CN104902931A - 包含修饰的抗原的生物缀合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供了大肠杆菌的修饰的抗原，即O抗原O121。本文还提供了修饰的O121抗原的用途，如所述修饰的O121抗原在治疗和/或预防疾病中的用途，例如，治疗和/或预防由肠道沙门氏菌引起的疾病，包括由伤寒沙门氏菌(S.typhi)引起的疾病。

Description

包含修饰的抗原的生物缀合物及其用途
本申请要求于2012年9月10日提交的美国临时专利申请号61/698,843的优先权，将其公开内容以其整体通过引用结合于此。
1.引言
本文提供了一种大肠杆菌(Escherichia coli)的修饰的抗原，来自大肠杆菌(E.coli)血清型O121的O抗原。本文还提供了所述修饰的大肠杆菌O121 O-抗原的用途，如所述修饰的大肠杆菌O121 O-抗原在治疗和/或预防疾病中的用途，例如，治疗和/或预防由肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)引起的疾病，包括由伤寒沙门氏菌(S.typhi)引起的疾病。
2.背景技术
伤寒症仍然是一种严重的公众健康问题，其每年发生2200-3300万病例，包括约216,000-500,000例死亡[Crump,J.A.,Luby,S.P.,Mintz,E.D.:Theglobal burden of typhoid fever(伤寒热的全球负担).Bull World Health Organ82(5),346-353(2004)]。这种人类全身感染的病原体伤寒沙门氏菌(S.typhi)是通过污染的水和食物经口(feco-orally)传播的。因此，伤寒症是卫生条件仍然较差的较不发达地区中的地方性疾病。包括亚洲、非洲和南美洲在内的许多国家的学生和年轻人最经常受到影响[Bhan,M.K.,Bahl,R.,Bhatnagar,S.:Typhoid and paratyphoid fever(伤寒症和副伤寒).Lancet366(9487),749-762(2005)]。伤寒热的抗微生物治疗通过出现伤寒沙门氏菌的多药抗性菌株而日渐变得复杂[Mirza,S.H.,Beeching,N.J.,Hart,C.A.:Multi-drug resistant typhoid:a global problem(多药抗性伤寒：全球问题).JMed Microbiol 44(5),317-319(1996)]。
高危险人群的疫苗接种被认为是用于控制和预防伤寒症的最有前景策略。目前，有两种被许可的伤寒疫苗：经口施用的、全细胞减毒活疫苗Ty21a和纯化的Vi多糖肠胃外疫苗。Ty21a疫苗具有多种缺点：(i)有助于这种伤寒沙门氏菌菌株的减毒表型的突变未被充分定义[Hone,D.M.,Attridge,S.R.,Forrest,B.,Morona,R.,Daniels,D.,LaBrooy,J.T.,Bartholomeusz,R.C.,Shearman,D.J.,Hackett,J.:A galE via(Vi antigen-negative)mutant ofSalmonella typhi Ty2retains virulence in humans(伤寒沙门氏菌Ty2的galEvia(Vi抗原阴性)突变体在人中保持病毒性).Infect Immun 56(5),1326-1333(1988)]，(ii)减毒菌株理论上可以恢复为病毒性，和(iii)Ty21a是仅适度免疫原性的并且每5年需要三至四个初始剂量和加强剂量[Levine,M.M.,Ferreccio,C.,Black,R.E.,Germanier,R.:Large-scale field trial of Ty21a liveoral typhoid vaccine in enteric-coated capsule formulation(肠包衣的胶囊制剂中的Ty21a活性伤寒疫苗的大规模现场试验).Lancet 1(8541),1049-1052(1987)；Black,R.E.,Levine,M.M.,Ferreccio,C.,Clements,M.L.,Lanata,C.,Rooney,J.,Germanier,R.:Efficacy of one or two doses of Ty21a Salmonellatyphi vaccine in enteric-coated capsules in a controlled field trial(肠包衣胶囊中一个或两个剂量的Ty21a伤寒沙门氏菌疫苗在受控现场试验中的效力).Chilean Typhoid Committee.Vaccine 8(1),81-84(1990)；Murphy,J.R.,Grez,L.,Schlesinger,L.,Ferreccio,C.,Baqar,S.,Munoz,C.,Wasserman,S.S.,Losonsky,G.,Olson,J.G.,Levine,M.M.:Immunogenicity of Salmonella typhiTy21a vaccine for young children(伤寒沙门氏菌疫苗对于年轻幼儿的免疫原性).Infect Immun 59(11),4291-4293(1991)；Levine,M.M.,Ferreccio,C.,Cryz,S.,Ortiz,E.:Comparison of enteric-coated capsules and liquid formulation ofTy21a typhoid vaccine in randomised controlled field trial(Ty21a伤寒疫苗的肠包衣胶囊和液体制剂在随机化受控现场试验中的比较).Lancet 336(8720),891-894(1990)；Levine,M.M.,Ferreccio,C.,Abrego,P.,Martin,O.S.,Ortiz,E.,Cryz,S.:Duration of efficacy of Ty21a,attenuated Salmonella typhi live oralvaccine(Ty21a减毒的伤寒沙门氏菌活口服疫苗的效力的持续时间).Vaccine 17Suppl 2,S22-27(1999)]。Vi多糖疫苗的有用性受其年龄相关的免疫原性和针对多糖的免疫应答是T细胞无关这一事实所限制。因此，不能建立免疫记忆并且再接种疫苗不会引起任何加强应答[Weintraub,A.:Immunology of bacterial polysaccharide antigens(细菌多糖抗原的免疫学).Carbohydr Res 338(23),2539-2547(2003),Landy,M.:Studies on Vi antigen.VI.Immunization of human beings with purified Vi antigen(人类用纯化的Vi抗原免疫).Am J Hyg 60(1),52-62(1954)]。由于这些缺陷，所以期望用良好定义的、良好耐受的且高度免疫原性的疫苗替代当前的伤寒疫苗。
多糖疫苗的缺点可以通过将糖缀合至蛋白质载体(缀合物疫苗)而克服。在缀合后，多糖的行为类似于T细胞依赖性抗原。已证实，共价连接至重组绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A(EPA)的纯化的Vi多糖在幼儿中诱发针对伤寒沙门氏菌的保护性免疫应答[Szu,S.C.,Taylor,D.N.,Trofa,A.C.,Clements,J.D.,Shiloach,J.,Sadoff,J.C.,Bryla,D.A.,Robbins,J.B.:Laboratory and preliminary clinical characterization of Vicapsular polysaccharide-protein conjugate vaccines(Vi荚膜多糖-蛋白质缀合物疫苗的实验室和初步临床表征).Infect Immun 62(10),4440-4444(1994)；Lin,F.Y.,Ho,V.A.,Khiem,H.B.,Trach,D.D.,Bay,P.V.,Thanh,T.C.,Kossaczka,Z.,Bryla,D.A.,Shiloach,J.,Robbins,J.B.,Schneerson,R.,Szu,S.C.:The efficacy of a Salmonella typhi Vi conjugate vaccine intwo-to-five-year-old children(伤寒沙门氏菌Vi缀合物疫苗在二至五岁儿童中的效力).N Engl J Med 344(17),1263-1269(2001)]。然而，缀合物疫苗的生产是一个复杂的多步骤过程。首先，必须培育产生重组蛋白质载体和多糖抗原的分离的细菌菌株。多糖和蛋白质载体在该两种组分进行化学偶合之前必须通过不同的程序纯化。最后的步骤涉及用于获得最终产物的额外纯化步骤。该费力的生产过程具有以下缺点：(i)需要多个纯化步骤，其中可能出现相当大的损失和(ii)由于化学偶合的随机性，所以产物不是均一结构而是不同糖缀合物的混合物，具有潜在的不同效力分布曲线。
因此，仍然需要对感染了肠道沙门氏菌，包括伤寒沙门氏菌的受试者进行治疗和预防的改进方法。
3.概述
在一个方面，本文提供了包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌O121 O-抗原的生物缀合物。
在某些实施方式中，本文提供的生物缀合物的修饰的大肠杆菌O121 O-抗原共价结合至载体蛋白的糖基化位点内的天冬酰胺残基(Asn)，其中所述糖基化位点包含氨基酸序列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr，其中X和Z可以是除Pro之外的任何氨基酸。在某些实施方式中，本文提供的生物缀合物的载体蛋白不是天然地(例如，在其正常/天然的或“野生型”状态)包含糖基化位点。在某些实施方式中，本文提供的生物缀合物的载体蛋白被改造成包含一个或多个糖基化位点，例如，所述载体蛋白被改造成包含一个或多个糖基化位点，该糖基化位点包含氨基酸序列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr，其中X和Z可以是除Pro之外的任何氨基酸。例如，根据本文描述的方法使用的载体蛋白可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个糖基化位点，每一个糖基化位点具有氨基酸序列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr，其中X和Z可以是除Pro之外的任何氨基酸；并且其中一些(例如，1、2、3、4、5、6、7、8或9个)或全部糖基化位点已被重组地引入到所述载体蛋白中。
适合用于本文描述的方法(例如，治疗和/或预防伤寒沙门氏菌感染)中的任何载体蛋白可以在本文描述的生物缀合物的生产中使用。示例性载体蛋白包括，但不限于，铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的外毒素A(EPA)、CRM197、白喉类毒素(Diphtheria toxoid)、破伤风类毒素(tetanus toxoid)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)的解毒溶血素A、聚集因子(clumping factor)A、聚集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素(E.coli heat labile enterotoxin)、大肠杆菌不耐热肠毒素的解毒变体、霍乱毒素B亚基(Cholera toxin B subunit)(CTB)、霍乱毒素、霍乱毒素的解毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大肠杆菌sat蛋白的效应结构域、空肠弯曲杆菌AcrA(C.jejuni AcrA)和空肠弯曲杆菌天然糖蛋白。
在一种具体实施方式中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌O121 O-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌O121 O-抗原包含：
→4)-α-D-GalNAcA-(1→4)-α-D-GalNAcA-(1→
在另一种具体实施方式中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌O121 O-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌O121 O-抗原包含：
在另一种具体实施方式中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌O121 O-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌O121 O-抗原包含：
在另一种具体实施方式中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌O121 O-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌O121 O-抗原包含：
在另一个方面，本文提供了能够生产本文描述的生物缀合物的原核宿主细胞。在一种具体实施方式中，本文提供了一种可用于产生生物缀合物的原核宿主细胞，其中所述原核宿主细胞包含：(i)编码载体蛋白的异源核苷酸序列，所述载体蛋白包含至少一个糖基化位点，该糖基化位点包含氨基酸序列Asp/Glu–X–Asn–Z–Ser/Thr，其中X和Z可以是除Pro之外的任何天然氨基酸；和(ii)编码寡糖基转移酶的异源核苷酸序列；其中所述原核宿主细胞被重组地改造成生产Und-PP-修饰的大肠杆菌O121 O-抗原(即，本文描述的任一个修饰的大肠杆菌O121 O-抗原)，其中所述寡糖基转移酶将修饰的大肠杆菌O121 O-抗原转移至所述糖基化位点的Asn。在一种具体实施方式中，本文描述的原核宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞。在另一种具体实施方式中，本文描述的原核宿主细胞是大肠杆菌菌株K12宿主细胞。在另一种具体实施方式中，重组地引入到本文描述的宿主细胞，例如，大肠杆菌宿主细胞中的寡糖基转移酶是空肠弯曲杆菌的PglB。
在某些实施方式中，除了异源寡糖基转移酶之外，本文描述的宿主细胞包含异源核酸序列(即，不是与宿主细胞在其自然/天然状态，例如，在其“野生型”状态正常相关联的核酸序列，例如，基因)。这样的额外的异源核酸序列可以包含编码已知是属于糖基化操纵子，例如，原核糖基化操纵子的基因的核酸。在具体的实施方式中，这样的额外异源核酸序列包含属于空肠弯曲杆菌的pgl簇的基因，或包含空肠弯曲杆菌的全部pgl簇。
在某些实施方式中，本文描述的宿主细胞包含一个或多个基因缺失和/或一个或多个基因失活，即，宿主细胞的遗传背景已经以使得与宿主细胞正常相关的基因(例如，一个或多个“野生型”基因)失活或功能失常，或者将该基因全部去除的方式进行修饰。在一种具体实施方式中，在本文描述的生物缀合物的生产中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在wbqG基因中的突变或该wbqG基因的缺失。在另一种具体实施方式中，在本文描述的生物缀合物的生产中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在wbqC基因中的突变或该wbqC基因的缺失。在另一种具体实施方式中，在本文描述的生物缀合物的生产中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在wbqE基因中的突变或该wbqE基因的缺失。在另一种具体实施方式中，在本文描述的生物缀合物的产生中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在wbqG基因和wbqC基因中的突变或该wbqG基因和wbqC基因的缺失。在另一种具体实施方式中，在本文描述的生物缀合物的产生中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在wbqG基因和wbqE基因中的突变或该wbqG基因和wbqE基因的缺失。在另一种具体实施方式中，在本文描述的生物缀合物的产生中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在wbqG基因、wbqC基因和wbqE基因中的突变或该wbqG基因、wbqC基因和wbqE基因的缺失。
在某些实施方式中，大肠杆菌的O121基因簇(例如，大肠杆菌O121参照菌株CCUG 11422的O121基因簇；在Fratamico等,2003,J.Clin.Microbiol.41(7):3379-3383中描述的O121基因簇)被引入(例如，重组地引入)到本文描述的宿主细胞中。在某些实施方式中，O121基因簇被引入到不产生任何O抗原的宿主细胞中，例如，所述宿主细胞已以使其不产生任何O抗原的方式被修饰。在某些实施方式中，O121基因簇的一个或多个基因被功能性失活(例如，缺失，以使该基因失活的方式突变等)。在一种具体实施方式中，引入到本文描述的宿主细胞中的O121基因簇的wbqG基因被功能性失活(例如，缺失)。在另一种具体实施方式中，引入到本文描述的宿主细胞中的O121基因簇的wbqG基因和/或wbqE基因被功能性失活(例如，缺失)。在具体的实施方式中，这样的宿主细胞被用来生产修饰的大肠杆菌O121 O-抗原(即，本文描述的任一修饰的大肠杆菌O121 O-抗原)。
在某些实施方式中，除了或代替上述的一个或多个基因缺失，在本文描述的生物缀合物的生产中使用的宿主细胞包含一个或多个以下基因的缺失/失活：waaL(参见，例如，Feldman等, 2005, PNAS USA 102:3016-3021)、脂质A核心生物合成簇、半乳糖簇、阿拉伯糖簇、可拉酸(colonic acid)簇、荚膜多糖簇、十一癸烯醇-p生物合成基因、und-P再循环基因、在核苷酸激活的糖生物合成中涉及的代谢酶、肠道细菌共同抗原簇、和原噬菌体O抗原修饰簇如gtrABS簇。
在另一个方面，本文提供了产生本文提供的生物缀合物的方法。在某些实施方式中，用于产生本文提供的生物缀合物的方法包括在适合生产蛋白质的条件下培养本文描述的宿主细胞，和分离生物缀合物。本领域技术人员将了解适用于维持宿主细胞生长的条件以使本文描述的生物缀合物可以通过所述宿主细胞生产并随后分离。这样的方法额外地通过本文提供的工作实施例涵盖(参见第6部分)。
在又一个方面，本文提供了包含本文描述的生物缀合物的组合物，例如，免疫原性组合物。在某些实施方式中，本文描述的免疫原性组合物包含本文描述的生物缀合物和一种或多种额外的组分，例如，佐剂。
在另外的一个方面，本文提供了治疗或预防肠道沙门氏菌的感染的方法，包括向被肠道沙门氏菌感染的或处于被肠道沙门氏菌感染风险中的受试者施用本文描述的生物缀合物、或其组合物(例如，免疫原性组合物)。在具体的实施方式中，所述肠道沙门氏菌是伤寒沙门氏菌(S.typhi)。
3.1惯例和缩写
大肠杆菌O121     大肠杆菌血清型O121
PglB             细菌寡糖基转移酶PglB
Und-PP           十一异戊二烯焦磷酸盐(undecaprenyl pyrophosphate)
ELISA            酶联免疫吸附测定
EPA              绿脓假单胞菌外毒素A
Vi               α-1,4-连接的N-乙酰基半乳糖胺糖醛酸(D-GalNAcA)残基的荚膜
               多糖线性的、酸性均聚物
viaB             Vi生物合成基因簇
ABC转运蛋白     ATP结合盒
wzy             聚合酶基因
大肠杆菌O121    含有2-乙酰胺基-2-脱氧-d-半乳糖醛酸(d-GalNAcA)而不是
wbqG            d-GalNAcAN的大肠杆菌O121 wbqG O抗原突变体(d-GalNAcA)
CPS             荚膜多糖
D-GalNAcAN      N-乙酰基半乳糖胺糖醛酰胺(N-acetylgalactosaminuronamide)
残基a          (1→3)-α-D-GlcNAc
残基b          (1→4)-α-D-GalNAcA
残基c          (1→4)-α-D-GalNAcAN(60％在C-3处O-乙酰化的)
残基c’        (1→4)-α-D-GalNAcA(30-40％在C-3处O-乙酰化的)
残基d          (1→3)-β-D-Qui4NAcGly
LPS            脂多糖
2AB            2-氨基苯甲酰胺
MS             质谱法
m/z            质荷比
(CID) MS-MS    碰撞诱导解离质谱-质谱法
Da             道尔顿，质量的单位
kDa            千道尔顿
waaL           O抗原连接酶基因
Und-PP         十一异戊二烯焦磷酸
Dol-PP         焦磷酸长醇(dolichyl pyrophosphate)
wzz            O抗原链长度调节基因
ECA            肠道细菌共同抗原
CWP            细胞壁多糖
ELISA          酶联免疫吸附测定
A600           在600 nm的光密度
MES            2-(N-吗啉代)乙磺酸，用于MES运行缓冲液
TBAP           磷酸四丁铵
TFA            三氟乙酸
PEG            聚乙二醇
CHCA           α-氰基-4-羟基肉桂酸
IPTG           异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷
CTAB           十六烷基三甲基溴化铵
rpm            每分钟的转数
BCA            二金鸡宁酸测定
Vi-Tyr         酪氨酸化的Vi多糖
HRP            辣根过氧化物酶
TMB            3,3’,5,5’-四甲基联苯胺
4.附图描述
图1：伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)Vi多糖的结构和大肠杆菌O121O抗原的重复单元。O121  O抗原簇编码的基因wbqG的突变导致修饰的O多糖结构的表达。GalNAcA：2-乙酰胺基-2-脱氧-D-半乳糖醛酸；GalNAcAN：2-乙酰胺基-2-脱氧-D-半乳糖糖醛酰胺；Qui4N：4-氨基-4,6-二脱氧-D-葡萄糖。
图2：大肠杆菌O121及其wbqG突变衍生物的O多糖分析。(A)来自表达O121野生型O抗原基因簇或其wbqG突变衍生物的W3110细胞的LPS通过SDS-PAGE分离并用银染色或在转移至硝基纤维素后用抗-O121和抗-Vi抗体检测。wbqG的突变导致与抗-Vi血清是反应性的修饰的O抗原的装配。(B)Und-PP-连接的聚糖从表达O121野生型O抗原基因簇或其突变wbqG衍生物的大肠杆菌SCM6细胞提取，接着2AB标记并使用GlycoSep N柱通过正常相HPLC分离。单个峰馏分通过质谱法分析并表明所鉴别的聚糖结构。■：N-乙酰基己糖胺；：二脱氧己糖胺；◇：己糖醛酸；◇N：葡糖醛酰胺(hexuronamide)；Ac：乙酰基；NAc：N-乙酰基。
图3：通过正常相HPLC分离的聚糖物种的CID MS-MS谱图。该CIDMS-MS谱图对应于在图2B中看到的在单个峰馏分中鉴别的聚糖物种，具有以下保留时间：(A)58.8分钟，(B)65.1分钟，(C)67.2分钟和(D)73.5分钟。
图4：利用细菌N-糖基化系统生产糖缀合物。糖缀合物通过共表达细菌寡糖基转移酶PglB、改造的载体蛋白EPA和推动抗原性多糖的合成的基因(大肠杆菌O121,大肠杆菌O121wbqG突变体,痢疾志贺氏菌(Shigelladysenteriae)O1)在大肠杆菌CLM24中生产。在使用抗-EPA、抗-O121和抗-Vi抗体转移至硝基纤维素膜后，纯化的糖缀合物通过SDS-PAGE，接着通过考马斯蓝染色(Coomassie blue staining)或糖苷蛋白质印迹分析。
图5：利用糖缀合物的免疫化研究。使多组小鼠在氢氧化铝存在下用纯化的糖缀合物免疫。对照组用纯化的Vi多糖免疫。(A)在第67天收集的血清的抗-O121总免疫球蛋白效价。(B)在第67天收集的血清的抗-Vi抗体效价。数据表示为单个效价(●)和平均效价(-)。用O121wbqG-EPA缀合物免疫的一个动物不发展O121-LPS特异性抗体应答，但是同一动物显示抗-Vi抗体效价的显著升高。
5.详细描述
在一个方面，本文提供了包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌O121 O-抗原的生物缀合物。
在另一个方面，本文提供了能够生产本文描述的生物缀合物的原核宿主细胞。在一种具体实施方式中，本文提供了一种可用于产生生物缀合物的原核宿主细胞，其中所述原核宿主细胞包含：(i)编码载体蛋白的异源核苷酸序列，该载体蛋白包含至少一个糖基化位点，该糖基化位点包含氨基酸序列Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr，其中X和Z可以是除Pro之外的任何天然氨基酸；和(ii)编码寡糖基转移酶的异源核苷酸序列；其中所述原核宿主细胞被重组地改造以生产Und-PP-修饰的大肠杆菌O121 O-抗原(即，本文描述的任一修饰的大肠杆菌O121 O-抗原)，其中所述寡糖基转移酶将所述修饰的大肠杆菌O121 O-抗原转移至糖基化位点的Asn。
在另一个方面，本文提供了产生本文提供的生物缀合物的方法。在某些实施方式中，用于产生本文提供的生物缀合物的方法包括在适合生产蛋白质的条件下培养本文描述的宿主细胞，和分离所述生物缀合物。
在又一个方面，本文提供了包含本文描述的生物缀合物的组合物，例如，免疫原性组合物。在一个进一步的方面，本文提供了治疗或预防肠道沙门氏菌的感染的方法，包括向被肠道沙门氏菌感染的或处于被肠道沙门氏菌感染的风险的受试者施用本文描述的生物缀合物或其组合物(例如，免疫原性组合物)。在具体的实施方式中，所述肠道沙门氏菌是伤寒沙门氏菌(S.typhi)。
5.1宿主细胞
任何宿主细胞可以用来生产本文描述的生物缀合物。在具体的实施方式中，用来生产本文描述的生物缀合物的宿主细胞是原核宿主细胞。示例性的原核宿主细胞包括，但不限于，埃希氏菌属(Escherichia)物种、志贺氏菌属(Shigella)物种、克雷伯氏菌属(Klebsiella)物种、黄单胞菌属(Xhantomonas)物种、沙门氏菌属(Salmonella)物种、耶尔森氏菌属(Yersinia)物种、乳球菌属(Lactococcus)物种，乳杆菌属(Lactobacillus)物种、假单胞菌属(Pseudomonas)物种、棒状杆菌属(Corynebacterium)物种、链霉菌属(Streptomyces)物种、链球菌属(Streptococcus)物种、葡萄球菌属(Staphylococcus)物种、芽胞杆菌属(Bacillus)物种和芽胞杆菌属(Clostridium)物种。在一种具体实施方式中，用来生产本文描述的生物缀合物的宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)宿主细胞(例如，大肠杆菌菌株K12或CLM 24及其衍生物)。
在某些实施方式中，用来生产本文描述的生物缀合物的宿主细胞被改造成包含异源核酸，例如，编码一种或多种载体蛋白的异源核酸(参见，例如，第5.2部分)和/或编码一种或多种蛋白质的异源核酸，例如，编码一种或多种蛋白质的基因(参见，例如，第5.1.1部分)。在一种具体实施方式中，涉及糖基化途径(例如，原核和/或真核糖基化途径)的编码蛋白质的异源核酸可以被引入到本文描述的宿主细胞中。这样的核酸可以编码蛋白质，包括但不限于寡糖基转移酶和/或羰基转移酶。异源核酸(例如，编码载体蛋白的核酸和/或编码其他蛋白质，例如在糖基化中涉及的蛋白质的核酸)可以使用本领域技术人员已知的任何方法，例如，电穿孔、通过热冲击的化学转化、自然转化、噬菌体转导和缀合，引入到本文描述的宿主细胞中。在具体的实施方式中，异源核酸使用质粒引入到宿主细胞中，例如，异源核酸通过质粒(例如，表达载体)在宿主细胞中表达。
在某些实施方式中，可以向本文描述的宿主细胞中引入(例如，使用重组技术)额外的修饰。例如，编码蛋白质(其形成可能与糖基化途径竞争或干扰糖基化途径(例如与被重组地引入到宿主细胞中的在糖基化中所涉及的一种或多种异源基因竞争或干扰糖基化)的一部分)的宿主细胞核酸(例如，基因)可以被缺失或者以使它们失活/失去功能的方式在宿主细胞背景(基因组)中修饰(即缺失/修饰的宿主细胞核酸不编码功能性蛋白质或者不编码任何蛋白质)。在某些实施方式中，当核酸从本文提供的宿主细胞的基因组缺失时，它们被所需序列，例如，可用于糖蛋白生产的序列替代。控制宿主细胞中可以被缺失(并且，在一些情况下，被其他所需核酸序列替代)的示例性基因包括在糖脂生物合成中涉及的宿主细胞的基因，如waaL(参见，例如，Feldman等,2005,PNAS USA 102:3016-3021)、脂质A核心生物合成簇、半乳糖簇、阿拉伯糖簇、结肠酸簇、荚膜多糖簇、十一癸烯醇-p生物合成基因、und-P再循环基因、在核苷酸激活的糖生物合成中涉及的代谢酶、肠道细菌共同抗原簇、和原噬菌体O抗原修饰簇如gtrABS簇。在一种具体实施方式中，本文描述的宿主细胞被修饰以使它们不产生不同于本文描述的修饰的大肠杆菌O121 O-抗原的任何O抗原(例如，用于生产不同本文描述的修饰的大肠杆菌O121 O-抗原的O抗原的宿主细胞机制被缺失/失活)。
在具体的实施方式中，本文描述的宿主细胞的基因组可以以在生产变得与本文描述的生物缀合物相关联的抗原中涉及的一个或多个基因不再由所述宿主生产的方式被修饰。例如，在生产在正常情况下将与本文描述的生物缀合物相关联的抗原侧链中涉及的一个或多个基因可以被缺失。不意图受限于任何特定的操作理论，认为编码在生产变得与本文描述的生物缀合物相关联的抗原(不同于本文描述的修饰的大肠杆菌O121 O-抗原(例如，抗原侧链))中涉及的基因的失活/缺失核酸，增加/增强针对本文描述的修饰的大肠杆菌O121 O-抗原的特异性免疫应答，由此增加本文描述的生物缀合物的抗原性。在一种具体实施方式中，本文描述的宿主细胞具有突变的/缺失的/失活的wbqC基因，导致AcGly侧链(即，图1中的残基d)的失活/缺失。在另一种具体实施方式中，本文描述的宿主细胞具有突变的/缺失的/失活的wbqE基因。
在一种具体实施方式中，在本文描述的生物缀合物的生产中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在wbqG基因中的突变或wbqG基因的缺失。在另一种具体实施方式中，在本文描述的生物缀合物的产生中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在wbqC基因中的突变或wbqC基因的缺失。在另一种具体实施方式中，在本文描述的生物缀合物的产生中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在wbqE基因中的突变或wbqE基因的缺失。在另一种具体实施方式中，在本文描述的生物缀合物的产生中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在wbqG基因和wbqC基因中的突变或wbqG基因和wbqC基因的缺失。在另一种具体实施方式中，在本文描述的生物缀合物的产生中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在wbqG基因和wbqE基因中的突变或wbqG基因和wbqE基因的缺失。在另一种具体实施方式中，在本文描述的生物缀合物的产生中使用的宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞，其中所述大肠杆菌宿主细胞具有在wbqG基因、wbqC基因和wbqE基因中的突变或wbqG基因、wbqC基因和wbqE基因的缺失。这样的宿主细胞可以还包含本文描述的任何修饰，例如，宿主细胞包含编码载体蛋白和/或编码在蛋白质糖基化中涉及的一个或多个基因(例如，寡糖基转移酶)的异源核酸和/或宿主细胞可以还包含基因缺失/失活(例如，waaL的缺失)。
在某些实施方式中，大肠杆菌的O121基因簇(例如，大肠杆菌O121参照菌株CCUG 11422的O121基因簇；描述于Fratamico等,2003,J.Clin.Microbiol.41(7):3379-3383中的O121基因簇)被引入(例如，重组地引入)到本文描述的宿主细胞中。在某些实施方式中，O121基因簇被引入到不产生任何O抗原的宿主细胞中，例如，宿主细胞已以使其不生产任何O抗原的方式被修饰。在某些实施方式中，O121基因簇的一个或多个基因在功能上失活(例如，缺失，以使基因失活的方式突变等)。在一种具体实施方式中，引入到本文描述的宿主细胞中的O121基因簇的wbqG基因在功能上失活(例如，缺失)。在另一种具体实施方式中，引入到本文描述的宿主细胞中的O121基因簇的wbqG基因和/或wbqE基因在功能上失活(例如，缺失)。在具体的实施方式中，这样的宿主细胞用来生产修饰的大肠杆菌O121 O-抗原(即，本文描述的任何修饰的大肠杆菌O121 O-抗原)。
5.1.1糖基化机构
在某些实施方式中，本文提供的宿主细胞被修饰以表达糖基化机构(machinery)以使该宿主能够生产本文描述的修饰的大肠杆菌O121 O-抗原。在甚至更具体的实施方式中，宿主细胞的糖基化机构被改造以生产UndPP-连接的修饰的大肠杆菌O121 O-抗原。
不受理论限制，UndPP-连接的修饰的大肠杆菌O121 O-抗原然后从宿主细胞的细胞溶质快速翻转(flip)到宿主细胞的壁膜间隙中。而且，不受理论限制，修饰的大肠杆菌O121 O-抗原然后在载体蛋白的糖基化位点的Asn上从UndPP转移到载体蛋白上。
在某些实施方式中，编码糖基化转移的异源核酸引入(例如，使用重组方法引入)到宿主细胞中以使修饰的大肠杆菌O121 O-抗原在UndPP上产生。本领域技术人员将容易地认识到，任何合适的异源糖基化转移酶可以根据本文描述的方法使用。在一种具体实施方式中，编码来自空肠弯曲杆菌的糖基化转移酶的异源核酸被引入到宿主细胞中。
在某些实施方式中，编码寡糖基转移酶的异源核酸被引入到本文描述的宿主细胞中。本领域技术人员将容易认识到，任何合适的异源寡糖基转移酶可以根据本文描述的方法使用。在一种具体实施方式中，编码来自空肠弯曲杆菌的寡糖基转移酶的异源核酸被引入到宿主细胞中。在另一种具体实施方式中，来自空肠弯曲杆菌的寡糖基转移酶Pglb被引入到本文描述的宿主细胞中。
在某些更具体的实施方式中，异源糖基化操纵子被引入到本文描述的宿主细胞中。在某些实施方式中，异源糖基化操纵子具有一个或多个突变，即操纵子中的一个或多个基因发生突变以使该基因失活/缺失。在一种具体实施方式中，编码来自空肠弯曲杆菌的糖基化操纵子的异源核酸被引入到宿主中。
5.2载体蛋白
适合用于生产生物缀合物的任何载体蛋白可以在本文中使用。示例性载体蛋白包括，但不限于，铜绿假单胞菌(EPA)的外毒素A、CRM197、白喉类毒素、破伤风类毒素、金黄色葡萄球菌的解毒溶血素A、聚集因子A、聚集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素的解毒变体、霍乱毒素B亚基(CTB)、霍乱毒素、霍乱毒素的解毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大肠杆菌sat蛋白的效应结构域、空肠弯曲杆菌AcrA和空肠弯曲杆菌天然糖蛋白。
在某些实施方式中，在产生本文描述的生物缀合物中使用的载体蛋白被修饰，例如，以使蛋白质毒性更低和或更易于糖基化等的方式修饰。在一种具体实施方式中，在产生本文描述的生物缀合物中使用的载体蛋白被修饰以使载体蛋白中的糖基化位点的数量以允许更低浓度的蛋白质可以被施用的方式最大化，例如，以免疫原性组合物、以其生物缀合物形式。因此，在某些实施方式中，本文描述的载体蛋白被修饰以包括将通常与载体蛋白相关联的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个糖基化位点(例如，相对于与在其天然/自然，例如，“野生型”状态的载体蛋白相关联的糖基化位点的数量)。在具体的实施方式中，糖基化位点的引入伴随蛋白质的初级结构中的糖基化共有序列的插入。这样的糖基化位点的引入可以伴随，例如，将新的氨基酸添加至蛋白质的初级结构(即，糖基化位点被添加，全部或部分)，或伴随使蛋白质中的现有氨基酸突变以产生糖基化位点(即，氨基酸没有添加至蛋白质，但所选的蛋白质的氨基酸发生突变以形成糖基化位点)。本领域技术人员将认识到，蛋白质的氨基酸序列可以使用本领域已知的方法，例如，重组方法(包括编码蛋白质的核酸序列的修饰)容易地修饰。在具体的实施方式中，糖基化共有序列被引入到载体蛋白的特定区域中，例如，蛋白质的表面结构，在蛋白质的N或C末端，和/或在通过在蛋白质的基部处通过二硫键稳定化的环中。在某些实施方式中，经典的5个氨基酸糖基化共有序列可以通过赖氨酸残基延展用于更有效的糖基化，并且因此所插入的共有序列可以编码应被插入或代替受体蛋白氨基酸的5、6或7个氨基酸。
在某些实施方式中，用于产生本文描述的生物缀合物的载体蛋白包含“标签”，即，允许分离和/或鉴别载体蛋白的氨基酸的序列。例如，将标签添加至本文描述的载体蛋白可以可用于纯化该蛋白质，并且因此，可用于纯化包含标签的载体蛋白的生物缀合物。可以在本文使用的示例性标签包括，但不限于，组氨酸(HIS)标签(例如，六组氨酸-标签，或6XHis-Tag)、FLAG-TAG和HA标签。在某些实施方式中，一旦不再需要它们，例如在所述蛋白已被纯化之后，本文中使用的标签是可去除的，例如，通过化学试剂或通过酶促手段去除。
5.3修饰的大肠杆菌O121 O-抗原
本文描述的生物缀合物包含修饰的大肠杆菌O121 O-抗原，其中，作为使用本文描述的方法修饰所述抗原(例如，缺失wbqG基因)的结果，所述修饰的大肠杆菌O121 O-抗原含有与肠道沙门氏菌Vi多糖，特别是伤寒沙门氏菌(S.typhi)Vi多糖的结构相似性。不期望受理论限制，由于本文提供的修饰的大肠杆菌O121 O-抗原与肠道沙门氏菌Vi多糖的相似性所致，这样的修饰的大肠杆菌O121 O-抗原适合用于治疗和/或预防受试者(例如，人类受试者)由肠道沙门氏菌引起的感染，特别是当所述修饰的大肠杆菌O121 O-抗原作为生物缀合物施用时。本领域技术人员将认识到，基于发明人的发现，只要所述修饰的大肠杆菌O121 O-抗原保持与肠道沙门氏菌Vi多糖，例如，伤寒沙门氏菌(S.typhi)Vi多糖的相似性，任何修饰的大肠杆菌O121 O-抗原都适合根据本文描述的方法使用，并且可以用于产生本文描述的生物缀合物。
在一种具体实施方式中，本文提供了一种修饰的大肠杆菌O121 O-抗原,其中所述修饰的大肠杆菌O121 O-抗原包含以下结构：
→4)-α-D-GalNAcA-(1→4)-α-D-GalNAcA-(1→。
在另一种具体实施方式中，本文提供了一种修饰的大肠杆菌O121 O-抗原，其中所述修饰的大肠杆菌O121 O-抗原包含以下结构：
在另一种具体实施方式中，本文提供了一种修饰的大肠杆菌O121 O-抗原，其中所述修饰的大肠杆菌O121 O-抗原包含以下结构：
在另一种具体实施方式中，本文提供了一种修饰的大肠杆菌O121 O-抗原，其中所述修饰的大肠杆菌O121 O-抗原包含以下结构：
5.4生物缀合物
本文提供了通过本文描述的宿主细胞生产的生物缀合物，其中所述生物缀合物包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌O121 O-抗原。如本文提及的，生物缀合物包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌O121 O-抗原，其中所述修饰的大肠杆菌O121 O-抗原共价连接至载体蛋白的天冬酰胺(ASN))残基(例如，连接在载体蛋白的糖基化位点)。
在一种具体实施方式中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌O121 O-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌O121 O-抗原包含：
→4)-α-D-GalNAcA-(1→4)-α-D-GalNAcA-(1→。
在另一种具体实施方式中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌O121 O-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌O121 O-抗原包含：
在另一种具体实施方式中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌O121 O-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌O121 O-抗原包含：
在另一种具体实施方式中，本文提供了一种包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌O121 O-抗原的生物缀合物，其中所述修饰的大肠杆菌O121 O-抗原包含：
在某些实施方式中，本文提供的生物缀合物被分离，即，使用本领域已知的和/或本文描述的生产生物缀合物的方法通过本文描述的宿主细胞生产所述生物缀合物，并且分离和/或纯化所生产的生物缀合物。在某些实施方式中，本文提供的生物缀合物为至少75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％纯的，例如没有其他污染物等。
在某些实施方式中，本文提供的生物缀合物相对于连接至载体蛋白的糖基化位点的修饰的大肠杆菌O121 O-抗原是同源的，例如，所述生物缀合物在载体蛋白的所有糖基化位点处表达相同的修饰的大肠杆菌O121 O-抗原。
在某些实施方式中，本文提供的生物缀合物相对于连接至载体蛋白的糖基化位点的修饰的大肠杆菌O121 O-抗原不是同源的，例如，所述生物缀合物在载体蛋白的糖基化位点处表达不同的修饰的大肠杆菌。
在某些实施方式中，本文提供的生物缀合物具有多于一个的糖基化位点，其中载体蛋白的每个糖基化位点被糖基化(即，载体蛋白的100％的糖基化位点被糖基化)，即，修饰的大肠杆菌O121 O-抗原连接至每个糖基化位点。在某些实施方式中，本文提供的生物缀合物具有多于一个的糖基化位点，其中不是载体蛋白的所有糖基化位点都被糖基化，例如，约或至少10％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，或95％的载体蛋白的糖基化位点被糖基化，但不是载体蛋白的所有糖基化位点被糖基化(即，修饰的大肠杆菌O121 O-抗原不是连接至每个糖基化位点)。在某些实施方式中，被糖基化的载体蛋白的所有糖基化位点包含相同的修饰的大肠杆菌O121 O-抗原(即，被其糖基化)。
在某些实施方式中，本文提供了生物缀合物的群。在一种实施方式中，本文提供了一群生物缀合物，其中至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％，或其中100％的在所述群中的生物缀合物的载体蛋白中的第一糖基化位点被糖基化。在一种具体实施方式中，至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％,或95％或100％的每个生物缀合物的第一糖基化位点被相同的修饰的大肠杆菌O121 O-抗原糖基化，如同该群中的其他生物缀合物(即，所有生物缀合物在载体蛋白的第一糖基化位点处具有相同的修饰的大肠杆菌O121 O-抗原)。在某些实施方式中，至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％,或95％，或100％的在所述群中的生物缀合物的载体蛋白中的第二糖基化位点被糖基化。在一种具体实施方式中，至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，或95％，或100％的每个生物缀合物的第二糖基化位点被相同的修饰的大肠杆菌O121 O-抗原糖基化，如同该群中的其他生物缀合物(即，所有的生物缀合物在载体蛋白的第二糖基化位点处具有相同的修饰的大肠杆菌O121 O-抗原)。在某些实施方式中，至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，或95％，或100％的在所述群中的生物缀合物的载体蛋白中的第三糖基化位点被糖基化。在一种具体实施方式中，至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，或95％，或100％的每个生物缀合物的第三糖基化位点被相同的修饰的大肠杆菌O121 O-抗原糖基化，如同该群中的其他生物缀合物(即，所有生物缀合物在载体蛋白的第三糖基化位点处具有相同的修饰的大肠杆菌O121 O-抗原)。在某些实施方式中，至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，或95％，或100％的所述群中的生物缀合物的载体蛋白中的第四糖基化位点被糖基化。在一种具体实施方式中，至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，或95％，或100％的每个生物缀合物的第四糖基化位点被相同的修饰的大肠杆菌O121 O-抗原糖基化，如同该群中的其他生物缀合物(即，所有生物缀合物在载体蛋白的第四糖基化位点处具有相同的修饰的大肠杆菌O121 O-抗原)。在某些实施方式中，至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，或95％，或100％的所述群中的生物缀合物的载体蛋白中的第五糖基化位点被糖基化。在一种具体实施方式中，至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，或95％，或100％的每个生物缀合物的第五糖基化位点被相同的修饰的大肠杆菌O121 O-抗原糖基化，如同该群中的其他生物缀合物(即，所有生物缀合物在载体蛋白的第五糖基化位点处具有相同的修饰的大肠杆菌O121 O-抗原)。
5.5组合物
5.5.1包含宿主细胞的组合物
在一种实施方式中，本文提供了包含了本文描述的宿主细胞的组合物。这样的组合物可以在用于产生本文描述的生物缀合物的方法中使用，例如，该组合物可以在适合生产蛋白质的条件下培养。随后，将生物缀合物与所述组合物分离。
本文提供的包含宿主细胞的组合物包含适用于本文描述的宿主细胞的维持和存活的额外组分，并且可以额外地包含通过宿主细胞生产蛋白质所需的或有益的额外组分，例如用于诱导型启动子的诱导物，如阿拉伯糖，IPTG。
5.5.2包含生物缀合物的组合物
在另一种实施方式中，本文提供了包含本文描述的生物缀合物的组合物。这样的组合物可以在治疗和预防疾病的方法中使用。在一种具体实施方式中，本文描述的组合物用于治疗被肠道沙门氏菌感染的受试者(例如，人类受试者)。在另一种具体实施方式中，本文描述的免疫原性组合物用于预防治疗被伤寒沙门氏菌(S.typhi)感染的受试者(例如，人类受试者)。
在一种具体实施方式中，本文提供了包含本文描述的一种或多种生物缀合物的免疫原性组合物。本文提供的免疫原性组合物可以用于在施用了该组合物的宿主中引发免疫应答。因此，本文描述的免疫原性组合物可以用作疫苗并且因此可以被配制为药物组合物。在一种具体实施方式中，本文描述的免疫原性组合物可以用于预防受试者(例如，人类受试者)受到肠道沙门氏菌的感染。在另一种具体实施方式中，本文描述的免疫原性组合物可以用于受试者(例如，人类受试者)受到伤寒沙门氏菌(S.typhi)的感染。
包含本文描述的生物缀合物的组合物可以包含适用于药物施用的额外组分。在具体的实施方式中，本文描述的免疫原性组合物是单价制剂。在其他实施方式中，本文描述的免疫原性组合物是多价制剂。例如，多价制剂包含多于一种的本文描述的生物缀合物。
在某些实施方式中，本文描述的组合物额外地包含防腐剂，例如，汞衍生物硫柳汞(thimerosal)。在一种具体实施方式中，本文描述的药物组合物包含0.001％至0.01％硫柳汞。在其他实施方式中，本文描述的药物组合物不包含防腐剂。
在某些实施方式中，本文描述的组合物(例如，免疫原性组合物)包含佐剂或与其联合施用。用于与本文描述的组合物联合施用的佐剂可以在施用所述组合物之前、同时地或之后施用。在一些实施方式中，术语“佐剂”是指当与本文描述的组合配合或作为该组合物的一部分施用时，增加、增强和/或加强对生物缀合物的免疫应答的化合物，但当该化合物单独施用时不会对生物缀合物产生免疫应答。在一些实施方式中，佐剂对多生物缀合物肽产生免疫应答而不产生变态反应或其他不利反应。佐剂可以通过多种机制增强免疫应答，所述机制包括例如淋巴细胞募集、刺激B和/或T细胞、以及刺激巨噬细胞。佐剂的具体实例包括但不限于铝盐(明矾(alum))(如氢氧化铝，磷酸铝和硫酸铝)，3脱-O-乙酰化的单磷酰脂质A(3De-O-acylatedmonophosphoryl lipid A)(MPL)(参见GB 2220211)，MF59(Novartis)，AS03(GlaxoSmithKline)，AS04(GlaxoSmithKline)，聚山梨醇酯80(Tween80；ICL Americas,Inc.)，咪唑并吡啶化合物(参见国际申请号PCT/US2007/064857，公布为国际公开号WO2007/109812)，咪唑并喹喔啉化合物(参见国际申请号PCT/US2007/064858，公布为国际公开号WO2007/109813)和皂角苷，如QS21(参见Kensil等,in Vaccine Design:TheSubunit and Adjuvant Approach(在疫苗设计中：亚基和佐剂方法)(eds.Powell&Newman,Plenum Press,NY,1995)；美国专利号5,057,540)。在一些实施方式中，佐剂是弗氏佐剂(完全或不完全的)。其他佐剂是水包油乳液(如鲨烯或花生油)，任选地联合免疫刺激剂，如单磷酰脂质A(参见Stoute等,N.Engl.J.Med.336,86-91(1997))。另一种佐剂是CpG(Bioworld Today,1998年11月15日)。
5.6用途
在一种实施方式中，本文提供了治疗受试者中的感染的方法，包括向所述受试者施用本文描述的生物缀合物或其组合物。在一种具体实施方式中，本文描述了一种用于治疗感染的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的本文描述的生物缀合物或其组合物。
在另一种实施方式中，本文提供了用于在受试者中诱发免疫应答的方法，包括向所述受试者施用本文描述的生物缀合物或其组合物。在一种具体实施方式中，本文提供了一种对本文描述的生物缀合物诱发免疫应答的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的本文描述的生物缀合物或其组合物。
在一种具体实施方式中，对其施用生物缀合物或其组合物的受试者受到感染或易感感染，例如细菌感染。在另一种具体实施方式中，对其施用生物缀合物或其组合物的受试者受到肠道沙门氏菌感染或者易感肠道沙门氏菌的感染。在另一种具体实施方式中，对其施用生物缀合物或其组合物的受试者受到伤寒沙门氏菌感染或易感伤寒沙门氏菌的感染。
在另一种实施方式中，本文描述的生物缀合物可以用于产生抗体，该抗体用于例如诊断和研究目的，例如，这样的抗体可用于确定施用包含本文描述的生物缀合物的免疫原性组合物、或用于治疗肠道沙门氏菌感染的任何其他组合物是否导致足以杀灭肠道沙门氏菌或使其无效的宿主免疫应答(例如，这样的抗体可以用于血清杀菌测定)。
5.7测定
5.7.1用于评估生物缀合物诱导免疫应答的能力的测定
可以使用本领域技术人员已知的或本文描述的任何方法来评估本文描述的生物缀合物在能够与肠道沙门氏菌(S.enterica)的Vi多糖交叉反应的受试者中产生免疫应答的能力。在一些实施方式中，本文描述的生物缀合物在能够与肠道沙门氏菌的Vi多糖交叉反应的受试者中产生免疫应答的能力可以通过用本文描述的生物缀合物使受试者(例如，小鼠)或受试者组免疫并且用对照(PBS)使额外的受试者(例如，小鼠)或受试者组免疫进行评估。这样的受试者可以代表疾病的动物模型，例如，伤寒症的动物模型(参见，例如，Libby等,2010,PNAS USA 107(35):15589-15594)。可以随后用毒性的肠道沙门氏菌攻击所述受试者或受试者组并且可以确定该毒性的肠道沙门氏菌在所述受试者或受试者组中引起疾病(例如，伤寒症)的能力。本领域技术人员将认识到，如果用对照免疫的受试者或受试者组在用肠道沙门氏菌攻击后患病(例如，伤寒症)而用本文描述的生物缀合物免疫的受试者或受试者组没有患病，则该生物缀合物能够在能够与肠道沙门氏菌的Vi多糖交叉反应的受试者中产生免疫应答。可以通过例如免疫测定(如ELISA)来测试本文描述的生物缀合物诱导与肠道沙门氏菌的Vi多糖交叉反应的抗血清的能力。
5.7.2血清杀菌测定
可以使用血清杀菌测定(SBA)来评估本文描述的生物缀合物在能够与肠道沙门氏菌的Vi多糖交叉反应的受试者中产生免疫应答的能力。这样的测定是本领域熟知的并且简单地包括产生和分离针对关注的靶标(例如，肠道沙门氏菌的Vi多糖)的抗体的步骤，其中通过向受试者(例如，小鼠)施用激发出这样的抗体的化合物。随后，可以例如通过以下来评估抗体的杀菌能力：在所述抗体和补充物存在下培养所讨论的细菌(例如，肠道沙门氏菌)，并例如使用标准的微生物学方法测定所述抗体杀灭该细菌和/或使其无效的能力。
6.实施例
本实施例证实，能够成功地形成修饰的大肠杆菌O121 O-抗原并且施用包含这样的抗原的生物缀合物能够在与肠道沙门氏菌的Vi多糖交叉反应的小鼠中产生抗体。
6.1材料和方法
(a)菌株、质粒和培养条件。
本实施例中描述的菌株和质粒列于表1中。质粒的构建在下文中描述。将大肠杆菌株在37℃在LB培养基(每升10g胰蛋白胨、5g酵母膏和5gNaCl)或LB琼脂(每升添加了15g琼脂的LB培养基)中培养。使伤寒沙门氏菌BRD948在37℃在补充了1％v/v Aro-mix(在10ml ddH2O中的40mg L-苯丙氨酸、40mg L-色氨酸、10mg 4-氨基苯甲酸和10mg 2,3-二羟基苯甲酸)和1％v/v Tyr-mix(在10ml ddH2O中的40mg L-酪氨酸二钠)的LB培养基中生长。如果适当，该培养基含有四环素(20μg ml-1)、壮观霉素(80μg ml-1)或氨苄西林(100μg ml-1)。
表1.本研究中使用的菌株和质粒。
*哥德堡大学微生物保藏中心(Culture Collection University of)，保藏人：瑞典哥德堡E.R.B.Moore教授
**Coligenetic Stock Center，耶鲁大学，美国康奈提格州纽黑文
(b)DNA操作
使用NucleoSpin Plasmid或NucleoBond Xtra Maxi Plus试剂盒(Macherey-Nagel)分离质粒DNA。使用NucleoSpin Tissue试剂盒(Macherey-Nagel)分离总染色体DNA。根据制造商说明使用限制酶(Fermentas)、虾碱性磷酸酶(Fermentas)、T4DNA连接酶(Fermentas)和Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzyme)。使用NucleoSpin Extract II试剂盒(Macherey-Nagel)，纯化PCR和限制片段用于克隆。所有DNA测序通过Synergene Biotech GmbH(瑞士)完成并且合成的寡核苷酸在MicrosynthAG(瑞士)订购。
(c)质粒构建
质粒1含有合成的寡核苷酸盒，其形成自退火连接入EcoRI-消化的PLAFR1中的5’-AATTGGCGCGCCCGGGACTAGTCTTGGG(SEQ ID NO.:1)和5’-AATTCCCAAGACTAGTCCCGGGCGCGCC(SEQ ID NO.:2)[Friedman,A.M.,Long,S.R.,Brown,S.E.,Buikema,W.J.,Ausubel,F.M.:Construction of a broad host range cosmid cloning vector and its use in thegenetic analysis of Rhizobium mutants(宽宿主范围粘粒克隆载体的构建及其在根瘤菌突变体的遗传分析中的用途).Gene 18(3),289-296(1982)]，由此引入独特的AscI和SpeI单个限制位点。使用引物5’-AAAGGCGCGCCGCGAAGGTAAAGTCAGCCG(SEQ ID NO.:3)和5’-AAAACTAGTCAGGAGTGAATTAAGTCATTG(SEQ ID NO.:4)，将大肠杆菌O121 O抗原簇由制备自大肠杆菌O121(CCUG 11422)的基因组DNA扩增。将该消化的PCR片段连接到AscI/SpeI消化的质粒1中，产生质粒2。质粒3通过如下构建：将形成自退火5’-TGAATGAATGAACTAGTTCAATCACTCA(SEQ ID NO.:5)和5’-TGAGTGATTGAACTAGTTCATTCATTCA(SEQ ID NO.:6)的合成寡核苷酸盒插入到单个限制位点PmlI中，中断wbqG的开放阅读框。
(d)LPS分析
收集相当于A600为1的过夜培养物的细胞，再悬浮在100μl的根据Laemmli的1x样品缓冲液[Laemmli,U.K.,Favre,M.:Maturation of the headof bacteriophage T4.I.DNA packaging events(噬菌体T4.I.DNA包装事件的头部的突变).J Mol Biol 80(4),575-599(1973)]并在95℃煮10分钟。加入蛋白酶K(Fermentas)至200μg/ml的最终浓度，并将样品在60℃温育1小时。根据制造商说明，使用来自Invitrogen的12％BisTris NuPAGE凝胶和MES运行缓冲液，通过SDS-PAGE分离来自蛋白酶K-消化的全细胞溶解产物的LPS分子物质。通过用银染色使LPS可视化[Tsai,C.M.,Frasch,C.E.:Asensitive silver stain for detecting lipopolysaccharides in polyacrylamide gels(用于检测聚酰胺凝胶中的脂多糖的灵敏银染色).Anal Biochem 119(1),115-119(1982)]。O抗原的免疫学性质使用标准方法通过蛋白质印迹分析。大肠杆菌O121 O抗原的结构与痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)类型7O抗原相同，因此抗-痢疾志贺氏菌类型7血清购自Reagensia AB(瑞典)并以1:100稀释液使用。抗-Vi多克隆抗体购自Murex Biotech Ltd(英格兰)并以1:100稀释液使用。
(e)十一异戊二烯焦磷酸(Und-PP)-连接的O抗原聚糖的分析
O抗原聚糖在大肠杆菌菌株SCM6中分析，该菌株在多个多糖基因簇中含有染色体缺失。O多糖通过用编码O抗原簇的质粒和wecA表达质粒(质粒4)转化SCM6细胞而表达。用空质粒转化的SCM6用作阴性对照以鉴别O抗原特异信号。菌株在摇瓶中培养过夜。收获相当于A600为400的细胞，用0.9％NaCl洗涤一次，并冻干。通过重复的多轮涡旋和冰上温育10分钟，用95％甲醇(MeOH)从干燥的细胞中提取脂质。通过添加ddH2O将该悬浮液转换成85％MeOH并在规则涡旋的同时再温育10分钟。在离心后，收集上清并且提取物在N2下干燥。将干燥的脂质溶解在含有10mM磷酸四丁铵(TBAP)的1:1甲醇/水(M/W)中并经过C18SepPak柱(WatersCorp.,Milford,MA)。该柱用10ml MeOH调节，接着用以1:1M/W的10ml10mM TBAP调节。在上样后，用1:1M/W的10ml 10mM TBAP洗涤该柱并用5ml MeOH接着用5ml 10:10:3氯仿/甲醇/水(C/M/W)洗脱。合并的洗脱流分在N2下干燥。
根据Glover等[Glover,K.J.,Weerapana,E.,Imperiali,B.:In vitroassembly of the undecaprenylpyrophosphate-linked heptasaccharide forprokaryotic N-linked glycosylation(用于原核N-连接的糖基化的十一异戊二烯焦磷酸-连接的七糖的体外组装).Proc Natl Acad Sci U S A 102(40),14255-14259(2005)]，通过将在2ml 1M三氟乙酸(TFA)中的干燥样品溶解在50％正丙醇中并加热至50℃达15分钟来水解脂质样品。水解的样品在N2下干燥，溶解在4ml 3:48:47C/M/W中并经过C18SepPak柱(Waters Corp.,Milford,MA)以从水解的聚糖分离脂质。该柱用10ml MeOH调节，接着用10ml 3:48:47C/M/W平衡。将样品上样至柱并收集流出物(flow-through)。用4ml 3:48:47C/M/W洗涤柱并且利用SpeedVac干燥合并的流出流分。
根据Bigge等[Bigge,J.C.,Patel,T.P.,Bruce,J.A.,Goulding,P.N.,Charles,S.M.,Parekh,R.B.:Nonselective and efficient fluorescent labeling of glycansusing 2-amino benzamide and anthranilic acid(聚糖使用2-氨基苯甲酰胺和邻氨基苯甲酸的非选择性和有效荧光标记).Analytical biochemistry 230(2),229-238(1995)]，用2-氨基苯甲酰胺(2AB)标记干燥的样品。使用如在Merry等[Merry,A.H.,Neville,D.C.,Royle,L.,Matthews,B.,Harvey,D.J.,Dwek,R.A.,Rudd,P.M.:Recovery of intact 2-aminobenzamide-labeledO-glycans released from glycoproteins by hydrazinolysis(通过肼解释放自糖蛋白的完整2-氨基苯甲酰胺-标记的O-聚糖的回收).Analytical biochemistry304(1),91-99(2002)]中描述的纸片法(paper disk method)，进行聚糖清理。根据Royle等[Royle,L.,Mattu,T.S.,Hart,E.,Langridge,J.I.,Merry,A.H.,Murphy,N.,Harvey,D.J.,Dwek,R.A.,Rudd,P.M.:An analytical and structuraldatabase provides a strategy for sequencing O-glycans from microgramquantities of glycoproteins(分析和结构数据库提供用于对来自微克量的糖蛋白的O-聚糖测序的策略).Analytical biochemistry 304(1),70-90(2002)]，但改变为三溶剂系统，使用GlycoSep N正相柱，通过HPLC进行2-AB标记的聚糖的分离。溶剂A：在80％乙腈中的10mM甲酸铵pH 4.4。溶剂B：在40％乙腈中的30mM甲酸铵pH 4.4。溶剂C：0.5％甲酸。柱温度为30℃并且2AB-标记的聚糖通过荧光检测(λex＝330nm,λem＝420nm)。梯度条件：在160分钟内100％A至100％B的线性梯度，流速为0.4ml min-1，接着2分钟100％B至100％C，在2分钟内恢复至100％A并以100％A在1ml min-1流速运行15分钟，然后恢复至0.4ml min-1达5分钟。将样品注入到ddH2O中。
为了鉴别O抗原特异性聚糖，从获自含有O抗原簇的细胞的痕迹减去来自带有空白质粒对照的细胞的2AB聚糖分布图。收集O抗原特异性峰并且2AB聚糖在MALDI SYNAPT HDMS Q-TOF系统(Waters Corp.,Milford,MA)上进行分析。将样品溶解在5:95乙腈/水中并用在80:20甲醇/水中的20mg ml-1DHB 1:1形成斑点。用PEG(准备好的混合溶液，Waters Corp.,Milford,MA)进行校准，用在60:40:0.1乙腈/水/三氟乙酸中的5mg ml-1α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA,Sigma-Aldrich,瑞士)1:3形成斑点。仪器装配有200Hz固态UV激光器。以正离子模式记录质谱。对于MSMS：激光能量在燃烧速率为200Hz下固定在240，碰撞气体为氩气。碰撞能量分布图用来根据m/z渐变碰撞能。合并的、减去背景的和平滑化的(Savitzsky Golay)谱图使用MassLynx v4.0软件(Waters Corp.,Milford,MA)集中。
(f)糖缀合物的生产和纯化
通过在大肠杆菌中表达寡糖基转移酶PglB、改造的受体蛋白EPA(绿脓假单胞菌的外毒素A)和生产十一异戊二烯焦磷酸(Und-PP)-连接的聚糖的基因簇来实现糖缀合物的生产。将PGVXN114(表达PglB)、PGVXN150(表达C-末端His6-标记的EPA)和质粒2(O121抗原簇)或质粒3(O121wbqG突变抗原)共转化入大肠杆菌菌株Clm24[Feldman,M.F.,Wacker,M.,Hernandez,M.,Hitchen,P.G.,Marolda,C.L.,Kowarik,M.,Morris,H.R.,Dell,A.,Valvano,M.A.,Aebi,M.:Engineering N-linked protein glycosylation withdiverse O antigen lipopolysaccharide structures in Escherichia coli.(在大肠杆菌中利用不同O抗原脂多糖结构改造N-连接的蛋白质糖基化)Proc NatlAcad Sci U S A 102(8),3016-3021(2005)]。在37℃将细胞在振荡培养箱(180rpm)中在补充有抗生素的LB培养基中进行培养。从未诱导的过夜培养物接种摇瓶表达培养物至A600为0.05。PglB和载体蛋白EPA的表达通过IPTG(1mM)和L-阿拉伯糖(0.02％w/v)在A600为0.4-0.6进行诱导。在第一次诱导后四小时，添加第二批L-阿拉伯糖(0.02％w/v)。在过夜温育后收获细胞(总诱导时间为19-22小时)。团粒用0.9％NaCl洗涤并以相当于A600为50的浓度悬浮在再悬浮缓冲液(25％蔗糖，10mM EDTA，200mMTris HCl pH 8.0)中。该细胞悬浮液在4℃在摇床上温育20分钟。在离心后，将细胞团粒再悬浮在相同体积的渗透冲击缓冲液(osmotic shock buffer)(10mM Tris HCl pH 8.0)中。该悬浮液在4℃在摇床上温育30分钟并以10,000g离心20分钟以除去球芽。收集含有周质蛋白的上清并且含有C-末端六组氨酸标签的重组EPA使用HisTrap粗制FF 1ml柱(GE Healthcare,瑞士)纯化。提取物用5x HT结合缓冲液(2.5M NaCl,150mM Tris HCl pH 8.0,50mM咪唑)稀释以优化结合条件并添加MgCl2至50mM的终浓度。过滤提取物并施加至用1x HT结合缓冲液平衡的HisTrap粗制FF柱。在加载后，柱用含有20mM咪唑的相同缓冲液洗涤以除去未结合的蛋白质。用HT洗脱缓冲液(含有0.5M咪唑的HT结合缓冲液)将蛋白质从柱洗脱。
随后，使用Resource Q 1ml柱(GE Healthcare,瑞士)将糖蛋白从未糖基化的EPA分离。汇合含有EPA的HisTrap洗脱馏分并用RQ结合缓冲液(20mM L-组氨酸,pH 6.0)稀释10x。将稀释的EPA样品施加至用RQ结合缓冲液平衡的阴离子交换柱。该柱用以25柱体积的0％至32.5％的RQ洗脱缓冲液((含有1M NaCl的RQ结合缓冲液)的线性梯度洗脱并且使用FPLC(Amersham Biosciences)收集0.5ml馏分。馏分通过SDS-PAGE分析并且蛋白质用考马斯蓝(Coomassie blue)染色。汇合含有糖蛋白的馏分，并且根据制造商说明，通过多个浓缩和稀释步骤，使用具有30kDa膜(Millipore)的Amicon Ultra-4离心滤器，将缓冲液交换为PBS。将最终纯化的蛋白质样品的浓度调节至1mg ml-1。
(g)大肠杆菌O121LPS的纯化
大肠杆菌O121(CCGU 11422)培养物的LPS如在其他地方描述的通过酚提取纯化[Apicella,M.A.:Isolation and characterization oflipopolysaccharides(脂多糖的分离和表征).Methods Mol Biol 431,3-13(2008)]。
(h)Vi多糖的纯化和用酪胺的修饰
Vi多糖通过如之前描述的改进的程序纯化自伤寒沙门氏菌BRD948[Demil,P.,D'Hondt,E.,Hoecke,C.V.:Salmonella typhi vaccinecompositions(伤寒沙门氏菌疫苗组合物).European Patent EP1107787(2003)]。简言之，将伤寒沙门氏菌BRD948在补充了Aro-和Tyr-mix的LB培养基中培养。在振荡培养箱(180rpm)中在37℃过夜温育后，将培养物加热至60℃达1小时并离心。Vi从具有0.1％溴化十六烷基三甲铵(CTAB,Sigma,H6269)的上清中沉淀。加入20g l-1硅藻土(celite)545(Sigma,20199-U)并将混合物在室温(RT)搅拌1小时以允许形成多糖-CTAB复合物，其吸附在硅藻土上。将该硅藻土倒入装配有玻璃料(frit)(SocochimS.A.)的适当尺寸的储罐(Extract-clean EV SPE Reservoir,Socochim S.A.)。通过具有10柱体积(CV)的0.05％CTAB、10CV的20％乙醇、50mM磷酸钠缓冲液pH 6.0和14CV的45％乙醇的梯度流连续地洗涤柱以去除吸附的杂质。Vi多糖最后用1.5CV的50％乙醇、0.4M NaCl洗脱。在洗脱后，通过添加乙醇至80％的终浓度并在室温温育20分钟使所述多糖沉淀。最后，通过在15000g离心20分钟收集沉淀的多糖，用80％乙醇洗涤两次，并冻干。
纯化的Vi多糖的蛋白质和核酸含量分别通过二辛可宁酸法(BCA)和UV光谱法确定。O-乙酰基含量利用乙酰胆碱作为标准进行测量[Hestrin,S.:The reaction of acetylcholine and other carboxylic acid derivatives withhydroxylamine,and its analytical application(乙酰胆碱和其他羧酸衍生物与羟胺的反应，及其分析应用).J Biol Chem 180(1),249-261(1949)]。
为了增大Vi与微滴定板的结合效率，将多糖酪胺化(Vi-Tyr)。将酪胺盐酸盐(30mg ml-1,Sigma)添加至10mg纯化的Vi中。加入100μl的0.5M N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺HCl(Sigma)并将混合物在pH4.9-5.1温育3小时。将反应混合物对于ddH2O进行透析。
(i)免疫研究
多组7只CB6F1雌性小鼠(6-8周龄)用于免疫实验。小鼠用20μg的具有Alum(Rehydragel LV-Aluminium Hydroxide,General Chemical)作为佐剂的糖缀合物或5μg的Vi多糖(Typhim Vi,Sanofi Pasteur MSD)免疫。在刚要免疫之前进行糖缀合物的辅佐。简言之，将纯化的糖缀合物用PBS稀释至200μg ml-1的终浓度，加入Alum(最终量为Al3+对应于0.6mg ml-1)，并将该溶液在室温温和地混合1小时。在第1、22和57天进行免疫。多组小鼠正常接受100μl剂量的疫苗，对应于20μg的缀合物(蛋白质)。在第二次免疫后10天和在最后一次免疫后10天收集血液样品。
(j)酶联免疫吸附测定(ELISA)
平底96孔微滴定板(Nunc immuno PolySorb)用50μl的5μg ml-1大肠杆菌O121LPS或5μg ml-1的酪胺化Vi(Vi-Tyr)涂覆，在PBS中稀释，在4℃过夜。倒掉涂覆溶液并将板在4000ml的洗涤缓冲液(1x PBS，具有0.05％Triton X 100)浸泡并剧烈搅拌。该清洗步骤进行至少4次。随后，该板通过颠倒放置在微板转子中并旋转进行干燥。此洗涤程序总是在另外的洗涤步骤中施加。每个孔完全用300μl的封闭缓冲液(1x PBS，具有2.5％BSA(无球蛋白的BSA,Sigma,A7030))填充并在板摇床上在室温温育2小时。在洗涤和干燥所述板后，将在稀释缓冲液(1x PBS，具有0.5％BSA)中的小鼠血清的稀释液加入到板(100μl)中并在板摇床上在室温温育1小时。为了检测总免疫球蛋白(Ig)，向每个孔中加入100μl的在稀释缓冲液中1:2000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗-小鼠Ig(Sigma)并将该板在板摇床上在室温温育1小时。在洗涤和干燥板之后，反应用100μl的Ultra TMB底物(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺液体底物，Pierce)显影15分钟并利用添加100μl的2M硫酸终止。在450nm测量光密度(OD)。
为了确定终点效价，根据[Frey,A.,Di Canzio,J.,Zurakowski,D.:Astatistically defined endpoint titer determination method for immunoassays(用于免疫测定的统计学定义终点效价确定方法).J Immunol Methods 221(1-2),35-41(1998]定义95％的置信度。作为阴性样品，使用一池免疫前血清。
6.2结果
(a)大肠杆菌O121wbqG突变体O多糖的分析
首先考察通过大肠杆菌O121wbqG突变体生产的O多糖是否将被对于伤寒沙门氏菌Vi荚膜多糖特异性的抗体识别。大肠杆菌O121 O抗原基因簇被克隆，并且wbqG的开放阅读框通过插入含有寡盒(oligocassette)的终止密码子中断。将克隆的质粒转化到大肠杆菌K-12菌株W3110中并且脂多糖(LPS)通过SDS-PAGE分析并用银染色，或在转移至硝基纤维素膜转化通过蛋白质印迹分析(图2A)。如之前报道的，wbqG基因的突变不会消除O抗原表达[King,J.D.,Vinogradov,E.,Tran,V.,Lam,J.S.:Biosynthesisof uronamide sugars in Pseudomonas aeruginosa O6and Escherichia coli O121O antigens(绿脓假单胞菌O6和大肠杆菌O121 O抗原中的糖醛酰胺糖的生物合成).Environ Microbiol 12(6),1531-1544(2010)]。然而，在银染色的聚丙烯酰胺凝胶中可视化的wbqG突变体的LPS分布图在以下方面与野生型不同：(i)含有聚合的O抗原的条带的染色相对于野生型LPS较弱，(ii)由连接至脂质A-核心的一个O抗原重复单元(核心+1RU)构成的条带更密实地染色和(iii)含有O抗原的带比野生型LPS的等同带更快速地移动。据估计，通过分析过曝光的银染色的SDS-PAGE凝胶，两个LPS分布图含有连接至脂质A-核心的平均12个O抗原重复单元。LPS的蛋白质印迹分析揭示，抗-O121血清与wbqG突变体O抗原反应。该wbqG突变体O多糖被抗-Vi血清识别。
为了确认表达的O抗原重复单元的结构和确定O-乙酰化的程度，从表达O121野生型或wbqG突变体O抗原的大肠杆菌SCM6提取糖脂。脂质连接的寡糖使用C18 SepPak柱纯化并用特异地释放Und-PP-连接的聚糖的弱酸处理。在同样使用C18 SepPak柱的额外纯化步骤之后，聚糖用2-氨基苯甲酰胺(2AB)标记，随后使用GlycoSep N柱通过正相HPLC拆分。图2B示出了色谱图的一部分，其中预期洗脱单个重复单元和短的聚合的O抗原。含有公认2AB-标记的聚糖物质的流分通过质谱法(MS)分析(图3)，并且通过MS鉴别的聚糖结构示于图2B。
由表达O121野生型O抗原的SCM6细胞制备的2AB-标记的聚糖的色谱图的特征在于在58.8分钟具有洗脱的峰。在该峰流分中，鉴别出质荷比(m/z)为1083的分子。保留时间为65.1分钟的峰流分主要含有m/z为1041的物质。该检测的m/z对应于2AB-标记的、非乙酰化的O121野生型亚基的单电荷钠加合物。两个检测的质量之间的差异对应于42 Da，其是O-乙酰基和羟基之间的质量差。这两种物质经过碰撞诱导解离(CID)MS-MS。获自m/z为1083的前体的系列单电荷片段离子(图3A)与来自2AB-标记的O121野生型O抗原重复单元的糖苷裂解产物一致(在残基c处含有O-乙酰基)。而m/z为1041的分子物质的CID MS-MS谱图对应于非乙酰化的2AB-标记的O121亚基(图3B)。
由表达wbqG突变体多糖的SCM6细胞制备的2AB-标记的聚糖的色谱图显示两个突出的峰。在保留时间为67.2分钟的峰流分中，检测到m/z为1084的分子。该检测到的质量与在58.8分钟洗脱的O121野生型痕迹的相应峰中测得的质量相差1Da。同样地，对于保留时间为73.5分钟的2AB-标记的分子测得m/z为1042。这些前体离子的CID MS-MS(图3C和图3D)导致类似于获自O121野生型2AB-标记的聚糖的谱图的碎片图。测得的1Da的质量差分配给聚糖结构的残基c。1Da的质量差对应于酸和酰胺基之间的计算的质量差，与wbqG突变体O抗原的公开结构一致[King,J.D.,Vinogradov,E.,Tran,V.,Lam,J.S.:Biosynthesis of uronamide sugars inPseudomonas aeruginosa O6and Escherichia coli O121 O antigens(绿脓假单胞菌O6和大肠杆菌O121 O抗原中的糖醛酰胺糖的生物合成).EnvironMicrobiol 12(6),1531-1544(2010)]。
聚合的2AB-标记的O抗原亚基在O121野生型痕迹中鉴别。分别在保留时间为83.1分钟、86.9分钟和90.6分钟的峰流分中鉴别出可变地O-乙酰化的两个亚基。双倍乙酰化的物质首先洗脱，接着单次乙酰化和非乙酰化形式。由于乙酰化和非乙酰化形式的分离，所以可以确定O-乙酰化的程度。在两个菌株中，大约50％的单个重复单元被O-乙酰化。
也在O121野生型痕迹(图2B)的一些峰中鉴别出肽聚糖单体的前体。肽聚糖前体也在十一异戊二烯焦磷酸上类似并且预期被纯化并用用于O抗原亚基的方法进行标记。
(b)糖缀合物的生产
确认了O121wbqG突变体的结构，并且显示与对于Vi抗原产生的抗体是交叉反应的。接着，确定wbqG突变体O多糖是否可以引出结合至Vi的抗体。制备糖缀合物用于免疫研究。通过在大肠杆菌K12衍生物CLM24表达细菌寡糖基转移酶PglB、改造的周质载体蛋白EPA(类毒素重组绿脓假单胞菌外毒素A)、和大肠杆菌O121野生型或wbqG突变体抗原来生产糖蛋白[Feldman,M.F.,Wacker,M.,Hernandez,M.,Hitchen,P.G.,Marolda,C.L.,Kowarik,M.,Morris,H.R.,Dell,A.,Valvano,M.A.,Aebi,M.:Engineering N-linked protein glycosylation with diverse O O antigenlipopolysaccharide structures in Escherichia coli.(在大肠杆菌中利用不同OO抗原脂多糖结构改造N-连接的蛋白质糖基化).Proc Natl Acad Sci U S A102(8),3016-3021(2005)]。菌株CLM24缺乏O抗原连接酶(WaaL)。因此，O抗原转移至脂质A-核心被阻断并且Und-PP-连接的O抗原底物在内膜的周质面处聚集，提供O抗原供体用于PglB-催化的转移至蛋白质受体内的特异天冬酰胺残基。另外，大肠杆菌K12衍生物缺乏功能性内源性O抗原基因簇[Liu,D.,Reeves,P.R.:Escherichia coli K12regains its O antigen(大肠杆菌K12复得其O抗原).Microbiology 140(Pt 1),49-57(1994)；Feldman,M.F.,Marolda,C.L.,Monteiro,M.A.,Perry,M.B.,Parodi,A.J.,Valvano,M.A.:Theactivity of a putative polyisoprenol-linked sugar translocase(Wzx)involved inEscherichia coli O antigen assembly is independent of the chemical structure ofthe O repeat(大肠杆菌O抗原组装中涉及的公认多萜醇-连接的糖转位酶(Wzx)的活性).J Biol Chem 274(49),35129-35138(1999)]。因此，质粒编码的O抗原基因簇可以在没有产生混合的O抗原群的情况下被表达。如其他地方所述的，EPA用作蛋白质受体，具有用于II型依赖性分泌至周质的N-末端信号序列，和用于通过亲和性色谱法纯化的C-末端六组氨酸标签[Ihssen,J.,Kowarik,M.,Dilettoso,S.,Tanner,C.,Wacker,M.,Thony-Meyer,L.:Production of glycoprotein vaccines in Escherichia coli(大肠杆菌中糖蛋白疫苗的生产).Microb Cell Fact 9,61(2010)]。EPA含有两个改造的N-糖基化位点。低拷贝质粒PGVXN114用于在IPTG诱导型tac启动子控制下的PglB的表达。
在诱导PglB和EPA后，新合成的糖蛋白通过镍亲和色谱法从周质提取物纯化。由于在糖缀合物中存在带负电荷的多糖，所以使用阴离子交换色谱法来分离糖基化形式与非糖基化形式。基于两种物质的分离，发现在表达O121野生型O多糖基因簇的培养物中，大约70％的总EPA被糖基化。糖基化效率在表达wbqG突变体O抗原的培养物中较低，而35％的总载体蛋白含有聚糖修饰。
纯化的糖缀合物通过SDS-PAGE分离并在转移至硝基纤维素膜后使用抗-EPA、抗-O121和抗-Vi抗体通过考马斯蓝染色或通过蛋白质印迹可视化(图4)。通过考马斯蓝染色，在纯化的O121多糖-EPA缀合物(O121-EPA))中检测到与未糖基化的EPA(70kDa)相同质量的带，其也被抗-EPA血清识别但不被抗-O121血清识别。因此，未糖基化的EPA在糖缀合物制备中被很大程度地去除。主要地，在100和130kDa之间成簇的一系列带通过考马斯蓝染色进行检测。这些带与抗-EPA血清反应，表明EPA的修饰形式。这些较大的多肽，但不是用痢疾志贺氏菌O1抗原修饰的EPA(O1-EPA)(描述于[Ihssen,J.,Kowarik,M.,Dilettoso,S.,Tanner,C.,Wacker,M.,Thony-Meyer,L.:Production of glycoprotein vaccines in Escherichia coli(大肠杆菌中糖蛋白疫苗的生产).Microb Cell Fact 9,61(2010)])也利用抗-O121特异性抗体检测，表明该载体被共表达的多糖修饰。用wbqG突变体O多糖羰基的EPA(O121wbqG-EPA)额外地用抗-Vi抗体染色。
如通过SDS-PAGE分析确定的，主要是单糖基化的EPA被纯化，即在两个改造的糖基化位点之一上用相应的O-多糖修饰的EPA。二糖基化的EPA的痕迹可以在纯化的O121wbqG-EPA样品中通过蛋白质印迹进行检测(图4)。EPA的二糖基化形式作为比130kDa稍大的第二微弱系列带运行。如在图2A中看到的，表达的O-抗原显示具有平均12个重复单元的模式链长度分布。假定纯化的糖缀合物由单糖基化的EPA构成，含有平均长度为12个重复单元的单个多糖链，则糖与蛋白质的重量比估计为0.15:1。
(c)糖缀合物在小鼠中的免疫原性和多糖特异性抗体应答的评价
接下来，评估在用缀合物疫苗免疫后的小鼠中引发的免疫应答。在小组的CB6F1小鼠中进行中间实验以确定纯化的糖缀合物的剂量范围和辅佐。这些建立了20μg的蛋白质(大约3μg的多糖)，结合Alum，是可再现地免疫原性的。随后，多组CB6F1小鼠(7只/组)在第1、22和57天用O121-EPA、O121wbqG-EPA或用5μg的纯化的Vi多糖(Typhim Vi,SanofiPasteur MSD)皮下地免疫。在第32和67天对小鼠进行采血并且测试血清是否存在抗-O121LPS和抗-Vi总免疫球蛋白(Ig)。到第67天，观察到在用任一缀合物免疫的14只动物中的13只中的血清Ig抗-O121LPS效价的显著升高(图5A)。在用O121wbqG-EPA免疫的一组小鼠中的一只动物未显示血清转化。感兴趣的是，同一动物在血清Ig抗-Vi效价方面显示出显著的升高(图5B)。如所预期的，用纯化的Vi多糖免疫的对照组未显示出可检测的抗-O121LPS应答，但在血清Ig抗-Vi效价方面有显著升高。
6.3讨论
本实施例描述了用于分析十一异戊二烯焦磷酸(Und-PP)-连接的聚糖的新方法。所描述的程序基于用来分析真核细胞的焦磷酸长醇Dol-PP)-连接的寡糖的方法。主要改进包括用于细菌糖脂的优化提取程序和在聚糖释放之前通过弱酸水解的纯化步骤。细菌Und-PP-连接的聚糖的纯化策略通过大量各种各样的在该脂质载体上组装的不同糖结构而进一步复杂化。用来分析Und-PP-连接的聚糖的具体亚类的恰当表达菌株的选择是关键。在本实施例中，分析了Und-PP-连接的O多糖。由于Und-PP-连接的O抗原代表LPS生物合成的中间物质，所以使用大肠杆菌菌株，缺乏O抗原连接酶(ΔwaaL)。因此，Und-PP-连接的O多糖不被转移至脂质A-核心，导致这种脂质中间体的积累。如果O抗原在waaL阳性菌株中表达，则不能鉴别出2AB-标记的O聚糖，这最可能是由于这种糖脂物质的快速周转(turnover)。此外，O抗原是具有高分子量的聚合的结构，使其对于通过质谱法的分析日渐困难。因此，选择含有在O抗原亚基的有效聚合中涉及的O抗原链长度调节子(wzz)基因中的突变的菌株背景。这导致主要产生单一重复单元和短聚合的O抗原，由此简化MS分析。多个其他多糖结构也在Und-PP上组装，如同肽聚糖前体、荚膜多糖和肠道细菌共同抗原(ECA)，这会使O聚糖物质的鉴别和表征复杂化。含有在所有主要多糖基因簇中的缺失的大肠杆菌菌株SCM6恰恰适合用于O抗原表达。
利用这种改进的方法，分析O121wbqG突变体O多糖。本实施例证实了由King等[King,J.D.,Vinogradov,E.,Tran,V.,Lam,J.S.:Biosynthesis ofuronamide sugars in Pseudomonas aeruginosa O6and Escherichia coli O121 Oantigens(绿脓假单胞菌O6和大肠杆菌O121 O抗原中的糖醛酰胺糖的生物合成).Environ Microbiol 12(6),1531-1544(2010)]公开的结构。此外，确定了重组表达的wbqG突变体O抗原结构含有O-乙酰化的N-乙酰基半乳糖胺糖醛酸，最可能地在C-3处修饰。因此，这种突变体O多糖含有在Vi多糖中也存在的结构基序。Vi多糖的O-乙酰基形成免疫优势表位并且Vi的免疫原性与O-乙酰化程度密切相关[Szu,S.C.,Bystricky,S.:Physical,chemical,antigenic,and immunologic characterization of polygalacturonan,its derivatives,and Vi antigen from Salmonella typhi(来自伤寒沙门氏菌的多聚半乳糖醛酸聚糖、其衍生物和Vi抗原的物理、化学、抗原和免疫表征).Methods Enzymol363,552-567(2003)；Szu,S.C.,Li,X.R.,Stone,A.L.,Robbins,J.B.:Relationbetween structure and immunologic properties of the Vi capsular polysaccharide(Vi荚膜多糖的结构和免疫性质之间的相关性).Infect Immun 59(12),4555-4561(1991)]。
本实施例首次显示出，wbqG突变体O多糖与抗Vi抗原产生的抗体是交叉反应性的。
类似地，在本实施例中制备了由大肠杆菌O121野生型或wbqG突变体O多糖和铜绿假单胞菌外毒素A构成的糖缀合物(O121-EPA/O121wbqG-EPA)。EPA已经被成功地用作伤寒缀合物疫苗中的免疫原性载体[Szu,S.C.,Taylor,D.N.,Trofa,A.C.,Clements,J.D.,Shiloach,J.,Sadoff,J.C.,Bryla,D.A.,Robbins,J.B.:Laboratory and preliminary clinicalcharacterization of Vi capsular polysaccharide-protein conjugate vaccines(Vi荚膜多糖-蛋白质缀合物疫苗的实验室和初步临床表征).Infect Immun 62(10),4440-4444(1994)]。用糖缀合物免疫的两组小鼠形成聚糖特异性抗体应答。用O121wbqG-EPA缀合物免疫的7只小鼠中的6只显示在血清免疫球蛋白(Ig)抗-O121LPS效价方面的显著升高，这表明不同于糖醛酰胺基团(uronamide group)的抗原决定簇对于诱导抗-O121LPS特异性免疫应答是重要的。用O121wbqG-EPA缀合物免疫的一只动物的抗体与大肠杆菌O121LPS不是反应性的，而与Vi多糖是反应性的。这表明这种动物形成了针对由残基b和c’构成的表位(其类似于Vi结构)的抗体应答。然而，该组的其他动物产生针对O121-LPS特异性表位的抗体，该表位最可能地是残基d，其含有突出的表面暴露侧基。O121聚糖结构的其他优化将在免疫后提高Vi特异性免疫应答。
表2.序列表
SEQ ID NO. 描述 序列
SEQ ID NO:1 合成的寡核苷酸 AATTGGCGCGCCCGGGACTAGTCTTGGG
SEQ ID NO:2 合成的寡核苷酸 AATTCCCAAGACTAGTCCCGGGCGCGCC
SEQ ID NO:3 合成的寡核苷酸 AAAGGCGCGCCGCGAAGGTAAAGTCAGCCG
SEQ ID NO:4 合成的寡核苷酸 AAAACTAGTCAGGAGTGAATTAAGTCATTG
SEQ ID NO:5 合成的寡核苷酸 TGAATGAATGAACTAGTTCAATCACTCA
SEQ ID NO:6 合成的寡核苷酸 TGAGTGATTGAACTAGTTCATTCATTCA
本文描述的实施方式意图仅是示例性的，并且本领域技术人员将认识到或者仅仅利用常规实验将能够确定本文描述的具体程序的大量等同替换。所有这样的等同替换认为是在本发明的范围内并且由所附权利要求所涵盖。
本文引述的所有参考文献(包括专利申请、专利和出版物)以其整体通过引用结合于此并且用于所有目的，其程度与每个单个出版物或专利或专利申请被具体且单个地指明以其整体通过引用结合于此用于所有目的的程度相同。

Claims (19)

1.一种生物缀合物，包含载体蛋白和修饰的大肠杆菌O121 O-抗原。
2.根据权利要求1所述的生物缀合物，其中，所述修饰的大肠杆菌O121O-抗原共价结合至所述载体蛋白的糖基化位点内的Asn，其中所述糖基化位点包含氨基酸序列Asp/Glu–X–Asn–Z–Ser/Thr，其中X和Z可以是除Pro之外的任何氨基酸。
3.根据权利要求2所述的生物缀合物，其中，所述糖基化位点已被重组改造并且在天然载体蛋白中不存在。
4.根据权利要求2所述的生物缀合物，其中，所述载体蛋白包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个糖基化位点，每个所述糖基化位点具有所述氨基酸序列Asp/Glu–X–Asn–Z–Ser/Thr，其中X和Z可以是除Pro之外的任何氨基酸。
5.根据权利要求1所述的生物缀合物，其中，所述载体蛋白选自由以下物质组成的组：铜绿假单胞菌的外毒素A、CRM197、白喉类毒素、破伤风类毒素、金黄色葡萄球菌的解毒溶血素A、聚集因子A、聚集因子B、大肠杆菌FimH、大肠杆菌FimHC、大肠杆菌不耐热肠毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素的解毒变体、霍乱毒素B亚基、霍乱毒素、霍乱毒素的解毒变体、大肠杆菌sat蛋白、大肠杆菌sat蛋白的过客结构域、空肠弯曲杆菌AcrA、和空肠弯曲杆菌天然糖蛋白、脑膜炎奈瑟氏菌菌毛蛋白、NMB0088、亚硝酸还原酶(AniA)、肝素结合性抗原(NHBA)、因子H结合蛋白(fHBP)、粘附素NadA、Ag473、表面蛋白A(NapA)、肠道沙门氏菌的抗原。
6.根据权利要求1所述的生物缀合物，其中，所述修饰的大肠杆菌O121O-抗原包含：
→4)-α-D-GalNAcA-(l→4)-α-D-GalNAcA-(l→。
7.根据权利要求1所述的生物缀合物，其中，所述修饰的大肠杆菌O121O-抗原包含
8.根据权利要求1所述的生物缀合物，其中，所述修饰的大肠杆菌O121O-抗原包含：
9.根据权利要求1所述的生物缀合物，其中，所述修饰的大肠杆菌O121O-抗原包含：
10.一种免疫原性组合物，包含根据权利要求1至9中任一项所述的生物缀合物。
11.根据权利要求10所述的免疫原性组合物，其用于治疗或预防肠道沙门氏菌感染。
12.根据权利要求10所述的免疫原性组合物，其用于治疗或预防伤寒沙门氏菌感染。
13.一种治疗或预防受试者中肠道沙门氏菌感染的方法，其中，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求10所述的免疫原性组合物。
14.一种治疗或治疗受试者中伤寒沙门氏菌感染的方法，其中，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的权利要求10所述的免疫原性组合物。
15.一种用于产生生物缀合物的原核宿主生物，其中，所述原核宿主生物包含：
a.编码载体蛋白的异源核苷酸序列，所述载体蛋白包含至少一个糖基化位点，所述糖基化位点包含氨基酸序列Asp/Glu–X–Asn–Z–Ser/Thr，其中X和Z可以是除Pro之外的任何天然氨基酸；和
b.编码寡糖基转移酶的异源核苷酸序列；
其中，所述原核宿主生物被重组改造以产生修饰的大肠杆菌O121 O抗原，并且其中所述寡糖基转移酶将所述修饰的大肠杆菌O121 O抗原转移至所述糖基化位点的Asn。
16.根据权利要求15所述的原核宿主生物，其中，所述原核宿主生物是大肠杆菌。
17.根据权利要求15所述的原核宿主生物，其中，所述原核宿主生物是大肠杆菌菌株K12。
18.根据权利要求15所述的原核宿主生物，其中，所述寡糖基转移酶是空肠弯曲杆菌的PglB。
19.一种产生权利要求1的生物缀合物的方法，其中，所述方法包括：
a.培养权利要求15至18中任一项所述的原核宿主生物；和
b.分离所述生物缀合物。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107961370A (zh) * 2017-03-22 2018-04-27 武汉博沃生物科技有限公司 多价肺炎球菌缀合疫苗及其制备方法
CN110652585A (zh) * 2018-10-26 2020-01-07 武汉博沃生物科技有限公司 多糖-蛋白缀合物免疫制剂及其制备与应用
CN113646438A (zh) * 2019-01-11 2021-11-12 西北大学 在原核生物细胞裂解物中合成生物缀合物疫苗

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3167903B1 (en) 2013-01-17 2018-12-26 ARSANIS Biosciences GmbH Mdr e. coli specific antigen
KR20160062169A (ko) * 2013-10-11 2016-06-01 글리코박신 아게 숙주 세포 변형 방법
JP6276427B2 (ja) 2014-02-24 2018-02-07 グリコヴァキシン アーゲー 新規の多糖及びその使用
CA2945542C (en) * 2014-04-17 2024-03-05 Glycovaxyn Ag Modified host cells and uses thereof
AR104469A1 (es) 2014-08-08 2017-07-26 Glycovaxyn Ag Células huésped modificadas para su uso en producción de bioconjugados
TWI715617B (zh) 2015-08-24 2021-01-11 比利時商葛蘭素史密斯克藍生物品公司 對抗腸道外病原性大腸桿菌之免疫保護之方法及組合物
GB201610599D0 (en) 2016-06-17 2016-08-03 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic Composition
AR109621A1 (es) 2016-10-24 2018-12-26 Janssen Pharmaceuticals Inc Formulaciones de vacunas contra glucoconjugados de expec
GB201721576D0 (en) 2017-12-21 2018-02-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Hla antigens and glycoconjugates thereof
GB201721582D0 (en) 2017-12-21 2018-02-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa S aureus antigens and immunogenic compositions
CN113227125A (zh) 2018-12-12 2021-08-06 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 用于o-连接的糖基化的修饰的载体蛋白
AR118389A1 (es) 2019-03-18 2021-09-29 Janssen Pharmaceuticals Inc Métodos de producción de bioconjugados de polisacáridos de e. coli o-antígeno, sus composiciones y métodos de utilización
EA202192390A1 (ru) 2019-03-18 2021-12-03 Янссен Фармасьютикалз, Инк. Биоконъюгаты полисахаридных о-антигенов e.coli, способы их получения и способы их применения
EP3757217A1 (en) 2019-06-27 2020-12-30 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Methods for protein purification
EP3770269A1 (en) 2019-07-23 2021-01-27 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Quantification of bioconjugate glycosylation
EP3777884A1 (en) 2019-08-15 2021-02-17 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Immunogenic composition
WO2021259743A2 (en) 2020-06-25 2021-12-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine
CN115803087A (zh) 2020-09-17 2023-03-14 杨森制药公司 多价疫苗组合物及其用途
WO2023118033A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vaccine

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101072586A (zh) * 2004-09-21 2007-11-14 圣诺菲·帕斯图尔公司 多价脑膜炎球菌源性多糖－蛋白质缀合物及疫苗
CN101983070A (zh) * 2008-02-20 2011-03-02 格林考瓦因有限公司 由来源于原核细胞的重组n-糖基化蛋白制备生物共轭物

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
PT1107787E (pt) 1998-08-28 2003-07-31 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicoes de vacinas contra a salmonella typhi
EP2357184B1 (en) 2006-03-23 2015-02-25 Novartis AG Imidazoquinoxaline compounds as immunomodulators
EP2007765B1 (en) 2006-03-23 2012-06-27 Novartis AG Immunopotentiating compounds

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101072586A (zh) * 2004-09-21 2007-11-14 圣诺菲·帕斯图尔公司 多价脑膜炎球菌源性多糖－蛋白质缀合物及疫苗
CN101983070A (zh) * 2008-02-20 2011-03-02 格林考瓦因有限公司 由来源于原核细胞的重组n-糖基化蛋白制备生物共轭物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JERRY D. KING: "Biosynthesis of uronamide sugars in Pseudomonas aeruginosa O6 and Escherichia coli O121 O antigens", 《ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 *
张超凡 等: "大肠杆菌O121侵袭性菌株的发现与研究", 《微生物学报》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107961370A (zh) * 2017-03-22 2018-04-27 武汉博沃生物科技有限公司 多价肺炎球菌缀合疫苗及其制备方法
CN107961369A (zh) * 2017-03-22 2018-04-27 武汉博沃生物科技有限公司 多价脑膜炎球菌缀合疫苗及其制备方法
CN107961368A (zh) * 2017-03-22 2018-04-27 武汉博沃生物科技有限公司 人用流脑-肺炎球菌联合疫苗及其制备方法
CN107961370B (zh) * 2017-03-22 2020-08-11 武汉博沃生物科技有限公司 多价肺炎球菌缀合疫苗及其制备方法
CN107961369B (zh) * 2017-03-22 2020-08-11 武汉博沃生物科技有限公司 多价脑膜炎球菌缀合疫苗及其制备方法
CN107961368B (zh) * 2017-03-22 2020-09-08 武汉博沃生物科技有限公司 人用流脑-肺炎球菌联合疫苗及其制备方法
CN110652585A (zh) * 2018-10-26 2020-01-07 武汉博沃生物科技有限公司 多糖-蛋白缀合物免疫制剂及其制备与应用
CN110652585B (zh) * 2018-10-26 2023-05-26 武汉博沃生物科技有限公司 多糖-蛋白缀合物免疫制剂及其制备与应用
CN113646438A (zh) * 2019-01-11 2021-11-12 西北大学 在原核生物细胞裂解物中合成生物缀合物疫苗

Also Published As

Publication number Publication date
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