikarilmasi, ör. N297`yi mutasyona sokmak, ör. A'ya veya T299`a göre, tipik olarak indirgenmis efektör fonksiyonu olan aglikosile edilmis antikor forrnatlariyla sonuçlanir.

Antikor glikozilasyonundaki büyük farkliliklar hücre çizgileri arasinda meydana gelir ve hatta farkli kültür kosullari altinda yetistirilen belirli bir hücre çizgisi için küçük farkliliklar görülür. Bakteriyel hücrelerde ekspresyon tipik olarak aglikosile edilmis bir antikor saglar. CH2 hücrelerinin bis (1,4) -N-asetilglukosaminiltransferaz III (GnTIII) ekspresyonuna sahip CHO hücrelerinin, glikozil-transferaz katalizörlü gliseranin olusumunu gelistirdigi, fonksiyonel (ADCC) aktivitesinin arttigi seçimine ek olarak, antikorlarin rekombinant üretimi sirasinda glikosilasyonu etkileyen faktörler, büyüme modu, ortam formülasyonu, kültür yogunlugu, oksijenasyon, pH, saflastirma semalari ve benzerlerini içerir. katilan bir antikorun parçasini ifade eder. Antijen baglanma bölgesi, agir ("H") ve / veya hafif ("L") zincirlerinin N-terminal degiskeninin ("V") bölgelerinin amino asit kalintilari veya bunlarin degisken alanlarindan olusur. "Hiperdegisken bölgeler" diye deginilen agir ve hafif zincirlerin V bölgeleri arasinda oldukça yüksek olan üç uzama, çerçeve bölgeleri olarak bilinen daha korunmus yanlara dogru uzanan uzantilar arasina yerlestirilir. Antijen baglanma alani, üçlüye tamamlayici bir yüzey saglar.

Bagli bir epitopun veya antijenin boyutsal yüzeyi ve hiper degisken bölgeler edilen baglanma bölgesi de burada "CDR baglama bölgesi" olarak adlandirilmaktadir.

Burada kullanilan "antijen" terimi, "hedef" veya "hedef antijen" terimleriyle dönüsümlü olarak, bir tam baglanma molekülüne veya bir antikor baglama bölgesi tarafindan taninan bu molekülün bir fragmanina atifta bulunacaktir. Spesifik olarak, bir antijenin alt yapilari, örn. genel olarak "epitoplar" diye deginilen bir polipeptit veya karbonhidrat yapisi, örn. Immünolojik olarak ilgili olan B-hücresi epitoplari ya da T-hücresi epitopu, bu baglanma bölgesi tarafindan taninabilmektedir. 025b veya O25a antijenleri gibi spesifik antijenler, izole edilmis antijenler veya baska bir deyisle, Ekolicells veya hücre fraksiyonlari formunda saglanir.

Burada kullanildigi sekliyle "epitop" terimi, özellikle, spesifik bir baglanma partneri tamamen olusturabilen veya bir antikorun bir baglanma bölgesine spesifik bir baglanma partnerinin parçasi olabilen bir moleküler yapiya deginecektir. Bir epitop, dogada veya yapay olarak meydana gelebilir ve bir karbonhidrat, bir peptidik yapi, bir yagli asit, bir organik, biyokimyasal veya inorganik madde veya bunlarin türevleri ve bunlarin herhangi bir kombinasyonundan olusur. Bir epitop, bir peptit, bir polipeptid veya bir protein gibi bir peptidik yapi içinde yer alirsa, genellikle en az 3 amino asit, tercihen 5 ila 40 amino asit ve daha tercihen yaklasik 10-20 amino asit içerir.

Epitoplar, dogrusal veya konformasyonel epitoplar olabilir. Dogrusal bir epitop, bir polipeptit veya karbohidrat zincirinin bir birincil sekansinin tek bir segmentinden olusur. Dogrusal epitoplar bitisik veya örtüsebilir. Konformasyonel epitoplar, bir üçüncü] yapi olusturmak üzere polipeptidi katlayarak bir araya getirilen amino asitler veya karbonhidratlardan olusur ve amino asitler dogrusal sekansta birbirine bitisik degildir. Spesifik olarak ve polipeptid antijenleri ile ilgili olarak, konformasyone] veya süreksiz epitop, birincil sekansta ayrilmis iki veya daha fazla ayri amino asit tortusunun varligi ile karakterize edilir, fakat polipeptid dogal protein / antijene katlandiginda molekül yüzeyinde tutarli bir yapiya monte edilir.

Burada "epitop" terimi, özellikle bir antikor tarafindan taninan tekli epitopa veya her biri spesifik olarak hedefi taniyan bir antikoru kast edecektir, her biri, spesifik olarak lGlO ve 8DlO-C8 olarak adlandirilan antikorlardan olusan gruptan seçilen bir antikor 8D10-C8'den olusan gruptan seçilen bir antikor tarafindan hedeflenen epitop, bir karbonhidrat epitopudur.

”Ifade" terimi asagidaki sekilde anlasilmaktadir. Örnek olarak bir ekspresyon ürününün istenen kodlama dizisini içeren nükleik asit molekülleri; burada tarif edildigi gibi bir antikor ve örn. islevsel baglantida bir promoter, ekspresyon amaçlari için kullanilabilir. Bu sekanslarla transforme veya transfekte edilen konakçilar, kodlanmis proteinleri üretebilir. Dönüsümü etkilemek için, ifade sistemi bir vektöre dahil edilebilir; fakat, ilgili DNA, konakçi kromozomuna da entegre edilebilir.

Spesifik olarak terim, örn. vektör tarafindan tasinan ve konakçi hücreye sokulan yabanci DNA tarafindan kodlanan bir proteinin ifadesi için, uygun kosullar altinda bir konakçi hücreye ve uyumlu vektöre atifta bulunur.

Kodlama DNA'si, belirli bir polipeptit veya protein gibi ör. bir antikor, belirli bir amino asit dizisini kodlayan bir DNA dizisidir. Promotör DNA, kodlayan DNA'nin ekspresyonunu baslatan, düzenleyen veya baska sekilde aracilik eden veya kontrol eden bir DNA dizisidir. Promotör DNA ve kodlama DNA'si ayni genden veya farkli genlerden olabilir ve ayni veya farkli organizmalardan olabilir. Rekombinant klonlama vektörleri genellikle, klonlama veya ekspresyon için bir veya daha fazla replikasyon sistemi, konakçida seçim için bir veya daha fazla markör, ör. antibiyotik direnci ve bir veya daha fazla ekspresyon kasetini içerecektir.

Burada kullanilan "vektörler", klonlanmis rekombinant nükleotit sekanslarinin, yani rekombinant genlerin transkripsiyonu ve mRNA'larinin uygun bir konakçi organizmada translasyonu için gerekli olan DNA sekanslari olarak tanimlanir.

Bir "ifade kaseti", tanimlanmis kisitlama bölgelerinde bir vektöre sokulabilen bir ifade ürününü kodlayan bir DNA kodlama dizisini veya DNA parçasini ifade eder.

Kaset kisitlama alanlari kasetin uygun okuma çerçevesine yerlestirilmesini saglamak için tasarlanmistir. Genel olarak, yabanci DNA, vektör DNA'sinin bir veya daha fazla kisitlama bölgesine eklenir ve daha sonra vektör tarafindan, nakledilebilir vektör DNA'si ile birlikte bir konakçi hücreye tasinir. Bir ifade vektörü gibi sokulan veya eklenen DNA'ya sahip bir segment veya DNA dizisi de bir "DNA yapisi" olarak adlandirilabilir.

Ekspresyon vektörleri, ekspresyon kasetini içerir ve ilave olarak genellikle, konakçi hücrelerde veya bir genom entegrasyon bölgesinde, bir ya da daha fazla seçilebilir markör (ör. bir amino asit sentezi geni veya zeosin, kanamisin, G418 veya higromisin gibi antibiyotiklere direnç kazandiran bir gen), bir dizi restriksiyon enzim bölünme yeri, bir uygun promoter sekansi ve bir transkripsiyon terminatörü içinde otonom replikasyon için bir orijin içerir. Burada kullanilan ivektör" terimi, otonom olarak replike olan nükleotit sekanslarinin yani sira genom entegre edici nükleotit sekanslarini içerir. Yaygin bir vektör türü, genellikle, ek (yabanci) DNA'yi kolayca kabul edebilen ve kolayca uygun bir konakçi hücrenin içine sokulabilen, çift-sarmal DNA'nin kendi kendine yeten bir molekülü olan bir "plazmid" dir. Bir plazmid vektörü genellikle kodlayici DNA ve promoter DNA`yi içerir ve yabanci DNA'nin yerlestirilmesi için uygun bir veya daha fazla kisitlama bölgesine sahiptir. Spesifik olarak, "vektör" veya "plazmid" terimi, konakçiyi dönüstürmek ve ekspresyonu tesvik etmek (örnegin transkripsiyon ve translasyon) amaciyla bir DNA veya RNA dizisinin (örnegin bir yabanci genin) bir konakçi hücreye sokulabilecegi bir araci belirtir.

Burada kullanildigi sekliyle "konakçi hücre" terimi, burada tarif edilen bir antikor gibi özel bir rekombinant proteini üretmek için dönüstürülmüs birincil konu hücrelere ve bunlarin herhangi bir soyuna refere eder. Anlatilmalidir ki, tüm soyagacilar, ebeveyn hücresine tam olarak özdes degildir (kasitli veya kasitsiz mutasyonlar veya ortamdaki farkliliklar nedeniyle), ancak, bu tür degistirilmis döller, bu terim içine dahil edilir, çünkü soy, orijinal olarak dönüstürülmüs hücrenin islevi ile ayni islevselligi korurlar. üretmek için bir rekombinant geni eksprese etmek için kullanildigi gibi konakçi hücrelerin bir hücre dizisini belirtir. Burada kullanildigi sekliyle "hücre çizgisi" terimi, uzun bir süre boyunca çogalma yetenegini kazanmis belirli bir hücre tipinin yerlesik bir klonuna karsilik gelir. Bu konakçi hücre veya konakçi hücre dizisi, hücre kültüründe muhafaza edilebilir ve / veya bir rekombinant polipeptid üretmek için yetistirilebilir.

Bir bilesime "bagisiklik yaniti", örn. burada ayrica bir antijen veya epitop içeren edildigi gibi bir asi, ilgili kompozisyona veya ilgili asiya hücresel ve / veya antikor aracili immün tepkisinin konakçi veya konusundaki gelismedir. Genellikle böyle bir cevap, söz konusu kompozisyon ya da asiya dahil edilen bir antijene ya da antijenlere özel olarak yönlendirilen antikor üreten antikorlari, B hücrelerini, yardimci T hücrelerini, baskilayici T hücrelerini ve / veya sitotoksik T hücrelerini içerir.

Bir "koruyucu bagisiklik yaniti", terapötik immün tepkisi olarak anlasilir ve bir patojenden türetilen bir antijene karsi bir bagisiklik tepkisine karsilik gelir; bu, bir sekilde hastalik semptomlarini, yan etkileri veya ilerlemeyi önler, iyilestirir, tedavi eder veya en azindan kismen tutarlar. Spesifik olarak, immün olmayan popülasyonunkiyle karsilastirildiginda indüklenmis veya dogal bir enfeksiyon veya toksin tehdidinin önemli ölçüde daha iyi bir sonucunu saglayan koruyucu immün tepkisi tetiklenir.

Bir immünojen veya immünojenik kompozisyon genellikle antijen veya epitop ve özellikle bir adjuvan içerebilen bir tasiyici içerir. "Yardimci madde" terimi, bir antijen takviyeleri ile birlikte uygulandiginda ve / veya antijene karsi bagisiklik tepkisini yeniden yönlendiren, ancak tek basina uygulandiginda antijene karsi bir bagisiklik tepkisi olusturmayan bir bilesige refere eder. Adjuvanlar, lenfosit alimi, B ve/ veya T hücrelerinin uyarilmasi ve makrofajlarin uyarilmasi gibi çesitli mekanizmalarla bagisiklik yanitini güçlendirebilir. Örnek tasiyicilar lipozomlar veya katyonik peptitlerdir; örnek yardimci maddeler, alüminyum fosfat veya alüminyum hidroksit, MF59 veya CpG oligonükleotididir.

Bir nükleik asit, bir antikor veya baska bir bilesik ile ilgili olarak burada kullanildigi sekliyle "izole edilmis" veya "izolasyon" terimi, 'büyük ölçüde sat` formda var olacagi sekilde, dogal olarak birlestirilecegi ortamdan yeterince ayrilmis olan bu bilesige atifta bulunur. "izole", yapay veya sentetik karisimlarin, diger bilesikler veya malzemelerle veya temel aktiviteye müdahale etmeyen ve örnegin tamamlanmamis saflastirma nedeniyle mevcut olabilecek safsizliklarin varligi disinda birakilmasi anlamina gelmez. Özellikle mevcut bulusun izole edilmis nükleik asit molekülleri, kimyasal olarak sentezlenenleri de kapsamaktadir.

Bulusun nükleik asitlerine referansla, "izole edilmis nükleik asit" terimi bazen kullanilir. Bu terim, DNA'ya uygulandiginda, içinde bulundugu organizmanin dogal olarak meydana gelen genomunda hemen bitisik oldugu dizilerden ayrilmis bir DNA molekülüne refere eder. Örnegin, bir "izole edilmis nükleik asit", bir plazmid veya virüs vektörü gibi bir vektöre eklenen veya bir prokaryotik veya ökaryotik hücre veya konakçi organizmanin genomik DNA'sina entegre edilen bir DNA molekülünü içerebilir. RNA'ya uygulandiginda, "izole edilmis nükleik asit" terimi, esas olarak, yukarida tanimlandigi gibi izole edilmis bir DNA molekülü tarafindan kodlanan bir RNA molekülünü belirtir. Alternatif olarak, terim, dogal haliyle (yani, hücrelerde veya dokularda) iliskilendirilecegi diger nükleik asitlerden yeterince ayrilan bir RNA molekülüne refere edebilir. "Izole edilmis bir nükleik asit" (DNA veya RNA) ayrica dogrudan biyolojik veya sentetik yollarla üretilen ve üretimi sirasinda mevcut olan diger bilesenlerden ayrilan bir molekülü temsil edebilir.

Bulusa ait antikorlar veya epitoplar gibi polipeptitler veya proteinler ile ilgili olarak olarak baglantili olduklari, serbest veya büyük ölçüde serbest olan bilesiklere atifta bulunacaktir. Dogal ortamlarinda veya hazirlandiklari ortamda (örnegin hücre kültürü) bu tür bir preparat, vitroorin vivo uygulanan rekombinant DNA teknolojisi ile bulunur. Izole edilen bilesikler, seyrelticiler veya yardimci maddeler ile formüle edilebilir ve hala pratik amaçlar için izole edilebilir. Örnegin, polipeptidler veya polinükleotitler, teshis veya tedavide kullanildiginda farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar veya eksipiyanlarla karistirilabilir. Özellikle, bulusun izole edilmis antikoru, 025 (a) suslarina karsi yükseltilen poliklonal serum preparatlarindan farklidir, çünkü izole edilmis ve saflastirilmis formda saglanir, tercihen tek aktif madde olarak izole edilmis antikoru içeren bir preparatta saglanir. Fakat, izole edilmis antikorun, sinirli sayida daha iyi tanimlanmis (izole edilmis) antikorlar içeren bir kombinasyon halinde temin edilmesi engellenmemektedir. Izole edilmis antikorlar, boncuklar gibi bir kati, yari sivi veya sivi tasiyici üzerinde de saglanabilir. kullanilmaktadir ve MDR E.koli gibi enfekte olmus bir protein toksinleri üreterek enfeksiyonlari tesvik etmekten ya da toksinlerin nötralizasyonun gerçeklestigi mekanizmadan bagimsiz olarak bir denekde bir hedef hücreye zarar vermesini engellemek için patojeni inhibe eden herhangi bir molekülü ifade eder. Nötralizasyon, örnegin, MDR E. koli endotoksinin hedef hücreler üzerindeki kognat reseptörü ile (öm., TLR4 reseptörüne baglanma) baglanmasini ve / veya etkilesimini inhibe eden bir antikor ile saglanabilir. Nötralizasyon ayrica Fc aracili fonksiyonlarla dolasimdan endotoksin moleküllerinin uzaklastirilmasiyla da ortaya çikabilir.

Nötralizasyon gücü tipik olarak standart bir deneyde, örn. Endotoksinin biyolojik aktivitesinin inhibisyonunun ör. kolorimetrik olarak ölçüldügü LAL testi, ile belirlenir. enfeksiyonlar, sadece son on yilda ortaya çikan ve küresel olarak yayilan dominant dirençli bir klon olan STl3l-025b H4 klonal nesline bagli olarak önemli bir bölümdedir. Çok dirençli E. koli, özellikle üç veya daha fazla antibiyotik sinifina direnç gösteren suslar olarak, asagidaki ajanlar / gruplar olarak anlasilmaktadir: penisilinler, sefalosporinler, karbapenemler, aminoglikozitler, tetrasiklinler, fuorokinolonlar, nitrofurantoin, trimetoprim (ve onun kombinasyonlari), fosfomisin, polimiksinler, kloramfenikol, azriteonam, tigesiklin.

Asidik kapsüler polisakkarit (CPS), çogu patojeni çevreleyen kalin, mukus benzeri bir polisakkarit tabakasidir. Bu nedenle, bulusun bir antikoru tarafindan taninan spesifik epitopun, hem kapsüllenmis hem de kapsüllenmemis MDR E.koli sus üzerinde spesifik olarak erisilebilir olmasi sasirticidir.

MDR E. koli ile mücadele eden veya nötralize eden antikorlar patojenlere ve patojenik reaksiyonlara müdahale ederler, böylece enfeksiyonu sinirlayabilir veya önleyebilir ve / veya bu tür bir enfeksiyondan kaynaklanan bir hastalik durumunu iyilestirebilir veya MDR E. koli patojenezini, Özellikle konakçinin steril vücut bölmelerinin içine veya içine yayma ve çogaltma, inhibe edebilirler. Bu baglamda ajana karsi bagisikliktan sorumlu olan antikorlar olarak anlasilmaktadir. Özellikle, burada tarif edilen koruyucu antikorlar, ör. muhtemelen bir patojen tarafindan indüklenen hastalik semptomlarini, yan etkilerini veya ilerlemesini önlemek, iyilestirmek, tedavi etmek veya en azindan kismen durdurmak için profilaksi veya tedavi için terapötik amaçlar için kullanilabilir. Spesifik olarak koruyucu antikorlar, Ör. serum bakterisidal veya opsonofagositik aktiviteleri indükleyerek canli E. koli hücrelerinin replikasyonunu öldürür ya da engelleyebilir ya da terapötik uygulamalari izleyen tüm bakteriyel hücreleri ya da LPS moleküllerini steril vücut bölgelerinden temizleyebilir. (yani, belirlenmis bir enfeksiyonda verilen) Alternatif olarak, profilaktik olarak uygulanan koruyucu antikorlar, yukarida bahsedilen veya diger mekanizmalardan biri ile bir enfeksiyonun (yani, steril olmayan bölümleri steril vücut bölümlerine koordine etmek) yayilmasini önler. antijeni olarak anlasilmaktadir. Yapi benzer, ancak 025 (a) antijeninden farklidir.

O25b, benzer, fakat O25a'dan farkli olan bir serotip olarak anlasilmaktadir (bakiniz Sekil 3 (a)). tekrarlama ünitesinden yapilan antijen olarak anlasilmaktadir. (Kenne L, Lindberg B, Madden JK, Lindberg AA, Gemski P Jr. Escherichia koli O-antijen 25 in yapisal önce, 025 terimi burada tarif edildigi gibi 025a için durmustur (bakiniz Sekil 3 (b)).

Burada kullanildigi sekliyle "rekombinant" terimi "genetik mühendisliginin sonucu veya hazirligi” anlamina gelecektir. Bir rekombinant konakçi, spesifik olarak bir ekspresyon vektörü veya klonlama vektörü içerir veya genomik bir nükleik asit sekansi ihtiva etmek üzere genetik olarak yapilandirilmistir, özellikle konakçiya yabanci olan nükleotid sekansi kullanilir. Bir konakçida bir rekombinant nükleik asit eksprese edilerek bir rekombinant protein üretilir. Burada kullanildigi sekliyle yaratilmis veya izole edilmis, (a) insan immünoglobulin genleri veya bunlardan hazirlanan bir hibridoma için transgenik veya transkromozomal olan bir hayvandan (örnegin bir fare) izole edilmis antikorlar, (b) antikoru ifade etmek üzere transforme edilen bir konakçi hücreden izole edilmis antikorlar, örn., bir transfektanstan, (c) rekombinant, kombinatoryal insan antikor kütüphanesinden izole edilmis antikorlar ve (d) insan immünoglobulin gen sekanslarinin diger DNA sekanslarina yapismasini içeren baska herhangi bir yolla hazirlanmis, eksprese, yaratilmis veya izole edilmis antikorlar, içerir. Bu tür rekombinant antikorlar, örnegin antikor olgunlasmasi sirasinda meydana gelen yeniden düzenlemeleri ve mutasyonlari içerecek sekilde tasarlanmis antikorlari içerir.

Burada kullanildigi sekliyle "spesifisite" veya "spesifik baglanma" terimi, heterojen bir moleküller popülasyonunda ilgili kognat ligandinin determinatif olan bir baglanma reaksiyonunu belirtir. Bu nedenle, belirlenmis kosullar altinda (örnegin immünoassay kosullari), bir antikor spesifik hedefine spesifik olarak baglanir ve bir örnekte bulunan diger moleküllere önemli miktarda baglanmaz. Spesifik baglanma, baglamanin, seçildigi gibi, hedef kimlik, yüksek, orta veya düsük baglanma afinitesi veya aviditesi açisindan seçici oldugunu belirtir. Baglanma sabiti veya baglanma dinamigi en az 10 kat farkli oldugunda, tercihen fark en az 100 kat (en az 2 log farki olarak anlasilir) ve daha çok tercihen en az 1000 kat (En az 3 log farkliligi olarak anlasilir) oldugunda, seçici baglanma saglanir. "Spesifiklik" veya "spesifik baglanma" terimi, ayrica bir veya daha fazla moleküle, Ör. çapraz spesifik baglayicilara baglanan baglayicilara da uygulandigi anlasilmaktadir.

Bulusun antikoru, spesifik olarak sadece 025b antijeninin baglanmasi veya 025a antijenine göre 025b antijeninin baglanmasi veya 025b'nin 025a suslarina karsi yükseltilmis poliklonal serum ile karsilastirildiginda daha yüksek afinite ile baglanmasi, selektif olarak seçicidir. Düsük afiniteye sahip 025b antijenine.

Dolayisiyla, bulusun antikoru, en azindan 1 log, tercihen en az 2 log, tercihen en az 3 log olan bir Kd farki ile farkli bir afinite gibi, bu antijenlen' ör. en azindan esit afinite ile veya esit afiniteyle farkli sekilde bagladigi anlasilmalidir. O25a antijenine göre 025b antijenine seçici olarak baglanan bu antikor tercihen teshis veya tedavi amaçli kullanilir. Bazi diagnostik amaçlarla, spesifik olarak 025b antijenini sadece saptanabilir bir sekilde baglayan bir antikor kullanilir. baglanma" teriminin kullanilmasi esdeger monoklonal antikorlarin ayni veya esasen ayni, yani benzer immünoreaksiyon (baglanma) özelliklerini sergiledigini ve önceden seçilmis bir hedef baglanma dizisine baglanmaya rekabet ettigini gösterir. Belirli bir hedef için bir antikor molekülünün göreceli özgüllügü, örnegin, örn. Harlow ve dig., ANTIKORLAR: BIR LABORATUVAR KILAVUZU, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988).

Burada kullanildigi haliyle "denek" terimi, sicakkanli bir memeliye, özellikle bir insana deginecektir. Özellikle bulusun tibbi kullanimi veya ilgili tedavi yöntemi, bir erken asama veya geç evre hastalik dahil olmak üzere, bir MDR E.koli enfeksiyonu veya hastaliktan muzdarip bir hastalik durumunun profilaksisi veya tedavisine ihtiyaç duyan bir hasta için geçerlidir. "Hasta" terimi, profilaktik veya terapötik tedavi gören insan ve diger memeli konulari içerir. "Tedavi" teriminin, hem profilaktik hem de terapötik tedaviyi kapsamasi amaçlanmistir.

Bir denek, örn. profilaksi veya MDR E.koli hastaligi kosullarinin tedavisi için tedavi edilir. Özellikle de, enfeksiyon ya da bu hastalik ya da hastalik nüksetmesi ya da bu tür bir enfeksiyon ve / veya bu tür enfeksiyonla iliskili hastaliktan muzdarip bir özne riski tasiyan kisi tedavi edilir.

Spesifik olarak "profilaksi" terimi, patojenez riskini azaltmak için patojenez baslangicini veya profilaktik önlemleri önlemeyi amaçlayan önleyici tedbirleri belirtmektedir.

Spesifik olarak, burada tarif edildigi gibi bir hastadaki bir hastalik durumunun tedavi edilmesi, önlenmesi veya geciktirilmesi için yöntem, durumun nedense] maddesi olarak MDR E. koli'nin patojenezine müdahale etmektir.

Burada kullanildigi sekliyle "büyük ölçüde saf" veya "satlastirilmis" terimi, bir nükleik asit molekülü veya bir antikor gibi bir bilesimin en az % 50, tercihen en az % bilesik için uygun yöntemler ile ölçülür (örnegin kromatografik yöntemler, poliakrilamid jel elektroforezi, HPLC analizi ve benzerleri).

Burada kullanilan "terapötik olarak etkili miktar" terimi, burada bir bilesigin "etkili miktari" veya "yeterli miktari" terimlerinin herhangi biriyle, örnegin; burada tarif edilen bir antikor veya immünojen, söz konusu etkiye tatbik edildiginde klinik sonuçlar da dahil olmak üzere yararli veya arzu edilen sonuçlar için yeterli bir miktar veya etkinliktir ve bu nedenle, etkili bir miktar veya bunun esanlami, uygulandigi içerige baglidir.

Etkili bir miktar, bu tür hastaliklari veya bozuklugu tedavi etmek, önlemek veya engellemek için yeterli olan bir bilesigin miktarini ifade eder. Hastalik baglaminda, burada tarif edilen antikorun terapötik olarak etkili miktarlari, MDR E. koli patogenezinin inhibisyonu, mukozal yüzeylerin yapismasi ve kolonizasyonu, steril vücut bölgelerinde kontrolsüz replikasyon ve konakçi hücrelerin bakteriyel ürünler tarafindan toksisitesinden yararlanan bir hastaligi veya durumu özellikle tedavi etmek, modüle etmek, zayiflatmak, tersine çevirmek veya etkilemek için kullanilirlar.

Böyle bir etkili miktara karsilik gelecek olan bilesigin miktari, verilen ilaç veya bilesik, farmasötik formülasyon, uygulama yolu, hastalik tipi veya bozuklugu, tedavi edilen hasta veya konakçinin kimligi gibi çesitli faktörlere bagli olarak degisecektir, ancak yine de teknikte uzman bir kisi tarafindan rutin olarak belirlenebilir.

Burada tarif edilen antikor veya immünojen, MDR E. koli enfeksiyonunun baslangicini inhibe etmek için profilaktik olarak veya MDR E. koli enfeksiyonunu tedavi etmek için terapötik olarak, özellikle de refrakter oldugu bilinen veya spesifik bir denek olarak bilinen MDR E. koli enfeksiyonlarinin diger geleneksel antibiyotik tedaviyle tedaviye refrakter oldugu kanitlanmis olabilir.

Burada tarif edildigi gibi bir insan hastaya saglanan gibi terapötik olarak etkili bir miktardaki antikor, özellikle 0.5-500 mg araliginda, tercihen 1-400 mg araliginda, olabilir, ancak akut hastalik kosullari tedavisinde daha yüksek dozlar belirtilebilir.

Ayrica, mevcut bulusun antikorunun terapötik olarak etkili bir miktarina sahip bir denegin tedavi veya önleme rejimi, tek bir uygulamadan olusabilir veya alternatif olarak bir dizi uygulamayi içerir. Örnegin, antikor en az yilda bir kez, en az bir kez yarim yil veya ayda en az bir kez verilebilir. Fakat, baska bir düzenekte antikor, belirli bir tedavi için haftada yaklasik bir kez ila yaklasik günlük bir uygulamaya kadar denege uygulanabilir. Tedavi süresinin uzunlugu, hastaligin siddeti, akut veya kronik hastalik, hastanin yasi, konsantrasyon ve antikor formatinin aktivitesi gibi çesitli faktörlere baglidir. Ayrica, tedavi veya profilaksi için kullanilan etkili dozajin, belirli bir tedavi veya profilaksi rejiminin seyri boyunca artabilecegi veya azaltabilecegi de takdir edilecektir. Dozajdaki degisiklikler, teknikte bilinen standart teshis deneyleri ile sonuçlanabilir ve ortaya çikabilir. Bazi durumlarda kronik uygulama gerekebilir.

Bir MDR E. koli enfeksiyonu ile iliskili bir hastalik durumu gelistirme riski tasiyan bir hastaya saglandigi gibi burada tarif` edilen bir immünojenin etkili bir miktari, spesifik olarak doz basina 1-15 mg/ kg araliginda olabilir. Örnegin, immünojen, bir MDR enfeksiyonuna uzun süreli etkili bir bagisiklik yanitini indüklemek için bir birinci-doz asilama semasina göre belirli bir zaman dilimi içinde bir ya da daha fazla yükseltici doz (lar) ile takip edilen bir birinci doz olarak uygulanabilir. Tercih edilen bir asilama programi, üç dozun, ör. 0. günde bir birinci günde bir üçüncü dozun uygulanmasini kapsayacaktir. Tercih edilen hizlandirilmis bir programa göre, idare 0, 7 ve !4 günlerde olabilir. Ör. Elektif cerrahi ile karsi karsiya kalan hastalar için profilaksi için hizlandirilmis çizelgeler endike olabilir. Genellikle sap bir yardimci madde olarak, örn. fosfat veya hidroksit olarak, kullanilir.

Bu nedenle, mevcut konu, O25b'ye oldukça spesifik olan murin mAb'lerinin kesfine dayanmaktadir. Bu antikorlar, ST131 soyuna ait MDR suslarinin tanimlanmasi için teshis reaktifleri olarak büyük potansiyele sahiptir. Ayrica, özellikle insanlasmayi takiben, bu mAb'lar profilaksi için (örnegin yüksek risk gruplari için) ve STl3l- 025b: H4 suslarinin neden oldugu E. kolin enfeksiyonlarinin tedavisi için kullanilmaya uygundur.

E.koli susun teshis tanimlamasinda, 025'e karsi bagisiklik serumunun rutin olarak kullanildigi gerçegine dayali olarak ayni veya çok benzer oldugu düsünülmüstür.

ST131 suslarinda O-antijen sentezinin genetik altyapisi tam olarak açikliga kavusturulamamistir, fakat, (O-antijen sentezini sifreleyen) spesifik bir gen, 025b suslarinin PCR bazli tanimlanmasinin temelini olusturmaktadir. Ayrica, hiçbir yapisal veri su ana kadar 025 (a) ve 025b antijenleri arasinda herhangi bir farki desteklemedi.

Dolayisiyla, bulusun bir antikorunun 025b antijenini spesifik olarak baglayabildigi ve özellikle 025b ve 025a antijenleri arasinda farklilasabilecegi sasirticiydi. 025b ve 025a antijeni ifade eden E. koli suslari arasindaki genetik farkliligi teyit etmek için, O-antijen sentezini kodlayan rfb küme, korunmus kusatma genlerine: gnd ve galF, özgü oligonükleotitler ile baslayan bir primer yürüyüs metodu kullanilarak ticari olarak temin edilebilen bir sustan 81009 (Szijarto ve arkadaslari, FEMS kontrast 11,300 bp uzunlugundadir ve sadece 025 antijen sentez enzimlerini kodlayana kismen benzerdir (NCBI erisim numarasi GU014554). O25b rfb operonunun 3 'ucunda 2043 bp uzun segmentin, 025 rfb operonun karsilik gelen bölgesine homolog olmadigina ve bu segmentin, fukoz sentezi amd naklini kodlayan bir 6267 bp uzun diziyle degistirildigi ortaya çikmistir.

E. koli STlSl'den izole edilen LPS'de bulunan O-spesifik PS biyolojik tekrarlama ünitesinin (RU) yapisi, bir tekrarlama ünitesi (RU) ile ikame edilen çekirdek OS tarafindan olusturulan saflastirilmis bir fraksiyonda ayrintili olarak analiz edilmistir.

LPS ST131'in RU, Sekil 3'te gösterilen yapiya sahip bir O-asetillenmis pentasakarittir.

Gerçekte, ST131 O-PS'nin RU yapisi, Kenne ve arkadaslari (Kenne, Lindberg ve ark., farklidir ve bildigimiz kadariyla, E. koli lipopolisakkaridler arasinda yeni bir 0- Ayrica, MALDI-TOF kütle spektrometrisi ve LPS STl3l'den izole edilmis bir çekirdek oligosakkaritin kompozisyon analizleri, daha Önce Szijârtö V. ve arkadaslari tarafindan genetik analizler temelinde rapor edilen K-12 tipini desteklemistir. ana çekirdekli oligosakkarit (OS) glikoformundan olustugu gösterilmistir.

Glikoformun tipi O-spesifik polisakkaritin (PS) varligina veya yokluguna baglidir.

Sübstitüe edilmemis çekirdek OS'nin hakim glikoformu, -› 7) -oi-Hepp- (1 - 6) -oi- Glcpdisakkaritten yoksun olan K-12 çekirdekli oligosakaritin kesikli versiyonudur.

Bu disakkaritin varligi, O-PS ile ikame edilmis çekirdek isletim sistemi ve ikame edilmemis çekirdek isletim sistemi arasindaki farktir. Özel bir yönüne göre, O25b'ye özgü epitopu seçici olarak baglayan bir antikor, öm. antikoru olarak adlandirilan antikorlardan herhangi birinin baglanmasi, bu terim esas olarak ayni epitopa baglanan varyantlari içerir; veya 8D5-1G10 antikoru ile ayni adlandirilan antikorlardan herhangi birini içeren, bu terim esas olarak ayni baglama antikorlar, özellikle 025b antijeni ve 025a antijeni arasinda spesifik olarak farklilasan ve sadece 025b antijenini baglayan bir baglanma bölgesi içerecektir. 8D10-C8 olarak adlandirilan antikor, 025b ve 025a antijenlerini çapraz olarak spesifik olarak baglayan ve tercihen 025a antijenine kiyasla 025b antijenini baglayan bir baglanma bölgesi içerecektir.

Antikorlarin "ayni epitopa baglanmasi" veya "ayni baglama bölgesine" baglanmasi veya "esasen ayni baglanma" özelliklerine sahip oldugu söylenir, eger antikorlar, sadece bir antikorun belirli bir zamanda epitopa baglanabilecegi sekilde çapraz rekabet ederse, yani bir antikor digerinin baglanma veya modüle edici etkisini önler.

Bir antikor ile ilgili olarak burada kullanildigi sekliyle "rekabet" veya "çapraz rekabet" terimi, bir birinci antikorun veya bunun antijen baglayici bir kisminin, bir saniyenin baglanmasina yeterince benzer bir sekilde bir epitopa baglandigi anlamina gelir, öyle ki birinci antikorun kendi es-yapili epitopu ile baglanmasinin sonucu, ikinci antikorun varliginda, birinci antikorun baglanmasina kiyasla, ikinci antikorun varliginda, saptanabilir sekilde azalir. Ikinci antikorun kendi epitopuna baglanmasinin, ayni zamanda, birinci antikorun varliginda, saptanabilir bir sekilde azaldigi alternatif olabilir, ancak bu durumun söz konusu olmasi gerekmez. Yani, bir birinci antikor, bir ikinci antikorun, epitopuna baglanmasini, ikinci antikorun, kendi antikorunun kendi epitopuna baglanmasini inhibe etmeden önleyebilir. Fakat, her bir antikor, diger antikorun kendi kognat epitopu ile baglanmasini inhibe ederek, ayni, daha büyük veya daha az ölçüde olsun, antikorlarin, kendi epitope(lar)inin baglanmasi için birbirleriyle "çapraz-rekabet" ettigi söylenir. Hem rakip hem de çapraz rakip antikorlar mevcut bulus tarafindan kapsanmaktadir.

Buradaki rekabet, rekabet ELISA analizi ile belirlendigi gibi, örnekler bölümünde açiklandigi gibi % 30'dan daha büyük bir nispi engelleme anlamina gelir. Belirli bir konteksde, örnegin, 025b'nin baglanmasinin amaçlanan fonksiyonu ile tasarlanan yeni antikorlari seçmek veya taramak için rekabet analizinin kullanildigi yerde, uygun bir rekabet seviyesi olan kriterler olarak daha yüksek bir göreli engelleme esigi belirlemek istenebilir. Bu nedenle, örnegin, bir antikorun yeterince rekabetçi oldugu kabul edilmeden önce en az % 40 nispi inhibisyonun tespit edildigi veya en az % 50, baglanma için kriterleri ayarlamak mümkündür. antikorlarin herhangi birinin degisken bölgesini, özellikle CDR dizilerinin en az olusan gruptan seçilen bir antikorun CDR sekanslarinin fonksiyonel olarak aktif olan varyantlarini içeren gruptan seçilen bir antikorun CDR dizilerinin en az iki, en az 3, en az 4, en az 5 veya en az alti CDR içeren bir antikor saglanir. Daha spesifik olarak, herhangi biri saglanmistir.

Spesifik olarak, 8D5-1G10 antikoru veya 8D10-C8 antikoru olarak adlandirilan antikor veya bunun fonksiyonel olarak aktif bir varyanti, birikmis konak hücrelerin biri ve / veya plazmidlerden bir tanesi gibi içerilen materyal veya burada yer alan ilgili nükleotit sekansi kullanilarak üretilebilir. Özel bir yönüne göre, 8D5-1G10 antikoru veya bunun fonksiyonel olarak denk bir bulunan plazmidlerden herhangi biri tarafindan kodlanan bir degisken bölge içeren bir antikordan türetilebilir; örnegin belirli antikoru veya bunun fonksiyonel olarak aktif bir varyantini tasarimlastirmak için birikmis malzemenin bir kismi veya (nokta) mutasyona ugramis CDR dizisinin kullanilmasi.

Daha spesifik bir özellige göre, 8D5-1G10 antikoru veya bunun fonksiyonel olarak hücre tarafindan üretilen bir antikorun degisken bölgesinden türetilebilir veya kullanilabilir; Örnegin. kismi bir dizinin kullanilmasi, öm. belirli antikoru veya bunun fonksiyonel olarak aktif bir varyantini tasarimlastirmak için depolanan malzemenin CDR dizilerinin bir veya daha fazlasi.

Spesifik olarak, 6D1-lB2 veya 8A1-1G8 antikor varyanti, fonksiyonel olarak aktif olan 8D5-lGlO antikorunun bir CDR varyantidir, örn. CDR dizilerinin en az birinde kismi degisiklikler ile. Özel bir yönüne göre, 8D10-C8 antikoru veya bunun fonksiyonel olarak denk bir bulunan plazmidlerden herhangi biri tarafindan kodlanan bir degisken bölge içeren bir antikordan türetilebilir; örnegin belirli antikoru veya bunun fonksiyonel olarak aktif bir varyantini tasarimlastirmak için birikmis malzemenin bir kismi veya (nokta) mutasyona ugramis CDR dizisinin kullanilmasi.

Daha spesifik bir özellige göre, 8DlO-C8 antikoru veya bunun fonksiyonel olarak konakçi hücre tarafindan üretilen bir antikorun degisken bölgesinden türetilebilir veya kullanilabilir; örnegin kismi bir dizinin kullanilmasi, örn. belirli antikoru veya bunun fonksiyonel olarak aktif bir varyantini tasarimlastirmak için depolanan malzemenin CDR dizilerinin bir veya daha fazlasi.

Bazi yönlerde, bulus, bu tür bir degisken antikorlar, tercihen bir agir zincir ve bir hafif zincir içeren, tercihen monoklonal antikorlar, en çok tercih edildigi sekilde murin, hümanize veya insan antikorlari saglar, burada agir zincirin veya VH degisken bölgesinin herhangi biri veya ilgili CDR'ler, ilgili biriktirilmis plazmidden ve / veya ilgili biriktirilmis konakçi hücreden türetilen bir amino asit dizisini içerir.

Belirli yönlerde, bulus, bu tür bir degisken antikorlar, tercihen monoklonal antikorlar, en çok tercihen, bir agir zincir ve bir hafif zincir içeren, tercihen murin, hümanize veya insan antikorlari saglar, burada herhangi bir hafif zincir veya VL degisken bölge veya ilgili CDR'ler, ilgili biriktirilmis plazmidden ve / veya ilgili biriktirilmis konakçi hücreden türetilen bir amino asit dizisini içerir.

Belirli yönlerde, bulus, bu tür degisken antikorlar, tercihen monoklonal antikorlar, en çok tercih edildigi sekilde agir zincir ve hafif zincir içeren agir zincir ve insan zinciri veya VH / VL degisken bölgeleri veya ilgili CDR'ler, ilgili biriktirilmis plazmidlerden ve/ veya ilgili biriktirilmis konakçi hücrelerden türetilen bir amino asit dizisini içerir.

Bazi yönlerde bulus, ayni zamanda, degisken diziler ve / veya CDR dizileri gibi, örnegin, baglanmis dizilerden, örn. herhangi bir CDR dizisi, türetildigi gibi amino asit özdeslige sahip, yatirilmis malzemeden ve varyantin fonksiyonel olarak aktif bir varyant oldugu bir dizi içerir.

Burada tarif edildigi gibi, bir yönüyle bulus, ör. 025b antijenine baglanmak için monoklonal antikor 8D5-lGlO veya 8D10-C8 ile rekabet etme kabiliyeti ile herhangi biri, antikorlar bir murin IgG3 antikorudur ve 8D10-C8 antikoru, bulus sahipleri izole edilmis ve karakterize edilen kappa hafif Zincirlerini tasiyan bir murin alanlari, burada referans olarak verilen depolanmis materyal ile ifade edilir. Bu nedenle, hafif zincir ve agir zincir ile belirlenen baglanma karakteristikleri ve 8D5 antikorunun veya 8D10 antikorunun VL / VH alanlarinin tamami burada açiklanmaktadir, ki bir ana antikor olarak kullanilmasini ya da islevsel olarak aktif varyantlarla ya da bulusun rakip antikorlariyla karsilastirilmasi saglanir. konak hücresinin veya burada bulunan kodlama plazmidinin ilgili sekans bilgisinin kullanilmasiyla üretilir. konakçi hücresinin veya burada bulunan kodlama plazmidinin ilgili sekans bilgisinin kullanilmasiyla üretilir. konakçi hücresinin veya burada bulunan kodlama plazmidinin ilgili sekans bilgisinin kullanilmasiyla üretilir. konakçi hücresinin veya burada bulunan kodlama plazmidinin ilgili sekans bilgisinin kullanilmasiyla üretilir. 025b antijeni, tercihen, diger E. koli antijenlere göre, örn. 025 antijeni veya herhangi bir çekirdek antijenden baska herhangi bir karbonhidrat antijeni, tercihen en az 10 kat daha yüksektir, yani en az 10, tercihen en az 100 kat daha yüksek, daha tercihen en az 1000 kat daha yüksek bir Kd farkina sahiptir.

Tercihen 025b antijenine difrensiyal baglanma afinitesi, Statens Serum Enstitüsü'nden (#81369). yüksek titreli E. koli 025 antiserumu gibi ticari tipte serum ile karsilastirildiginda, spesifik olarak en az 5 kat, veya en az 6 kat veya en az 7 kat veya en az 8 kat veya en az 9 kat veya en az 10 kat daha yüksektir. 025b antijeni tercihen O25a antijenine göre baglamak için diferansiyel baglanma afinitesi, en azindan esittir veya esittir, örn. en az 1.5 kat veya en az 2 kat veya en az 3 kat -kat veya en az 9 kat veya en az 10 kat daha yüksektir.

Bulusun tercih edilen antikorlari, söz konusu bireysel antijenlerden, özellikle 025b antijeninden, yüksek bir afinite ile, özellikle yüksek ve / veya düsük kapali bir hizda veya yüksek bir baglayicilik oranina sahip baglanmalardir. Bir antikorun baglanma afinitesi, genellikle antijen haznesinin yarisinin oldugu antikorun konsantrasyonu açisindan karakterize edilir.

Bulusun tercih edilen antikorlarl, söz konusu bireysel antijenlerin, özellikle 025b antijeninin, özellikle yüksek bir ve / veya düsük bir kapali oran ile yüksek bir afinite ile veya yüksek bir baglanma ayan ile baglanmasidir. Bir antikorun baglanma afinitesi genellikle, antijen baglanma alanlarinin yarisinin isgal edildigi, antikorun konsantrasyonu açisindan ayrilir, ayrilma sabiti (Kd veya KD) olarak bilinir.

Genellikle bir baglayici bir Kd <10 '7 M ile bazi durumlarda, örn. daha yüksek afinitelere sahip terapötik amaçlar için, örn. bir Kd <10 _8 M, tercihen bir Kd <10 '9 M ile daha da tercih edilen bir Kd <10 -'° M'dir.

Yine de, özellikle tercih edilen bir düzenlemede, münferit antijen baglanma afiniteleri, orta afiniteye sahiptir, öm. en az iki antijene baglandiginda Kd degeri 10 _6 dan küçük ve lO '7 M'ye kadardir.

Orta afinite baglayicilari, bulusa göre, gerekirse, tercihen bir afinite olgunlastirma islemi ile birlikte temin edilebilir.

Afinite olgunlasmasi, bir hedef antijen için artan afiniteye sahip olan antikorlarin üretildigi islemdir. Bir antikorun, amino asit mutagenezi veya immünoglobulin gen bölümlerinde somatik mutasyonun bir sonucu olarak yapisal degisiklikleri ile, bir baglanma alaninin bir antijene varyantlari üretilir ve daha büyük afiniteler için seçilir.

Afinite olgunlastirilmis antikorlar, bir ana antikora göre birkaç logfold daha fazla afinite sergileyebilir. Tek ebeveyn antikorlari afinite olgunlasmasina maruz kalabilir.

Alternatif olarak, hedef antijene benzer baglanma afinitesine sahip antikor havuzlari, afinite olgunlastinlmis tekli antikorlar veya bu antikorlarin afinite olgunlastirilmis havuzlarini elde etmek için çesitlendirilen ana yapilar olarak düsünülebilir.

Bulusa göre bir antikorun tercih edilen afinite olgunlastirilmis varyanti, baglanma afinitesinde, tercihen en az 100 kat artista en az 10 kat artis sergiler. Afinite olgunlasmasi, ana moleküllerin ilgili kütüphanelerinin kullanildigi seçim kampanyalari sirasinda, ya baglanma afinitesi Kd <10 '7 M'nin spesifik hedef baglanma özelligine sahip olan bulusun antikorunu elde etmek için orta baglanma afinitesine sahip olan antikorlar ile kullanilabilir. Alternatif olarak, afinite, bulusa göre olan antikorun afinite maturasyonu ile daha da aitabilir, Kd 10 '8 M'den daha düsük veya 10 `9 M'den daha düsük, tercihen daha az olan bir Kd'ye karsilik gelen yüksek degerleri elde etmek için 10 .10 M veya hatta 10 "11 M'den daha az, en çok tercih edilenler ise picomolar araliktadir. Özel bir yön, kompleman aracili bakteriyel öldürme ve opsonofagositik alim ve öldürme gibi spesifik bir anti-bakteriyel fonksiyonel aktivite ile karakterize edilen bulusun bir antikorunu ifade eder.

Fagositik efektör hücreler, tamamlayici aktivasyonunu kullanan baska bir yoldan aktive edilebilir. Mikroorganizmalar üzerinde yüzey antijenlerine baglanan antikorlar, kompleman kaskadinin Fc bölgesi ile ilk bilesenini çeker ve "klasik" kompleman sisteminin aktivasyonunu baslatir. Bu, tamamlayici ve antikor bagimli mekanizmalar (CDC) ile nihai olarak hedef bakterileri öldüren fagositik efektör hücrelerin uyarilmasiyla sonuçlanir. Özel bir düzenlemeye göre, bulusun antikoru, standart bir SBA veya OPK analizinde ölçülen immün-efektör hücrelerin varliginda bir sitotoksik aktiviteye sahiptir. Bir kontrol ile karsilastirildiginda bakteriyel öldürme yüzdesinde önemli bir artis varsa, bir SBA veya OPK analiziyle belirlenen bir sitotoksik aktivite, bulusun bir antikoru için gösterilebilir. SBA veya OPK ile ilgili bakterisit aktivitesi tercihen % 5'ten daha yüksek, daha tercihen % 10'dan daha yüksek, daha da tercihen % 20,% 30,% 40 veya Mevcut bulusa ait antikorlar, bir hibridoma yöntemi kullanilarak tanimlanabilir veya elde edilebilir. Böyle bir yöntemde, bir fare veya bir hamster gibi diger uygun bir konakçi hayvan, immünizasyon için kullanilan proteine spesifik olarak baglanacak antikorlari üreten veya üretebilen lenfositleri açiga çikarmak için asilanir. Alternatif olarak, lenfositler in vitro immünize edilebilirler. Lenfositler daha sonra bir hibridoma hücresi olusturmak için polietilen glikol gibi uygun bir kaynastirma maddesi kullanilarak miyelom hücreleriyle kaynastirilir.

Hibridoma hücrelerinin yetistirildigi kültür ortami, antijene karsi yönlendirilmis monoklonal antikorlarin üretimi için tahlil edilir. Tercihen, hibridoma hücreleri tarafindan üretilen monoklonal antikorlarin baglanma spesifitesi, immünopresipitasyon veya radyoimmünoassay (RIA) veya enzime bagli immüno- emici deney (ELISA) gibi anin vitrobinding analizi ile belirlenir. Örnegin, bu bulusun antikorlari, kaynak (ana) antikorlardan, öm. fareler, bir temsili ile farelerin, tespsisteri (kodlama kapsüler sentezini), kanamisin direncini kodlayan bir kasetle degistirerek bagisikli kilinmasiyla elde edilir. Farelerden elde edilen serum numuneleri daha sonra analiz edilebilir ve farenin 025b antijenine karsi en yüksek kullanilabilir. Alt klonlamayi takiben, canli yabani tipte E'nin yüzeyine baglandigi gibi 025b antijenlerine özgü antikorlari salgilayan hibridoma klonlari seçilebilir. 025b antijenlerini ifade eden kolistrains. Daha sonra mAb'ler, 025b antijeninin spesifik baglanmasi için ve muhtemelen O25a antijenine göre 025b antijenine ve onun antikorlarinin mühendisligine göre, örn. farkli teshis veya tedavi amaçli. tercihen diferansiyel baglanma afinitesi için daha fazla test için hibridoma süpernatantlarindan saflastirilabilir.

Bazi durumlarda seçici antikorlar olarak da adlandirilan, farkli baglanma antikorlari, tek antijenlere karsi tarama yoluyla ortaya çikar. Farkli baglanma klonlarini izole etme olasiligini arttirmak için, farkli antijenlere karsi asamali olarak taranarak çoklu seçici basinçlar uygulanacaktir. Özel mAb seçim stratejileri 025b ve 025a bilesenlerini veya diger E. koli antijenleri degisken bir sekilde kullanir.

Rekombinant antijen (ler), bir antikor kütüphanesinden antikorlarin seçilmesi için kullanilabilir, örn. maya ile sergilenen bir antikor kütüphanesi.

Her iki durumda da, seçici baglanma, teknolojide bilinen antikor optimizasyon yöntemleri ile daha da gelistirilebilir. Örnegin burada tarif edilen immünoglobulin zincirlerinin degisken bölgelerinin bazi bölgeleri, hafif zincir karilmasi, hedef mutagenez, CDR birlesmesi ve seçilmis CDR ve / veya çerçeve bölgelerinin yönlendirilmis mutagenezi dahil olmak üzere bir veya daha fazla optimizasyon Istenen seçici baglanma özelliklerine sahip antikorlarin belirlenmesi için tarama yöntemleri, görüntüleme teknolojileri (faj, bakteri, maya veya memeli hücreleri kullanilarak) ile yapilabilir. Reaktivite, ELISA, Western blotlama veya akis sitometrisi ile yüzey boyama, vb. standart deneyler kullanarak degerlendirilir.

Istenen özelliklere sahip olan farkli olarak antikorlar baglandiginda, antikorlar tarafindan taninan baskin epitop veya epitoplar belirlenebilir. Epitop haritalamasi için yöntemler, teknikte iyi bilinmektedir ve örnegin, Epitop Haritalama: Bir Pratik Yaklasim, Westwood ve Hay, ed., Oxford University Press, 2001'de açiklanmistir.

Epitop haritalamasi, bir antikorun baglandigi epitopun tanimlanmasi ile ilgilidir.

Antikor-antijen kompleksinin kristalografi analizi, rekabet tahlilleri, gen fragman sentezleme deneyleri ve sentetik peptit bazli analizler dahil olmak üzere proteinler üzerindeki epitoplarin yerini belirlemek için teknikte uzman kisilerce bilinen birçok yöntem vardir. Bir referans antikoru olarak "ayni epitopu baglayan" bir antikor, asagidaki sekilde anlasilmaktadir. Iki antikor, özdes veya sterik olarak örtüsen epitoplar olan epitoplari tanidiginda, antikorlar ayni veya esas olarak ayni veya esas olarak ayni epitoplari baglar. Iki antikorun özdes veya sterik olarak önüsen epitoplara baglanip baglanmadigini belirlemek için yaygin olarak kullanilan bir yöntem, etiketli antijen veya etiketli antikor kullanilarak, farkli sayida farkli formatta yapilandirilabilen rekabet tahlilidir. Genellikle bir antijen 96 kuyucuklu bir plaka üzerinde hareketsizlestirilir ve etiketlenmemis antikorlarin etiketlenmis antikorlarin baglanmasini bloke etme kabiliyeti radyoaktif veya enzim etiketleri kullanilarak Istenen farkli baglanma özelliklerine sahip antikorlar belirlendiginde, antikor fragmanlarini içeren bu antikorlar, örnegin hibridoma teknikleri veya rekombinant DNA teknolojisi dahil olmak üzere teknikte iyi bilinen yöntemlerle üretilebilir.

Rekombinant monoklonal antikorlar, örnegin, gerekli antikor Zincirlerini kodlayan DNA'nin izole edilmesi ve iyi bilinen rekombinant ekspresyon vektörleri kullanilarak, bir rekombinant konakçi hücrenin, ekspresyon için kodlama dizileri ile transfekte edilmesiyle üretilebilir. Gerekli antikor Zincirlerini kodlayan DNA'yi izole ederek ve iyi bilinen rekombinant ekspresyon vektörleri, ör. antikor dizilerini kodlayan nükleotid dizilerini içeren bulusun plazmidleri veya ekspresyon kaset (1er)i kullanarak ekspresyon için kodlama dizileriyle bir rekombinant konakçi hücrenin transfekte edilmesiyle üretilebilir. Rekombinant konakçi hücreler, yukarida tarif edilenler gibi prokaryotik ve ökaryotik hücreler olabilir.

Belirli bir özellige göre, nükleotid dizisi, antikora insanlastirmak veya antikorun benzerligini veya benzerligini gelistirmek için genetik manipülasyon için kullanilabilir. Örnegin, antikor, klinik arastirmalarda ve insanlarda tedavilerde kullanilirsa, sabit bölge, bagisiklik tepkisinden kaçinmak için insan sabit bölgelerine daha çok benzeyecek sekilde tasarlanabilir. Antikor sekansinin hedef 025b'ye daha yüksek afinite ve MDR E. koli'ye karsi daha fazla etkinlik elde etmek için genetik olarak manipüle edilmesi istenebilir. Teknikte uzman bir kisi için, bir veya daha fazla polinükleotid degisiminin antikora yapilabildigi ve yine de hedef 025b`ye baglanma özelligini koruyabildigi anlasilacaktir.

Antikor moleküllerinin, çesitli yollarla üretimi genellikle iyi anlasilmaktadir. Örnegin, olarak tek bir vektörden veya tek bir hücrede iki ayri vektörden eksprese edildigi antikorlarin rekombinant üretimi için bir yöntemi tarif etmektedir. Wibbenmeyer ve J. Biotechnology 101: 189-198), ayri olarak üretilen agir ve hafif zincirlerden elde edilen monoklonal antikorlarin üretimini E.k01i'nin ayri kültürlerinde eksprese edilen plazmidleri kullanarak tarif eder. Antikorlarin üretimi ile ilgili diger çesitli teknikler, örnegin Harlow ve dig., ANTIKORLAR: A LABORATUVAR KILAVUZU, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1988) saglanir.

Istenirse, bulusun antikoru, örn. 8D5-1G10 antikoru veya 8D10-C8 antikoru veya ilgili baglanma bölgesi veya CDR sekanslanabilir ve polinükleotit sekansi veya bir sekans varyanti veya mutanti daha sonra ekspresyon veya çogaltma için bir vektöre klonlanabilir. Antikoru kodlayan dizi, bir konakçi hücrede vektörde muhafaza edilebilir ve konakçi hücre daha sonra genisletilebilir ve ileride kullanilmak üzere dondurulabilir. Hücre kültüründe rekombinant monoklonal antikorlarin üretimi, teknikte bilinen yöntemlerle B hücrelerinden antikor genlerinin klonlanmasi yoluyla gerçeklestirilebilir.

Baska bir yönüyle bulus, bu bulusun rekombinant antikorunun üretimini kodlayan bir diziyi içeren izole edilmis bir nükleik asit saglar.

Baska bir yönüyle bulus, bu bulusun rekombinant epitopunun üretimini kodlayan bir diziyi veya bu bulusun bu tür epitopunu içeren bir molekülü içeren bir izole edilmis nükleik asit saglar. Fakat, bulusun epitopu ayrica sentetik olarak üretilebilir, örn. bu teknikte iyi bilinen sentez yöntemlerinden herhangi biri ile.

Nükleik asiti sifreleyen bir antikor veya epitop herhangi bir uygun özellige sahip olabilir ve bunlarin herhangi bir uygun özelligini veya kombinasyonlarini içerebilir.

Bu nedenle, örnegin, bir nükleik asidi sifreleyen bir antikor veya epitop, DNA, RNA veya bunun bir hibrit formunda olabilir ve dogal olarak olusmayan bazlar, modifiye edilmis bir omurga, ör. nükleik asidin stabilitesini destekleyen bir fosfontioat omurgasi veya her ikisini içerebilir. Nükleik asit, avantajli olarak, bulusun bir ekspresyon kasetine, vektörüne veya plazmidine, hedef konakçi hücre (ler) de arzu edilen ekspresyon, replikasyon ve / veya seleksiyonu destekleyen özellikler içeren bir araya getirilebilir. Bu gibi özelliklerin örnekleri arasinda, çogaltma bileseninin bir kaynagi, bir seçim gen bileseni, bir destekleyici bilesen, bir güçlendirici eleman bileseni, bir poliadenilasyon dizisi bileseni, bir sonlandirma bileseni ve benzerleri sayilabilir.

Mevcut tarifname ayrica burada tarif edilen bir veya daha fazla nükleotid sekansi içeren rekombinant DNA yapilarini saglamaktadir. Bu rekombinant yapilar, bir plazmid, fajmid, faj veya viral vektör gibi bir vektör ile baglantili olarak, burada açiklanan herhangi bir antikoru kodlayan bir DNA molekülünün sokuldugu sekilde kullanilir.

Monoklonal antikorlar, kültürde sürekli hücre çizgileri ile antikor molekülleri üreten herhangi bir yöntem kullanilarak üretilir. Monoklonal antikorlari hazirlamak için Brodeur ve dig., Monoklonal Antikor Üretim Teknikleri ve Uygulamalari sayfa .

Bulus ayrica burada tarif edildigi gibi bir antikor veya bir immünojen ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici veya eksipiyan içeren farmasötik bilesimler saglar.

Bu farmasötik bilesimler, mevcut bulusa uygun olarak bir bolus enjeksiyonu veya infüzyonu veya sürekli infüzyon ile uygulanabilir. Bu tür uygulama yollarini kolaylastirmak için uygun farmasötik tasiyicilar, teknolojide iyi bilinmektedir.

Farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar genel olarak herhangi bir uygun çözücüyü, dispersiyon ortamini, kaplamalari, antibakteriyel ve antifungal ajanlari, izotonik ve absorpsiyon geciktirici ajanlari ve fizyolojik olarak bulusa uygun bir antikor veya ilgili bilesim veya kombinasyon ile uyumlu olanlari içerir. Farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilarin diger örnekleri, steril su, salin, fosfat tamponlu salin, dekstroz, gliserol, etanol ve benzerlerini ve bunlarin herhangi bir kombinasyonunu içerir.

Böyle bir açidan, bir antikor arzu edilen bir uygulama yoluna uygun bir veya daha fazla tasiyici ile birlestirilebilir, antikorlar, örn. laktoz, sükroz, nisasta, alkanoik asitlerin selüloz esterleri, stearik asit, talk, magnezyum stearat, magnezyum oksit, sodyum ve kalsiyum tuzlari, fosforik ve sülfürik asitler, akasya, jelatin, sodyum aljinat, polivinilpirrolidin, polivinil alkol ve istege bagli olarak geleneksel uygulama için daha fazla tablet haline getirilir veya kapsüllenir. Alternatif olarak, bir antikor, salin, su, polietilen glikol, propilen glikol, karboksimetil selüloz kolloidal çözeltiler, etanol, misir yagi, yerfistigi yagi, pamuk tohumu yagi, susam yagi, kitre sakizi ve / veya çesitli tamponlar içinde çözülebilir. Diger tasiyicilar, adjuvanlar ve uygulama sekilleri farmasötik sanatlarda iyi bilinmektedir. Bir tasiyici, tek basina veya bir mum ile gliseril monostearat veya gliseril distearat gibi kontrollü bir salim materyalini veya zaman geciktirme maddesini veya teknikte iyi bilinen baska maddeleri içerebilir.

Farmasötik olarak kabul edilebilir ilave tasiyicilar, teknolojide bilinmektedir ve örn.

REMINGTON`UN ILAÇ BILIMLERI. Sivi formülasyonlar, çözeltiler, emülsiyonlar veya süspansiyonlar olabilir ve süspansiyon haline getirici maddeler, çözündürücüler, yüzey aktif maddeler, koruyucu maddeler ve selatlayici maddeler gibi yardimci maddeler içerebilir.

Mevcut bulusa ait bir antikor veya immünojenin ve bir veya daha fazla terapötik olarak aktif ajanin formüle edildigi farmasötik bilesimler tasarlanmistir. Mevcut bulusa ait antikor veya immünojenin stabil formülasyonlari, liyofilize edilmis formülasyonlar veya sulu çözeltiler formunda istege bagli farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar, eksipiyanlar veya stabilizatörler ile istenen safliga sahip olan adi geçen immünoglobulinin karistirilmasiyla hazirlanir. In vivo uygulama için kullanilacak olan formülasyonlar, tercihen steril bir sulu çözelti formunda özellikle sterildir. Bu, steril filtrasyon membranlari veya diger yöntemler yoluyla filtrasyon yoluyla kolayca gerçeklestirilir. Burada açiklanan antikor ve diger terapötik olarak aktif maddeler, immünolipozomlar olarak da formüle edilebilir ve / veya mikrokapsüller içinde tutulabilir.

Mevcut bulusun bir antikoru veya immünojeni içeren farmasötik kompozisyonun uygulanmasi, agizdan, deri altindan, damardan, burun içinden, intraototik, transdermal, mukozal, topikal, örn., Jeller, merhmeler, losyonlar, kremler, vs., intraperitonal, intramüsküler, intrapulmoner, ör. Solunabilir teknoloji veya pulmoner dagitim sistemleri, vajinal, parenteral, rektal veya intraoküler olarak kullanilir.

Parenteral uygulama için kullanilan örnek formülasyonlar, örnegin steril bir çözelti, emülsiyon veya süspansiyon gibi deri alti, kas içi veya intravenöz enjeksiyon için uygun olanlari içerir.

Bir düzenekte mevcut bulusun antikoru veya immünojeni, bir denege, ör. monoterapiyi modifiye eden veya önleyen bir hastalik olarak uygulanan tek terapötik olarak aktif maddedir.

Alternatif olarak, mevcut bulusun antikoru veya immünojeni, standart tedavi ile sinirli olmamakla birlikte, bir veya daha fazla baska terapötik veya profilaktik madde ile kombinasyon halinde, örn. antibiyotikler, steroid ve non-steroid enflamasyonu inhibitörleri ve / veya diger antikor bazli tedavi, örri. anti-bakteriyel veya anti- enflamatuar aj anlarin kullanilmasi.

Kombinasyon terapisi özellikle standart bir rejimi, Ör. MDR E. koli enfeksiyonunun tedavisinde kullanilmak üzere kullanir. Bu antibiyotikler ör. tygecycline, linezolide, metisilin ve / veya vankomisini içerebilir.

Kombinasyon terapisinde, antikor bir karisim olarak veya bir veya daha fazla baska terapötik rejimle, örnegin; Eszamanli ya da eszamanli tedaviden önce ya önce ya da sonra, uygulanabilir.

Bazi durumlarda immünojenlerin profilaktik olarak uygulanmasi, burada tarif edilen immünojeni, yani tek degerli bir asiyi içeren bir asiyi kullanabilir. Fakat, ayni veya farkli hedef patojenlere karsi bir bagisiklik tepkisini uyarmak için farkli immünojenler içeren bir çok degerlikli asi kullanilabilir.

Antikorun biyolojik özellikleri, immünojen veya bulusun farmasötik preparatlari, canli hücre, doku ve bütün organizma deneyleri olarak karakterize edilebilir. Teknikte bilindigi gibi, ilaçlar, bir ilacin hastalik veya hastalik modeline karsi tedavi için etkinligini ölçmek amaciyla, veya bir ilacin farmakokinetigini, farmakodinamigini, toksisitesini ve diger özelliklerini ölçmek için fareler, siçanlar, tavsanlar, köpekler, kediler, domuzlar ve maymunlar dahil ancak bunlarla sinirli olmamak üzere, hayvanlar üzerinde test edilir. Hayvanlar hastalik modelleri olarak adlandirilabilir.

Terapötikler genellikle sinirlandirici olmamak kosuluyla çiplak fareler, SCID fareleri, ksenogreft fareleri ve transgenik fareler (knockin ve knockout dahil) dahil olmak üzere farelerde test edilir. Bu tür deneyler, aktif veya pasif immünoterapide uygun yari ömür, efektör fonksiyon, (çapraz) nötralize edici aktivite ve / veya immün yanit ile terapötik veya profilaktik olarak kullanilacak antikorun potansiyelinin belirlenmesi için anlamli veriler saglayabilir. Test için herhangi bir organizma, tercihen memeliler kullanilabilir. Örnegin, insanlara genetik benzerlikleri nedeniyle, primatlar, maymunlar terapötik modellere uygun olabilir ve bu nedenle, denegin veya bilesimin etkinligini, toksisitesini, farmakokinetigini, farmakodinamigini, yari ömrünü veya diger özelliklerini test etmek için kullanilabilir. Insanlarda testler nihayetinde uyusturucu olarak onaylanmak için gereklidir ve bu nedenle elbette bu deneyler tasarlanmistir. Dolayisiyla, mevcut bulusun antikoru, immünojeni ve ilgili farmasötik bilesimleri, terapötik veya profilaktik etkinlik, toksisite, immünojenisite, farmakokinetik ve / veya diger klinik özelliklerini belirlemek için insanlarda test edilebilir.

Bulus ayrica bulusun konu olan antikorunu teshis amaçli, örn. bir biyolojik sivi numunesinde immünoreaktif veya hedef olarak bir bakteri yükü veya antikorunun konsantrasyonunu tespit etme ve kantitatif olarak belirleme yöntemlerinde kullanim Bulus ayrica sepsis veya MDR E. koli enfeksiyonun biyolojik bir örnekte, örn. vücut sivisi gibi MDR Ekoli içeren bir numunenin yükü, derecesini saptamak için, bulusun bir antikoru ile numunenin temas ettirilmesi asamasini içeren yöntemler de saglar.

Bulusun antikoru, rekabetçi baglama deneyleri, dogrudan ve dolayli sandviç analizleri, immüno-çökeltme deneyleri ve enzime bagli immünosorbent analizleri (ELISA) gibi bilinen herhangi bir analiz yönteminde kullanilabilir.

Tercih edilen teshis testi asagidaki gibi gerçeklestirilir. Hedef antijene spesifik antikorlar, vücut sivilarinda bulunan veya izole edilen bakterilerle inkübe edilen lateks boncuklar üzerinde sabitlenir. Pozitif reaksiyon, bakteri yüzeyinde ifade edilen karsilik gelen ayni kökenli antijen mevcudiyetinde renkli lateks boneuklarin agregasyonu nedeniyle çiplak gözle tespit edilebilir.

Mevcut bulusa göre kullanilan bir vücut sivisi, doku özütü, idrar, kan, serum, diski ve balgam gibi bir öznenin biyolojik örneklerini içerir.

Bir düzenlemede, yöntem, antikorun kati destegin yüzeyine tutunmasina izin veren kosullar altinda, spesifik olarak hedef ile bir kompleks olusturan belirli bir antikor fragmaninin fazlaligi ile bir kati destegin temas ettirilmesini içerir. Antikorun baglandigi sonuçtaki kati destek daha sonra biyolojik sivi numunesi ile temas ettirilir, böylece biyolojik sivi içindeki hedef antikora baglanir ve bir hedef antikor kompleksi olusturur. Kompleks tespit edilebilir bir isaretleyici ile etiketlenebilir. Alternatif olarak, hedef veya antikor, formasyonun olusturulmasindan önce etiketlenebilir. Örnegin, saptanabilir bir isaretleyici (etiket) antikora konjuge edilebilir. Kompleks daha sonra saptanabilir ve niceliksel olarak belirlenebilir, böylece biyolojik sivi numunesinde hedefin konsantrasyonunu tespit ederek ve kantitatif olarak belirleyebilir. Özel uygulamalar için bulusun antikoru, organik moleküller, enzim etiketleri, radyoaktif etiketler, renkli etiketler, flüoresan etiketler, kromojenik etiketler, lüminesan etiketler, haptenler, digoksigen, biyotin, metal kompleksleri, metaller, kolloidal altin ve bunlarin karisimlarini içeren gruptan seçilen bir etiket veya raportör moleküle konjuge edilir. Etiketlere veya haberci moleküllere konjuge edilmis antikorlar, örnegin, tahlil sistemleri veya teshis yöntemlerinde, ör. bunlarla iliskili MDR E. koli enfeksiyonunu veya hastalik kosullarini teshis etmek için kullanilabilir.

Bulusun antikoru, örnegin, baglanma deneylerinde (örn., ELISA) ve baglanma çalismalarinda, bahsedilen konjügatin basit bir sekilde saptanmasina izin veren baska moleküllere konjuge edilebilir.

Mevcut bulusun bir baska yönü, bir veya daha fazla antikorun yani sira çesitli diagnostik veya terapötik ajanlari içerebilen bir antikor içeren bir kit saglar. Bir kit ayrica bir teshis veya terapötik yöntemde kullanim için talimatlar içerebilir. Bu talimatlar, örnegin bir hastaligin teshisi için MDR E. koli yükünü belirlemeden önce bir hücre ve / veya protein içeren fraksiyonu ayirma gibi teshis amaçlari için bir biyolojik numune hazirlamak için kit, ör. aletler veya bir cihazda bulunan bir cihazda saglanabilir. Avantajli olarak, böyle bir kit, burada tarif edilen çesitli teshis yöntemlerinin bir veya daha fazlasinda kullanilabilecek bir antikor ve bir diyagnostik ajan veya reaktif içerir. Tercih edilen baska bir düzenekte kit, bir antikor, öm. liyofilize formda, istege bagli olarak talimatlar ve liyofilizatin yeniden yapilandirilmasi için bir ortam ve / veya yakin dönem uygulama için enjekte edilebilir bir bilesim olusturmak üzere kullanilmadan önce karistirilabilen farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyici (lar) ile kombinasyon halinde, içerir. 8D5-1G10 ve 8D10-C8 olarak adlandirilan antikorlar, özellikle antikor hafif zincirlerinden ve / veya agir zincirlerden herhangi biri, ayrica DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b /Inhoffenstrasse 7B, 38124 Braunschweig (DE) `de depolanan biyolojik materyal ile karakterize edilir.

Tortular, her biri ilgili bir gendin bir eki ile klonlanmis bir plazmid ihtiva eden dönüstürülmüs E. koli kültürlerini ifade eder. Ilgilenilen genler, fare monoklonal antikoru 8D5-1G10'un (IgG3) agir ve hafif zincirlerinin degisken fareleri ve fare monoklonal antikoru 8D10-C8'in (lgGZb) agir ve hafif zincirleridir. dizisini içeren bir plazmid ile transforme edilen bir Ekoli konak hücresidir. depozitör: Arsanis Biosciences GmbH, Viyana, Avusturya. dizisini içeren bir plazmid ile transforme edilmis bir Ekoli konak hücresidir. depozitör: Arsanis Biosciences GmbH, Viyana, Avusturya. içeren bir plazmid ile transforme edilmis bir E.koli konak hücresidir. Escherlicia koli Biosciences GmbH, Viyana, Avusturya.

DSM 28172, 8DlO-C8 agir zincirinin (8DlO-C8-HC) degisken alan kodlama dizisini içeren bir plazmid ile transforme edilmis bir E.k01i konak hücresidir. Escherichia koli Biosciences GmbH, Viyana, Avusturya.

Asagidaki tanimlarin konusu, bu bulusun düzenlemeleri olarak kabul edilir: 1. Çoklu ilaca dirençli (MDR) E. koli suslarin 025b antijenini spesifik olarak taniyan bir antijen baglanma bölgesini içeren izole edilmis bir monoklonal antikor. 2. Tam uzunluktaki bir monoklonal antikorun veya bunun bir antikor fragmaninin bir baglanma bölgesine sahip olan ve bir baglanma bölgesini içeren en az bir antikor alanini içeren tanim 1 in antikoru. baglamak için bir afiniteye sahip olan 1 ya da 2 sayili tanimin antikoru. 4. 1 ila 3 arasindaki tanimlardan herhangi birine ait antikor olup; a) DSM 26763 altinda biriktirilen konakçi hücre tarafindan üretilen antikor hafif zincirinin degisken bölgesi; ve b) DSM 26762 altinda biriktirilen konakçi hücre tarafindan üretilen antikor agir zincirinin degisken bölgesi ile karakterize edilir.

. Isik zincirini ve 1 ila 4 arasindaki tanimlardan herhangi birine ait bir antikorun agir zincirini eksprese etmek için bir kodlama sekansi içeren bir ekspresyon kaseti olup, kodlama sekansi; adlandirilan antikor hafif zincirinin degisken bölgesini kodlayan bir nükleotid dizisi; DSM 26762 altinda depolanmis bir konakçi hücrede bulunan 8D5-lGlO-HC olarak adlandirilan antikor agir zincirinin degisken bölgesini kodlayan bir nükleotid dizisi. 6. Tanim 5 kasetini içeren bir konak hücre. 7. Tanim 6'ya göre bir konakçi hücrenin, adi geçen antikoru üretmek için kosullar altinda yetistirildigi veya muhafaza edildigi 1 ila 4 arasindaki tanimlardan herhangi birine ait bir antikor üretme yöntemi. 8. Asagidakileri içeren bir aday antikoru tanimlamak için bir yöntem: (a) bir antikor veya antikor üreten hücre içeren bir numune temin etmek; ve (b) numune tarafindan üretilen veya üretilen bir antikorun, bir ST131-025b: H4 sus ve bir MDR E. koli sus olmayan 02521 antijeninin 025b antijeni ile baglanmasinin degerlendirilmesi, burada, 025a antijenine göre antikor ve 025b antijeni arasinda spesifik bir pozitif reaksiyonun antikoru aday antikor olarak tanimlamaktadir. 9. 1 ila 4 arasindaki tanimlardan herhangi birine ait bir antikor üretme yöntemi olup; (a) açikliga (8) göre belirlenen bir aday antikorun saglanmasi; ve (b) aday antikor ile ayni epitop baglanma spesifisitesine sahip bir monoklonal antikor veya aday antikorun hümanize veya insan formunun veya bunun bir türevinin üretilmesi adimlarini içerir.

. Bir MDRE'den muzdarip veya muzdarip bir öznenin tedavisinde kullanim için 1 ila 4 arasindaki tanimlardan herhangi birine ait antikor. söz konusu hastaliga enfeksiyonun sinirlandirilmasi için antikorun etkili bir miktarinin verilmesini veya söz konusu enfeksiyondan kaynaklanan bir hastalik durumunun iyilestirilmesini, tercihen piyelonefrit, sekonder bakteriyemi, sepsis, peritonit, menenjit ve ventilatörün tedavisi veya profilaksisi için denege iliskili pnömoni. ll. Tercihen farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici veya eksipiyan içeren bir parenteral veya mukoza] formülasyon içeren, 1-4 arasindaki tanimlardan herhangi birine ait bir antikorun farmasötik preparati. 12. Üst ve alt idrar yolu enfeksiyonlari gibi, 1 ila 4 arasindaki tanimlarin herhangi birinin antikoru kullanilarak, özellikle diyabetik hastalarda ve ayni zamanda bakteriyemi, sepsis, peritonit veya bagirsak kolonizasyonuyla birlikte, sistit veya üretrit, artan veya hematojenöz piyelonefrit dahil, LPS O25b ekspresyonu yapan MDR suslarinin neden oldugu bir hastada E. koli enfeksiyonunu belirleme yöntemi olup, enfeksiyon, antikor ile söz konusu denegin vücut sivisi örnegini temas ettirerek ex vivo olarak belirlenir, burada antikorun spesifik bir immün reaksiyonu enfeksiyonu 13. 1 ila 4 arasindaki istemlerden herhangi birine ait bir antikorun, bir antikor ve en az bir tanesinin immobilize edilmesi için bir etikete ve / veya bir kati faza sahip bir etiket ve / veya bir baska diyagnostik reaktif ile antikoru içeren bir diyagnostik preparasyonu reaktif. 14. 1 ila 4 arasindaki tanimlardan herhangi birine ait bir antikoru kodlayan izole edilmis nükleik asit.

Yukaridaki açiklama, asagidaki örneklere referansla daha iyi anlasilacaktir. Fakat, bu tür örnekler, sadece mevcut bulusun bir veya daha fazla düzenlemesini uygulama yöntemlerini temsil eder ve bulusun kapsamini sinirlayici olarak okunmamalidir. ÖRNEKLER Örnek 1: 025b've özgü antikorlar Kanatisin direncini kodlayan bir kaset ile kps kümesini (kapsül sentezini sifreleyen) digerleri, FEMS Microbiol Lett, 2012, 332: l3l-6]) in kapsüllenmemis bir mutantini ürettik. Bu mutant susn canli veya formaldehit ile inaktive edilmis hücrelerinin subletal dozlari, iki haftalik aralarla 4 kez farelerin immünize edilmesi için kullanildi.

Daha sonra, farelerden elde edilen serum örnekleri analiz edildi ve hibridoma üretimi için farenin 025b antijenine karsi en yüksek IgG titresini (ELISA, immünoblotlama ve yüzey boyamasi) gösteren dalagi kullanildi. Alt klonlamadan sonra, saflastirilmis 025b antijenlerine özgü antikorlari salgilayan ve ayrica 025b antijenlerini eksprese eden canli yabani tip E.k01i suslarin yüzeyine baglanan birkaç hibridoma klonu seçildi. Bu mAb'ler, daha fazla test için hibridoma süpernatanlarindan saflastirilmistir.

Sekil 1'de gösterildigi gibi, tüm antikorlar, ifade edilen kapsüler polisakkaritten (K5, K2 veya bilinmeyen K tipleri) bagimsiz olarak STl3l-O25b: H4 suslari olarak belirlenen birkaç farkli klinik izolatlara baglanmistir. 025a antijenini ifade eden suslara baglanma bakimindan iki tip mAb belirlenmistir. MAb 8D5-1G10 tarafindan temsil edilen bir grup 025a suslarinin yüzeyine baglanmazken, 8DlO-C8 ile temsil edilen diger mAb'ler 025a suslarina çapraz reaktif olmustur. Fakat, mAb'lerin hiçbiri ilgisiz antijenleri ifade eden herhangi bir E. koli susna, yani 02'ye (Sekil 1) veya diger 0 tiplerine baglanabilir.

MAb'lerin spesifitesi, saflastirilmis LPS (Sekil 2) kullanilarak immünoblot analizi ile teyit edilmistir. MAb'ler, 025b antijenini içeren ST131 suslanndan LPS moleküllerini tanidilar, ancak 025a LPS antijenlerine karsi çapraz reaktif potansiyellerinde C8, 025a'ya çapraz reaktif olmustur. Bu gözlemlenen çapraz reaktivite, ticari 025 tipte serum (ST131: O25b suslarinin saptanmasi için rutin olarak kullanilan) (Statens Serum Institut, yüksek titreli E. koli 025 antiserum, # 81369) tarafindan sergilenenle karsilastirilmistir. Ticari tavsan serumu O25a antijenlerine karsi 025b LPS'ye karsi net tercih gösterdi. Bunun aksine, murin mAb 8DlO-C8, en azindan 025a molekülleri ile ayni yogunlukta 025b LPS moleküllerine tepki gösterdi. Sonraki kantitatif analiz, baglanma yogunlugunun 025b'ye karsi O25a'ya oraninin, mAb 8D10-C8 durumunda ticari tiplendirme serumuna kiyasla en az 10 kat daha yüksek oldugunu ortaya çikarmistir.

Yukaridaki veriler birlikte, 025b'ye özgü iki tip OAb'nin, 025b'ye oldukça spesifik olan ve O25a ve 025b antijenleri tarafindan paylasilan bir epitopu tanimlayanlar oldugunu göstermektedir. Sonuç olarak, verilerimiz 025b'nin yapisinin aslinda klasik 025 (yani O25a) antijenininkinden farkli oldugunu teyit etmektedir. 025b alt ünitesinin yeni yapisi, Örnek 2'de tarif edildigi gibi aydinlatilmistir.

O25b'ye özgü mAb'lerin agir (VH) ve hafif (VL) zincirlerinin degisken alanlari, dejenere agir ve hafif zincir primerleri ile RT-PCR kullanilarak hibridoma klonlarindan amplifiye edildi ve dizildi. Diziler, GK veritabani için IMGT / V- QUEST'in yani sira BLAST ile analiz edilmis ve CDR bölgeleri Kabat terminolojisine göre tanimlanmistir.

MAb 8D5-1G10'un degisken hafif ve agir zincir sekanslari, DSMZ'de katilim kullanilan ilgili vektörlere klonlanmistir.

MAb 8D10-C8'in degisken hafif ve agir zincir sekanslari, DSMZ'de katilim kullanilan ilgili vektörlere klonlanmistir. Örnek 2: 025b antiieninin yapi analizi E. koli ST131 nin LPS si, sicak fenol / su yöntemi ile izole edildi ve diyaliz, proteinaz K sindirimi ve ultrasantrifüjleme ile saflastirildi. LPS preparatlarinin ortalama verimi, kuru bakteri kütlesinin % 2.61'i idi. LPS, SDS-PAGE ile analiz edildi, farkli sayilarda oligosakkarit tekrarlama birimleri (RU) ile ikame edilmis çekirdek oligosakarit (OS) ve ayni zamanda ikame edilmemis çekirdek oligosakkaritleri içeren fraksiyonlari gösterdi. O-spesifik polisakkarid (O-PS) ve farkli oligosakkarit bilesenleri, hafif asidik hidroliz ile serbest birakildi ve Bio-Gel P-lO üzerinde jel filtrasyonu ile izole edildi. Fraksiyonlar, seker ve metilasyon analizleri, NMR spektroskopisi ve MALDI- TOF kütle spektrometresi (MS) ile analiz edildi.

O-PS RU'nun yapisi, tek bir RU ile ikame edilen çekirdek OS'den olusan bir fraksiyon kullanilarak belirlendi. Monosakkarit analizi, Rha, Glc, Gal, Hep ve daha az miktarda GlcN varligini gösterdi. Esit miktarda Rhap terminal terminalleri, terminal Glcp, 3,6 ikameli Glcp, 3-ikameli Rhap, eser miktarda 3-ikameli GlcpN tanimlanmis ve O-PS RU'ya tanimlanmistir. Kalan 7 metilenmis Hepp, 6-ikameli Glcp, 2-ikameli Glcp, terminal Galp, 3,6-ikameli Glcp ve terminal Hepp'in kismen metillenmis alditol asetatlari, K-12 tipi çekirdek oligosakkariti olusturdu. 3,4-ikameli Hepp, 3,4,7-ikameli Hepp ve Kdo türevleri, P ve PPEtn'nin ikame edilmesine ve karboksil grubunun mevcudiyetine bagli olarak standart metilasyon ve seker analizi sirasinda tespit edilememistir.

LPS ST131'in O-spesifik PS`nin RU yapisi, NMR spektroskopisinin kullanilmasiyla belirlenmistir. O-PS 1H ve 13C rezonanslarinin tam olarak atanmasi, COZY, TOCSY ve NOESY'den elde edilen bilgilerin yani sira HSQC-DEPT, HMBC ve HSQC- TOCSY deneylerinin birlestirilmesiyle elde edildi. 'H, 13c HSQC-DEPT spektrumunda 13 anomerik proton ve karbon ve bir Kdo spin sistemi için sinyaller vardi. Bu sinyaller, çekirdek oligosakkaritten ve O-spesifik PS'nin bir RU'undan türetilmistir. Yüksek alanli bölge, O-asetil grubunun bir CH3 sinyalini, N-asetil grubunun bir CH3 sinyalini ve 6-de0ksi sekerler için CH3 karakteristiginin iki upfield sinyalini içermistir. (Rha) Spektrumlar, arastirilan oligosakaritin bir tetradecasakkarit yapisini gösterdi. P, PP ve PEtn ile ilgili yüksek heterojenlik nedeniyle, indirgeyici olmayan ucun sekiz sekerinin tam dönüs sistemleri, RU yapisi ve K-12 çekirdek isletim sistemine baglanmasi ile tamamen çözülmüstür.

Bitisik seker artiklari arasindaki kalinti-arasi baglar NOESY ve HMBC deneyleri ile gözlenmistir. HMBC spektrumlari, anomerik proton ile karbonun baglanti pozisyonundaki ve anomerik karbon ile baglanti pozisyonundaki proton arasindaki çapraz zirveleri, polisakaritin indirgeyici olmayan bölgesinde seker artiklari dizisini teyit etmistir.

Bu ölçümlere dayanarak, çekirdek OS: -›7)-0t-Hepp (kalinti L) 'nin birinci artiginin yerini alan bir RU kalintisi olarak -> 3) -ß-GlcpNAc (kalinti K) içeren bir pentasakkarittirolan 025b'ye özgü PS'nin tekrarlayan birimi, belirlendi (Sekil 3 (a)).

Daha uzun PS fraksiyonlarinin olasi bir kontaminasyonu nedeniyle, birinci RU'nun O- spesifik zincirin müteakip RU'su ile ikame pozisyonunu tanimlamak imkansizdi.

Ayrica, bu fraksiyonlarin daha ayrintili yapisal analizleri olmaksizin, a-anomer olarak daha önce tekrarlanan ünitelerde (daha önce bazi E. koli lipopolisakkaridler için rapor edilmis olan) GlcNAc'nin varligi göz ardi edilebilir. Çekirdek OS'nin moleküler agirliklari, bir RU ile ikame edilen çekirdek OS ve son olarak O-PS RU, MALDI-TOF MS'nin kullanimiyla teyit edildi (veriler gösterilmemistir). Tüm spektrumlar, LPS ST131'in RU'unun ve daha önceden tanimlanan K-12 çekirdek OS'nin glikoformlannin buradaki yapisina göre ile ikame edilen çekirdek OS'den olusan düsük çözünürlüklü spektrumlarin MALDI- 3 ve 4 RU ile ikame edilen çekirdek OS (P ve PPEtn ile) ye atfedilen m / 25383 .6 kümelerini gösterdi. Bu iyonlar arasindaki ortalama kütle farki 862.1 Da idi ve O- spesifik PS RU'nun ( hesaplanmis ortalama kütlesidir.

RU'nun moleküler agirligi dikkate alinarak ve diger fraksiyonlar için MS sonuçlarinin karsilastirilmasiyla, ilk RU (sekil 3 (a)) bir ikame yeri olarak dis çekirdek bölgesinde -› 7) -d-Hepp- (1 - 6) -a-Glcp disakkarit içeren daha uzun çekirdek OS glikoform varligini gösterdik. Glikoformun tipi O-spesifik PS'nin varligina veya yokluguna baglidir. Ikame edilmemis çekirdek OS'nin hakim glikoformu, -› 7) -u-Hepp- (1 - 6) - a-Glcpdisakkaritten yoksun olan K-12 çekirdekli oligosakaritin kesikli versiyonudur.

Bu disakkarit, O-PS ile ikame edilmis çekirdek isletim sistemi ve ikame edilmemis çekirdek isletim sistemi arasindaki farktir. Örnek 3: E. koli O25b've özgü teshis testi O25b'ye özgü mAb 8D5-1G10, üreticinin talimatlarina uyarak l um çapli lateks boncuklara (Polysciences) baglanmistir. Lateks-bagli boncuklar, farkli E. koli suslari aglütine etme potansiyelleri açisindan test edildi. Bir döngü bakteri (yaklasik 108 cfu), PBS içinde 10 nl % 1 mAb-bagli lateks boncuk süspansiyonu ile karistirilmistir. Sekil 4 de gösterildigi gibi, 025b antijenlerini eksprese eden e. koli suslari birkaç saniye süreyle hafif karistirmadan sonra güçlü bir aglütinasyon modeli ortaya çikti. Aksine, O25a veya 02 antijenlerini eksprese eden Ekoli suslari ayni reaktifle aglütinasyon yapmamistir. Bu nedenle, bu varsayilan teshis reaktifi, 025b (ve O25a) - pozitif E.koli'nin saptanmasi için kullanilan halihazirda kullanilan sanat aglütinasyon reaktifi (yani, 025'e karsi poliklonal tavsan serumu) durumundan daha spesifik olarak kabul Ayrica, aglütinasyon analizlerinde isiyla öldürülmüs (yani lize edilmis) E.koli hücreleri ile ticari anti-025 serumunun kullanilmasi önerildigi için, 025b mAb'lerinin - ör. lateks boncuklara saflastirilmis veya baglanmis olsun olmasin, bozulmamis kapsüler polisakkaritlerin varliginda canli E. koli hücrelerini aglütine edip edemedikleri konusunda daha yüksek bir duyarliliga sahip olup olmadiklarini test ettik. 025b klinik izolatlarinin büyük bir paneli test edilmis ve bazi temsili suslar Tablo 1'de sunulmustur. Duyarlilikta gelisme iki açidan bulunmustur: i) temsili suslar formda hem serbest hem de boncuk bagli 025b'ye spesifik mAb'ler ile aglütlenebilirken, ticari 025 tavsan serumu ile aglütinasyon, bakterilerin daha önce isiyla parçalanmasi gerektirmistir, ii) temsili # 3 ve # 4 temsili olmayanlar isiyla öldürülmüs formda dahi ticari serumla aglütinasyona tabi tutulurken, ayni lizatlar saflastirilmis mAb 8D5-1G10 ile pozitif sonuç verdi. Önemli olarak, ayni antikor lateks boncuklara baglandiginda, aglütinasyon dogal bakteriyel hücreler ile bile gelisti. Bu sonuçlar, boncuk baglanmis mAb'lerin bir aglütinasyon deneylerinde üstün bir duyarliligini göstermektedir, ki bu, simdiye kadar test edilen tüm 025b pozitif E.k01i suslarin simdiye kadar hiç bir isil islem yapilmadan bile (ör. isiyla öldürülen lizat üretmeden), bu reaktif ile pozitif bir aglutinasyon saglamasi gerçegiyle desteklenmistir. Dahasi, bu reaktifin 025b ifade eden bakterilerin saptanmasi için bir teshis araci olarak kullanilmasi, PCR bazli teknige göre avantajlidir, bu da aslinda hedef antijeni ifade eden bakterilerle pozitif bir sonuç verir. Örnegin Tablo 1'deki temsil sus # 5, teshislerde rutin olarak kullanilan 025b`ye özgü gen için PCR pozitif olmustur, ancak herhangi bir aglütinasyon analizinde negatif olmustur. Bu susn kaba bir LPS fenotipi sergiledigi kanitlanmistir (ifade edilen O-antijenleri yok), bu nedenle PCR sonucu yanlis pozitif olarak kabul edilebilir. Böyle bir yanlis pozitifligin önlenmesi, bu tür analizlerin, yardimci tanilama olarak kullanildiginda, ör. 025b spesifik terapötik yaklasimlardan faydalanabilen 025b ifade eden E.koli sus ile enfekte olmus hastalari seçmek için büyük önem tasimaktadir.

Lateks boncuk ile baglanmis mAb'ler tarafindan serbest 025b LPS moleküllerinin bulgulanmasi potansiyeli de test edilmistir. [-1000 ng araligindaki farkli miktarlardaki yüksek derecede saflastirilmis 025b LPS, PBS içinde 10 ul% 1 boncuk süspansiyonu ile inkübe edildi. Sekil 5'te tasvir edildigi gibi, doza bagli aglütinasyon modeli görülmüstür: en iyi sonuçlar 100 mg serbest LPS ile elde edilmis, aglutinasyon 1000 veya 10 ng ile hala tespit edilebilir iken, 1 ng serbest 025b LPS ile tespit edilememistir.

Tablo 1: Çesitli 025b suslari ile elde edilen aglutinasyon sonuçlarinin ticari 025 tiplendirme serum ve 025b`ye spesifik mAb 8D5-1G10 kullanilarak karsilastirilmasi. soy F:: :1 tip serumu (ticari) ile ile aglütinasyon: eslestirilmis (isi ile öldürülmcmis) aglütinasyon damlalari ile aglütinasyon Lizutlar (isi Canli ile hücreler (isi öldürülmüs) ile öldürül- Örnek 4: 025b`ye özgü mAb'lerin antibakteriyel etkisi O25b'ye spesifik mAb'lerin (OZSa'ya çapraz reaktiviteli veya çapraz reaktivite olmadan) potansiyel koruyucu etkisi, öldürücü bir murin bakteriyemi modelinde test belirlenmistir) enjekte edildi. 3 hafta boyunca farelerin Öldürücü günlük izlendi. Sekil 6, benzer sonuçlara sahip 2 bagimsiz deneyin birlestirilmis sonuçlarini göstermektedir. PBS ile asilanmis farelerin % 90'1 enfeksiyona yenik düsmüsken, her iki mAb testi, izlenen 3 haftalik enfeksiyon sonrasi süre boyunca sagkalim açisindan istatistiksel olarak (Logrank testi) anlamli bir artis saglamistir.

Bu in vivo bilgiyi desteklemek için, saflastirilmis mAb'lerin bakterisidal etkisi de in vitro olarak test edildi. 2 ml bir orta-log kültürü E. koli sus 81009, iki kez PBS içinde yikandi ve 5x105 CFU / ml'lik bir son konsantrasyona yeniden süspanse edildi. Bu bakteriyel süspansiyonun 10 ul'si, % 3 insan albümini ile takviye edilmis 40 ul RPMI- 1640 tamponunda seyreltilmis 4 ug ilgili mAb'ler ile 4 o C'de 15 dakika için önceden inkübe edildi. Daha sonra, 50 ul toplanmis insan serumu (daha önce E. Koli sus 81009 ile adsorbe edildi) ilave edildi ve 37 ° C'de l, 2 ve 3 saat süreyle inkübe edildi.

Reaksiyondaki son CFU ve antikor konsantrasyonlari, toplam 100 ul'lik bir hacimde sirasiyla 5x104 CFU / ml ve 40 ug / ml idi. Belirtilen zaman noktalarinda koloni sayimi için 10 ul alikotlar TSB plakalari üzerine kaplanmistir.

Sekil 7'de gösterildigi gibi, test edilen her iki mAb, 3 saatlik çalisma periyodu boyunca CFU'yu önemli ölçüde azaltabilmistir. Aksine, ilgisiz bir mAb ile karistirilmis olan veya antikorlari olmayan bakteriler, bu ortamda sürekli bir gelisme göstermistir. Komplemanin serum örneklerinde inaktif hale getirilmesi durumunda (56 ° C'de 30 dakika inkübasyon), herhangi bir mAb tarafindan bakteri öldürme görülmemistir (veriler gösterilmemistir). Bu sonuçlar, 025b`ye özgü mAb'lerin kompleman aracili bakterisid etkisini tetikleyebilecegini kanitlamaktadir.

Claims (14)

ISTEMLER

1. Çoklu ilaca dirençli (MDR) E. koli suslarinin 025b antijenini spesifik olarak taniyan bir antijen baglanma bölgesini içeren izole edilmis bir monoklonal antikor.

2. Istem 1'deki gibi bir antikor olup, tam uzunluklu bir monoklonal antikorun veya bunun bir antikor fragmaninin bir baglanma bölgesine sahiptir ve bir baglanma bölgesini içeren en az bir antikor alani içerir.

3. Istemler 1 veya 2'den herhangi birine göre bir antikor olup, bu O25b antijeni 10* 7M'den daha az, tercihen lO'RM'den daha düsük bir Kd ile baglamak için bir afiniteye sahiptir.

4. 1 ile 3 arasindaki istemlerden herhangi birine ait antikor olup; a) DSM 26763 altinda biriktirilen konakçi hücre tarafindan üretilen antikor hafif zincirinin degisken bölgesi; ve b) DSM 26762 altinda biriktirilen konakçi hücre tarafindan üretilen antikor agir zincirinin degisken bölgesi ile karakterize edilir.

5. Istemler `l ila 4'ten herhangi birine göre bir hafif zincir ve bir agir zincir zincirini ifade etmek için bir kodlama sekansi içeren bir ekspresyon kaseti olup, kodlama sekansi; - DSM 26763 altinda biriktirilmis bir konakçi hücrede bulunan 8D5-lGlO-LC olarak adlandirilan antikor hafif zincirinin degisken bölgesini kodlayan bir nükleotit sekansi; adlandirilan antikor agir zincirinin degisken bölgesini kodlayan bir nükleotit sekansi

6. Istem 5`in ekspresyon kasetini içeren bir konak hücre.

7. Istemler 1 ila 4'ten herhangi birine göre bir antikor üretme yöntemi olup, burada istem 6'ya göre bir konakçi hücre yetistirilir veya bahsedilen antikoru üretmek için kosullar altinda muhafaza edilir.

8. Bir aday antikoru tanimlamak için bir yöntem olup: (a) bir antikor veya antikor üreten hücre içeren bir numune temin etme; ve (b) bir antikorun, örnegin bir STl3l-025b H4 susunun O25b antijeni ve bir MDR olmayan E. koli susunun 025a antijeni ile baglanmasi veya degerlendirilmesi için degerlendirmeyi içerir, burada antikor ve 025a antijeni ile ilgili O25b antijeni arasinda spesifik bir pozitif reaksiyon, antikoru aday antikor olarak tanimlar.

9. 1 ile 4 arasindaki istemlerden herhangi birine ait bir antikor üretme yöntemi olup yöntem; (a) istem 8'e göre tanimlanan bir aday antikorun saglanmasi; ve (b) aday antikor ile ayni epitop baglanma spesifisitesine sahip bir monoklonal antikor veya aday antikorun hümanize veya insan formunun veya bunun bir türevinin üretilmesini içerir.

10. Bir MDR E. koli enfeksiyonundan muzdarip olan veya bu hastaliktan muzdarip bir denegin tedavisinde kullanim için, hastadaki enfeksiyonu sinirlandirmak için etkili bir miktarda antikorun uygulanmasini veya söz konusu enfeksiyondan, tercihen piyelonefrit, sekonder bakteriyemi, sepsis, peritonit, menenjit ve ventilatörle iliskili pnömoninin tedavisi veya profilaksisi için bir hastalik durumunun iyilestirilmesi, kaynaklanan bir hastalik durumunun iyilestirilmesini için kullanilan Istem 1 ila 4'ten herhangi birine gore antikor.

ll. Tercihen farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici veya eksipiyan içeren bir parenteral veya mukozal formülasyon içeren, istem 1 ila 4'ten herhangi birine ait bir antikorun farmasötik preparati.

12. Üst ve alt idrar yolu enfeksiyonlari gibi, sistit veya üretrit, yükselen veya hematojenöz piyelonifrit dahil olmak üzere, özellikle diyabetik hastalarda, bakteriyemi, sepsis, peritonit veya bagirsak kolonizasyonu gibi, Istem 1 ila 4'ten herhangi birine göre olan bir antikor kullanilarak, LPS O25b'yi eksprese eden MDR suslarinin neden oldugu bir hastada Ekoli enfeksiyonunu belirleme yöntemi olup, burada enfeksiyon, söz konusu denegin vücut sivisi örnegini antikorla temas ettirerek ex vivo olarak belirlenir, burada antikorun spesifik bir immün reaksiyonu enfeksiyonu

13. Istemler 1 ila 4'ten herhangi birine göre bir antikorun bir diagnostik preparati olup, istege bagli olarak, bir etiket ve / veya baska bir teshis reaktifi olan bir antikor ve bir etiket ve / veya bir kati faz ile antikoru ve teshis reaktifi en az birini sabitlemek için bir antikor içerir.

14. 1'den 4'e kadar olan istemlerden herhangi birine ait bir antikoru kodlayan izole edilmis nükleik asit.