JP2004515450A - 敗血症処置のためのリポ多糖結合体ワクチン - Google Patents
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Abstract
本発明は、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍのプロテイナーゼ１に連結された、生物学的に脱アシル化されたグラム陰性細菌成分由来の多糖、およびその新規サブユニットを含む免疫原性複合体、ならびに、敗血症およびその他の感染性合併症を処置するために、ワクチンに、この複合体を作成および用いる方法を提供する。好ましくは、この免疫原性複合体は、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍのプロテイナーゼ１のグルコサミン残基に共有結合した、複数の、グラム陰性細菌由来の脱アシル化ＬＰＳ分子を含む。好ましくは、このＬＰＳ分子は、リピッドＡの脱脂グルコサミンの二糖類骨格を含む。
Description
【０００１】
本発明は、Ｓｍａｌｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ助成金番号１ Ｒ４３Ａ１４４５７８−０１の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
（発明の背景）
抗生物質治療および集中治療の顕著な改善にもかかわらず、敗血症およびその続発症、敗血症症候群または敗血症性ショック（集合的に、「敗血症」）は、入院患者における罹患率および死亡率の主な原因のままである。敗血症は、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌、真菌および他の病原性微生物によって誘発される。これらの生物は、損傷または感染の病巣で毒素を放出し、この毒素は次いで、サイトカインおよび他のメディエーターの放出を誘発する。感染が制御されない場合、内毒素および／または他の炎症メディエーターが循環中に進入し得、このことは、敗血症ならびに内皮損傷、低血圧および多器官不全をもたらす事象のカスケードを開始する。グラム陰性細菌は、多数のこのようなエピソードを担い、このようなエピソードは、高い死亡率と関連する。例えば、Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ，「Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｎａｔｉｏｎａｌ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｄｉｓｃｈａｒｇｅ ｓｕｒｖｅｙ ｒａｔｅｓ ｆｏｒ ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ Ｂ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ，１９７９−１９８７」，Ｍｏｒｂｉｄ．Ｍｏｒｔａｌ．Ｗｅｅｋｌｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ，３９，３１（１９９０）を参照のこと。グラム陰性細菌によって引き起こされた敗血症性ショックを発症した患者において、致命率は５０％以上に達し得る。Ｒ．Ｃ．Ｂｏｎｅら，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１７，６５３（１９８７）を参照のこと。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは、グラム陰性血液単離物の４０％〜５２％を占める主な原因生物のままである（Ｓ．Ｃｈａｍｂｅｒｌａｎｄら，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５，６１５（１９９２）；Ｂ．Ｅ．Ｋｒｅｇｅｒら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，６８，３３２（１９８０））。
【０００３】
リポ多糖（ＬＰＳ、内毒素）は、グラム陰性細菌の外膜の主成分であり、敗血症性ショックおよび死をもたらし得る、グラム陰性病原体による感染の間に観察される病原性効果の多くを担う（Ｅ．Ｔ．Ｒｉｅｔｓｃｈｅｌら，Ｓｃｉｅｎｔ．Ａｍｅｒ．，２６７，５４（１９９２）；ＦＡＳＥＢ Ｊ．，８，２１７（１９９４））。腸内細菌ＬＰＳは、３つのドメイン（すなわち、リピドＡ、コア領域およびＯ特異的鎖）からなり、そのうちリピドＡは、異なる病原性細菌間で構造的に最も保存されており、そしてＬＰＳの毒性素因を表す（Ｃ．Ａ．Ｈ．Ｒａｅｔｚ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，１２９（１９９０）；Ｅ．Ｔ．Ｒｅｉｔｓｃｈｅｌら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．，５，７５３（１９９１）；Ｃ．Ｇａｌａｎｏｓら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４８，１（１９８５））。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＬＰＳの構造を図１に示す（Ｇａｌａｎｏｓら（１９８５）から）。ＬＰＳによって発揮される毒性効果は、細菌の生存率とは独立しており、そして抗生物質に対する病原性細菌の耐性を増大させることを考慮すると、敗血症についての代替処置ストラテジーについての探索は主な重要性である。
【０００４】
敗血症の免疫治療についての最も有望なアプローチの１つは、ＬＰＳの保存領域（すなわち、リピドＡおよびコア領域）に対する抗体を用いた受動免疫である。このような抗体は、異なるグラム陰性病原体と交差反応性であり、それゆえ、交差防御性であり得ると期待される。細菌ＬＰＳに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を用いた受動免疫は、敗血症の動物モデルにおいて防御効果を示した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５由来の部分的に無毒化されたＬＰＳが、ラットにおけるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染に対する受動防御を提供されたウサギにおいてポリクローナル抗体を惹起し得ることが示された（Ａ．Ｋ．Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７０，６２２（１９９４））。同様に、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５に対するモノクローナル抗体が、マウスにおける異種細菌チャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に対する受動免疫防御を提供し得ることが示された（Ｍ．Ｐ．Ｓｃｈｕｔｚｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２，２６３５（１９８９））。Ｆ．Ｅ．ＤｉＰａｄｏｖａら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６１，３８６９（１９９３）；Ｊ．Ｄ．Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒら，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．１８７，４６４（１９９３）もまた参照のこと。しかし、防御は一般に、敗血症の病理が始まる前に抗体（Ａｂ）が投与されることを必要とする。このことは、受動免疫が、予防的防御を提供する可能性を有するが、治療効力を提供する可能性は有さないことを示す。
【０００５】
予防的防御は、受動免疫よりもむしろ、能動免疫またはワクチン接種によって最もよく提供される。防御抗体の誘導は、適切に改変された形態で提示されるＬＰＳでの免疫によって、またはＬＰＳ生合成が欠損した変異細菌（ラフ型変異体（ｒｏｕｇｈ ｍｕｔａｎｔ））を介して、潜在的に達成され得る（Ｃ．Ｇａｌａｎｏｓら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１，２３０（１９７２）；Ｓ．Ｃ．Ｂｒｕｉｎｓら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，１７，１６（１９７７））。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｊ−５（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４のラフ型変異体）は、３０年より長い間、ＬＰＳに対する広範に交差反応性でかつ交差防御性の抗体を誘導する試みにおいて、免疫学的研究の大多数において用いられている。実際、熱殺傷Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５細胞でのマウスの免疫は、ｂ型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅでのマウスのチャレンジに対して能動免疫防御を惹起し得る（Ｍ．Ｉ．Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，６９，７４２（１９８２））。Ｊ．Ｂ．Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６３，７６９（１９９１）もまた参照のこと。精製した無毒化Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＬＰＳの多重感染は、交差防御性抗ＬＰＳ Ａｂを惹起する抗原としても機能し得る。Ａ．Ｋ．Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７３，１１５７（１９９６）は、非共有結合性ワクチンを、部分的に無毒化したＪ５ ＬＰＳおよびＢ群Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質を用いて調製した。
【０００６】
しかし、敗血症に対する安全かつ有効なワクチンの開発は、多くの種類の細菌に対する交差防御性抗体を惹起し得る非毒性ＬＰＳ抗原の調製に関連した問題によって妨害されている。図１に示すように、ＬＰＳのジグルコサミン部分は、エステル連結ホスフェート、エステルおよびアミド連結脂肪酸、およびグリコシド性アリル（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃａｌｌｙ）連結多糖で置換されている（Ｃ．Ｒ．Ｒａｅｔｚ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，１２９（１９９０））。ＬＰＳ分子の非脂質部分は、有益な抗体を惹起することに関与し得るエピトープを含む；そして、脂質（または脂肪酸）置換基は、ＬＰＳ毒性の決定基を含む（Ｃ．Ｇａｌａｎｏｓら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４８，１（１９８５）；Ｔ．Ｒｅｉｔｓｃｈｅｌら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒ．，５，７５３（１９９１））。従って、ＬＰＳを無毒化するために、他のエピトープの損失を最小限にしながら、脂肪酸を加水分解的に除去する試みが行われている。１つのアプローチは、エステル連結脂肪酸をジグルコサミン骨格から遊離させるマイルドなアルカリ加水分解を使用する。この方法を用いる問題は、この方法は、アミド連結した脂肪酸を遊離させず、それゆえ、完全な無毒化を提供しないことである。この処理をＥ．ｃｏｌｉ Ｊ５由来のＬＰＳに適用した場合、ＬＰＳの部分的脱アシル化は、ＬＰＳ発熱性を約１００倍減少させた（Ａ．Ｋ．Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７０，６２２（１９９４））。しかし、部分的に脱アシル化された生成物は、防御抗体を惹起するために必要とされる用量よりも少ない用量で、発熱活性を依然として示した。
【０００７】
ＬＰＳの無毒化のための他のアプローチは、マイルドな酸性加水分解を使用する。このアプローチは、毒性のより大きな弱毒化を提供するが、多糖エピトープのより広範囲の破壊を引き起こす。この処理は、ＬＰＳの内部コアとリピドＡジグルコサミン骨格との間のグリコシド結合を切断する（Ｓ．Ｊ．Ｃｒｙｚら（米国特許第５，３７０，８７２号）；Ｒ．Ｋ．Ｇｕｐｔａら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６３，２８０５（１９９５）；Ｃ．Ｇａｌａｎｏｓら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４８，１（１９８５））。加水分解後、多糖画分は、抗原として使用するために収集され、そして脂肪酸およびホスフェートが連結したジグルコサミンは廃棄される。この方法の問題は、酸性加水分解が、ジグルコサミンに会合したエピトープを除去し、そしてまた、ＬＰＳ多糖の構造を部分的に改変することである。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＬＰＳの場合、マイルドな酸性加水分解処理は、ネイティブなＬＰＳの多糖コアに存在することが公知の糖基およびホスフェート基の両方を失った多糖抗原を生成し得る。従って、ジグルコサミン骨格が存在しないことに加えて、無毒化ＬＰＳ多糖は、エタノールアミンホスフェートおよび非還元末端の３−デオキシ−マンノ−オクト−２−ウロソン酸（ＫＤＯ）残基が枯渇している（Ｓ．Ｍｕｌｌｅｒ−Ｌｏｅｎｎｉｅｓら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６０，２３５（１９９９））。
【０００８】
無毒化ＬＰＳに基づくワクチンの調製はまた、ＬＰＳ抗原について適切なキャリアタンパク質の調製に関連した問題によって妨害されている。ＬＰＳ多糖はヘルパーＴ細胞を活性化するエピトープを有さず、そしてキャリアを伴わないと、高力価の長期存続抗体を惹起するために必要とされる免疫記憶を誘導しないので、キャリアタンパク質が必要とされる（Ｊ．Ｂ．Ｒｏｂｂｉｎｓら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６１，８２１（１９９０））。「トキソイド」といわれる、破傷風毒素またはトキシンＡのような無毒化細菌毒素は、多糖抗原についてのキャリアとして用いられている。キャリアタンパク質に共有結合した場合、無毒化ＬＰＳ多糖は、ハプテンとして作用し、そしてキャリアのいくつかの免疫原性特性がこの連結した多糖に付与される。特に、キャリア中のＴ細胞エピトープは、連結した多糖ハプテンに対する免疫記憶応答を誘導し得る。
【０００９】
トキソイドキャリアの使用における制限は、トキソイドが、ハプテンのキャリア特異的エピトープ抑制を引き起こし得ることである。実験動物においては、この現象は、動物をトキソイド−ハプテン結合体でワクチン接種する前に動物をトキソイドに対して免疫した場合に生じる（Ｃ．Ｂｅｒｑｕｉｓｔら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６５，１５７９（１９９７）；Ｌ．Ａ．Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ，２８５，６６４（１９８０）；Ｍ．Ｐ．Ｓｃｈｕｔｚｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５，２３１９（１９８５））。トキソイドに対する獲得免疫がまた、キャリア特異的エピトープ抑制をヒトにおいて引き起こし得る証拠が存在する（Ｄ．ＤｉＪｏｈｎら，Ｌａｎｃｅｔ，２，１４１５（１９８９））。成人は、暴露の可能性の増加に起因して、トキソイドに対する免疫を有する可能性が若い子供よりも高い。この観察は、トキソイド−多糖結合体ワクチンが、若い子供においてよりも成人において、より効力が低いという予測をもたらす。
【００１０】
それゆえ、グラム陰性敗血症に感受性である哺乳動物においてグラム陰性敗血症に対する防御を提供し得る免疫原性結合体についての継続した必要性が存在する。
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍプロテイナーゼ１の分子のグルコサミン残基に共有結合した複数の脱脂グラム陰性細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）分子を含む免疫原性結合体を提供し、この結合体は、キャリア分子として機能する。本発明の結合体は好ましくは、各脱脂ＬＰＳ部分をプロテイナーゼ１のグルコサミン残基へと共有結合する二官能性連結分子（すなわち「リンカー」）をさらに含む。本発明の結合体は、グラム陰性細菌によって引き起こされる感染または敗血症（全身性炎症応答および敗血症性ショックを含めて、その病原的結果を含む）を処置（予防または減弱）するために、ワクチンとして使用されて、感受性哺乳動物または感染した哺乳動物（例えば、ヒト）を、この感染または敗血症に対して能動的に免疫し得る。
【００１２】
好ましくは、リンカーを、ＬＰＳおよびプロテイナーゼ１分子の両方においてグルコサミン残基に導入されたアルデヒドまたはアセタール部分と反応させる。例えば、リンカー上のアミン部分および／またはヒドラジノ部分は、Ｓｃｈｉｆｆ塩基反応を介して、アルデヒド部分またはアセタール部分と反応し得、続いて還元されて、安定なＣＨ２−ＮＨ結合を生じ得る。従って、本発明の結合体を作製するために用いられる方法および中間体もまた本発明の局面である。
【００１３】
脱アシル化ＬＰＳ分子は、グラム陰性細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｊ５株））から調製され得、そして本明細書中以下では、多糖抗原または「ＰＳ」抗原といわれる。ＰＳ抗原は、得られるＰＳ抗原上のリピドＡジグルコサミン骨格もしくはコア成分（例えば、ジホスホリルエタノールアミン（−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＯＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２）またはＫＤＯ部分）も失うことなく、従って、高レベルの抗原性を保持して、脂肪酸のアミド結合およびエステル結合を切断することによって細菌性ＬＰＳが脱脂される条件下でグラム陰性細菌上で粘菌Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍを増殖させることによって入手され得る。この生物変換を達成する好ましい発酵条件は、最少塩培地（例えば、脱イオン水中に約１ｍＭ〜１０ｍＭのＭｇＣｌ２および約５ｍＭ〜５０ｍＭのＫＣｌを含む培地）中のグラム陰性細菌上でＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍを増殖させることを含む。好ましいＰＳ抗原は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＬＰＳから得られた脱脂したＬＰＳである。Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ培養物によって生成されるこのＰＳ抗原の構造を図２に示す。
【００１４】
この物質は、ホスホロモノエステラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｍｏｎｏｅｓｔｅｒａｓｅ）によって処理されて、１’−ホスフェート基を切断して、アセタール（またはＣＨＯ）基を生成し得、この基はさらに改変され得るかまたはリンカー上の官能基と反応し得る。それゆえ、脱脂したＰＳ抗原および加水分解したＰＳ抗原は両方とも、本発明の実施形態である。
【００１５】
さらなる実施形態では、本発明は、細菌細胞由来のＬＰＳを無毒化するための生物学的方法を提供する。特に、Ｅ．ｃｏｌｉのＪ５株から無毒化ＬＰＳを単離するために生物学的方法が提供される。この具体化方法は、細菌細胞をＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍの培養物についての食物供給源としての使用に適切にするような方法で細菌細胞が調製されることを必要とする。この方法はまた、細菌細胞中のＬＰＳが、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞によって生成される酵素によって脱アシル化され得る形態のリピドＡを含むことを必要とする。これらの条件が満たされれば、具体化方法を用いて無毒化ＬＰＳ抗原を、いくつかの異なる種類のグラム陰性細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｅａｃｅａｅ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅおよびＶｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ科の細菌、ならびにヒトの組織および器官における炎症および／または感染を引き起こす雑多な属のグラム陰性細菌を含めて、野生型または変異株のいずれかの医学的に関連した細菌を含む）から単離し得ることを期待することは妥当である。
【００１６】
ＰＳ抗原のための新規キャリア分子は、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍプロテイナーゼ１の誘導体である。本発明のさらなる局面は、このキャリア分子を調製するための方法を提供することである。プロテイナーゼ１は、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ培養物の細胞画分から単離され得る。ＰＳ抗原分子は、ＰＳ抗原の直接的または間接的な結合を可能にするように改変された、キャリア分子中のリン酸化糖基に連結される。このリン酸化糖部分は、プロテイナーゼ１中の主なＢ細胞エピトープであると考えられ、そしてＰＳ抗原の結合体化は、キャリア上のＴｈ細胞エピトープを保存しながら、これらのエピトープを本質的に除去する。ＰＳ抗原によるキャリアＢ細胞エピトープの置換は、キャリアエピトープがＰＳエピトープに対する免疫応答のエピトープ抑制を引き起こすのを阻害すると期待される。この結合体化方法は、本発明のさらなる局面であり、キャリアがインビボでの防御抗ＰＳ抗体の生成を増幅し、次いでこの抗体がＬＰＳが敗血症および敗血症性ショックの病理を引き起こすのをブロックする能力を最適化する。
【００１７】
別の局面では、本発明は、結合体ワクチンのような免疫原性分子において有用な部分および抗原性ハプテンのためのキャリア分子として使用するためのＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍプロテイナーゼ１誘導体を提供する。プロテイナーゼ１誘導体は、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍプロテイナーゼ１の、または類似のリン酸化グルコサミンを含む他のタンパク質（例えば、類似の構造のプロテイナーゼ）の、リン酸化されたグルコサミン部分の３，４−ジオール部分の酸化的切断によって調製された複数のアルデヒド部分を含む。このようなキャリア分子は、本明細書中以下の実施例に記載のようにＥ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＰＳ抗原とともに用いられ得るか、あるいは他の無毒化細菌性ＬＰＳ部分または他のネイティブハプテンもしくは合成ハプテンに対して結合体化され得る。例えば、本発明の方法を用いて、ハプテンが、感染性疾患のワクチン、癌ワクチン、アトピー性疾患についてのワクチンまたは自己免疫疾患についてのワクチンのための防御多糖またはペプチドエピトープを表す結合体ワクチンを調製し得る。
【００１８】
トキソイドまたは他のキャリアタンパク質、ならびに本発明のキャリア分子およびＰＳ抗原と組み合わされ得る他のＰＳ抗原およびハプテンを含む結合体ワクチンはそれぞれ、例えば、Ｃ．Ｊ．Ｃｒｙｚら（米国特許第４，７７１，１２７号および同第５，３７０，８７０号）、Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎら（米国特許第５，４４５，８１９号）およびＰａｒｒｏ（米国特許第５，３０６，４９２号）に開示される。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
（ＬＰＳ多糖抗原）
抗原用途のためにＬＰＳを無毒化する伝統的な方法は、非特異的な酸触媒加水分解プロセスまたは塩基触媒加水分解プロセスを用いて、脂肪酸をＬＰＳ多糖抗原から除去し、これらのプロセスは、本明細書中で上記で考察したように、多糖エピトープの所望でない改変を引き起こす。対照的に、本発明の生物学的無毒化プロセスは、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞によって生成される酵素に頼って、脂肪酸をＬＰＳへと連結するアミド結合およびエステル結合を加水分解する。これらの酵素的改変は非常に特異的であるので、この生物学的処理は、防御抗体を惹起するために必要とされる非毒性エピトープを保持しながら、毒性成分を選択的に除去する。従って、ＬＰＳ無毒化の生物学的方法は、化学的無毒化プロセスとは異なり、ジグルコサミン、非還元末端のＫＤＯ、またはエタノールアミンピロリン酸基のいずれかをＬＰＳの多糖へと連結する共有結合を加水分解することなく、ＬＰＳを完全に脱アシル化する。
【００２０】
本発明の方法は、本発明の方法を例示するためにＥ．ｃｏｌｉ Ｊ５をＰＳ抗原の供給源として用いる。本明細書中上記で考察したように、この生物由来のネイティブなＬＰＳは、いくつかの他種のグラム陰性細菌由来のＬＰＳと交差反応性の抗体を惹起し得る。Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞によるＥ．ｃｏｌｉ Ｊ５の生物学的処理を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＬＰＳを無毒化するための手段として用いた。なぜなら、以前の研究によって、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞が脱アシル化ＬＰＳ誘導体を細菌性異化の最終生成物として天然で生成することが示されたからである（Ｄ．Ｍａｌｃｈｏｗら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２，４６９（１９６７）；７，２３９（１９６９））。これらの研究はまた、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞がエステル連結脂肪酸およびアミド連結脂肪酸をＬＰＳのリピドＡ部分から代謝的に除去するが、ＬＰＳの多糖部分におけるグリコシド結合を加水分解しないことを示唆した。さらに、これらの研究は、ネイティブなＬＰＳに対して惹起された抗体が、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍによって生成されるいくつかのＬＰＳ異化代謝産物を認識することを示した。しかし、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍがＥ．ｃｏｌｉのＪ５株を代謝し得ることは公知ではなかった。また、本発明より前には、その構造がどのようなものであろうとも、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍによって生成される形態の脱アシル化ＬＰＳが、抗体を惹起する免疫原性エピトープとしての活性を有し、次いでこの抗体がネイティブな形態のＬＰＳを認識し得ることは公知でなかった。さらに、本発明よりも前には、先行技術は、脱アシル化Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＬＰＳをＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ培養物から単離するための方法を提供しなかった。
【００２１】
従って、本発明は、細菌性ＬＰＳをワクチン抗原として有用である形態で生物学的に抽出および無毒化するための、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍのような細胞性粘菌の最初に報告された用途を表す。無毒化ＬＰＳ抗原を生成するための具体化生物学的方法は、ＬＰＳワクチン抗原を調製するために以前に用いられた化学的プロセスよりも経済的かつ有効である。以前の単離方法とは異なり、新たな生物学的方法は、ＬＰＳを抽出するために毒性の溶媒を必要としない。さらに、新たなプロセスは、ＬＰＳを無毒化する前にＬＰＳを化学的に分画することを必要としない。その代わり、無毒化ＬＰＳ抗原は、食物供給源として細菌上で増殖させたＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞の培養物によって生成される水溶性の最終生成物として直接入手される。抗原は、選択的濾過プロセスによって、およびエタノール−水混合物中でのそれらのバリウム塩の分別沈澱によって、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ培養培地から容易に精製される。
【００２２】
本発明の無毒化方法によって、細菌を、液体培地中で培養し、収集し、そして塩化カリウムおよび塩化マグネシウムを含有する塩溶液で洗浄する。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５を、塩化マグネシウムおよび塩化カリウムの両方を含有する培地に添加した場合、細菌細胞は、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍによって容易に食作用される凝集物を形成した。細菌でＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍを培養するための具体的方法は、５ｍＭ〜５０ｍＭの塩化カリウムおよび１ｍＭ〜１０ｍＭの塩化マグネシウムを含有する、リン酸を含まない培地を使用する。これらの塩の最適濃度は、異なる細菌株をこの具体化方法に用いた場合、異なり得る。例えば、Ｅ ｃｏｌｉ Ｊ５については、塩化カリウムおよび塩化マグネシウムについての好ましい濃度は、それぞれ、１５ｍＭおよび５ｍＭである。
【００２３】
洗浄した細菌を同じ塩溶液中に懸濁し、そしてＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ胞子またはＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍアメーバを播種する。得られた懸濁物を、１５℃と２５℃との間の一定温度で攪拌およびエアレーションしながらインキュベートする。Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞の増殖および凝集を、培養サンプルの定期的な顕微鏡検査によって追跡する。
【００２４】
Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞が増殖を止めて集まって多細胞凝集物になるまで、培養を継続する。これらの条件が満たされた場合、培養物の攪拌およびエアレーションを中断し、そして凝集したＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞を培養培地から沈降（ｓｅｄｉｍｅｎｔ）させる。次いで、培養培地を沈降物から分離し、そして濾過して残りの細胞を除去する。次いで、培地濾液を、０．２〜０．５容量のエタノールと混合し、そして混合物に、水溶性のバリウム塩を補充する。バリウムイオンの添加によって、エタノール−培地混合物から沈澱（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）および沈降するバリウム−抗原錯体の形成が引き起こされる。
【００２５】
ＬＰＳ抗原をＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ培養培地から沈澱させるためのこの方法は新規である。以前の研究（Ｄ．Ｍａｌｃｈｏｗら，上記で引用）では、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ培養培地中のＬＰＳ誘導体は、遠心分離、エバポレーションおよび透析のプロセスを含む多段階法によって濃縮された。これらの方法は、ワクチン抗原として使用することが意図されたＬＰＳ誘導体を精製するためには望ましくない。第１に、遠心分離およびエバポレーションのプロセスは大規模で行うにはコストがかかるからであり；そして第２に、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５由来の脱アシル化ＬＰＳ抗原は、従来の透析膜を容易に透過するからである。
【００２６】
濾過された培養培地からＬＰＳ抗原を濃縮するための本発明の方法では、この培地は、１０％と５０％との間のエタノールおよび１ｍＭ〜１０ｍＭの間のバリウムイオンを含むように調整される。通常の水溶性バリウム塩（例えば、酢酸バリウムまたは塩化バリウム）は、バリウムイオンの供給源として使用される。代替的な二価カチオンでバリウムを置換することは、これらの方法の範囲内である。例えば、カルシウムイオンは、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ培養物において生成されたいくつかの種のＬＰＳ抗原を沈澱させるためにバリウムイオンよりも適切であり得る。
【００２７】
０℃〜１０℃の温度での少なくとも１０時間のインキュベーション後、沈降物を収集し、水中に懸濁し、そして酸で処理してバリウムイオンをＰＳ抗原から除去する。この処理後、ＰＳ抗原溶液を、適切な量の塩基（例えば、水酸化カリウム）の添加によって中和し、そして可溶化した抗原は、選択的濾過によって、および分別沈澱によって、種々の濃度のエタノールおよび種々の緩衝液を含有する溶液からさらに精製される。
【００２８】
本発明の方法によって入手される精製されたＰＳ抗原は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５由来のネイティブなＬＰＳの多糖部分について以前に決定された糖組成と類似した糖組成を有する（Ｓ．Ｍｕｌｌｅｒ−Ｌｏｅｎｎｉｅｓら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６０，２３５（１９９９））。精製された抗原調製物におけるＫＤＯ：ヘプトース：グルコサミン：グルコース：Ｎ−アセチルグルコサミンの比は、それぞれ、約２：３：２：１：１であった。リン−３１ ＮＭＲは、ホスフェートが、精製された抗原分子中に、ジホスホジエステル形態およびホスホモノエステル形態として生じることを示した。ＰＳ抗原の構造を図２に示す。
【００２９】
最終精製工程では、抗原は、ホスホモノエステラーゼで処理されて、１’−ホスフェートが各抗原分子中のジグルコサミン基から除去される。この処理は、各抗原分子中に１つのアルデヒド官能基またはアセタール官能基を生じ、この官能基は、キャリアタンパク質への直接的結合のためにさらに改変され得るか、または種々の（二）官能性連結分子と反応され得る。この加水分解反応を、図３の工程（１）に示す。
【００３０】
（リンカー分子）
分子中へのアルデヒドまたはケタールの導入後、これらの基を、二官能性リンカー（例えば、アジピン酸ジヒドラジド（ａｄｉｐｉｃ ｄｉｈｙｄｒａｚｉｄｅ；ＡＤＨ）と反応させ、続いて、Ｓｃｈｉｆｆ塩基の還元を行って、キャリアタンパク質へのＰＳ抗原分子のその後の結合体化のために用いられ得るリンカー基を取り込み得る。この反応を、図３の工程２に示す。この誘導体化反応では、抗原は、ｐＨ５で約１０％ ｖ／ｖの酢酸ナトリウムを含有するホルムアミドの溶液中で、または過剰のシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）を含有するｐＨ４〜６の間の緩衝水溶液中で、約２０℃〜４０℃で約２０時間インキュベートされる。続いて、水素化ホウ素ナトリウムを誘導体化反応液に添加して、抗原とＡＤＨとの間に形成されるヒドラジン結合の還元を増強し得る。これらの条件は、抗原中のアルデヒド基をＡＤＨ中のα−ヒドラジド基へと連結する共有結合的なヒドラジド結合を含む、抗原−ヒドラジド分子を形成する反応を支持する。この反応に関与するアルデヒド基は、各抗原分子の還元末端グルコサミンにおけるアノマー性炭素を表す。
【００３１】
他のリンカーが入手可能であり、そして２つのアルデヒド部分、２つのカルボン酸部分、またはそれらの混合物を連結するために用いられ得る。このようなリンカーとしては、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンジヒドラジド、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンジアミンもしくは（Ｃ１〜Ｃ６）アリーレンジアミン、ω−アミノアルカン酸（ａｍｉｎｏａｌｋａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、アルキレンジオールもしくはオキシアルケンジオールもしくはオキシアルケンジチオール、環状アミドおよび無水物などが挙げられる。例えば、米国特許第５，７３９，３１３号を参照のこと。
【００３２】
（キャリアタンパク質およびその改変）
ＰＳ抗原についての本発明のキャリア分子を調製するために、プロテイナーゼ１（リソソーム性システインプロテイナーゼ）を、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞から新規な方法によって精製した。以前に、プロテイナーゼ１は、２以上のクロマトグラフィー工程を用いる方法によって精製された（Ｇ．Ｌ．Ｇｕｓｔａｆｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４，１２４７１（１９７９）；Ｄ．Ｐ．Ｍｅｈｔａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１０８９７（１９９６）；Ｔ．Ｏｒｄら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３３９，６４（１９９７））。以前のこれらの方法は、本発明の方法における使用のためには不適切であった。なぜなら、これらの方法は、精製された酵素の回収率が低く、そしてクロマトグラフィー工程は、酵素の大規模生成には望ましくなかったからである。本発明のプロテイナーゼ１精製方法における新規の工程は、酵素を酢酸バリウムの存在下でエタノール水溶液から沈澱させる工程、および酵素を高濃度の硫酸アンモニウムの存在下で沈澱させる工程を含む。クロマトグラフィー分画をこれらの新規工程で置き換えることによって、精製された酵素を、以前に達成されたよりもはるかに高い収率でかつより大きな規模で製造することが可能である。
【００３３】
精製されたプロテイナーゼ１を、キャリアタンパク質としての使用に適切な形態に変換するために、このプロテイナーゼを、ｐＨ５とｐＨ６との間のｐＨに調整された緩衝水溶液中で過ヨウ素酸ナトリウムと反応させる。この反応混合物中の過ヨウ素酸塩の好ましい濃度は、５０ｍＭと１５０ｍＭとの間であり、そして好ましい反応温度は−２０℃と２０℃との間、好ましくは約０℃であり、そして所望の反応は、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスフェート（ＧｌｃＮＡｃＰ）残基中のジオール基の、ジアルデヒド基への酸化的変換である。
【００３４】
ＧｌｃＮＡｃＰ−セリン部分を含む他のタンパク質（例えば、同様のリソソーム性システインプロテイナーゼ）は、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍまたは他の粘菌（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍの他の種またはＰｏｌｙｓｐｈｏｎｄｙｌｉｕｍの種を含む）から入手され得ると考えられる。
【００３５】
本発明の実施は、プロテイナーゼ１を生成するために用いられるＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞を遺伝的に改変することによって増強され得る。例えば、遺伝的改変は、（１）より多量のプロテイナーゼ１を生成するＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ変異体、（２）精製することがより容易である、変更された形態のプロテイナーゼ１を生成するＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ変異体、または（３）より多数のＧｌｃＮＡｃＰ残基を含む、変更された形態のプロテイナーゼ１を生成するＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ変異体を提供し得る。これらの増強は、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞を、天然または改変形態のプロテイナーゼ１の合成をコードするＤＮＡでトランスフェクトすることによって達成され得る。組換えＤＮＡ技術は、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍの遺伝的改変における使用のために適合されており（Ｊｅｎｎｅら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．，１１１，６１（１９９８）；Ｍｏｒｅｎｏ−Ｂｕｅｎｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３４９，５２７（２０００）、およびＡｇａｒｗａｌら，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，６５，７３（１９９９））、そしてプロテイナーゼ１の製造またはプロテイナーゼ１のキャリア機能のいずれかを増強するためにＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍのゲノムを改変する方法の使用は、本発明の範囲内である。
【００３６】
（結合体化）
キャリアタンパク質（すなわち、酸化されたプロテイナーゼ）をＰＳ抗原−ヒドラジドに結合体化するために、酸化されたタンパク質を、脱塩し、緩衝水溶液（好ましくはｐＨ４とｐＨ７との間のｐＨ）中に懸濁し、そして約１０℃〜３０℃の温度で約２０時間〜３０時間、抗原−ヒドラジドと反応させる。次いで、得られる混合物を、過剰のシアノ水素化ホウ素ナトリウムで約２４時間〜７２時間、約０℃〜２０℃で処理する。図４に示すように、これらの条件は、キャリアタンパク質中のアルデヒド基とＰＳ抗原−ヒドラジド中のヒドラジド基との間で共有結合を生成する反応を支持する。いくつかの抗原を用いた場合、結合体化工程は、ＡＤＨが、酸化されたプロテアーゼと最初に反応し、次いで遊離ヒドラジノ基が抗原アルデヒドと反応するように逆転され得る。
【００３７】
結合体化反応が完了したら、結合体は、未結合の抗原から分離され、透析によって脱塩され、そして濾過滅菌される。無菌の結合体は、水溶液、凍結溶液または凍結乾燥生成物として貯蔵され得る。
【００３８】
（ワクチン処方物およびワクチン接種）
本発明のワクチンは代表的に、本発明のＰＳ抗原−キャリア結合体を薬学的に受容可能な処方物中に取り込むことによって形成される。この処方物は、薬学的に受容可能なアジュバント（例えば、オイル、界面活性剤、ミョウバン）、免疫促進剤（例えば、リン脂質、糖脂質、グリカン、グリコペプチド、またはリポペプチド）、および１以上の希釈剤（「賦形剤」）を含み得る。使用のために適切な希釈剤の例は、水、リン酸緩衝化生理食塩水、０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液、デキストロース、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、希エタノール、およびこれらの混合物である。薬学的に受容可能な投薬形態のワクチンは、液剤、乳剤、分散剤、錠剤またはカプセル剤として処方され得る。
【００３９】
ヒトでの使用については、ワクチンは好ましくは、通常、皮下注射経路または筋肉内注射経路を介して、非経口的に投与される。あるいは、これらは、腹腔内に、静脈内に、または吸入によって投与され得る。液剤または懸濁剤のような経口投薬形態もまた用いられ得る。一般に、本発明のワクチンは、１用量のワクチンが、０．１ｍｌと０．５ｍｌとの間の容量で投与され得るように処方されるが、経口的に与えられる場合、本発明のワクチンは、カプセル剤または錠剤の形態で投与され得る。ワクチン投薬量、個体に与えられる用量の数、およびワクチン接種スケジュールは、結合体中の抗原の抗原性および免疫原性、ならびに他の公知の薬学的考慮事項（例えば、個体の年齢および体重）に依存する。
【００４０】
本発明のワクチンは、敗血症および敗血症性ショックを発症する危険性の高いヒトに防御的利益を提供する。これらとしては、慢性疾患を有する、より高齢の患者、攻撃的化学療法または免疫抑制治療で処置されている患者、移植器官を受けている患者、および重篤な外傷性傷害の犠牲者が挙げられる。本発明のワクチンはまた、ヒトにおいて、病原性グラム陰性細菌を含む１種以上の感染に対する防御的利益を提供し得る。ワクチンを用いて得られる防御のレベルは、ワクチン接種された個体において生成される抗ＬＰＳ抗体の血液力価と相関し得る。投薬量はまた、ヒトにおいて安全および／または有効であることが見出されているトキソイド−ＰＳワクチンの投薬量から外挿され得る。例えば、米国特許第４，７７１，１２７号および同第５，３７０，８７２号を参照のこと。
【００４１】
本発明は、以下の詳細な実施例を参照してさらに記載され、ここで、比色アッセイおよびＨＰＬＣアッセイは、ＬＰＳ−多糖およびＰＳ抗原の化学的組成を評価するために用いられた。これらは、以下についてのアッセイを含んでいた：ホスフェート（Ｂ．Ｎ．Ａｍｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，８，１１５（１９６６））、グルコサミン（Ｒ．Ｌ．Ｓｍｉｔｈら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９８，４７８（１９７９））、Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｔ．Ａ．Ｇｏｏｄら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９，２５３（１９６４））、ＫＤＯおよびヘプトース（Ｍ．Ｓ．Ｏｓｂｏｒｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５０，４９９（１９６３））、グルコース（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，Ｋｉｔ ＃５１０−Ａ）（Ｅ．Ｒａａｂｏら，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１２，４０２（１９６０））およびアルデヒド官能基（Ｊ．Ｔ．Ｐａｒｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１８１，１４９（１９４９））。種々の精製工程を通じての多糖の回収は、フェノール−硫酸アッセイ（Ｇ．Ａｓｈｗｅｌｌら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，４２，６４８（１９６５））によってモニタリングされた。エタノールアミン、エタノールアミンホスフェートおよびジグルコサミンは、ＨＰＬＣによってモニタリングされた。プロテイナーゼ１の酵素活性は、Ｇ．Ｌ．Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ（上記に引用）によって以前に記載された通りに決定された。全ての遠心分離プロセスは、３６００×ｇで１５分間、５℃で行われた。核磁気共鳴分光法は、Ｖａｒｉａｎ Ｕｎｉｔｙ ４００ ＭＨＺ ＮＭＲ装置を用いて行われた。プロテイナーゼ１の分画のためのトリクロロ酢酸緩衝液（ＴＣＡＢ）は、ナトリウム塩として購入されたかまたは４Ｍの冷トリクロロ酢酸溶液を４Ｍの冷水酸化ナトリウムで１．５の最終ｐＨになるまで滴定することによって調製されたかのいずれかであった。全てのＴｒｉｃｉｎｅ緩衝液は、ｐＨ８で調製された。
【００４２】
（実施例１：Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞およびグラム陰性細菌からの粗脱アシル化ＬＰＳの生成）
（Ａ．材料）
酵母抽出物、トリプトン（ｔｒｙｐｔｏｎｅ）、デキストロースおよび寒天は、Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ製であった。他の全ての化学物質は、試薬等級であった。
【００４３】
（Ｂ．生物および増殖条件）
１．細胞株。Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍのＮＣ−４株（ＡＴＣＣ ２４６９７）およびＥ．ｃｏｌｉのＪ５株（ＡＴＣＣ ４３４７５）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手した。Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ ＮＣ−４胞子およびＥ．ｃｏｌｉ Ｊ５細胞のストックを、−８０℃で、それぞれ、３３％グリセロールおよび１５％グリセロール中で保存した。Ｐａ３は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＡＴＣＣ ３３３５４）から誘導されたラフ型ＬＰＳ変異体である。
【００４４】
２．処方箋。栄養ブロス（ＮＢ）：１０ｇ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、１０ｇデキストロース、１ｇ酵母抽出物、０．２４７ｇ（１ｍＭ）硫酸マグネシウム七水和物、０．３７８ｇ（２．７ｍＭ）第二リン酸ナトリウム、１．４４ｇ（１０．６ｍＭ）第一リン酸カリウム（脱イオン水で１リットルにする）。栄養寒天（ＮＡ）：１ＬのＮＢ＋１５ｇ寒天。栄養培地１（ＮＭ１）：１８ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．９）、２０ｇ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、３０ｇデキストロース、３ｇ酵母抽出物、０．０２５５ｇ（０．２３ｍＭ）ＣａＣｌ２、０．５ｇ（３．８ｍＭ）硫酸アンモニウム、０．４５ｇ（２ｍＭ）硫酸マグネシウム、０．０４２７ｇ（０．１８ｍＭ）クエン酸ナトリウム、０．０１２ｇ（０．０８ｍＭ） 硫酸鉄（ＩＩ）および１．０ｍｌ微量元素（脱イオン水で１リットルにする）。栄養培地２（ＮＭ）：酵母抽出物を含まないＮＭ１。マグネシウム培地（ＭｇＭ）：脱イオン水中の５ｍＭ塩化マグネシウムおよび１５ｍＭ塩化カリウム。
【００４５】
３．作業培養物。微生物を、各生成操作について新たに調製した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５の作業培養物については、ストック細胞を、無菌の栄養寒天プレートに画線し、そして３７℃にて３日間インキュベートした。Ｐａ３の作業培養物については、ストック細胞を、無菌のＴＳＡプレートに画線し、そして３７℃で２４時間〜４８時間インキュベートした。Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ胞子の作業培養物については、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５のストック細胞およびＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍのストック胞子を、無菌の栄養寒天プレートに広げ、そして２０℃で１週間インキュベートした。
【００４６】
４．種菌培養物。種細菌を、３リットルの無菌のＮＭ１に、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５またはＰａ３の作業培養物を接種し、そして１０時間〜１６時間、３７℃にてインキュベートすることによって調製した。得られた培養物中の細菌を遠心分離によって収集し、そして無菌のＭｇＭで洗浄した。Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍアメーバの種菌培養物を、１リットルのＭｇＭに１２ｇ（湿重量）の種細菌（２×１０８個のＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ胞子）を接種することによって調製し、そして培養物を、３０時間〜４０時間、２０℃にてインキュベートした。
【００４７】
５．Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５およびＰａ３飼料（ｆｅｅｄ）細菌：飼料細菌を、１５ＬのＮＭ２に６ｇの洗浄Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５またはＰａ３種細菌を接種し、そしてこの培養物が定常期に入るまで、攪拌、エアレーションおよびｐＨ制御しながら３７℃でこの培養物をインキュベートすることによって調製した。飼料細菌を遠心分離によって収集し、そして無菌のＭｇＭで洗浄した。代表的に、洗浄した細菌の湿重量の収量は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５について４００ｇ〜５００ｇの間、そしてＰａ３について２００ｇ〜４００ｇの間であった。これらの細菌を用いて、１５ＬのＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ培養物に給餌した。
【００４８】
６．培養条件。１５リットルの無菌のＭｇＭに、１２０ｇ〜１６０ｇ（湿重量）の洗浄した飼料細菌を補充し、１リットルのＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ種菌アメーバを接種し、そして攪拌およびエアレーションしながら２０℃でインキュベートした。本質的に全ての細菌が消費されたときに、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞を培養培地から分離し、２５ｍＭ塩化カリウムで洗浄し、そしてその後のプロテイナーゼ１を調製する際の使用のために、−８０℃で凍結して保存した。粗脱アシル化ＬＰＳを含有する培養培地を、多糖抗原を調製する際の使用のために別に収集した。
【００４９】
７．多糖抗原の単離。１５〜１７リットルの遠心分離した培養培地（粗脱アシル化ＬＰＳを含有する）を、ＺｅｔａＰｌｕｓ ６０ＳＰ薬学的等級の深層フィルターに通過させた。濾液に、０．５Ｍ Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液（２０ｍｌ／濾液１Ｌ）、１Ｍ酢酸バリウムまたは塩化バリウム（４ｍｌ／濾液１Ｌ）、９５％エタノール（３００ｍｌ／濾液１Ｌ）を補充し、そして４℃で１０時間〜２０時間インキュベートした。工程２からのインキュベーション混合物を遠心分離した；ペレットを４００ｍｌの脱イオン水に懸濁し、そして硫酸の添加によってｐＨ３にした。酸性化した懸濁物のｐＨを、水酸化カリウムの添加によってｐＨ８になるように再度調整した。この懸濁物を遠心分離し、そして硫酸バリウムペレットを棄てた。
【００５０】
上清を１０ｍＭ ＥＤＴＡにし、等容量の９５％エタノールと混合し、そして得られた混合物を−２０℃で３０分間インキュベートする。沈澱した多糖抗原を遠心分離によって収集した。ペレットを１５０ｍｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中に溶解し、等容量の９５％エタノールと混合し、そして−２０℃で３０分間インキュベートさせた。沈澱した多糖抗原を遠心分離によって再度回収した。
【００５１】
ペレットを、３０ｍｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解し、そして３０ｐｓｉの圧力下で攪拌セル中で５，０００分子量カットオフのフィルターに通過させた。次いで、このフィルターを、さらに３０ｍｌ〜５０ｍｌの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を通過させることによって洗浄した。この洗浄液を最初の濾液に添加し、２容量の９５％エタノールと混合し、そして−２０℃で１０時間〜２０時間インキュベートした。沈澱した多糖抗原を遠心分離によって収集した。ペレットを１０ｍｌ〜１５ｍｌの脱イオン水に溶解し、１５０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ（ｐＨ８．０）にし、２容量の９５％エタノールと混合し、そして−２０℃で１時間〜２０時間インキュベートした。沈澱した多糖抗原を遠心分離によって収集した。
【００５２】
精製した抗原を、脱イオン水に約１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌで再度溶解し、そしてアルカリホスファターゼで５６℃で１時間〜２時間消化して残りのホスフェートをジグルコサミン骨格の還元末端から除去した。ホスフェート遊離の完了を、標準的な比色アッセイを用いてアルデヒド対ＫＤＯ比をモニタリングすることによって確認した。
【００５３】
ホスファターゼ処理ＰＳ抗原を、５，０００分子量カットオフのフィルターを通した濾過によってアルカリホスファターゼから分離した。最初の濾液およびその後の洗浄液を上記のようにプールしておき、そして１５０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ（ｐＨ８．０）にした。２容量の９５％エタノールを、このプールした濾液に添加し、そして混合物を−２０℃で２時間〜２４時間インキュベートした。沈澱したホスファターゼ処理ＰＳ抗原を遠心分離によって収集した。精製した加水分解ＰＳ抗原を脱イオン水中に再懸濁し、所望の数の血清バイアル中に分散させ、シェル凍結（ｓｈｅｌｌ ｆｒｏｚｏｎ）し、凍結乾燥し、キャップし、そしてＰＳ抗原ヒドラジドを作製するために用いるまで貯蔵した。
【００５４】
（実施例２）
（Ａ．抗原ヒドラジドの調製（方法Ｉ））
アジピン酸ジヒドラジド（２．４８ｇ）を６３．９ｍｌのホルムアミドに溶解して溶液１を得た。精製したホスファターゼ処理ＰＳ抗原（２８０ｍｇ）（「ＰＳ抗原アルデヒド」）を７．１ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）中に溶解して、溶液２を得た。溶液１と溶液２とを合わせ、１．３４ｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを補充して溶液３を得た。
【００５５】
溶液３を氷酢酸の添加によってｐＨ７．５にし、そして室温で２０時間インキュベートした。このインキュベーション期間の最初の１２時間の間、溶液のｐＨを、氷酢酸の定期的な添加によってほぼｐＨ７．５に維持した。
【００５６】
インキュベーション後、溶液に７１ｍｌの０．５Ｍ Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液、０．５ｍｌの１Ｍ酢酸バリウムおよび１４０ｍｌの９５％エタノールを補充し；そして混合物を−２０℃で１時間インキュベートした。インキュベートした混合物を遠心分離し、ペレットを収集し、２５ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを含有する２２ｍｌの０．５Ｍ Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液中に溶解し、そして室温でインキュベートした。さらに２５ｍｇの部分の水素化ホウ素ナトリウムを、１時間のインキュベーション期間の経過の間に１５分間の間隔でこの混合物に３回添加した。
【００５７】
ＰＳ抗原ヒドラジドを、反応混合物に２２ｍｌの脱イオン水、８８ｍｌの９５％エタノールおよび０．２ｍｌの酢酸バリウムを添加することによって反応混合物から沈澱させた。沈澱させたＰＳ抗原ヒドラジドを遠心分離によって収集し、ペレットを、１．５ｍＭ酢酸バリウムを含有する４４ｍｌの０．２５Ｍ Ｔｒｉｃｉｎｅに溶解させ、そして８８ｍｌの９５％エタノールの添加によって再度沈澱させた。再沈澱工程を繰り返し、そして得られた洗浄したＰＳ抗原ヒドラジドを、８０００分子量カットオフのメンブレンを通して濾過した。
【００５８】
濾過したＰＳ抗原ヒドラジドを、２容量の９５％エタノールで沈澱させ、遠心分離によって収集し、そしてペレットを減圧下で乾燥させた。
【００５９】
（Ｂ．抗原ヒドラジドの調製（方法ＩＩ））
アジピン酸ジヒドラジド（２．６３ｇ）およびシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１．４３ｇ）を、０．５Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．３）（７５ｍＬ）中のホスファターゼ処理化ポリサッカリド抗原（３００ｍｇ）の溶液に添加した。反応物を、３７℃で２０時間、攪拌しそしてインキュベートした。
【００６０】
このインキュベーション後、反応混合物に、乾燥ＣＨＥＳ緩衝剤（７．７７ｇ）を補充し、次いで、溶液を、水酸化ナトリウムでｐＨ９．０に調整した。この反応物に、１時間周囲温度でインキュベートしながら、３０分間隔で、水素化ホウ素ナトリウム（７００ｍｇ）を２回添加した。抗原ヒドラジドを、９５％エタノール（２００ｍＬ）での沈殿および−２０℃で１時間のインキュベーション後に、遠心分離（４℃、３６００ｒｐｍで、１５分間）によって回収した。
【００６１】
ペレットを、水（７０ｍＬ）および０．５Ｍ Ｔｒｉｃｉｎｅ（ｐＨ ８．０）（３０ｍＬ）中に溶解し、そして９５％エタノール（２００ｍＬ）を添加しそして−２０℃で１時間インキュベートすることによって沈殿させた。抗原ヒドラジドを、上記のように遠心分離によって回収した。
【００６２】
この抗原ヒドラジドペレットを、水（７０ｍＬ）および０．９％生理食塩水（３０ｍＬ）中に溶解し、次いで、上記のように遠心分離によって沈殿させそして回収した。
【００６３】
このペレットを、水（５０ｍＬ）中に溶解し、−８０℃で凍結させ、そして乾燥するまで凍結乾燥させた。
【００６４】
（実施例３）
（プロテイナーゼ１の単離）
Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞の凍結ケーク（５００〜６００ｇｍ湿重量）を、３ｍＭ ジチオトレイトール（２．２５ｍｌ／ｇｍ細胞）中に懸濁し、そして懸濁液を、約４℃の温度で平衡化した。冷ＴＣＡＢ（０．７５ｍｌ／ｇｍ細胞）を、攪拌しながら懸濁液に添加し、次いで、得られた混合物を、約２．４の最終ｐＨまで冷０．５Ｎ ＨＣｌで滴定した。滴定した混合物を遠心分離し、そして上清液をプロテイナーゼ１のさらなる分画のために収集した。冷０．５Ｍ Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液（０．５ｍｌ／ｇｍ細胞）を上清液に添加し、そして混合物を水酸化ナトリウムの添加によってｐＨ８に調整した。この溶液を、フラクションＦ１と名付けた。
【００６５】
フラクションＦ１を、９５％エタノール（Ｆ１の０．６７×容量）と混合し、そして混合物を、−２０℃で１．５時間インキュベートした。遠心分離後、上清液を収集し、そして９５％エタノール（Ｆ１の１／３×容量）および１Ｍ 酢酸バリウム（Ｆ１の０．００４×容量）で補充した。−２０℃で１．５時間でのインキュベーション後、混合物を遠心分離し、ペレットを収集し、そして１０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ／４ｍＭ ジチオトレイトール（１０Ｔ／４Ｄ）を含有する６００ｍｌの緩衝液中に懸濁した。この懸濁液を遠心分離し、そして上清液（フラクションＦ２）を収集した。
【００６６】
フラクションＦ２を、９５％エタノール（Ｆ２の１×容量）および１Ｍ 酢酸バリウム（Ｆ２の１／５００×容量）と混合した。−２０℃で１時間のインキュベーション後、混合物を遠心分離し、上清を捨て、そしてペレットを、１５０ｍｌの１０Ｔ／４Ｄ緩衝液中に懸濁した。この懸濁液を遠心分離し、そして上清液（フラクションＦ３）を回収した。
【００６７】
フラクションＦ３を、９５％エタノール（Ｆ３の１×容量）および１Ｍ 酢酸バリウム（Ｆ３の０．００２×容量）と混合した。−２０℃で１時間のインキュベーション後、混合物を遠心分離し、上清を捨て、そしてペレットを、８０ｍｌの１０Ｔ／４Ｄ緩衝液中に懸濁した。この懸濁液を遠心分離し、そして上清液（フラクションＦ４）を回収した。
【００６８】
フラクションＦ４を、９５％エタノール（Ｆ４の１×容量）および１Ｍ 酢酸バリウム（Ｆ４の０．００２×容量）と混合した。−２０℃で１時間のインキュベーション後、混合物を遠心分離し、上清を捨て、そしてペレットを、４０ｍｌの１０Ｔ／４Ｄ緩衝液中に懸濁した。この懸濁液を遠心分離し、そして上清液（フラクションＦ５）を回収した。
【００６９】
フラクションＦ５を、９５％エタノール（Ｆ５の０．１５×容量）と混合した。−２０℃で１時間のインキュベーション後、混合物を遠心分離し、ペレットを捨て、そして上清を、エタノール（Ｆ５の０．８５×容量）と混合した。−２０℃で１時間のインキュベーション後、混合物を遠心分離し、上清を捨て、そしてペレットを、１０ｍｌの１０Ｔ／４Ｄ緩衝液中に懸濁した（フラクションＦ６）。
フラクションＦ６を、１０Ｔ／４Ｄ緩衝液に対して透析し、そして透析液を、等量の４Ｍ 硫酸アンモニウムと混合した。遠心分離後、上清液を収集した（フラクションＦ７）。
【００７０】
プロテイナーゼ１を、さらなる硫酸アンモニウムでの処理によってＦ７から沈殿させた。沈殿物を、遠心分離によって収集し、そして少量の５ｍＭ 重炭酸アンモニウム中に溶解し、さらなる５ｍＭ 重炭酸アンモニウムに対して透析し、そして凍結乾燥して、精製プロテイナーゼ１を得た。
【００７１】
（実施例４）
（プロテイナーゼ１−ＰＳ抗原結合体の合成）
以下のように、精製プロテイナーゼ１を酸化して、ジアルデヒド側鎖部分を導入した：１）約３５ｍｇのプロテイナーゼを、５４５ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウムを含有する２５．５ｍｌの０．１Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中に溶解し、そして得られた混合物を、２０時間４℃で暗所にて、氷浴中でインキュベートし、２）次いで、混合物に、５ｍｌの５０％グリセロールを補充し、そして氷浴中のインキュベーションを、さらに２時間継続した。この反応の生成物を、１０，０００分子量カットオフを有する透析膜を備えた攪拌透析チャンバ中で、透析および濃縮した。得られた溶液を、約１０ｍｌの最終容量中に０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）を含むように調整した。
【００７２】
乾燥ＰＳ抗原ジヒドラジド（約２８０ｍｇ）を、この酸化されたプロテイナーゼ１の溶液中に溶解し、結合体化反応混合物を形成した。この反応混合物を、室温で約１６時間インキュベートした。次いで、これに、３ｍｌの０．５Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５）および１６９ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを補充し、そしてインキュベーションを室温でさらに２０時間継続し、ＨＮＨＮＣ（Ｏ）（ＣＨ２）４Ｃ（Ｏ）ＮＨＮリンカーによって複数のＰＳ抗原部分に連結されたプロテイナーゼ１を得た。
【００７３】
次いで、キャリア−抗原結合体を、５０００分子量カットオフを有する膜を備えた攪拌透析チャンバ中での反応混合物の濾過によって、結合体化されていない抗原ヒドラジドから分離した。この結合体化生成物は、膜上に保持され、そしてこれを、１５ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液中に収集した。
【００７４】
緩衝溶液中の残りのバリウムイオンを、０．０２ｍｌの４Ｍ硫酸アンモニウムの添加後に硫酸バリウムとして沈殿させた。この沈殿を遠心分離によって除去し、そして残りの上清液体を５ｍＭの重炭酸アンモニウムに対して透析し、そして凍結乾燥させた。この凍結乾燥させた結合体化ワクチンは、約１８ｍｇのキャリアタンパク質および約２６ｍｇの多糖類抗原を含んだ。
【００７５】
（実施例５）
（プロテイナーゼ１ベースのキャリアがＥ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＰＳ−抗原に対する免疫原性応答および免疫記憶応答を増強する能力）
抗原−キャリア結合体を用いてワクチンを調製するために、結合体のサンプルを、０．１％のＴｗｅｅｎ−８０の適切な容量に溶解させ、０．１ｍｌの溶液当たり１０ワクチン用量を含む溶液を得た。等量のフロイント不完全アジュバントをこの溶液に添加し、そしてこの混合物を、乳化した。生じた乳濁液を、４容量の０．１％のＴｗｅｅｎ−８０で希釈して、１０ワクチン用量／ｍｌを含む最終乳濁液を得た。別々の乳濁液を、抗原−キャリア結合体の各々の用量レベルについて調製し、そして各々の用量を０．１ｍｌの総容量で送達した。
【００７６】
各ワクチン用量を、皮下注射によって別々のマウス群に投与した。成熟した雌性ＩＣＲマウスの年齢適合集団から、群を無作為に集合させた。免疫したマウス由来の血液サンプルを、ヘパリン中に回収し、マウスの各群由来の個々の血漿の等アリコートを、抗体分析のためにプールした。抗体力価をネガティブコントロールとして正常免疫血清（ワクチン接種されない１０匹のマウスからプールされた）を使用し、そしてポジティブコントロールとしてＥ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＬＰＳに対するモノクローナル抗体を使用するＥＬＩＳＡによって決定した。
【００７７】
予備実験（データは示さず）は、非結合体化ＰＳ抗原でのマウスの一次免疫および二次免疫が、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（ＳＥ）のいずれか由来のＬＰＳでのＥＬＩＳＡにおいて反応性の抗体を微量のみ誘発したことを示した。これらの結果は、非結合体化ＬＰＳ多糖類が弱い抗原であることを示す他の研究と一致する。
【００７８】
以下の表１は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＰＳ抗原およびキャリアタンパク質を含む結合体ワクチンの一次、二次および三次用量を与えられたマウスからのＥＬＩＳＡの結果を要約する。一次ワクチン用量を、１５週齢で与えた。二次ブースターワクチン用量を、一次用量の２４時間後に与え、そして三次ブースター用量を、二次用量の１１日後に与えた。群１のマウスは、各注射において２５μｇ用量の抗原−キャリア結合体を受け、群２のマウスは、５０μｇ用量の結合体を受け、そして群３のマウスは、１００μｇ用量の結合体を受けた。
【００７９】
【表１】
＊力価を、０．１＋バックグラウンドのＯＤ４５０の読み取りで決定した。平均ＯＤ４５０バックグラウンドは、約０．０６５であった。
【００８０】
これらの結果は、結合体ワクチンによるマウスの一次免疫が、７００〜１７００の間の抗ＬＰＳ抗体力価を誘発し；そして二次免疫が、約２０〜３０倍の抗体力価をブーストしたことを示す。これらの結果は、キャリアタンパク質が、これに結合体化した多糖類抗原の免疫原性およびＴ細胞依存性の両方を増強したことを実証する。各一次ワクチン用量と各二次ワクチン用量との間の、および各二次ワクチン用量と各三次ワクチン用量との間で観察される抗体力価の増幅は、このキャリアタンパク質がＰＳ抗原に連結した免疫学的記憶を誘発することを実証する。有意な差異（Ｐ＞０．０５）は、１００μｇのワクチン用量によって誘発された三次抗体力価と、ＰＳ抗原−キャリア結合体の２５μｇ用量または５０μｇ用量のいずれかによって誘発された三次抗体力価との間で観察されなかった。
【００８１】
（実施例６）
（交差反応性の抗ＬＰＳ抗体を誘発する、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＰＳ抗原結合体ワクチンの能力）
表２は、３つの別々の実験、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３から得られた、本発明の結合体ワクチンによって誘発される抗体の交差反応性についてのデータを示す。全ての実験におけるマウスは、成熟した非近交系（ｏｕｔ−ｂｒｅｄ）の雌性ＩＣＲマウスであった。４つの異なるロットの結合体ワクチンを使用した。Ｅ１におけるマウスは、一次注射のために２００μｇのロット１ワクチンを受け、７週間後の二次注射のために２００μｇのロット３ワクチンを受け、そして一次注射の１０週間後の三次注射のために２００μｇのロット４ワクチンを受けた。
【００８２】
Ｅ２におけるマウスは、一次注射のために２００μｇのロット２ワクチンを受け、６週間後の二次注射のために２００μｇの結合体ロット３ワクチンを受け、そして一次注射の１１週間後の三次注射のために２００μｇの結合体ロット４ワクチンを受けた。
【００８３】
Ｅ３におけるマウスは、一次注射のために２５μｇのロット４ワクチンを受け、３週間後の二次注射のために２５μｇのロット４ワクチンを受けた。
【００８４】
血漿を、Ｅ１およびＥ２については三次ワクチン接種の２週間後に回収し、そしてＥ３については二次ワクチン接種の１１日後に回収した。各群のマウス由来の等アリコートの血漿をプールした。プールした血漿サンプルを、指定された型の細菌から精製したＬＰＳに対する抗体力価についてＥＬＩＳＡによって評価した。ワクチン接種したマウス由来のプールされた血漿における抗ＬＰＳ力価を、非免疫マウス由来のプールされた血漿における抗ＬＰＳ力価と比較した。表２に報告した交差反応抗体力価は、非免疫のバックグラウンド力価より少なくとも４〜５倍であった。
【００８５】
【表２】
Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３＝実験１，２，および３
非免疫血清は、１００に等しいかまたはそれより小さかった
ＮＤ＝検出されず
表２中の結果は、敗血症の原因因子として関連した種々野生型細菌からのＬＰＳと交差反応した抗体を惹起した発明の複合ワクチンを示し、しかも本発明のワクチンが、これらの種類の細菌により引き起こされた感染に対し有益な保護を提供し得たことを示す。
【００８６】
（実施例７）
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＰＳ抗原−キャリア結合体を用いたワクチン接種は、重篤な敗血症に対しマウスを保護する。
【００８７】
誘導されたＬＰＳ−過敏症を含むモデルを用い、本発明の複合ワクチンにより与えられる保護活性を評価した。マウスを、熱殺傷したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍの腹腔注射により過敏症にした（Ｃ．Ｇａｌａｎｏｓら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．、１８７、３４９（１９９３））。この処置の６日後、動物を、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓからの、１０ｎｇのＬＰＳを抗原投与した。抗原投与後、２時間および６時間に体温を測定した。
【００８８】
図５−６中のデータは、マウスの２つの非ワクチン接種コントロール群（第１群および第２群）に由来する。第１群は、Ｃ．ｐａｒｖｕｍで感作したが、ＬＰＳを抗原投与しなかった；そして第２群は、感作および抗原投与した。実験群（第３群）は、３回の、１００μｇ用量の複合ワクチンで免疫化した。
【００８９】
図５−６中に要約した実験では、第３群のマウスは、第２群と同じ様式で感作および抗原投与した。この実験は、第３群のマウスが、第３の免疫化後４０日にＣ．ｐａｒｖｕｍ感作を受け、そしてこの免疫化の後４６日にＬＰＳで抗原投与されるようなスケジュールとした。すべての群からのマウスの体温を、ＬＰＳを用いた抗原投与後２および６時間後（それぞれ図５および６）測定した。
【００９０】
第１群に関する図５に示される結果は、ＬＰＳで抗原投与されなかったＣ．ｐａｒｖｕｍ処理マウスが、３６．５〜３８℃の範囲の体温を有し、そしてこの温度範囲が、観察期間の経過の間保持されたことを示した（図６）。対照的に、抗原投与後２時間の第２群マウスの体温範囲は、３２．７−３７．２℃であり、そして約７０％のマウスが、第１群で観察された最小温度より低い体温を有していた。図６に示されるように、抗原投与後６時間では、第２群のマウスの約５５％が、第１群の３６．５℃最小温度より低い体温を有しており、そして第２群の残りは、３７．５〜３８．５℃の範囲にある温度を有していた。
【００９１】
対照的に、ワクチン接種された群のマウス（第３群）は、抗原投与後２時間には、３４．３〜３８℃の範囲の体温を有し、４７％が第１群の最小３６．５℃より低い温度を有していた。抗原投与後６時間では、１９匹のワクチン接種マウスのうち２匹だけ（１１％）が、３６．５℃より低い体温を有し、そして残りは、３６．９〜３８．５℃の範囲の温度を有していた。
【００９２】
通常の非処理マウスの体温範囲は、３６．１〜３７．１℃で、３６．７℃の平均温度であることが観察された（データは示さず）。これは、他の研究者により得られた平均の通常体温と同様である（Ａ．Ｒｏｍａｎｏｖｓｋｙら．、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２７０、Ｒ６９３（１９９６））。従って、図５−６における結果を評価する目的には、３７．１℃を超える体温が高体温（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉｃ）であると考えられ、そして３６．１℃より低い体温が低体温（ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉｃ）であると考えられた。この関係から、図５−６における結果から、以下の結論が導かれた：ａ）ＬＰＳで抗原投与されなかった非ワクチン接種過敏症マウス（第１群）の約半分が、通常マウスの範囲の体温を有し、そして残りがわずかに高体温であった；ｂ）ＬＰＳで抗原投与された非ワクチン接種過敏症マウスの大部分が、抗原投与後２時間で高体温であり、抗原投与後６時間で約半分のマウスで高体温が持続した；およびｃ）ワクチン接種した、過敏症マウスの約１／３が、抗原投与後２時間で低体温であったが、低体温は、抗原投与後６時間で１９匹のマウスのうち２匹のみで持続した。
【００９３】
図５−６で要約される実験の前に、非ワクチン接種過感作マウスにおけるＳ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓの致死用量の閾値が約２０ｎｇであることを見出した。従って、上記の実験に用いられた１０ｎｇのＬＰＳ抗原投与用量は、非ワクチン接種マウスの致死用量の閾値に近かった。マウスおよびラットのような小げっ歯類では、持続する低体温は重篤な敗血症の症状であり、そして一時的な低体温は、軽い敗血症の症状である。例えば、Ｒ．Ｂｌａｎｑｕｅら、Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２７、９７３（１９９６）；Ｔ．Ｐ．Ｃｌｅｍｍｅｒら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．、２０、１３９５（１９９２）を参照のこと。従って、図５−６における結果は、１０ｎｇのＬＰＳ抗原投与用量が、具現化された複合ワクチンで免疫化したマウスにおけるより、コントロールマウス中でかなり重篤な敗血症を引き起こしたという結論を支持する。
【００９４】
敗血症に対する保護を提供することに加えて、具現化された複合ワクチンはまた、その他の感染性合併症に対する保護を提供し得る。例えば、このワクチンは、紅斑性狼瘡（エリテマトーデス）を患う患者および鎌型赤血球病を患う患者において生じるＳ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｕｓによる感染に対する保護を提供し得、そして、それは、この細菌によって引き起こされる胃腸炎および腸熱に対する保護もまた提供し得る。例えば、Ｓ．Ａｂｒａｍｓｏｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．、２８、７５（１９８５）；Ｊ．Ｒ．Ｗｒｉｇｈｔら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．、１３０、３３４（１９９７）；Ｊ．Ｌ．Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１６７、７８１（１９９３）；ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ．Ｗｅｅｋｌｙ Ｒｅｐ．、４９、７３（２０００）を参照のこと。また、本明細書に開示される方法は、その他の種類のＬＰＳ多糖を含む複合ワクチンを生成することに容易に適用し得、そしてこれらのワクチンは、単独または組み合わせて用いられ、グラム陰性細菌により引き起こされる広範な合併症および感染性疾患に対する予防的保護を提供し得る。
【００９５】
（実施例８）
プロテイナーゼ１を基礎にしたキャリアワクチンが、生理食塩水中、非アジュバント化ワクチン中のＰＳ抗原に対する、免疫原性および記憶応答を可能にする能力。
【００９６】
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５またはＰ．ａｅｕｒｏｇｉｎｏｓａのラフ（ｒｏｕｇｈ）変異体Ｐａ３のいずれかからのＰＳ抗原を用いるワクチンを、上記の実施例で記載したのとほぼ同様に調製した。これらのワクチンは、０．９％ＮａＣｌのみ中で処方し、そして一次ワクチン接種で開始し、三次ワクチン接種まで、２週間のスケジュールでマウスに投与した。各ワクチン接種で、少なくとも４つの異なるワクチン用量を与えた。用いた用量（１−８μｇ）は、上記の実施例５および６で提示したアジュバント化ワクチンで用いた用量より少ない。二次接種後および三次接種後、血清を、各々のワクチン接種の２週間後、尾放血により採取した。
【００９７】
表３−５は、バックグラウンドの２倍のＯＤ（４５０ｎｍ）読み取り値を与える希釈の逆数に等しいＥＬＩＳＡ力価を提示する。表３は、二次および三次注射後の抗Ｊ５ＰＳワクチンに対する用量応答を示す。Ｊ５ＰＳ複合ワクチンの二次および三次ワクチン接種の両方の後に、明瞭な用量応答がある。ＥＬＩＳＡ測定を基づけば、生理食塩水のみのワクチンは、三次注射の後、水中油ワクチンが示したよりも高い記憶増幅を示した。８μｇの三次の後の力価は、任意の水中油ワクチンの三次後の力価より高い。この水中油ワクチン接種は、１００、５０、および２５μｇの用量を有していた。従って、生理食塩水のみのワクチンは、全体に亘って、水中油ワクチンの示すより大きい免疫活性を示す。
【００９８】
【表３】
表４は、その親のＥ．ｃｏｌｉ細菌株、関連細菌、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ、およびより遠いグラム陰性細菌Ｐ．ａｕｒｕｇｉｎｏｓａからのＬＰＳを利用するＪ５ＰＳワクチンの制限された交差反応データを提示する。このＪ５ＰＳ複合ワクチンは、すべての３つの細菌株からのＬＰＳと有意な程度まで交差反応する抗体を惹起した。上記の初期のワクチンと同様に、非アジュバント化ワクチンは、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ ＬＰＳに対し最高の交差反応応答を示す。マウスにおける保護データは、生理食塩水のみのワクチン処方について利用可能ではない。
【００９９】
【表４】
ａ 抗原としてＪ５−ＬＰＳを用いて決定された相同的な力価。
【０１００】
表５は、抗Ｐａ３ＰＳワクチンにより惹起された抗体についての用量応答データを提示する。このワクチンに対する相同的ＬＰＳは利用可能ではないので、ＥＬＩＳＡアッセイは、抗原として全細菌を用いた。定性的には、これらのデータは、二次注射後の用量応答の証拠がより少ないことを除いて、Ｊ５ＰＳワクチンについて観察されたデータと類似である。しかし、三次の注射後に生じる記憶増幅の実質的な証拠、および明らかな用量応答の証拠がある。
【０１０１】
【表５】
Ｐａ３ＰＳワクチンの交差反応性について、ほんの限られたデータが利用可能である。Ｊ５ＰＳワクチンとは異なり、Ｐａ３ＰＳワクチンは、その野生型親細菌と良好に交差反応する抗体を惹起する（Ｊ５ＰＳワクチンについては１４％であるのに対し４１％）。Ｐａ３ＰＳ複合ワクチンは、Ｊ５全細菌と１４％まで交差反応した。
【０１０２】
抗原およびキャリアタンパク質の両方を提供するために、細胞の粘菌を用いて同様に各々調製されたこれらの２つの異なるワクチンは、広範な種類のグラム陰性細菌からの低コストで有効なワクチンの調製への、本特許およびその実施例で提示された核となる技法の利用可能性のさらなる証拠を提供する。たとえこれらのワクチンが、小さな脱脂ＬＰＳ炭水化物ハプテンのみを用いても、結合体ワクチン中でキャリアタンパク質であるプロテイナーゼ１に連結されるとき、このワクチンは、マウスにおいて顕著な免疫および記憶応答を惹起した。
【０１０３】
すべての刊行物、特許および特許書類は、個々に参考として援用されるように、本明細書中に参考として援用される。本発明を、種々の詳細かつ好適な実施態様および技法を参照して記載してきた。しかし、多くの改変および修飾が、本発明の思想および範囲にありながらなされえることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ−５ ＬＰＳの構造を示す。
【図２】
図２は、脱Ｏ−アセチル化および脱Ｎアセチル化Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＬＰＳの構造を示す。
【図３】
図３は、リンカー基を導入するためのＪ−５抗原の改変を示す。
【図４】
図４は、Ｊ−５抗原ヒドラジドへキャリアタンパク質を連結するためのこのキャリアタンパク質の改変を示す。
【図５】
図５は、本発明の結合体ワクチンが、マウスにおいて実験的に誘導された敗血症において低体温を阻害する能力をまとめる。
【図６】
図６は、本発明の結合体ワクチンが、マウスにおいて実験的に誘導された敗血症において低体温を阻害する能力をまとめる。
本発明は、Ｓｍａｌｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ助成金番号１ Ｒ４３Ａ１４４５７８−０１の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
（発明の背景）
抗生物質治療および集中治療の顕著な改善にもかかわらず、敗血症およびその続発症、敗血症症候群または敗血症性ショック（集合的に、「敗血症」）は、入院患者における罹患率および死亡率の主な原因のままである。敗血症は、グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌、真菌および他の病原性微生物によって誘発される。これらの生物は、損傷または感染の病巣で毒素を放出し、この毒素は次いで、サイトカインおよび他のメディエーターの放出を誘発する。感染が制御されない場合、内毒素および／または他の炎症メディエーターが循環中に進入し得、このことは、敗血症ならびに内皮損傷、低血圧および多器官不全をもたらす事象のカスケードを開始する。グラム陰性細菌は、多数のこのようなエピソードを担い、このようなエピソードは、高い死亡率と関連する。例えば、Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ，「Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｉｎ ｎａｔｉｏｎａｌ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｄｉｓｃｈａｒｇｅ ｓｕｒｖｅｙ ｒａｔｅｓ ｆｏｒ ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ Ｂ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ，１９７９−１９８７」，Ｍｏｒｂｉｄ．Ｍｏｒｔａｌ．Ｗｅｅｋｌｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ，３９，３１（１９９０）を参照のこと。グラム陰性細菌によって引き起こされた敗血症性ショックを発症した患者において、致命率は５０％以上に達し得る。Ｒ．Ｃ．Ｂｏｎｅら，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１７，６５３（１９８７）を参照のこと。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉは、グラム陰性血液単離物の４０％〜５２％を占める主な原因生物のままである（Ｓ．Ｃｈａｍｂｅｒｌａｎｄら，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５，６１５（１９９２）；Ｂ．Ｅ．Ｋｒｅｇｅｒら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，６８，３３２（１９８０））。
【０００３】
リポ多糖（ＬＰＳ、内毒素）は、グラム陰性細菌の外膜の主成分であり、敗血症性ショックおよび死をもたらし得る、グラム陰性病原体による感染の間に観察される病原性効果の多くを担う（Ｅ．Ｔ．Ｒｉｅｔｓｃｈｅｌら，Ｓｃｉｅｎｔ．Ａｍｅｒ．，２６７，５４（１９９２）；ＦＡＳＥＢ Ｊ．，８，２１７（１９９４））。腸内細菌ＬＰＳは、３つのドメイン（すなわち、リピドＡ、コア領域およびＯ特異的鎖）からなり、そのうちリピドＡは、異なる病原性細菌間で構造的に最も保存されており、そしてＬＰＳの毒性素因を表す（Ｃ．Ａ．Ｈ．Ｒａｅｔｚ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，１２９（１９９０）；Ｅ．Ｔ．Ｒｅｉｔｓｃｈｅｌら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍ．，５，７５３（１９９１）；Ｃ．Ｇａｌａｎｏｓら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４８，１（１９８５））。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＬＰＳの構造を図１に示す（Ｇａｌａｎｏｓら（１９８５）から）。ＬＰＳによって発揮される毒性効果は、細菌の生存率とは独立しており、そして抗生物質に対する病原性細菌の耐性を増大させることを考慮すると、敗血症についての代替処置ストラテジーについての探索は主な重要性である。
【０００４】
敗血症の免疫治療についての最も有望なアプローチの１つは、ＬＰＳの保存領域（すなわち、リピドＡおよびコア領域）に対する抗体を用いた受動免疫である。このような抗体は、異なるグラム陰性病原体と交差反応性であり、それゆえ、交差防御性であり得ると期待される。細菌ＬＰＳに対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を用いた受動免疫は、敗血症の動物モデルにおいて防御効果を示した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５由来の部分的に無毒化されたＬＰＳが、ラットにおけるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ感染に対する受動防御を提供されたウサギにおいてポリクローナル抗体を惹起し得ることが示された（Ａ．Ｋ．Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７０，６２２（１９９４））。同様に、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５に対するモノクローナル抗体が、マウスにおける異種細菌チャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に対する受動免疫防御を提供し得ることが示された（Ｍ．Ｐ．Ｓｃｈｕｔｚｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２，２６３５（１９８９））。Ｆ．Ｅ．ＤｉＰａｄｏｖａら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６１，３８６９（１９９３）；Ｊ．Ｄ．Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒら，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．１８７，４６４（１９９３）もまた参照のこと。しかし、防御は一般に、敗血症の病理が始まる前に抗体（Ａｂ）が投与されることを必要とする。このことは、受動免疫が、予防的防御を提供する可能性を有するが、治療効力を提供する可能性は有さないことを示す。
【０００５】
予防的防御は、受動免疫よりもむしろ、能動免疫またはワクチン接種によって最もよく提供される。防御抗体の誘導は、適切に改変された形態で提示されるＬＰＳでの免疫によって、またはＬＰＳ生合成が欠損した変異細菌（ラフ型変異体（ｒｏｕｇｈ ｍｕｔａｎｔ））を介して、潜在的に達成され得る（Ｃ．Ｇａｌａｎｏｓら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１，２３０（１９７２）；Ｓ．Ｃ．Ｂｒｕｉｎｓら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，１７，１６（１９７７））。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｊ−５（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｏ１１１：Ｂ４のラフ型変異体）は、３０年より長い間、ＬＰＳに対する広範に交差反応性でかつ交差防御性の抗体を誘導する試みにおいて、免疫学的研究の大多数において用いられている。実際、熱殺傷Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５細胞でのマウスの免疫は、ｂ型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅでのマウスのチャレンジに対して能動免疫防御を惹起し得る（Ｍ．Ｉ．Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，６９，７４２（１９８２））。Ｊ．Ｂ．Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６３，７６９（１９９１）もまた参照のこと。精製した無毒化Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＬＰＳの多重感染は、交差防御性抗ＬＰＳ Ａｂを惹起する抗原としても機能し得る。Ａ．Ｋ．Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７３，１１５７（１９９６）は、非共有結合性ワクチンを、部分的に無毒化したＪ５ ＬＰＳおよびＢ群Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質を用いて調製した。
【０００６】
しかし、敗血症に対する安全かつ有効なワクチンの開発は、多くの種類の細菌に対する交差防御性抗体を惹起し得る非毒性ＬＰＳ抗原の調製に関連した問題によって妨害されている。図１に示すように、ＬＰＳのジグルコサミン部分は、エステル連結ホスフェート、エステルおよびアミド連結脂肪酸、およびグリコシド性アリル（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃａｌｌｙ）連結多糖で置換されている（Ｃ．Ｒ．Ｒａｅｔｚ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，１２９（１９９０））。ＬＰＳ分子の非脂質部分は、有益な抗体を惹起することに関与し得るエピトープを含む；そして、脂質（または脂肪酸）置換基は、ＬＰＳ毒性の決定基を含む（Ｃ．Ｇａｌａｎｏｓら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４８，１（１９８５）；Ｔ．Ｒｅｉｔｓｃｈｅｌら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒ．，５，７５３（１９９１））。従って、ＬＰＳを無毒化するために、他のエピトープの損失を最小限にしながら、脂肪酸を加水分解的に除去する試みが行われている。１つのアプローチは、エステル連結脂肪酸をジグルコサミン骨格から遊離させるマイルドなアルカリ加水分解を使用する。この方法を用いる問題は、この方法は、アミド連結した脂肪酸を遊離させず、それゆえ、完全な無毒化を提供しないことである。この処理をＥ．ｃｏｌｉ Ｊ５由来のＬＰＳに適用した場合、ＬＰＳの部分的脱アシル化は、ＬＰＳ発熱性を約１００倍減少させた（Ａ．Ｋ．Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７０，６２２（１９９４））。しかし、部分的に脱アシル化された生成物は、防御抗体を惹起するために必要とされる用量よりも少ない用量で、発熱活性を依然として示した。
【０００７】
ＬＰＳの無毒化のための他のアプローチは、マイルドな酸性加水分解を使用する。このアプローチは、毒性のより大きな弱毒化を提供するが、多糖エピトープのより広範囲の破壊を引き起こす。この処理は、ＬＰＳの内部コアとリピドＡジグルコサミン骨格との間のグリコシド結合を切断する（Ｓ．Ｊ．Ｃｒｙｚら（米国特許第５，３７０，８７２号）；Ｒ．Ｋ．Ｇｕｐｔａら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６３，２８０５（１９９５）；Ｃ．Ｇａｌａｎｏｓら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４８，１（１９８５））。加水分解後、多糖画分は、抗原として使用するために収集され、そして脂肪酸およびホスフェートが連結したジグルコサミンは廃棄される。この方法の問題は、酸性加水分解が、ジグルコサミンに会合したエピトープを除去し、そしてまた、ＬＰＳ多糖の構造を部分的に改変することである。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＬＰＳの場合、マイルドな酸性加水分解処理は、ネイティブなＬＰＳの多糖コアに存在することが公知の糖基およびホスフェート基の両方を失った多糖抗原を生成し得る。従って、ジグルコサミン骨格が存在しないことに加えて、無毒化ＬＰＳ多糖は、エタノールアミンホスフェートおよび非還元末端の３−デオキシ−マンノ−オクト−２−ウロソン酸（ＫＤＯ）残基が枯渇している（Ｓ．Ｍｕｌｌｅｒ−Ｌｏｅｎｎｉｅｓら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６０，２３５（１９９９））。
【０００８】
無毒化ＬＰＳに基づくワクチンの調製はまた、ＬＰＳ抗原について適切なキャリアタンパク質の調製に関連した問題によって妨害されている。ＬＰＳ多糖はヘルパーＴ細胞を活性化するエピトープを有さず、そしてキャリアを伴わないと、高力価の長期存続抗体を惹起するために必要とされる免疫記憶を誘導しないので、キャリアタンパク質が必要とされる（Ｊ．Ｂ．Ｒｏｂｂｉｎｓら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１６１，８２１（１９９０））。「トキソイド」といわれる、破傷風毒素またはトキシンＡのような無毒化細菌毒素は、多糖抗原についてのキャリアとして用いられている。キャリアタンパク質に共有結合した場合、無毒化ＬＰＳ多糖は、ハプテンとして作用し、そしてキャリアのいくつかの免疫原性特性がこの連結した多糖に付与される。特に、キャリア中のＴ細胞エピトープは、連結した多糖ハプテンに対する免疫記憶応答を誘導し得る。
【０００９】
トキソイドキャリアの使用における制限は、トキソイドが、ハプテンのキャリア特異的エピトープ抑制を引き起こし得ることである。実験動物においては、この現象は、動物をトキソイド−ハプテン結合体でワクチン接種する前に動物をトキソイドに対して免疫した場合に生じる（Ｃ．Ｂｅｒｑｕｉｓｔら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６５，１５７９（１９９７）；Ｌ．Ａ．Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ，２８５，６６４（１９８０）；Ｍ．Ｐ．Ｓｃｈｕｔｚｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５，２３１９（１９８５））。トキソイドに対する獲得免疫がまた、キャリア特異的エピトープ抑制をヒトにおいて引き起こし得る証拠が存在する（Ｄ．ＤｉＪｏｈｎら，Ｌａｎｃｅｔ，２，１４１５（１９８９））。成人は、暴露の可能性の増加に起因して、トキソイドに対する免疫を有する可能性が若い子供よりも高い。この観察は、トキソイド−多糖結合体ワクチンが、若い子供においてよりも成人において、より効力が低いという予測をもたらす。
【００１０】
それゆえ、グラム陰性敗血症に感受性である哺乳動物においてグラム陰性敗血症に対する防御を提供し得る免疫原性結合体についての継続した必要性が存在する。
【００１１】
（発明の要旨）
本発明は、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍプロテイナーゼ１の分子のグルコサミン残基に共有結合した複数の脱脂グラム陰性細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）分子を含む免疫原性結合体を提供し、この結合体は、キャリア分子として機能する。本発明の結合体は好ましくは、各脱脂ＬＰＳ部分をプロテイナーゼ１のグルコサミン残基へと共有結合する二官能性連結分子（すなわち「リンカー」）をさらに含む。本発明の結合体は、グラム陰性細菌によって引き起こされる感染または敗血症（全身性炎症応答および敗血症性ショックを含めて、その病原的結果を含む）を処置（予防または減弱）するために、ワクチンとして使用されて、感受性哺乳動物または感染した哺乳動物（例えば、ヒト）を、この感染または敗血症に対して能動的に免疫し得る。
【００１２】
好ましくは、リンカーを、ＬＰＳおよびプロテイナーゼ１分子の両方においてグルコサミン残基に導入されたアルデヒドまたはアセタール部分と反応させる。例えば、リンカー上のアミン部分および／またはヒドラジノ部分は、Ｓｃｈｉｆｆ塩基反応を介して、アルデヒド部分またはアセタール部分と反応し得、続いて還元されて、安定なＣＨ２−ＮＨ結合を生じ得る。従って、本発明の結合体を作製するために用いられる方法および中間体もまた本発明の局面である。
【００１３】
脱アシル化ＬＰＳ分子は、グラム陰性細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、Ｊ５株））から調製され得、そして本明細書中以下では、多糖抗原または「ＰＳ」抗原といわれる。ＰＳ抗原は、得られるＰＳ抗原上のリピドＡジグルコサミン骨格もしくはコア成分（例えば、ジホスホリルエタノールアミン（−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−ＯＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ２）またはＫＤＯ部分）も失うことなく、従って、高レベルの抗原性を保持して、脂肪酸のアミド結合およびエステル結合を切断することによって細菌性ＬＰＳが脱脂される条件下でグラム陰性細菌上で粘菌Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍを増殖させることによって入手され得る。この生物変換を達成する好ましい発酵条件は、最少塩培地（例えば、脱イオン水中に約１ｍＭ〜１０ｍＭのＭｇＣｌ２および約５ｍＭ〜５０ｍＭのＫＣｌを含む培地）中のグラム陰性細菌上でＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍを増殖させることを含む。好ましいＰＳ抗原は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＬＰＳから得られた脱脂したＬＰＳである。Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ培養物によって生成されるこのＰＳ抗原の構造を図２に示す。
【００１４】
この物質は、ホスホロモノエステラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｍｏｎｏｅｓｔｅｒａｓｅ）によって処理されて、１’−ホスフェート基を切断して、アセタール（またはＣＨＯ）基を生成し得、この基はさらに改変され得るかまたはリンカー上の官能基と反応し得る。それゆえ、脱脂したＰＳ抗原および加水分解したＰＳ抗原は両方とも、本発明の実施形態である。
【００１５】
さらなる実施形態では、本発明は、細菌細胞由来のＬＰＳを無毒化するための生物学的方法を提供する。特に、Ｅ．ｃｏｌｉのＪ５株から無毒化ＬＰＳを単離するために生物学的方法が提供される。この具体化方法は、細菌細胞をＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍの培養物についての食物供給源としての使用に適切にするような方法で細菌細胞が調製されることを必要とする。この方法はまた、細菌細胞中のＬＰＳが、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞によって生成される酵素によって脱アシル化され得る形態のリピドＡを含むことを必要とする。これらの条件が満たされれば、具体化方法を用いて無毒化ＬＰＳ抗原を、いくつかの異なる種類のグラム陰性細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｅａｃｅａｅ、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅおよびＶｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ科の細菌、ならびにヒトの組織および器官における炎症および／または感染を引き起こす雑多な属のグラム陰性細菌を含めて、野生型または変異株のいずれかの医学的に関連した細菌を含む）から単離し得ることを期待することは妥当である。
【００１６】
ＰＳ抗原のための新規キャリア分子は、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍプロテイナーゼ１の誘導体である。本発明のさらなる局面は、このキャリア分子を調製するための方法を提供することである。プロテイナーゼ１は、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ培養物の細胞画分から単離され得る。ＰＳ抗原分子は、ＰＳ抗原の直接的または間接的な結合を可能にするように改変された、キャリア分子中のリン酸化糖基に連結される。このリン酸化糖部分は、プロテイナーゼ１中の主なＢ細胞エピトープであると考えられ、そしてＰＳ抗原の結合体化は、キャリア上のＴｈ細胞エピトープを保存しながら、これらのエピトープを本質的に除去する。ＰＳ抗原によるキャリアＢ細胞エピトープの置換は、キャリアエピトープがＰＳエピトープに対する免疫応答のエピトープ抑制を引き起こすのを阻害すると期待される。この結合体化方法は、本発明のさらなる局面であり、キャリアがインビボでの防御抗ＰＳ抗体の生成を増幅し、次いでこの抗体がＬＰＳが敗血症および敗血症性ショックの病理を引き起こすのをブロックする能力を最適化する。
【００１７】
別の局面では、本発明は、結合体ワクチンのような免疫原性分子において有用な部分および抗原性ハプテンのためのキャリア分子として使用するためのＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍプロテイナーゼ１誘導体を提供する。プロテイナーゼ１誘導体は、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍプロテイナーゼ１の、または類似のリン酸化グルコサミンを含む他のタンパク質（例えば、類似の構造のプロテイナーゼ）の、リン酸化されたグルコサミン部分の３，４−ジオール部分の酸化的切断によって調製された複数のアルデヒド部分を含む。このようなキャリア分子は、本明細書中以下の実施例に記載のようにＥ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＰＳ抗原とともに用いられ得るか、あるいは他の無毒化細菌性ＬＰＳ部分または他のネイティブハプテンもしくは合成ハプテンに対して結合体化され得る。例えば、本発明の方法を用いて、ハプテンが、感染性疾患のワクチン、癌ワクチン、アトピー性疾患についてのワクチンまたは自己免疫疾患についてのワクチンのための防御多糖またはペプチドエピトープを表す結合体ワクチンを調製し得る。
【００１８】
トキソイドまたは他のキャリアタンパク質、ならびに本発明のキャリア分子およびＰＳ抗原と組み合わされ得る他のＰＳ抗原およびハプテンを含む結合体ワクチンはそれぞれ、例えば、Ｃ．Ｊ．Ｃｒｙｚら（米国特許第４，７７１，１２７号および同第５，３７０，８７０号）、Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎら（米国特許第５，４４５，８１９号）およびＰａｒｒｏ（米国特許第５，３０６，４９２号）に開示される。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
（ＬＰＳ多糖抗原）
抗原用途のためにＬＰＳを無毒化する伝統的な方法は、非特異的な酸触媒加水分解プロセスまたは塩基触媒加水分解プロセスを用いて、脂肪酸をＬＰＳ多糖抗原から除去し、これらのプロセスは、本明細書中で上記で考察したように、多糖エピトープの所望でない改変を引き起こす。対照的に、本発明の生物学的無毒化プロセスは、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞によって生成される酵素に頼って、脂肪酸をＬＰＳへと連結するアミド結合およびエステル結合を加水分解する。これらの酵素的改変は非常に特異的であるので、この生物学的処理は、防御抗体を惹起するために必要とされる非毒性エピトープを保持しながら、毒性成分を選択的に除去する。従って、ＬＰＳ無毒化の生物学的方法は、化学的無毒化プロセスとは異なり、ジグルコサミン、非還元末端のＫＤＯ、またはエタノールアミンピロリン酸基のいずれかをＬＰＳの多糖へと連結する共有結合を加水分解することなく、ＬＰＳを完全に脱アシル化する。
【００２０】
本発明の方法は、本発明の方法を例示するためにＥ．ｃｏｌｉ Ｊ５をＰＳ抗原の供給源として用いる。本明細書中上記で考察したように、この生物由来のネイティブなＬＰＳは、いくつかの他種のグラム陰性細菌由来のＬＰＳと交差反応性の抗体を惹起し得る。Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞によるＥ．ｃｏｌｉ Ｊ５の生物学的処理を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＬＰＳを無毒化するための手段として用いた。なぜなら、以前の研究によって、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞が脱アシル化ＬＰＳ誘導体を細菌性異化の最終生成物として天然で生成することが示されたからである（Ｄ．Ｍａｌｃｈｏｗら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２，４６９（１９６７）；７，２３９（１９６９））。これらの研究はまた、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞がエステル連結脂肪酸およびアミド連結脂肪酸をＬＰＳのリピドＡ部分から代謝的に除去するが、ＬＰＳの多糖部分におけるグリコシド結合を加水分解しないことを示唆した。さらに、これらの研究は、ネイティブなＬＰＳに対して惹起された抗体が、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍによって生成されるいくつかのＬＰＳ異化代謝産物を認識することを示した。しかし、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍがＥ．ｃｏｌｉのＪ５株を代謝し得ることは公知ではなかった。また、本発明より前には、その構造がどのようなものであろうとも、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍによって生成される形態の脱アシル化ＬＰＳが、抗体を惹起する免疫原性エピトープとしての活性を有し、次いでこの抗体がネイティブな形態のＬＰＳを認識し得ることは公知でなかった。さらに、本発明よりも前には、先行技術は、脱アシル化Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＬＰＳをＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ培養物から単離するための方法を提供しなかった。
【００２１】
従って、本発明は、細菌性ＬＰＳをワクチン抗原として有用である形態で生物学的に抽出および無毒化するための、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍのような細胞性粘菌の最初に報告された用途を表す。無毒化ＬＰＳ抗原を生成するための具体化生物学的方法は、ＬＰＳワクチン抗原を調製するために以前に用いられた化学的プロセスよりも経済的かつ有効である。以前の単離方法とは異なり、新たな生物学的方法は、ＬＰＳを抽出するために毒性の溶媒を必要としない。さらに、新たなプロセスは、ＬＰＳを無毒化する前にＬＰＳを化学的に分画することを必要としない。その代わり、無毒化ＬＰＳ抗原は、食物供給源として細菌上で増殖させたＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞の培養物によって生成される水溶性の最終生成物として直接入手される。抗原は、選択的濾過プロセスによって、およびエタノール−水混合物中でのそれらのバリウム塩の分別沈澱によって、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ培養培地から容易に精製される。
【００２２】
本発明の無毒化方法によって、細菌を、液体培地中で培養し、収集し、そして塩化カリウムおよび塩化マグネシウムを含有する塩溶液で洗浄する。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５を、塩化マグネシウムおよび塩化カリウムの両方を含有する培地に添加した場合、細菌細胞は、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍによって容易に食作用される凝集物を形成した。細菌でＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍを培養するための具体的方法は、５ｍＭ〜５０ｍＭの塩化カリウムおよび１ｍＭ〜１０ｍＭの塩化マグネシウムを含有する、リン酸を含まない培地を使用する。これらの塩の最適濃度は、異なる細菌株をこの具体化方法に用いた場合、異なり得る。例えば、Ｅ ｃｏｌｉ Ｊ５については、塩化カリウムおよび塩化マグネシウムについての好ましい濃度は、それぞれ、１５ｍＭおよび５ｍＭである。
【００２３】
洗浄した細菌を同じ塩溶液中に懸濁し、そしてＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ胞子またはＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍアメーバを播種する。得られた懸濁物を、１５℃と２５℃との間の一定温度で攪拌およびエアレーションしながらインキュベートする。Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞の増殖および凝集を、培養サンプルの定期的な顕微鏡検査によって追跡する。
【００２４】
Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞が増殖を止めて集まって多細胞凝集物になるまで、培養を継続する。これらの条件が満たされた場合、培養物の攪拌およびエアレーションを中断し、そして凝集したＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞を培養培地から沈降（ｓｅｄｉｍｅｎｔ）させる。次いで、培養培地を沈降物から分離し、そして濾過して残りの細胞を除去する。次いで、培地濾液を、０．２〜０．５容量のエタノールと混合し、そして混合物に、水溶性のバリウム塩を補充する。バリウムイオンの添加によって、エタノール−培地混合物から沈澱（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）および沈降するバリウム−抗原錯体の形成が引き起こされる。
【００２５】
ＬＰＳ抗原をＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ培養培地から沈澱させるためのこの方法は新規である。以前の研究（Ｄ．Ｍａｌｃｈｏｗら，上記で引用）では、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ培養培地中のＬＰＳ誘導体は、遠心分離、エバポレーションおよび透析のプロセスを含む多段階法によって濃縮された。これらの方法は、ワクチン抗原として使用することが意図されたＬＰＳ誘導体を精製するためには望ましくない。第１に、遠心分離およびエバポレーションのプロセスは大規模で行うにはコストがかかるからであり；そして第２に、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５由来の脱アシル化ＬＰＳ抗原は、従来の透析膜を容易に透過するからである。
【００２６】
濾過された培養培地からＬＰＳ抗原を濃縮するための本発明の方法では、この培地は、１０％と５０％との間のエタノールおよび１ｍＭ〜１０ｍＭの間のバリウムイオンを含むように調整される。通常の水溶性バリウム塩（例えば、酢酸バリウムまたは塩化バリウム）は、バリウムイオンの供給源として使用される。代替的な二価カチオンでバリウムを置換することは、これらの方法の範囲内である。例えば、カルシウムイオンは、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ培養物において生成されたいくつかの種のＬＰＳ抗原を沈澱させるためにバリウムイオンよりも適切であり得る。
【００２７】
０℃〜１０℃の温度での少なくとも１０時間のインキュベーション後、沈降物を収集し、水中に懸濁し、そして酸で処理してバリウムイオンをＰＳ抗原から除去する。この処理後、ＰＳ抗原溶液を、適切な量の塩基（例えば、水酸化カリウム）の添加によって中和し、そして可溶化した抗原は、選択的濾過によって、および分別沈澱によって、種々の濃度のエタノールおよび種々の緩衝液を含有する溶液からさらに精製される。
【００２８】
本発明の方法によって入手される精製されたＰＳ抗原は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５由来のネイティブなＬＰＳの多糖部分について以前に決定された糖組成と類似した糖組成を有する（Ｓ．Ｍｕｌｌｅｒ−Ｌｏｅｎｎｉｅｓら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６０，２３５（１９９９））。精製された抗原調製物におけるＫＤＯ：ヘプトース：グルコサミン：グルコース：Ｎ−アセチルグルコサミンの比は、それぞれ、約２：３：２：１：１であった。リン−３１ ＮＭＲは、ホスフェートが、精製された抗原分子中に、ジホスホジエステル形態およびホスホモノエステル形態として生じることを示した。ＰＳ抗原の構造を図２に示す。
【００２９】
最終精製工程では、抗原は、ホスホモノエステラーゼで処理されて、１’−ホスフェートが各抗原分子中のジグルコサミン基から除去される。この処理は、各抗原分子中に１つのアルデヒド官能基またはアセタール官能基を生じ、この官能基は、キャリアタンパク質への直接的結合のためにさらに改変され得るか、または種々の（二）官能性連結分子と反応され得る。この加水分解反応を、図３の工程（１）に示す。
【００３０】
（リンカー分子）
分子中へのアルデヒドまたはケタールの導入後、これらの基を、二官能性リンカー（例えば、アジピン酸ジヒドラジド（ａｄｉｐｉｃ ｄｉｈｙｄｒａｚｉｄｅ；ＡＤＨ）と反応させ、続いて、Ｓｃｈｉｆｆ塩基の還元を行って、キャリアタンパク質へのＰＳ抗原分子のその後の結合体化のために用いられ得るリンカー基を取り込み得る。この反応を、図３の工程２に示す。この誘導体化反応では、抗原は、ｐＨ５で約１０％ ｖ／ｖの酢酸ナトリウムを含有するホルムアミドの溶液中で、または過剰のシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）を含有するｐＨ４〜６の間の緩衝水溶液中で、約２０℃〜４０℃で約２０時間インキュベートされる。続いて、水素化ホウ素ナトリウムを誘導体化反応液に添加して、抗原とＡＤＨとの間に形成されるヒドラジン結合の還元を増強し得る。これらの条件は、抗原中のアルデヒド基をＡＤＨ中のα−ヒドラジド基へと連結する共有結合的なヒドラジド結合を含む、抗原−ヒドラジド分子を形成する反応を支持する。この反応に関与するアルデヒド基は、各抗原分子の還元末端グルコサミンにおけるアノマー性炭素を表す。
【００３１】
他のリンカーが入手可能であり、そして２つのアルデヒド部分、２つのカルボン酸部分、またはそれらの混合物を連結するために用いられ得る。このようなリンカーとしては、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンジヒドラジド、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキレンジアミンもしくは（Ｃ１〜Ｃ６）アリーレンジアミン、ω−アミノアルカン酸（ａｍｉｎｏａｌｋａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、アルキレンジオールもしくはオキシアルケンジオールもしくはオキシアルケンジチオール、環状アミドおよび無水物などが挙げられる。例えば、米国特許第５，７３９，３１３号を参照のこと。
【００３２】
（キャリアタンパク質およびその改変）
ＰＳ抗原についての本発明のキャリア分子を調製するために、プロテイナーゼ１（リソソーム性システインプロテイナーゼ）を、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞から新規な方法によって精製した。以前に、プロテイナーゼ１は、２以上のクロマトグラフィー工程を用いる方法によって精製された（Ｇ．Ｌ．Ｇｕｓｔａｆｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４，１２４７１（１９７９）；Ｄ．Ｐ．Ｍｅｈｔａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１０８９７（１９９６）；Ｔ．Ｏｒｄら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３３９，６４（１９９７））。以前のこれらの方法は、本発明の方法における使用のためには不適切であった。なぜなら、これらの方法は、精製された酵素の回収率が低く、そしてクロマトグラフィー工程は、酵素の大規模生成には望ましくなかったからである。本発明のプロテイナーゼ１精製方法における新規の工程は、酵素を酢酸バリウムの存在下でエタノール水溶液から沈澱させる工程、および酵素を高濃度の硫酸アンモニウムの存在下で沈澱させる工程を含む。クロマトグラフィー分画をこれらの新規工程で置き換えることによって、精製された酵素を、以前に達成されたよりもはるかに高い収率でかつより大きな規模で製造することが可能である。
【００３３】
精製されたプロテイナーゼ１を、キャリアタンパク質としての使用に適切な形態に変換するために、このプロテイナーゼを、ｐＨ５とｐＨ６との間のｐＨに調整された緩衝水溶液中で過ヨウ素酸ナトリウムと反応させる。この反応混合物中の過ヨウ素酸塩の好ましい濃度は、５０ｍＭと１５０ｍＭとの間であり、そして好ましい反応温度は−２０℃と２０℃との間、好ましくは約０℃であり、そして所望の反応は、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスフェート（ＧｌｃＮＡｃＰ）残基中のジオール基の、ジアルデヒド基への酸化的変換である。
【００３４】
ＧｌｃＮＡｃＰ−セリン部分を含む他のタンパク質（例えば、同様のリソソーム性システインプロテイナーゼ）は、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍまたは他の粘菌（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍの他の種またはＰｏｌｙｓｐｈｏｎｄｙｌｉｕｍの種を含む）から入手され得ると考えられる。
【００３５】
本発明の実施は、プロテイナーゼ１を生成するために用いられるＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞を遺伝的に改変することによって増強され得る。例えば、遺伝的改変は、（１）より多量のプロテイナーゼ１を生成するＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ変異体、（２）精製することがより容易である、変更された形態のプロテイナーゼ１を生成するＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ変異体、または（３）より多数のＧｌｃＮＡｃＰ残基を含む、変更された形態のプロテイナーゼ１を生成するＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ変異体を提供し得る。これらの増強は、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ細胞を、天然または改変形態のプロテイナーゼ１の合成をコードするＤＮＡでトランスフェクトすることによって達成され得る。組換えＤＮＡ技術は、Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍの遺伝的改変における使用のために適合されており（Ｊｅｎｎｅら，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．，１１１，６１（１９９８）；Ｍｏｒｅｎｏ−Ｂｕｅｎｏら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３４９，５２７（２０００）、およびＡｇａｒｗａｌら，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，６５，７３（１９９９））、そしてプロテイナーゼ１の製造またはプロテイナーゼ１のキャリア機能のいずれかを増強するためにＤｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍのゲノムを改変する方法の使用は、本発明の範囲内である。
【００３６】
（結合体化）
キャリアタンパク質（すなわち、酸化されたプロテイナーゼ）をＰＳ抗原−ヒドラジドに結合体化するために、酸化されたタンパク質を、脱塩し、緩衝水溶液（好ましくはｐＨ４とｐＨ７との間のｐＨ）中に懸濁し、そして約１０℃〜３０℃の温度で約２０時間〜３０時間、抗原−ヒドラジドと反応させる。次いで、得られる混合物を、過剰のシアノ水素化ホウ素ナトリウムで約２４時間〜７２時間、約０℃〜２０℃で処理する。図４に示すように、これらの条件は、キャリアタンパク質中のアルデヒド基とＰＳ抗原−ヒドラジド中のヒドラジド基との間で共有結合を生成する反応を支持する。いくつかの抗原を用いた場合、結合体化工程は、ＡＤＨが、酸化されたプロテアーゼと最初に反応し、次いで遊離ヒドラジノ基が抗原アルデヒドと反応するように逆転され得る。
【００３７】
結合体化反応が完了したら、結合体は、未結合の抗原から分離され、透析によって脱塩され、そして濾過滅菌される。無菌の結合体は、水溶液、凍結溶液または凍結乾燥生成物として貯蔵され得る。
【００３８】
（ワクチン処方物およびワクチン接種）
本発明のワクチンは代表的に、本発明のＰＳ抗原−キャリア結合体を薬学的に受容可能な処方物中に取り込むことによって形成される。この処方物は、薬学的に受容可能なアジュバント（例えば、オイル、界面活性剤、ミョウバン）、免疫促進剤（例えば、リン脂質、糖脂質、グリカン、グリコペプチド、またはリポペプチド）、および１以上の希釈剤（「賦形剤」）を含み得る。使用のために適切な希釈剤の例は、水、リン酸緩衝化生理食塩水、０．１５Ｍ塩化ナトリウム溶液、デキストロース、グリセロール、マンニトール、ソルビトール、希エタノール、およびこれらの混合物である。薬学的に受容可能な投薬形態のワクチンは、液剤、乳剤、分散剤、錠剤またはカプセル剤として処方され得る。
【００３９】
ヒトでの使用については、ワクチンは好ましくは、通常、皮下注射経路または筋肉内注射経路を介して、非経口的に投与される。あるいは、これらは、腹腔内に、静脈内に、または吸入によって投与され得る。液剤または懸濁剤のような経口投薬形態もまた用いられ得る。一般に、本発明のワクチンは、１用量のワクチンが、０．１ｍｌと０．５ｍｌとの間の容量で投与され得るように処方されるが、経口的に与えられる場合、本発明のワクチンは、カプセル剤または錠剤の形態で投与され得る。ワクチン投薬量、個体に与えられる用量の数、およびワクチン接種スケジュールは、結合体中の抗原の抗原性および免疫原性、ならびに他の公知の薬学的考慮事項（例えば、個体の年齢および体重）に依存する。
【００４０】
本発明のワクチンは、敗血症および敗血症性ショックを発症する危険性の高いヒトに防御的利益を提供する。これらとしては、慢性疾患を有する、より高齢の患者、攻撃的化学療法または免疫抑制治療で処置されている患者、移植器官を受けている患者、および重篤な外傷性傷害の犠牲者が挙げられる。本発明のワクチンはまた、ヒトにおいて、病原性グラム陰性細菌を含む１種以上の感染に対する防御的利益を提供し得る。ワクチンを用いて得られる防御のレベルは、ワクチン接種された個体において生成される抗ＬＰＳ抗体の血液力価と相関し得る。投薬量はまた、ヒトにおいて安全および／または有効であることが見出されているトキソイド−ＰＳワクチンの投薬量から外挿され得る。例えば、米国特許第４，７７１，１２７号および同第５，３７０，８７２号を参照のこと。
【００４１】
本発明は、以下の詳細な実施例を参照してさらに記載され、ここで、比色アッセイおよびＨＰＬＣアッセイは、ＬＰＳ−多糖およびＰＳ抗原の化学的組成を評価するために用いられた。これらは、以下についてのアッセイを含んでいた：ホスフェート（Ｂ．Ｎ．Ａｍｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，８，１１５（１９６６））、グルコサミン（Ｒ．Ｌ．Ｓｍｉｔｈら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９８，４７８（１９７９））、Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｔ．Ａ．Ｇｏｏｄら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９，２５３（１９６４））、ＫＤＯおよびヘプトース（Ｍ．Ｓ．Ｏｓｂｏｒｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５０，４９９（１９６３））、グルコース（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，Ｋｉｔ ＃５１０−Ａ）（Ｅ．Ｒａａｂｏら，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１２，４０２（１９６０））およびアルデヒド官能基（Ｊ．Ｔ．Ｐａｒｋら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１８１，１４９（１９４９））。種々の精製工程を通じての多糖の回収は、フェノール−硫酸アッセイ（Ｇ．Ａｓｈｗｅｌｌら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，４２，６４８（１９６５））によってモニタリングされた。エタノールアミン、エタノールアミンホスフェートおよびジグルコサミンは、ＨＰＬＣによってモニタリングされた。プロテイナーゼ１の酵素活性は、Ｇ．Ｌ．Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ（上記に引用）によって以前に記載された通りに決定された。全ての遠心分離プロセスは、３６００×ｇで１５分間、５℃で行われた。核磁気共鳴分光法は、Ｖａｒｉａｎ Ｕｎｉｔｙ ４００ ＭＨＺ ＮＭＲ装置を用いて行われた。プロテイナーゼ１の分画のためのトリクロロ酢酸緩衝液（ＴＣＡＢ）は、ナトリウム塩として購入されたかまたは４Ｍの冷トリクロロ酢酸溶液を４Ｍの冷水酸化ナトリウムで１．５の最終ｐＨになるまで滴定することによって調製されたかのいずれかであった。全てのＴｒｉｃｉｎｅ緩衝液は、ｐＨ８で調製された。
【００４２】
（実施例１：Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞およびグラム陰性細菌からの粗脱アシル化ＬＰＳの生成）
（Ａ．材料）
酵母抽出物、トリプトン（ｔｒｙｐｔｏｎｅ）、デキストロースおよび寒天は、Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ製であった。他の全ての化学物質は、試薬等級であった。
【００４３】
（Ｂ．生物および増殖条件）
１．細胞株。Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍのＮＣ−４株（ＡＴＣＣ ２４６９７）およびＥ．ｃｏｌｉのＪ５株（ＡＴＣＣ ４３４７５）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから入手した。Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ ＮＣ−４胞子およびＥ．ｃｏｌｉ Ｊ５細胞のストックを、−８０℃で、それぞれ、３３％グリセロールおよび１５％グリセロール中で保存した。Ｐａ３は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＡＴＣＣ ３３３５４）から誘導されたラフ型ＬＰＳ変異体である。
【００４４】
２．処方箋。栄養ブロス（ＮＢ）：１０ｇ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、１０ｇデキストロース、１ｇ酵母抽出物、０．２４７ｇ（１ｍＭ）硫酸マグネシウム七水和物、０．３７８ｇ（２．７ｍＭ）第二リン酸ナトリウム、１．４４ｇ（１０．６ｍＭ）第一リン酸カリウム（脱イオン水で１リットルにする）。栄養寒天（ＮＡ）：１ＬのＮＢ＋１５ｇ寒天。栄養培地１（ＮＭ１）：１８ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．９）、２０ｇ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、３０ｇデキストロース、３ｇ酵母抽出物、０．０２５５ｇ（０．２３ｍＭ）ＣａＣｌ２、０．５ｇ（３．８ｍＭ）硫酸アンモニウム、０．４５ｇ（２ｍＭ）硫酸マグネシウム、０．０４２７ｇ（０．１８ｍＭ）クエン酸ナトリウム、０．０１２ｇ（０．０８ｍＭ） 硫酸鉄（ＩＩ）および１．０ｍｌ微量元素（脱イオン水で１リットルにする）。栄養培地２（ＮＭ）：酵母抽出物を含まないＮＭ１。マグネシウム培地（ＭｇＭ）：脱イオン水中の５ｍＭ塩化マグネシウムおよび１５ｍＭ塩化カリウム。
【００４５】
３．作業培養物。微生物を、各生成操作について新たに調製した。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５の作業培養物については、ストック細胞を、無菌の栄養寒天プレートに画線し、そして３７℃にて３日間インキュベートした。Ｐａ３の作業培養物については、ストック細胞を、無菌のＴＳＡプレートに画線し、そして３７℃で２４時間〜４８時間インキュベートした。Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ胞子の作業培養物については、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５のストック細胞およびＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍのストック胞子を、無菌の栄養寒天プレートに広げ、そして２０℃で１週間インキュベートした。
【００４６】
４．種菌培養物。種細菌を、３リットルの無菌のＮＭ１に、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５またはＰａ３の作業培養物を接種し、そして１０時間〜１６時間、３７℃にてインキュベートすることによって調製した。得られた培養物中の細菌を遠心分離によって収集し、そして無菌のＭｇＭで洗浄した。Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍアメーバの種菌培養物を、１リットルのＭｇＭに１２ｇ（湿重量）の種細菌（２×１０８個のＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ胞子）を接種することによって調製し、そして培養物を、３０時間〜４０時間、２０℃にてインキュベートした。
【００４７】
５．Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５およびＰａ３飼料（ｆｅｅｄ）細菌：飼料細菌を、１５ＬのＮＭ２に６ｇの洗浄Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５またはＰａ３種細菌を接種し、そしてこの培養物が定常期に入るまで、攪拌、エアレーションおよびｐＨ制御しながら３７℃でこの培養物をインキュベートすることによって調製した。飼料細菌を遠心分離によって収集し、そして無菌のＭｇＭで洗浄した。代表的に、洗浄した細菌の湿重量の収量は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５について４００ｇ〜５００ｇの間、そしてＰａ３について２００ｇ〜４００ｇの間であった。これらの細菌を用いて、１５ＬのＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ培養物に給餌した。
【００４８】
６．培養条件。１５リットルの無菌のＭｇＭに、１２０ｇ〜１６０ｇ（湿重量）の洗浄した飼料細菌を補充し、１リットルのＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ種菌アメーバを接種し、そして攪拌およびエアレーションしながら２０℃でインキュベートした。本質的に全ての細菌が消費されたときに、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞を培養培地から分離し、２５ｍＭ塩化カリウムで洗浄し、そしてその後のプロテイナーゼ１を調製する際の使用のために、−８０℃で凍結して保存した。粗脱アシル化ＬＰＳを含有する培養培地を、多糖抗原を調製する際の使用のために別に収集した。
【００４９】
７．多糖抗原の単離。１５〜１７リットルの遠心分離した培養培地（粗脱アシル化ＬＰＳを含有する）を、ＺｅｔａＰｌｕｓ ６０ＳＰ薬学的等級の深層フィルターに通過させた。濾液に、０．５Ｍ Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液（２０ｍｌ／濾液１Ｌ）、１Ｍ酢酸バリウムまたは塩化バリウム（４ｍｌ／濾液１Ｌ）、９５％エタノール（３００ｍｌ／濾液１Ｌ）を補充し、そして４℃で１０時間〜２０時間インキュベートした。工程２からのインキュベーション混合物を遠心分離した；ペレットを４００ｍｌの脱イオン水に懸濁し、そして硫酸の添加によってｐＨ３にした。酸性化した懸濁物のｐＨを、水酸化カリウムの添加によってｐＨ８になるように再度調整した。この懸濁物を遠心分離し、そして硫酸バリウムペレットを棄てた。
【００５０】
上清を１０ｍＭ ＥＤＴＡにし、等容量の９５％エタノールと混合し、そして得られた混合物を−２０℃で３０分間インキュベートする。沈澱した多糖抗原を遠心分離によって収集した。ペレットを１５０ｍｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）中に溶解し、等容量の９５％エタノールと混合し、そして−２０℃で３０分間インキュベートさせた。沈澱した多糖抗原を遠心分離によって再度回収した。
【００５１】
ペレットを、３０ｍｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）に溶解し、そして３０ｐｓｉの圧力下で攪拌セル中で５，０００分子量カットオフのフィルターに通過させた。次いで、このフィルターを、さらに３０ｍｌ〜５０ｍｌの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を通過させることによって洗浄した。この洗浄液を最初の濾液に添加し、２容量の９５％エタノールと混合し、そして−２０℃で１０時間〜２０時間インキュベートした。沈澱した多糖抗原を遠心分離によって収集した。ペレットを１０ｍｌ〜１５ｍｌの脱イオン水に溶解し、１５０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ（ｐＨ８．０）にし、２容量の９５％エタノールと混合し、そして−２０℃で１時間〜２０時間インキュベートした。沈澱した多糖抗原を遠心分離によって収集した。
【００５２】
精製した抗原を、脱イオン水に約１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌで再度溶解し、そしてアルカリホスファターゼで５６℃で１時間〜２時間消化して残りのホスフェートをジグルコサミン骨格の還元末端から除去した。ホスフェート遊離の完了を、標準的な比色アッセイを用いてアルデヒド対ＫＤＯ比をモニタリングすることによって確認した。
【００５３】
ホスファターゼ処理ＰＳ抗原を、５，０００分子量カットオフのフィルターを通した濾過によってアルカリホスファターゼから分離した。最初の濾液およびその後の洗浄液を上記のようにプールしておき、そして１５０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ（ｐＨ８．０）にした。２容量の９５％エタノールを、このプールした濾液に添加し、そして混合物を−２０℃で２時間〜２４時間インキュベートした。沈澱したホスファターゼ処理ＰＳ抗原を遠心分離によって収集した。精製した加水分解ＰＳ抗原を脱イオン水中に再懸濁し、所望の数の血清バイアル中に分散させ、シェル凍結（ｓｈｅｌｌ ｆｒｏｚｏｎ）し、凍結乾燥し、キャップし、そしてＰＳ抗原ヒドラジドを作製するために用いるまで貯蔵した。
【００５４】
（実施例２）
（Ａ．抗原ヒドラジドの調製（方法Ｉ））
アジピン酸ジヒドラジド（２．４８ｇ）を６３．９ｍｌのホルムアミドに溶解して溶液１を得た。精製したホスファターゼ処理ＰＳ抗原（２８０ｍｇ）（「ＰＳ抗原アルデヒド」）を７．１ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）中に溶解して、溶液２を得た。溶液１と溶液２とを合わせ、１．３４ｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを補充して溶液３を得た。
【００５５】
溶液３を氷酢酸の添加によってｐＨ７．５にし、そして室温で２０時間インキュベートした。このインキュベーション期間の最初の１２時間の間、溶液のｐＨを、氷酢酸の定期的な添加によってほぼｐＨ７．５に維持した。
【００５６】
インキュベーション後、溶液に７１ｍｌの０．５Ｍ Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液、０．５ｍｌの１Ｍ酢酸バリウムおよび１４０ｍｌの９５％エタノールを補充し；そして混合物を−２０℃で１時間インキュベートした。インキュベートした混合物を遠心分離し、ペレットを収集し、２５ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを含有する２２ｍｌの０．５Ｍ Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液中に溶解し、そして室温でインキュベートした。さらに２５ｍｇの部分の水素化ホウ素ナトリウムを、１時間のインキュベーション期間の経過の間に１５分間の間隔でこの混合物に３回添加した。
【００５７】
ＰＳ抗原ヒドラジドを、反応混合物に２２ｍｌの脱イオン水、８８ｍｌの９５％エタノールおよび０．２ｍｌの酢酸バリウムを添加することによって反応混合物から沈澱させた。沈澱させたＰＳ抗原ヒドラジドを遠心分離によって収集し、ペレットを、１．５ｍＭ酢酸バリウムを含有する４４ｍｌの０．２５Ｍ Ｔｒｉｃｉｎｅに溶解させ、そして８８ｍｌの９５％エタノールの添加によって再度沈澱させた。再沈澱工程を繰り返し、そして得られた洗浄したＰＳ抗原ヒドラジドを、８０００分子量カットオフのメンブレンを通して濾過した。
【００５８】
濾過したＰＳ抗原ヒドラジドを、２容量の９５％エタノールで沈澱させ、遠心分離によって収集し、そしてペレットを減圧下で乾燥させた。
【００５９】
（Ｂ．抗原ヒドラジドの調製（方法ＩＩ））
アジピン酸ジヒドラジド（２．６３ｇ）およびシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１．４３ｇ）を、０．５Ｍ ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．３）（７５ｍＬ）中のホスファターゼ処理化ポリサッカリド抗原（３００ｍｇ）の溶液に添加した。反応物を、３７℃で２０時間、攪拌しそしてインキュベートした。
【００６０】
このインキュベーション後、反応混合物に、乾燥ＣＨＥＳ緩衝剤（７．７７ｇ）を補充し、次いで、溶液を、水酸化ナトリウムでｐＨ９．０に調整した。この反応物に、１時間周囲温度でインキュベートしながら、３０分間隔で、水素化ホウ素ナトリウム（７００ｍｇ）を２回添加した。抗原ヒドラジドを、９５％エタノール（２００ｍＬ）での沈殿および−２０℃で１時間のインキュベーション後に、遠心分離（４℃、３６００ｒｐｍで、１５分間）によって回収した。
【００６１】
ペレットを、水（７０ｍＬ）および０．５Ｍ Ｔｒｉｃｉｎｅ（ｐＨ ８．０）（３０ｍＬ）中に溶解し、そして９５％エタノール（２００ｍＬ）を添加しそして−２０℃で１時間インキュベートすることによって沈殿させた。抗原ヒドラジドを、上記のように遠心分離によって回収した。
【００６２】
この抗原ヒドラジドペレットを、水（７０ｍＬ）および０．９％生理食塩水（３０ｍＬ）中に溶解し、次いで、上記のように遠心分離によって沈殿させそして回収した。
【００６３】
このペレットを、水（５０ｍＬ）中に溶解し、−８０℃で凍結させ、そして乾燥するまで凍結乾燥させた。
【００６４】
（実施例３）
（プロテイナーゼ１の単離）
Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ細胞の凍結ケーク（５００〜６００ｇｍ湿重量）を、３ｍＭ ジチオトレイトール（２．２５ｍｌ／ｇｍ細胞）中に懸濁し、そして懸濁液を、約４℃の温度で平衡化した。冷ＴＣＡＢ（０．７５ｍｌ／ｇｍ細胞）を、攪拌しながら懸濁液に添加し、次いで、得られた混合物を、約２．４の最終ｐＨまで冷０．５Ｎ ＨＣｌで滴定した。滴定した混合物を遠心分離し、そして上清液をプロテイナーゼ１のさらなる分画のために収集した。冷０．５Ｍ Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液（０．５ｍｌ／ｇｍ細胞）を上清液に添加し、そして混合物を水酸化ナトリウムの添加によってｐＨ８に調整した。この溶液を、フラクションＦ１と名付けた。
【００６５】
フラクションＦ１を、９５％エタノール（Ｆ１の０．６７×容量）と混合し、そして混合物を、−２０℃で１．５時間インキュベートした。遠心分離後、上清液を収集し、そして９５％エタノール（Ｆ１の１／３×容量）および１Ｍ 酢酸バリウム（Ｆ１の０．００４×容量）で補充した。−２０℃で１．５時間でのインキュベーション後、混合物を遠心分離し、ペレットを収集し、そして１０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ／４ｍＭ ジチオトレイトール（１０Ｔ／４Ｄ）を含有する６００ｍｌの緩衝液中に懸濁した。この懸濁液を遠心分離し、そして上清液（フラクションＦ２）を収集した。
【００６６】
フラクションＦ２を、９５％エタノール（Ｆ２の１×容量）および１Ｍ 酢酸バリウム（Ｆ２の１／５００×容量）と混合した。−２０℃で１時間のインキュベーション後、混合物を遠心分離し、上清を捨て、そしてペレットを、１５０ｍｌの１０Ｔ／４Ｄ緩衝液中に懸濁した。この懸濁液を遠心分離し、そして上清液（フラクションＦ３）を回収した。
【００６７】
フラクションＦ３を、９５％エタノール（Ｆ３の１×容量）および１Ｍ 酢酸バリウム（Ｆ３の０．００２×容量）と混合した。−２０℃で１時間のインキュベーション後、混合物を遠心分離し、上清を捨て、そしてペレットを、８０ｍｌの１０Ｔ／４Ｄ緩衝液中に懸濁した。この懸濁液を遠心分離し、そして上清液（フラクションＦ４）を回収した。
【００６８】
フラクションＦ４を、９５％エタノール（Ｆ４の１×容量）および１Ｍ 酢酸バリウム（Ｆ４の０．００２×容量）と混合した。−２０℃で１時間のインキュベーション後、混合物を遠心分離し、上清を捨て、そしてペレットを、４０ｍｌの１０Ｔ／４Ｄ緩衝液中に懸濁した。この懸濁液を遠心分離し、そして上清液（フラクションＦ５）を回収した。
【００６９】
フラクションＦ５を、９５％エタノール（Ｆ５の０．１５×容量）と混合した。−２０℃で１時間のインキュベーション後、混合物を遠心分離し、ペレットを捨て、そして上清を、エタノール（Ｆ５の０．８５×容量）と混合した。−２０℃で１時間のインキュベーション後、混合物を遠心分離し、上清を捨て、そしてペレットを、１０ｍｌの１０Ｔ／４Ｄ緩衝液中に懸濁した（フラクションＦ６）。
フラクションＦ６を、１０Ｔ／４Ｄ緩衝液に対して透析し、そして透析液を、等量の４Ｍ 硫酸アンモニウムと混合した。遠心分離後、上清液を収集した（フラクションＦ７）。
【００７０】
プロテイナーゼ１を、さらなる硫酸アンモニウムでの処理によってＦ７から沈殿させた。沈殿物を、遠心分離によって収集し、そして少量の５ｍＭ 重炭酸アンモニウム中に溶解し、さらなる５ｍＭ 重炭酸アンモニウムに対して透析し、そして凍結乾燥して、精製プロテイナーゼ１を得た。
【００７１】
（実施例４）
（プロテイナーゼ１−ＰＳ抗原結合体の合成）
以下のように、精製プロテイナーゼ１を酸化して、ジアルデヒド側鎖部分を導入した：１）約３５ｍｇのプロテイナーゼを、５４５ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウムを含有する２５．５ｍｌの０．１Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中に溶解し、そして得られた混合物を、２０時間４℃で暗所にて、氷浴中でインキュベートし、２）次いで、混合物に、５ｍｌの５０％グリセロールを補充し、そして氷浴中のインキュベーションを、さらに２時間継続した。この反応の生成物を、１０，０００分子量カットオフを有する透析膜を備えた攪拌透析チャンバ中で、透析および濃縮した。得られた溶液を、約１０ｍｌの最終容量中に０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ５）を含むように調整した。
【００７２】
乾燥ＰＳ抗原ジヒドラジド（約２８０ｍｇ）を、この酸化されたプロテイナーゼ１の溶液中に溶解し、結合体化反応混合物を形成した。この反応混合物を、室温で約１６時間インキュベートした。次いで、これに、３ｍｌの０．５Ｍ 酢酸ナトリウム（ｐＨ５）および１６９ｍｇのシアノ水素化ホウ素ナトリウムを補充し、そしてインキュベーションを室温でさらに２０時間継続し、ＨＮＨＮＣ（Ｏ）（ＣＨ２）４Ｃ（Ｏ）ＮＨＮリンカーによって複数のＰＳ抗原部分に連結されたプロテイナーゼ１を得た。
【００７３】
次いで、キャリア−抗原結合体を、５０００分子量カットオフを有する膜を備えた攪拌透析チャンバ中での反応混合物の濾過によって、結合体化されていない抗原ヒドラジドから分離した。この結合体化生成物は、膜上に保持され、そしてこれを、１５ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｃｉｎｅ緩衝液中に収集した。
【００７４】
緩衝溶液中の残りのバリウムイオンを、０．０２ｍｌの４Ｍ硫酸アンモニウムの添加後に硫酸バリウムとして沈殿させた。この沈殿を遠心分離によって除去し、そして残りの上清液体を５ｍＭの重炭酸アンモニウムに対して透析し、そして凍結乾燥させた。この凍結乾燥させた結合体化ワクチンは、約１８ｍｇのキャリアタンパク質および約２６ｍｇの多糖類抗原を含んだ。
【００７５】
（実施例５）
（プロテイナーゼ１ベースのキャリアがＥ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＰＳ−抗原に対する免疫原性応答および免疫記憶応答を増強する能力）
抗原−キャリア結合体を用いてワクチンを調製するために、結合体のサンプルを、０．１％のＴｗｅｅｎ−８０の適切な容量に溶解させ、０．１ｍｌの溶液当たり１０ワクチン用量を含む溶液を得た。等量のフロイント不完全アジュバントをこの溶液に添加し、そしてこの混合物を、乳化した。生じた乳濁液を、４容量の０．１％のＴｗｅｅｎ−８０で希釈して、１０ワクチン用量／ｍｌを含む最終乳濁液を得た。別々の乳濁液を、抗原−キャリア結合体の各々の用量レベルについて調製し、そして各々の用量を０．１ｍｌの総容量で送達した。
【００７６】
各ワクチン用量を、皮下注射によって別々のマウス群に投与した。成熟した雌性ＩＣＲマウスの年齢適合集団から、群を無作為に集合させた。免疫したマウス由来の血液サンプルを、ヘパリン中に回収し、マウスの各群由来の個々の血漿の等アリコートを、抗体分析のためにプールした。抗体力価をネガティブコントロールとして正常免疫血清（ワクチン接種されない１０匹のマウスからプールされた）を使用し、そしてポジティブコントロールとしてＥ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＬＰＳに対するモノクローナル抗体を使用するＥＬＩＳＡによって決定した。
【００７７】
予備実験（データは示さず）は、非結合体化ＰＳ抗原でのマウスの一次免疫および二次免疫が、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ（ＳＥ）のいずれか由来のＬＰＳでのＥＬＩＳＡにおいて反応性の抗体を微量のみ誘発したことを示した。これらの結果は、非結合体化ＬＰＳ多糖類が弱い抗原であることを示す他の研究と一致する。
【００７８】
以下の表１は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＰＳ抗原およびキャリアタンパク質を含む結合体ワクチンの一次、二次および三次用量を与えられたマウスからのＥＬＩＳＡの結果を要約する。一次ワクチン用量を、１５週齢で与えた。二次ブースターワクチン用量を、一次用量の２４時間後に与え、そして三次ブースター用量を、二次用量の１１日後に与えた。群１のマウスは、各注射において２５μｇ用量の抗原−キャリア結合体を受け、群２のマウスは、５０μｇ用量の結合体を受け、そして群３のマウスは、１００μｇ用量の結合体を受けた。
【００７９】
【表１】
【００８０】
これらの結果は、結合体ワクチンによるマウスの一次免疫が、７００〜１７００の間の抗ＬＰＳ抗体力価を誘発し；そして二次免疫が、約２０〜３０倍の抗体力価をブーストしたことを示す。これらの結果は、キャリアタンパク質が、これに結合体化した多糖類抗原の免疫原性およびＴ細胞依存性の両方を増強したことを実証する。各一次ワクチン用量と各二次ワクチン用量との間の、および各二次ワクチン用量と各三次ワクチン用量との間で観察される抗体力価の増幅は、このキャリアタンパク質がＰＳ抗原に連結した免疫学的記憶を誘発することを実証する。有意な差異（Ｐ＞０．０５）は、１００μｇのワクチン用量によって誘発された三次抗体力価と、ＰＳ抗原−キャリア結合体の２５μｇ用量または５０μｇ用量のいずれかによって誘発された三次抗体力価との間で観察されなかった。
【００８１】
（実施例６）
（交差反応性の抗ＬＰＳ抗体を誘発する、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＰＳ抗原結合体ワクチンの能力）
表２は、３つの別々の実験、Ｅ１、Ｅ２およびＥ３から得られた、本発明の結合体ワクチンによって誘発される抗体の交差反応性についてのデータを示す。全ての実験におけるマウスは、成熟した非近交系（ｏｕｔ−ｂｒｅｄ）の雌性ＩＣＲマウスであった。４つの異なるロットの結合体ワクチンを使用した。Ｅ１におけるマウスは、一次注射のために２００μｇのロット１ワクチンを受け、７週間後の二次注射のために２００μｇのロット３ワクチンを受け、そして一次注射の１０週間後の三次注射のために２００μｇのロット４ワクチンを受けた。
【００８２】
Ｅ２におけるマウスは、一次注射のために２００μｇのロット２ワクチンを受け、６週間後の二次注射のために２００μｇの結合体ロット３ワクチンを受け、そして一次注射の１１週間後の三次注射のために２００μｇの結合体ロット４ワクチンを受けた。
【００８３】
Ｅ３におけるマウスは、一次注射のために２５μｇのロット４ワクチンを受け、３週間後の二次注射のために２５μｇのロット４ワクチンを受けた。
【００８４】
血漿を、Ｅ１およびＥ２については三次ワクチン接種の２週間後に回収し、そしてＥ３については二次ワクチン接種の１１日後に回収した。各群のマウス由来の等アリコートの血漿をプールした。プールした血漿サンプルを、指定された型の細菌から精製したＬＰＳに対する抗体力価についてＥＬＩＳＡによって評価した。ワクチン接種したマウス由来のプールされた血漿における抗ＬＰＳ力価を、非免疫マウス由来のプールされた血漿における抗ＬＰＳ力価と比較した。表２に報告した交差反応抗体力価は、非免疫のバックグラウンド力価より少なくとも４〜５倍であった。
【００８５】
【表２】
非免疫血清は、１００に等しいかまたはそれより小さかった
ＮＤ＝検出されず
表２中の結果は、敗血症の原因因子として関連した種々野生型細菌からのＬＰＳと交差反応した抗体を惹起した発明の複合ワクチンを示し、しかも本発明のワクチンが、これらの種類の細菌により引き起こされた感染に対し有益な保護を提供し得たことを示す。
【００８６】
（実施例７）
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＰＳ抗原−キャリア結合体を用いたワクチン接種は、重篤な敗血症に対しマウスを保護する。
【００８７】
誘導されたＬＰＳ−過敏症を含むモデルを用い、本発明の複合ワクチンにより与えられる保護活性を評価した。マウスを、熱殺傷したＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍの腹腔注射により過敏症にした（Ｃ．Ｇａｌａｎｏｓら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌ．、１８７、３４９（１９９３））。この処置の６日後、動物を、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓからの、１０ｎｇのＬＰＳを抗原投与した。抗原投与後、２時間および６時間に体温を測定した。
【００８８】
図５−６中のデータは、マウスの２つの非ワクチン接種コントロール群（第１群および第２群）に由来する。第１群は、Ｃ．ｐａｒｖｕｍで感作したが、ＬＰＳを抗原投与しなかった；そして第２群は、感作および抗原投与した。実験群（第３群）は、３回の、１００μｇ用量の複合ワクチンで免疫化した。
【００８９】
図５−６中に要約した実験では、第３群のマウスは、第２群と同じ様式で感作および抗原投与した。この実験は、第３群のマウスが、第３の免疫化後４０日にＣ．ｐａｒｖｕｍ感作を受け、そしてこの免疫化の後４６日にＬＰＳで抗原投与されるようなスケジュールとした。すべての群からのマウスの体温を、ＬＰＳを用いた抗原投与後２および６時間後（それぞれ図５および６）測定した。
【００９０】
第１群に関する図５に示される結果は、ＬＰＳで抗原投与されなかったＣ．ｐａｒｖｕｍ処理マウスが、３６．５〜３８℃の範囲の体温を有し、そしてこの温度範囲が、観察期間の経過の間保持されたことを示した（図６）。対照的に、抗原投与後２時間の第２群マウスの体温範囲は、３２．７−３７．２℃であり、そして約７０％のマウスが、第１群で観察された最小温度より低い体温を有していた。図６に示されるように、抗原投与後６時間では、第２群のマウスの約５５％が、第１群の３６．５℃最小温度より低い体温を有しており、そして第２群の残りは、３７．５〜３８．５℃の範囲にある温度を有していた。
【００９１】
対照的に、ワクチン接種された群のマウス（第３群）は、抗原投与後２時間には、３４．３〜３８℃の範囲の体温を有し、４７％が第１群の最小３６．５℃より低い温度を有していた。抗原投与後６時間では、１９匹のワクチン接種マウスのうち２匹だけ（１１％）が、３６．５℃より低い体温を有し、そして残りは、３６．９〜３８．５℃の範囲の温度を有していた。
【００９２】
通常の非処理マウスの体温範囲は、３６．１〜３７．１℃で、３６．７℃の平均温度であることが観察された（データは示さず）。これは、他の研究者により得られた平均の通常体温と同様である（Ａ．Ｒｏｍａｎｏｖｓｋｙら．、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２７０、Ｒ６９３（１９９６））。従って、図５−６における結果を評価する目的には、３７．１℃を超える体温が高体温（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉｃ）であると考えられ、そして３６．１℃より低い体温が低体温（ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉｃ）であると考えられた。この関係から、図５−６における結果から、以下の結論が導かれた：ａ）ＬＰＳで抗原投与されなかった非ワクチン接種過敏症マウス（第１群）の約半分が、通常マウスの範囲の体温を有し、そして残りがわずかに高体温であった；ｂ）ＬＰＳで抗原投与された非ワクチン接種過敏症マウスの大部分が、抗原投与後２時間で高体温であり、抗原投与後６時間で約半分のマウスで高体温が持続した；およびｃ）ワクチン接種した、過敏症マウスの約１／３が、抗原投与後２時間で低体温であったが、低体温は、抗原投与後６時間で１９匹のマウスのうち２匹のみで持続した。
【００９３】
図５−６で要約される実験の前に、非ワクチン接種過感作マウスにおけるＳ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓの致死用量の閾値が約２０ｎｇであることを見出した。従って、上記の実験に用いられた１０ｎｇのＬＰＳ抗原投与用量は、非ワクチン接種マウスの致死用量の閾値に近かった。マウスおよびラットのような小げっ歯類では、持続する低体温は重篤な敗血症の症状であり、そして一時的な低体温は、軽い敗血症の症状である。例えば、Ｒ．Ｂｌａｎｑｕｅら、Ｇｅｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２７、９７３（１９９６）；Ｔ．Ｐ．Ｃｌｅｍｍｅｒら、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．、２０、１３９５（１９９２）を参照のこと。従って、図５−６における結果は、１０ｎｇのＬＰＳ抗原投与用量が、具現化された複合ワクチンで免疫化したマウスにおけるより、コントロールマウス中でかなり重篤な敗血症を引き起こしたという結論を支持する。
【００９４】
敗血症に対する保護を提供することに加えて、具現化された複合ワクチンはまた、その他の感染性合併症に対する保護を提供し得る。例えば、このワクチンは、紅斑性狼瘡（エリテマトーデス）を患う患者および鎌型赤血球病を患う患者において生じるＳ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｕｓによる感染に対する保護を提供し得、そして、それは、この細菌によって引き起こされる胃腸炎および腸熱に対する保護もまた提供し得る。例えば、Ｓ．Ａｂｒａｍｓｏｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．、２８、７５（１９８５）；Ｊ．Ｒ．Ｗｒｉｇｈｔら、Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．、１３０、３３４（１９９７）；Ｊ．Ｌ．Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１６７、７８１（１９９３）；ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ．Ｗｅｅｋｌｙ Ｒｅｐ．、４９、７３（２０００）を参照のこと。また、本明細書に開示される方法は、その他の種類のＬＰＳ多糖を含む複合ワクチンを生成することに容易に適用し得、そしてこれらのワクチンは、単独または組み合わせて用いられ、グラム陰性細菌により引き起こされる広範な合併症および感染性疾患に対する予防的保護を提供し得る。
【００９５】
（実施例８）
プロテイナーゼ１を基礎にしたキャリアワクチンが、生理食塩水中、非アジュバント化ワクチン中のＰＳ抗原に対する、免疫原性および記憶応答を可能にする能力。
【００９６】
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５またはＰ．ａｅｕｒｏｇｉｎｏｓａのラフ（ｒｏｕｇｈ）変異体Ｐａ３のいずれかからのＰＳ抗原を用いるワクチンを、上記の実施例で記載したのとほぼ同様に調製した。これらのワクチンは、０．９％ＮａＣｌのみ中で処方し、そして一次ワクチン接種で開始し、三次ワクチン接種まで、２週間のスケジュールでマウスに投与した。各ワクチン接種で、少なくとも４つの異なるワクチン用量を与えた。用いた用量（１−８μｇ）は、上記の実施例５および６で提示したアジュバント化ワクチンで用いた用量より少ない。二次接種後および三次接種後、血清を、各々のワクチン接種の２週間後、尾放血により採取した。
【００９７】
表３−５は、バックグラウンドの２倍のＯＤ（４５０ｎｍ）読み取り値を与える希釈の逆数に等しいＥＬＩＳＡ力価を提示する。表３は、二次および三次注射後の抗Ｊ５ＰＳワクチンに対する用量応答を示す。Ｊ５ＰＳ複合ワクチンの二次および三次ワクチン接種の両方の後に、明瞭な用量応答がある。ＥＬＩＳＡ測定を基づけば、生理食塩水のみのワクチンは、三次注射の後、水中油ワクチンが示したよりも高い記憶増幅を示した。８μｇの三次の後の力価は、任意の水中油ワクチンの三次後の力価より高い。この水中油ワクチン接種は、１００、５０、および２５μｇの用量を有していた。従って、生理食塩水のみのワクチンは、全体に亘って、水中油ワクチンの示すより大きい免疫活性を示す。
【００９８】
【表３】
【００９９】
【表４】
【０１００】
表５は、抗Ｐａ３ＰＳワクチンにより惹起された抗体についての用量応答データを提示する。このワクチンに対する相同的ＬＰＳは利用可能ではないので、ＥＬＩＳＡアッセイは、抗原として全細菌を用いた。定性的には、これらのデータは、二次注射後の用量応答の証拠がより少ないことを除いて、Ｊ５ＰＳワクチンについて観察されたデータと類似である。しかし、三次の注射後に生じる記憶増幅の実質的な証拠、および明らかな用量応答の証拠がある。
【０１０１】
【表５】
【０１０２】
抗原およびキャリアタンパク質の両方を提供するために、細胞の粘菌を用いて同様に各々調製されたこれらの２つの異なるワクチンは、広範な種類のグラム陰性細菌からの低コストで有効なワクチンの調製への、本特許およびその実施例で提示された核となる技法の利用可能性のさらなる証拠を提供する。たとえこれらのワクチンが、小さな脱脂ＬＰＳ炭水化物ハプテンのみを用いても、結合体ワクチン中でキャリアタンパク質であるプロテイナーゼ１に連結されるとき、このワクチンは、マウスにおいて顕著な免疫および記憶応答を惹起した。
【０１０３】
すべての刊行物、特許および特許書類は、個々に参考として援用されるように、本明細書中に参考として援用される。本発明を、種々の詳細かつ好適な実施態様および技法を参照して記載してきた。しかし、多くの改変および修飾が、本発明の思想および範囲にありながらなされえることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ−５ ＬＰＳの構造を示す。
【図２】
図２は、脱Ｏ−アセチル化および脱Ｎアセチル化Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＬＰＳの構造を示す。
【図３】
図３は、リンカー基を導入するためのＪ−５抗原の改変を示す。
【図４】
図４は、Ｊ−５抗原ヒドラジドへキャリアタンパク質を連結するためのこのキャリアタンパク質の改変を示す。
【図５】
図５は、本発明の結合体ワクチンが、マウスにおいて実験的に誘導された敗血症において低体温を阻害する能力をまとめる。
【図６】
図６は、本発明の結合体ワクチンが、マウスにおいて実験的に誘導された敗血症において低体温を阻害する能力をまとめる。
Claims (31)
- Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍのプロテイナーゼ１のグルコサミン残基に共有結合した、複数の、グラム陰性細菌由来の脱アシル化ＬＰＳ分子を含む、免疫原性結合体。
- 前記脱アシル化ＬＰＳ分子が、リピッドＡの脱脂グルコサミンの二糖類骨格を含む、請求項１に記載の免疫原性結合体。
- 二官能性のリンカー分子によって、脱アシル化ＬＰＳ分子を、酸化的に切断されたプロテイナーゼ１のグルコサミン残基と共有結合することにより形成された、請求項１または２に記載の免疫原性結合体。
- 前記リンカー分子が、前記脱アシル化ＬＰＳ分子上のアルデヒド基またはアセタール基と反応性であって、かつそれを、プロテイナーゼ１中のグルコサミン残基のアルデヒドまたはジアルデヒド部分に連結する、請求項３に記載の結合体。
- 前記リンカー分子が、１、ω−アルキレンジヒドラジドである、請求項４に記載の結合体。
- 前記細菌が、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５株である、請求項１または２に記載の結合体。
- 請求項１または２の結合体の有効な免疫原性量を、キャリアとの組み合わせで含む、組成物。
- 前記キャリアが、生理学的に受容可能な液体ビヒクルである、請求項７に記載の組成物。
- 請求項８に記載の組成物を含む、単位用量形態。
- 敗血症にかかるか、またはグラム陰性細菌で感染される哺乳動物において、感染または敗血症を防ぐか軽減するに有効な量の、請求項１または２に記載の結合体を含む、ワクチン。
- 前記哺乳動物がヒトである、請求項１０に記載のワクチン。
- 敗血症に罹患したか、またはその危険性のあるヒトにおいて、グラム陰性敗血症の少なくとも１つの症状をブロックまたは軽減する、請求項１０に記載のワクチン。
- 免疫原性に有効な量のハプテンに連結した、セリン連結ＧｌｃＮＡｃＰ残基を含むリソソームシステインプロテイナーゼを含む、免疫原性結合体を調製する方法であって：
ａ）ｉ）プロテイナーゼ、およびｉｉ）抗原として有効な量の免疫学的に活性なハプテンを調製する工程；
ｂ）反応性部位を提供するために、前記プロテイナーゼおよび前記ハプテンを改変する工程；および
ｃ）前記改変されたプロテイナーゼを、前記改変されたハプテンに、直接または二官能性有機リンカーで連結する工程を包含し、
ここで、前記プロテイナーゼが、前記結合体をインビボで投与するとき、前記ハプテンに対する抗体応答を実質的に増大する、方法。 - 前記キャリアタンパク質が、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ由来のＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ１である、請求項１３に記載の方法。
- 前記プロテイナーゼ中のＮ−アセチルグルコサミン−１−リン酸基が、ハプテンへの共有結合を可能にするように改変されている、請求項１３および１４に記載の方法。
- 前記ハプテンが、リピッドＡの脱脂グルコサミン二糖骨格、およびその多糖を含む脱アシル化細菌ＬＰＳである、請求項１３に記載の方法。
- 前記脱アシル化が、最小塩類培地中のグラム陰性細菌上で生育するＤ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍから得られる、請求項１６に記載の方法。
- 前記最小塩類培地が、水中に、約１−５ｍＭの塩化マグネシウム、および約１０−２０ｍＭの塩化カリウムを含む、請求項１７に記載の方法。
- 前記ハプテンが、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５ ＬＰＳから得られた脱アシル化リポ多糖である、請求項１６に記載の方法。
- 前記脱アシル化ＬＰＳのリピッドＡが、加水分解により改変されてアルデヒド基またはケタール基が導入されている、請求項１９に記載の方法。
- 請求項１３、１４、１５または１６に記載の方法により生産された、免疫原性結合体。
- 請求項２１に記載の結合体、および薬学的に受容可能な賦形剤を含む、組成物。
- 請求項２２に記載の組成物を含む、ワクチン。
- リピッドＡの脱脂グルコサミン二糖、およびその多糖を含む、グラム陰性細菌から得られる、リポ多糖（ＬＰＳ）誘導体。
- 少なくとも１つのＫＤＯ部分を含む、請求項２４に記載のＬＰＳ誘導体。
- 少なくとも１つのエタノールアミン二リン酸基、または少なくとも１つのエタノールアミン一リン酸基を含む、請求項２４に記載のＬＰＳ誘導体。
- 前記リピッドＡのジグルコサミン部分上のＯＣＨ（ＯＰＯ３Ｈ−）部分が、−ＯＣＨ−ＯＨまたは−ＣＨＯ部分に変換されている、請求項２６に記載のＥ．ｃｏｌｉ ＬＰＳ誘導体。
- リン酸化グルコサミン残基上の３，４−ジオールの酸化的切断により調製された、複数のアルデヒド部分を含む、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍのプロテイナーゼ１誘導体。
- キャリア分子に連結された、複数の請求項２４、２５または２６に記載のＬＰＳ誘導体を含む、免疫原性組成物。
- 前記キャリア分子が、プロテイナーゼ１以外のキャリアタンパク質である、請求項２９に記載の免疫原性組成物。
- 前記キャリア分子が、酸化的に切断されたリン酸化グルコサミン基のジオール部分を含むプロテアーゼである、請求項３０に記載の免疫原性組成物。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016511633A (ja) * | 2013-01-17 | 2016-04-21 | アルサニス・バイオサイエンスズ・ゲゼルシャフト・ミト・ベシュレンクテル・ハフツング | Ｍｄｒ大腸菌特異的抗体 |
| US11844766B2 (en) | 2016-10-24 | 2023-12-19 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | ExPEC glycoconjugate vaccine formulations |
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Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US20060233776A1 (en) * | 2003-08-19 | 2006-10-19 | Norbert Heimburger | C1-inh as a drug for treating viruses pathogenic to humans |
| EP1713508A2 (en) * | 2004-01-29 | 2006-10-25 | Biosynexus Incorporated | Use of amino-oxy functional groups in the preparation of vaccine conjugates |
| WO2007059625A1 (en) * | 2005-11-23 | 2007-05-31 | National Research Council Of Canada | Bacterial antigens and uses thereof |
| US8647621B2 (en) | 2009-07-27 | 2014-02-11 | Fina Biosolutions, Llc | Method of producing protein-carbohydrate vaccines reduced in free carbohydrate |
| US9044517B2 (en) | 2009-12-17 | 2015-06-02 | Fina Biosolutions, Llc | Activation of polysaccharides via the cyanylating agent, 1-cyano-4-pyrrolidinopyridinium tetrafluoroborate (CPPT), in the preparation of polysaccharide/protein conjugate vaccines |
| US9358284B2 (en) | 2011-09-14 | 2016-06-07 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Methods for making saccharide-protein glycoconjugates |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6289632A (ja) * | 1985-09-27 | 1987-04-24 | シユウアイツエリツシエス・ゼル−ム−ウント・イムプフインステイトウト・ウント・インステイトウト・ツ−ル・エルフオルシユング・デル・インフエクツイオンスクランクハイテン | グラム陰性菌による感染に対する接合ワクチン及びその使用法 |
| JPH06340550A (ja) * | 1990-09-28 | 1994-12-13 | American Cyanamid Co | 改良されたオリゴ糖結合体ワクチン |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5785973A (en) | 1988-02-01 | 1998-07-28 | Praxis Biologics, Inc. | Synthetic peptides representing a T-cell epitope as a carrier molecule for conjugate vaccines |
| US5370872A (en) * | 1991-08-12 | 1994-12-06 | Swiss Serum And Vaccine Institute Berne | Escherichia coliO-polysaccharide-protein conjugate vaccine |
| EP0623026A1 (en) * | 1992-01-16 | 1994-11-09 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES | Detoxified lps-cholera toxin conjugate vaccine for prevention of cholera |
| US5736146A (en) | 1992-07-30 | 1998-04-07 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic peptide carriers and vaccines comprising them |
| US5445817A (en) | 1992-08-21 | 1995-08-29 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Pertussis toxin used as a carrier protein with non-charged saccharides in conjugate vaccines |
| DK0658118T3 (da) * | 1992-08-31 | 2002-05-06 | Baxter Healthcare Sa | Vaccine mod Neisseria meningitidis, gruppe C |
| US5573916A (en) | 1994-05-19 | 1996-11-12 | Coretech, Inc. | Immunogenic constructs comprising b-cell and t-cell epitopes on common carrier |
| US5869058A (en) | 1994-05-25 | 1999-02-09 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Peptides used as carriers in immunogenic constructs suitable for development of synthetic vaccines |
| US5866132A (en) | 1995-06-07 | 1999-02-02 | Alberta Research Council | Immunogenic oligosaccharide compositions |
| US6645503B1 (en) | 1998-03-10 | 2003-11-11 | Wyeth Holdings Corporation | Antigenic conjugates of conserved lipopolysaccharides of gram negative bacteria |
| CA2264970A1 (en) | 1998-03-10 | 1999-09-10 | American Cyanamid Company | Antigenic conjugates of conserved lipolysaccharides of gram negative bacteria |
| US6531131B1 (en) | 1999-08-10 | 2003-03-11 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Conjugate vaccine for Neisseria meningitidis |
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6289632A (ja) * | 1985-09-27 | 1987-04-24 | シユウアイツエリツシエス・ゼル−ム−ウント・イムプフインステイトウト・ウント・インステイトウト・ツ−ル・エルフオルシユング・デル・インフエクツイオンスクランクハイテン | グラム陰性菌による感染に対する接合ワクチン及びその使用法 |
| JPH06340550A (ja) * | 1990-09-28 | 1994-12-13 | American Cyanamid Co | 改良されたオリゴ糖結合体ワクチン |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2016511633A (ja) * | 2013-01-17 | 2016-04-21 | アルサニス・バイオサイエンスズ・ゲゼルシャフト・ミト・ベシュレンクテル・ハフツング | Ｍｄｒ大腸菌特異的抗体 |
| US10206992B2 (en) | 2013-01-17 | 2019-02-19 | Arsanis Biosciences Gmbh | MDR E. coli specific antibody |
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| US11844766B2 (en) | 2016-10-24 | 2023-12-19 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | ExPEC glycoconjugate vaccine formulations |
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